Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm - Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày

63 trang vanle 2420

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm - Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

ung_dung_cong_nghe_sinh_hoc_trong_cong_nghe_thuc_pham_enzyme.docx

Nội dung text: Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm - Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày

Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Ứng dụng công nghệ sinh học trong công nghệ thực phẩm Đề tài. Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày GVHD: Th.s Nguyễn Thị Thu Sang SVTH: Nhóm 19 Trần Quốc Huy 3005110114 Trần Thị Mỹ Lan 3005110137 Nguyễn Hoàng Linh 3005110145 Trần Thị Tiến 3005110335 Ngô Thị Minh Tuyền 3005110375 Tp.Hồ Chí Minh-2014 20 1 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Mục lục Nội dung trang Lời mở đầu 4 I. Enzyme protease 5 1. Khái quát về enzyme 5 1.1 Enzyme 5 1.2 Đặc tính chung của enzym 5 1.3 Cấu tạo của enzym 5 2 Tổng quan về enzyme protease 6 2.1 Giới thiệu 6 2.2 Đặc điểm chung 6 2.3 Phân loại 8 2.4 Cơ chế tác dụng 10 2.5 Nguồn cung cấp 10 II. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 15 1. Quy trình thu nhận enzyme protease 15 2. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 16 2.1 Tổng quan về Aspergillus oryzae 16 2.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 23 2.2.1. Sơ đồ quy trình 24 2.2.2. Thuyết minh quy trình 25 III. Ứng dụng enzyme Protease trong công nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày 30 1. Ứng dụng enzyme protease 30 2. Ứng dụng protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày 33 2.1 Giới thiệu 33 2.2 Phân loại nước mắm 34 2 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 2.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm 36 2.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm 37 2.5 Nguồn nguyên liệu 37 2.5.1 Cá 37 2.5.2 Muối 41 2.5.3 Nguyên liệu phụ 43 2.6 Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày 45 2.7 Giải thích quy trình 46 2.7.1 Rửa 46 2.7.2 Xử lý 47 2.7.3 Lên men 47 2.7.4 Lọc 51 2.7.5 Cô đặc chân không 52 2.7.6 Bổ sung hương 54 2.7.7 Đóng chai 56 IV Sản phẩm 58 1. Cách tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày 58 2. Tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm 58 3. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm 58 4. Một số sản phẩm nước mắm sử dụng phương pháp ngắn ngày trên thị trường 60 Kết luận 62 Tài liệu tham khảo 63 3 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Lời mở đầu Một trong những thành tựu to lớn của khoa học công nghệ trong thời gian gần đây là nghiên cứu về enzyme, nó đặt trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục năm qua, và một trong những enzyme được nghiên cứu rất nhiều, đó là enzyme protease, đây là enzyme được thu nhận từ rất nhiều nơi, từ động vật, thực vật cho tới vi sinh vật đều là nguồn gốc của enzyme protease, và điều đặc biệt là enzyme protease đóng vai trò vô cùng quan trọng trong cuộc sống của chúng ta và được ứng dụng trong rất nhiều ngành nghề, một trong số đó là ứng dụng quan trọng trong công nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày. Bài báo cáo về enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày sẽ giúp cho chúng ta hiểu rõ về enzym protease, cách thu nhận cũng như hiểu được tầm quan trọng của enzyme protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày, để có thể tham khảo và áp dụng thực tế một cách tốt nhất khi đi vào thực tế. Với sự góp mặt của các thành viên tích cực, sự kết hợp ưng ý cũng như sự phân công công việc công bằng, hứa hẹn sẽ đem đến một báo cáo hấp dẫn, đầy những kiến thức thú vị và bổ ích. Dù đã cố gắng hết sức, bài báo cáo chắc chắn không tránh khỏi những thiếu xót. Nhóm tác giả rất mong sự đóng góp ý kiến của Cô và toàn thể các bạn nghiên cứu đề tài này để nhóm có được những kiến thức đầy đủ nhất. Xin cảm ơn! 4 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang I. ENZYME PROTEASE 1. Khái quát về enzyme 1.1. Enzym - Enzym có bản chất là protein được sinh vật tổng hợp nên, tham gia vào các phản ứng hóa sinh học. 1.2. Đặc tính chung của enzym - Enzym được tạo ra trong tế bào sinh vật, không độc hại, thân thiện với môi trường. - Enzym tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi được tách khỏi tế bào sống. - Enzym có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn cuối giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau. - Enzym có thể được thực hiện một phản ứng: xảy ra ngoài tế bào (như trong ống nghiệm) - Phản ứng enzym tiêu hao năng lượng rất ít, hiệu suất và tốc độ cao - Enzyme tính chọn lọc cao - Enzym chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. 1.3. Cấu tạo của enzym Nhóm enzym đơn cấu tử : Thành phần cấu tạo chỉ có protein. Nhóm enzym đa cấu tử : - Gồm 2 phần: + Phần I: protein thuần : apoprotein hay apoenzym + Phần II: thành phần không phải protein : cofactor – chúng có thể gắn chặt (prosthetic) hoặc lỏng lẻo với phần protein (coenzym) 5 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Ngoài ra còn có một số kim loại giữ vai trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia vận chuyển điện tử. 2. Tổng quan về enzyme protease 2.1 . Giới thiệu. Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid. Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường. Protease là một trong những enzyme được ứng dụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực. Đặc biệt là công nghiệp thực phẩm, protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ và nâng cao đời sống của con người. Hiện nay trên thế giới, công nghệ thu nhận protease từ vi sinh vật hiện còn đang phát triển, tìm tòi nghiên cứu về khả năng ứng dụng vô vàn của enzyme protease. Ở Việt Nam cũng có nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng Protease, chủ yếu tập trung vào các protease thực vật và động vật còn protease vi sinh vật chỉ được nghiên cứu trong hơn chục năm trở lại đây. 2.2 . Đặc điểm chung. Ezyme protease là enzyme thủy phân các liên kết pectid (-CO-NH-) trong phân tử protein giải phóng các acid amin, pepton hoặc dittripepton. Hình 1.1: Mô hình enzyme Protease thủy phân phân tử Protein 6 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease. Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer. Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Hình 1.2: cấu trúc không gian enzyme protease 7 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 2.3. Phân loại. Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) . Hình 1.3: Sơ đồ phân loại protease Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặc điểm sau để phân loại chúng:  Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người ta chia protease làm 2 nhóm chính: • Exopeptidase: (Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptid,) được phân thành 2 loại: - Amino peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu N tự do của chuỗi poly peptid để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc một tripeptid. - Carboxy peptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗi poly peptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một đipepti. 8 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang • Endo peptidase: (Dựa vào động lực học của cơ chế xúc tác) được chia thành 4 nhóm: - Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Nhóm này bao gồm 2 nhóm nhỏ chymotripsin và subtilisin. Nhóm chymotripsin bao gồm các enzyme động vật như chymotripsin, tripsin, elastase. Nhóm subtilisin bao gồm 2 loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg, subtilisin BPN. Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện đặc hiệu cơ chất tương đối rộng. - Cyteim proteinase: các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt động. Cystein protease bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin, một vài proteinase động vật và proteinase ký sinh trùng. Các Cystein proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng. - Aspatic proteinase: hầu hết các asportic proteinase thuộc nhóm pepsin. Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hoá như: pepsin, chymosin, cathepsin, renin . Các asportic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở PH trung tính. - Metallo proteinase metallo proteinase: là nhóm proteinase được tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase thường hoạt động ở vùng PH trung tính và giảm hoạt động mạnh dưới tác dụng của EDTA.  Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các nhóm: - Protease acid: pepsin, renin, hoạt động ở vùng pH acid 2-4. - Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, hoạt động ở vùng pH kiềm 9- 11. - Protease trung tính: như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, hoạt động ở vùng pH trung tính 7-8  Ngoài ra có thể phân làm 2 loại khác: - Enzyme protease nồi bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kĩ thuật trích ly. 9 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay quá trình lên men đang diễn ra. 2.4. Cơ chế tác dụng Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ chế xúc tác sinh học của enzym người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng đều thống nhất ở chỗ quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzym và cơ chất thành hợp chất trung gian. E (enzym) + S (cơ chất)→ ES(hợp chất trung gian) 2.5. Nguồn cung cấp Enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô của sinh vật; nhưng để thuận lợi về kinh tế, người ta chỉ dùng những vật liệu cho phép thu một lượng lớn enzyme với hiệu suất cao. Hiên chúng ta sử dụng 3 nguồn nguyên liệu sinh học cơ bản để thu nhận protease: các mô và cơ động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật a. Nguồn Động vật Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặc biệt về khả năng đông tụ sữa. Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò ) Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều ezyme nhất. Trypsin là men phân giải các protein hỗn hợp men này do tuyến tụy tiết ra, tiền thân của nó là Trypsiogen, được hoạt hóa bởi Entorokiaza của ruột. Trypsin là một enzym có chức năng phân cắt các protein. Ngoài ra tuyến tụy còn tiết ra enzyme Chymotrypsin, enzym này góp phần phân giải protein trong ruột non và được chiết xuất từ tụy bò. Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin. Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat. Renin làm biến đổi các casein thành paracazein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có nồng độ Ca2+ (sự đông tụ sữa chua). 10 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như: ở các loài Eudothia parasitica và Mucor purillus. b. Nguồn thực vật Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Caria papaya) còn Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các enzyme này được sử dụng để chống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) do kết tủa protein. Những ứng dụng khác của protease thực vật này là trong công nghệ chế biến thịt nó làm mềm thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ngoài ra còn thu nhận ezyme Ficin tách từ dịch ép thân cây sung. Ezyme được sử dụng để phân hủy protein tự nhiên. Hình 1.4: mô hình phân tử enzyme papain Hình 1.5: nguồn thu nhận ezyme Protease từ thực vật 11 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang c. Nguồn vi sinh vật Hai nguồn nguyên liệu trên không để dùng làm nguyên liệu sản xuất công nghiệp quy mô lớn do những hạn chế về nguyên liệu và công nghệ. Vì dùng enzyme từ vi sinh vật sẽ khắc phục được các hạn chế sau: - Nguồn nguyên liệu vô hạn. - Hệ enzyme phong phú. - Hoạt tính mạnh. - Có khả năng tăng cường sinh tổng hợp enzyme nhờ chọ giống. - Vi sinh vật sinh sản với tốc độ cực nhanh. - Thức ăn nuôi dễ kiếm, rẻ tiền. Ezyme Protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men. • Vi khuẩn Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm 59 lượng enzyme được sử dụng. Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại andopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B. Subtilis có khả năng tổng hợp mạnh nhất. Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu. Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5 – 6) và có khả năng chịu nhiệt thấp.Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm. Chúng được sinh ra nhiều bởi B. Subtilis, B. Mesentericus, B. Thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium. 12 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 1.6: Clostridium Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng phân tử từ 20.000 – 30.000. Ổn định trong khoảng pH 6 – 12 và hoạt động trong khoảng pH rộng 7 – 12. Hình 1.7: Bacillus • Nấm Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng Aspergillus oryzae, A. Terricola, A. Fumigatus, Penicillium chysogenum, Các loại nấm mốc có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm, trung tính. Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phân protein ở pH 2,5 – 3. Một số nấm mốc khác như: A. Candidatus, P. Cameberti, P. Roqueforti cũng có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat 13 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 1.8: Nấm mốc • Xạ khuẩn Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. Fradiae, Hình 1.9: xạ khuẩn Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có những lợi ích như sau: - Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật. - Chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16 – 100 giờ nên có thể thu hoạch nhiều lần trong năm. - Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định hướng sử dụng và tăng hiệu suất thu hồi). 14 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức sản xuất. Tuy nhiên, trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc, gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp. Để sản xuất chế phẩm enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại enzyme nhất định cần thiết. II. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae 1. Quy trình thu nhận enzyme protease Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu protease thô và tinh sạch protease. Thu chế phẩm protease thô: Với nguồn động vật và thực vật thì ta nghiền , trích ly rồi ly tâm. Còn với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào rồi đem ly tâm. Tinh sạch protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần không phải protease ra khỏi thành phần protease. Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết. 15 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 2.1: Quy trình tổng quát thu nhận protease 2. Thu nhận enzyme protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae. 2.1. Tổng quan về Aspergillus oryzae a. Đặc điểm cấu tạo Aspergillus gồm hơn 185 loài khoảng 20 loài cho đến đã được báo cáo là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng cơ dụng để sản xuất thực phẩm, hóa chất và các enzyme . Trong số này, Aspergillus fumigatus là phổ biến nhất, tiếp theo là Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus clavatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus terreus, versicolor, Aspergillus oryzae - 16 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Nấm mốc Aspergillus oryzae sinh ra các enzym amylase, invertase, maltoase, protease và catalase có khả năng phân giải tinh bột, protein thành đường, acid amin. Nấm mốc Aspergillus oryzae là tác nhân chủ yếu lên men trong sản xuất nước tương theo phương pháp vi sinh vật. Trong công nghiệp người ta nhân giống nấm mốc này để sản xuất tương. Nấm Aspergillus orzae có cấu tạo đa bào thuộc loại vi hoàn khuẩn, các khuẩn ty có nhiều vách ngăn, khi khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng. Nấm Aspergillus oryzae có hình dáng là đính bào tử, màu thay đổi từ xanh vôi sang màu xanh thẩm. dưới kính hiển vi đính bào tử có dạng hình cầu có tia.  Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi nấm Aspergillus oryzae. - Protease: Ứng dụng trong công nghiệp da giày, y học, công nghiệp chế biến thức an gia súc - Amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dixtrin, malt - Cellulose: ứng dụng trong công nghiệp dệt,công nghệ giấy, xử lý ô nhiễm môi trường . b. Vai trò của giống Trong công nghệ enzyme từ vi sinh vật, giống đống vai trò quyết định đến: Năng suất của nhà máy, chất lượng sản phẩm sinh học (hay là hoạt tính của enzyme), vốn đầu tư cho sản xuất, giá thành sản phẩm, có ý nghĩa to lớn trong phát triển công nghệ vi sinh vật. c. Yêu cầu của giống Công nghệ sản xuất enzyme thuộc nhóm công nghệ lên men hiện đại và được sản xuất theo qui mô công nghiệp. Do đó, giống vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ enzyme cần có những yêu cầu và mục đích nhất định. Giống vi sinh vật phải cho ra sản phẩm mà ta mong muốn. Sản phẩm phải có số lượng và chất lượng cao.Vì trong quá 17 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang trình trao đổi chất, để chuyển hóa một lượng sinh khối khổng lồ gấp hàng ngàn lần cơ thể mình trong khoảng thời gian ngắn thì cơ thể vi sinh vật cần tổng hợp rất nhiều chất. + Giống phải cho năng suất sinh học cao + Giống phải có khả năng thích nghi nhanh và phát triển mạnh trong điều kiện sản xuất công nghiệp. + Giống vi sinh vật phải có khả năng đồng hóa các nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm tại địa phương. + Giống sử dụng trong quá trình sản xuất hiện đại phải là những vi sinh vật thuần khiết, có tốc độ sinh sản nhanh. + Tốc độ trao đổi chất mạnh để tạo nhanh các sản phẩm mong muốn, dễ dàng tách chiết, tinh sạch + Dễ dàng bảo quản và ổn định Để tạo thuận lợi lớn nhất về chủng giống vi sinh vật cung cấp cho quá trình lên men công nhiệp, ta cần tiến hành phân lập giống vi sinh vật thuần khiết. d. Phương pháp thu nhận protease từ chủng nấm mốc Asp.oryzae  Nuôi cấy bề mặt Phương pháp này rất thích hợp để nuôi cấy các loại nấm mốc do khả năng phát triển nhanh, mạnh nên ít bị tạp nhiễm. Khi nuôi nấm mốc phát triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu vào lòng môi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Người ta thường dùng cám mì, cám gạo, ngô mảnh Có chất phụ gia là trấu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều, không có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm mốc. Tỷ lệ các chất phụ gia phải đảm bảo sao cho hàm lượng tinh bột trong khối nguyên liệu không được thấp hơn 20% có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH 4)2 SO4, (NH4)2 10, phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Với phương pháp này nồng độ enzyme cao hơn nhiều lần so với dịch nuôi cấy chìm sau khi đã tách tế bào vi sinh vật.Chế phẩm dễ dàng sấy khô mà không làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng 18 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang trực tiếp nếu không cần khâu tách và làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ nuôi cấy đơn giản, có thể thực hiện quy mô gia đình. Nuôi cấy trong điều kiện vô trùng tuyệt đối và trong quá trình nuôi cấy nếu có nhiễm trùng phần nào, khu vực nào thì chỉ cần loại bỏ canh trường phần đó. Tuy nhiên, phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích nuôi lớn, chất lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều.  Nuôi cấy chìm Vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường lỏng, với có chất chủ yếu trong đa số trường hợp là tinh bột. Chỉ có một số ít giống vi sinh vật dùng nguồn cơ chất cacbon là đường glucoza, saccharoza. Phương pháp nuôi cấy bề sâu đòi hỏi phải được vô trùng tuyệt đối ở các khâu vệ sinh tổng hợp, thanh trùng môi trường dinh dưỡng, thao tác nuôi cấy, không khí cung cấp cho quá trình nuôi cấy. Các giai đoạn của quá trình nuôi cấy chìm một bước gồm: chuẩn bị môi trường nuôi cấy, nuôi cấy nấm men giống, nuôi cấy nấm mốc sản xuất. Phương pháp nuôi cấy hiện đại, dễ cơ khí hóa, tự động hóa năng suất cao, dễ tổ chức sản xuất. Có thể nuôi cấy dễ dàng các chủng vi sinh vật đột biến có khả năng sinh tổng hợp enzyme cao và lựa chọn tối ưu thành phần môi trường, các điều kiện nuôi cấy, enzyme thu được tinh khiết hơn, đảm bảo điều kiện vệ sinh vô trùng.Tuy nhiên do thu được canh trường và nồng độ enzyme thấp nên khi tách thu hồi enzyme sẽ có giá thành cao. Tốn điện năng cho khuấy trộn, nếu không bảo đảm vô trùng sẽ bị nhiễm hàng loạt, toàn bộ gây tổn thương lớn. e. Nguyên liệu sản xuất Cần phải chọn môi trường vì thành phần môi trường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của vi sinh vật. Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinh trưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme. Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượng cảm ứng. Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó hay sản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở. Chất cảm ứng tổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường thường là cơ chất tương ứng của enzyme cần tổng hợp. Thành phần chính của môi trường: C, H, ON. Ngoài ra các chất vô cơ: Mn, Ca, P, S, Fe, K và các chất vi lượng khác như. 19 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang  Nguồn cacbon Đối với Asp.oryzae: frucfoza saccroza maltoza glucoza manit arabinoza glactoza. Tinh bột là nguồn cacbon của nhiều chủng vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme protease. Chảng hạn như: vi khuẩn Bac. Subtilis có khả năng sinh tổng hợp protease ở môi trường tinh bột lớn hơn 8%. Nhiều xạ khuẩn ưa nhiệt, trong đó Micromonos pora vulgaris 42, mọc tốt và sinh tổng hợp protease cao ở môi trường có tinh bột. Tăng nồng độ tinh bột từ 0,25 – 1,5% sinh khối cũng tăng đồng thời với hiệu suất tổng hợp enzyme.  Nguồn nitơ Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt hơn cả. Các nguyên liệu đã chuẩn bị làm môi trường tự nhiên bao gồm: cám và bột hạt cốc, nước chiết ngô, dịch ép quả, rau, khô dầu, bã rượu, rỉ đường, sản phẩm phân hủy, nấm, men bia, trấu, lõi ngô. Khi lựa chọn sử dụng môi trường cần chú ý đến các chất có tác dụng điều hòa sinh tổng hợp enzyme, đặc biệt các chất cảm ứng. f. Phương pháp phân lập Vi sinh vật phân bố rất rộng trong tự nhiên, đâu đâu cũng có vi sinh vật. Ở những nơi giàu chất hữu cơ, trong không khí, trong cơ thể động vật, thực vật .Chính vì vậy mà vi sinh vật có khả năng tồn tại và phát triển ở những điều khắc nghiệt nhất. Thông thường chủng vi sinh vật để thu nhận enzyme thường có 3 cách phân lập: + Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên + Phân lập giống trong điều kiện sản xuất + Phân lập giống trong mẫu giống đã hư hỏng Tùy thuộc vào khả năng và điều kiện thực tế mà chọn cách phân lập phù hợp nhất.Mỗi cách có những ưu điểm riêng .  Phân lập giống trong điều kiện tự nhiên Ở điều kiện tự nhiên và trong điều kiện sản xuất công nghiệp thì có sự khác biệt đáng kể các giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzyme trong điều kiện tự 20 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang nhiên, được gọi là các chủng vi sinh vật hoang dại. Chúng đã quen với các điều kiện tự nhiên, khi chúng ta đưa chúng vào điều kiện sản xuất công nghiệp với điều kiện môi trường cố định đòi hỏi các loài vi sinh vật cũng có thời gian thích nghi. Huấn luyện chúng thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp là điều kiện rất cần thiết.  Phân lập giống trong điều kiện sản xuất Các giống được phân lập trong điều kiện sản xuất thường đã thích nghi với điều kiện sản xuất. Nhờ đó sau khi phân lập các giống này không qua giai đoạn huấn luyện. Các giống này đã được chọn lọc hoặc đã qua quá trình biến đổi gen và có những đặc điểm sinh hoá hơn hẳn các giống vi sinh vật hoang dại. Mật độ tế bào vi sinh vật thường rất cao, do đó khả năng thu nhận đã sinh tổng hợp cao  Phân lập giống trong điều kiện hư hỏng Các ống giống có thể bị nhiễm do quá trình bảo quản. Do bị nhiễm nhiều tế bào vi sinh vật đã bị thoái hoá nhưng cũng có nhiều tế bào không bị thoái hoá. i. Phương pháp phân lập nấm mốc Asp. oryzae Quy trình lấy mẫu: khoai tây cắt lát đem chôn xuống đất.Sau 8 ngày lấy những miếng khoai tây lên cho vào bao nilon và mang về phòng thí nghiệm. Tiến hành thí nghiệm: Mẫu khoai tây đã xay nhuyễn cho vao 90ml nước cất vô trùng và trộn đều mẫu.Lấy pipet hút 10ml từ dung dich ban đầu sang ống nghiêm khác chứa 90ml nước cất vô trùng. Tiếp tục pha loãng tới nồng độ 10-3, 10-4. - Hút 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng cho vào môi trường PDA - Dùng que trang trang đều mãu trên bề mặt thạch - Mốc sẽ sử dụng nguồn tinh bột làm cơ chất, nên sẽ xuất hiện những quầng sáng quanh khuẩn lạc - Nhận biết bằng cách bổ sung Iodine vào trong môi trường trước khi cấy. - Cấy chuyền những mớc đặc trưng vào trong môi trường Pda trong ống thạch nghiêng với 1% tinh bột cho phép mốc phát triển trong vòng 72h. - Nhân giống vi sinh vật trong bình tam giác: cho10ml nước cất vo trùng vào ống thạch nghiêng có chứa bào tử. Lắc đều cho bào tử trộn lẫn với môi trường 21 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Hút 0,1ml dung dịch cho vào bình tam giác chứa môi trường sinh trưởng của nấm. KH2PO4 1,4g MgSO4 0,1g NH4NO3 10g FeO4 0,01g KCL 0,5 Hồ tinh bột 20g pH=6,5 Sau khi nhân giống thành công có thể sử dụng ngay hoặc mang đi bảo quản, dự trữ. Để có hiệu quả cao cần lựa chon các phương pháp bảo quản thích hợp. j. Phương pháp bảo quản Khi sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzyme cần chọn giống thuần chủng đã được kiểm tra đầy đủ về các đặc tính hoá sinh, vi sinh và cần đặc biệt lưu ý đến điều kiện bảo quản giống. Thực tế khi bảo quản giống gốc trong một thời gian có thể tạo ra các biến dị ngẫu nhiên không mong muốn do đó định kỳ phải cấy chuyền và kiểm tra lại các đặc tính ban đầu.  Phương pháp cấy chuyền Đây là phương pháp phổ biến nhất dễ thực hiện bằng cách giữ giống trên môi trường thạch (thạch nghiêng, hợp petri ) với thành phần môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho giống vi sinh vật đó. Sau khi giống đã mọc tốt cần bảo quản ở nhiệt độ lạnh 3 – 4 và sau mỗi tuần phải cấy chuyền lại. Khi cấy chuyền chỉ lấy bào tử hoặc khuẩn lạc mà không chuyền các sản phẩm trao đổi chất vào môi trường mới (có thể gây biến đổi bất lợi không thể lường hết được). Nếu là xạ khuẩn thì không nên bảo quản giống trên môi trường thạch mà nên giữ trong đất để khử trùng. Để kéo thời gian bảo quản giống từ hàng tháng đến một năm, người ta phủ một lớp paraphin lỏng để tiệt trùng trên bề mặt giống để hạn chế sự phát triển của nó. Cần lưu ý chỉ phủ một lớp đầu sau khi cấy vi sinh vật đạt đến độ chín sinh lý. Phương pháp cấy chuyền rất có hiệu quả để bảơ quản các giống nấm men, vi khuẩn và rất hữu hiệu dễ dàng triển khai giống ra sản xuất lớn, hạn chế các tai biến có thể dẫn đến hư hỏng giống gốc.  Phương pháp làm khô Bằng cách giữ giống trên cát đất, silicagen trong điều kiện khô ráo (tất cả đều được khử trùng cẩn thận). Trong điều kiện như vậy sẽ hạn chế sự phát triển tiếp tục 22 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang của giống khi bảo quản. Phương pháp này rất hay được sử dụng để bảo quản nấm mốc, xạ khuẩn, một vài loại nấm men, vi khuẩn thời gian giữ giống có thể được một năm. Phương pháp làm khô cũng thực hiện đơn giản không cần dụng cụ đắt tiền. Tuy nhiên, giống như phương pháp cấy chuyền thời gian bảo quản tương đối ngắn.  Phương pháp đông khô Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu. Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không. Thiết bị động khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định. Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không. Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các nấm men, vi khuẩn và một số virut. Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng, đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật.  Phương pháp bảo quản lạnh sâu Đối với phương pháp bảo quản lạnh sâu thì vi sinh vật được bảo quản trong môi trường dịch thế và nước cần cho hoạt động sống của vi sinh vật bị bất hoạt ở nhiệt độ lạnh sâu (-1960C đến -800C). Với phương pháp này, tế bào có thể bị vỡ trong quá trình làm lạnh và làm tan mẫu. Một nguyên nhân dẫn đến làm vỡ tế bào là việc tích lũy các chất điện giải trong mẫu bảo quản và hình thành các tinh thể nước trong tế bào. Để khắc phục nhược điểm này người ta đã bổ sung các chất làm hạn chế tốc độ lạnh sâu và làm tan nhanh như glycerol, DMSO (dimethyl sulfo xide). Việc bảo quản theo phương pháp lạnh sâu này được thực hiện ở các thang nhiệt độ khác nhau như: -200C, - 300C, -400C, -700C, -400C và -1960C. Nói chung mức nhiệt cao hơn - 30 0C cho hiệu quả thấp do tế bào chịu nồng độ muối cao sinh ra từ các chất điện giải. Phương pháp bảo quản này có hiệu quả với nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn, xạ khuẩn và virut. 2.2. Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 23 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 2.2.1. Sơ đồ quy trình Môi trường Asp.oryzae Nuôi cấy Sử dụng enzyme thô Chế phẩm thô Trích ly Bã Thức ăn chăn nuôi Kết tủa enzyme Ly tâm Thu nhận kết tủa Sấy Chế phẩm Nghiền và enzyme bảo quản Hình 2.2: Quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus oryzae 24 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 2.2.2. Thuyết minh quy trình a. Môi trường Mục đích: Chuẩn bị môi trường cho nuôi cấy cho phép vi sinh vật phát triển tốt Cách tiến hành: Nguồn tinh bột như cám gạo, chứa khoảng 20% tinh bột, 10- 20% chất béo, 10–14% protein, 8 – 16% cellulose, các chất hòa tan không chứa nitơ 37– 59%.Cám không được chứa hàm lượng tinh bột dưới 20%, không có vị chua hay đắng, không hôi mùi mốc, độ ẩm không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%, có thể bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ ((NH4)2SO4, (NH4)2CO), photpho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô, nước lọc bã rượu. Các phụ phẩm thêm vào để thoáng khí cho môi trường nuôi cấy bề mặt như trấu , mùn cưa b. Nuôi cấy Mục đích: Tạo điều kiện tối ưu cho vi sinh vật phát triển và sinh enzyme Cách tiến hành: Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với chiều dài 2 -3cm, rồi được vào phòng nuôi cấy, đặt trên các giá đỡ. Các giá đỡ này được thiết kế sao cho lượng không khí được lưu thông thường xuyên. Phòng nuôi cấy phải có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm không khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 28 0C – 32oC. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến sự phát triển của sợi nấm. Trong quá trình nuôi cấy ta không cần phải điều chỉnh pH. Môi trường bán rắn là môi trường tĩnh nên sự thay đổi pH ở một vùng nào đó ít ảnh hưởng đến cả khối môi trường Thời gian nuôi sợi nấm thu nhận enzyme vào khoảng 36-60 giờ. Điều này còn phụ thuộc vào chủng mốc Asp. oryza, điều kiện môi trường cùng như kĩ thuật nuôi cấy Thiết bị: Khay nuôi cấy bề mặt 25 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 2.3. Khay nuôi cấy Thông số kĩ thuật: + Dày 4-5cm + Cao 1-1,2m Giai đoạn 1: Giai đoạn này kéo dài từ 10-14 giờ kể từ thời gian bắt đầu nuôi cấy. Ở giai đoạn này có những thay đổi sau như nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa, thành phần chất dinh dưỡng cũng bắt đầu thay đổi, khối môi trường còn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được hình thành. Trong giai đoạn này không được đưa nhiệt độ cao quá 30 0C vì thời kì đầu giống rất mẫn cảm với nhiệt độ. Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài từ 14-18 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau: Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và phát triển mạnh tạo thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ môi trường có thể tăng nhanh lên 40-50 0C, các chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme prorease được tổng hợp mạnh, lượng O 2 trong không khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải thông khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29-300C là tốt nhất. Giai đoạn 3: Giai đoạn này kéo dài từ 10-20 giờ. Trong giai đoạn này có những thay đổi như sau. Quá trình trao đổi chất yếu dần, do đó mức độ tiêu hao chất dinh dưỡng sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ giảm xuống. Do đó cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất. 26 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang c. Chế phẩm thô Mục đích: Thu được chế phẩm enzyme protease, chế phẩm này được gọi là enzyme thô vì ngoài thành phần enzyme chúng còn chứa sinh khối vi sinh vật, thành phần môi trường và nước. Cách tiến hành: Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp (Thường dùng là máy sấy chân không).Nhiệt độ sấy vào khoảng 38-40 0C ,enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60-76 0C, độ ẩm sau khi kết thúc sấy nhỏ hơn 10%. Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch. Trong những trường hợp khác ta phải tiến hành tinh sạch enzyme để bảo quan lâu hơn. d. Trích ly Mục đích: Tách enzyme ra khỏi khối môi trường. Cách tiến hành: Sau khi nghiền mịn người ta cho nước vào để trích ly enzyme. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên người ta sử dụng chúng như dung môi hòa tan. Cứ 1 phần chế phẩm thô cho 4-5 phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia súc. Thiết bị: Thiết bị trích ly kiểu thùng quay Hình 2.4. Máy trích ly Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ trích ly 250C + Thời gian 40-60 phút 27 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang e. Kết tủa enzyme Mục đích: Thu nhận dung dịch enzyme Cách tiến hành: Trong công nghiệp tinh chế enzyme người ta sử dụng cồn hoặc sunfatmon. Trong quá trình này người ta làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Cứ 1 phần dung dịch enzyme thô cho 2-2.5 phần cồn hoặc sunfat amon, cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và để trong điều kiện lạnh từ 4-7 0C trong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắng xuống, người ta thu nhận kết tủa (Độ ẩm > 70%). Người ta tiếp tục sấy kết tủa ở 400C và độ ẩm giảm xuống 5-8%. Thiết bị: Thiết bị kết tủa Hình 2.5. Thiết bị kết tủa Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ:tiến hành ở nhiệt độ phòng + Muối:amoni sunfat 80% + Thời gian: 10-18 giờ + Hoạt độ riêng: 162 IU/mg + Hiệu suất: 74% 28 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang f. Ly tâm Mục đích : Tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường Các biến đổi: Sự thay đổi về thể tích, khối lượng riêng, nhiệt độ của dung dịch, sự thay đổi hàm lượng chất khô và chất hòa tan trong 2 pha rắn-lỏng, tách huỳnh phù ra thành 2 pha rắn-lỏng Các yếu tố ảnh hưởng: Sự chênh lệch khối lượng riêng của 2 pha rắn lỏng:chênh lệch nhiều thì quá trình diễn ra dễ dàng hơn, tốc độ quay của roto: Tốc độ càng nhanh quá trình diễn ra càng tốt. Thiết bị: Thiết bị ly tâm lắng Hình 2.6. Thiết bị ly tâm lắng Thông số công nghệ: + Tốc độ quay 10000 rpm +Thời gian 10 phút + Nhiệt độ 40C + Hoạt độ riêng 80.1IU/mg + Độ tinh sạch: 1 i. Hệ thống sấy phun Mục đích: Tách nước ra khỏi dung dich mà không làm thay đổi tính chất của enzyme nhằm bảo quản lâu hơn. 29 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Các yếu tố ảnh hưởng: Nồng độ chất khô của nguyên liệu, nồng độ cao làm giảm thời gian bốc hơi, tăng độ nhớt của nguyên liệu gây khó khăn cho quá trình sấy phun. Nồng độ thấp làm tốn nhiều thời gian và năng lượng cho quá trình. Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính của enzyme để điều chỉnh nhiệt độ sấy thích hợp. Hình 2.7. Thiết bị sấy phun Thông số kĩ thuật: + Nhiệt độ: 30-3000C + Điện thế: 380V-50Hz-3 pha + Điều kiện: Chống quá nhiệt + Chế độ làm việc: Liên tục III. Ứng dụng enzyme Protease trong công nghệ sản xuất nước mắm ngắn ngày. 1. Ứng dụng enzyme protease a. Trong công nghiệp thực phẩm  Trong công nghệ chế biến thịt - Trong công nghiệp thịt, có thể dùng các chế phẩm protease để làm mềm thịt - Chế phẩm enzyme để làm mềm thịt thường là papain hay hỗn hợp của papain với protease của vi sinh vật - Tùy theo tính chất thịt mà sử dung các chế phẩm thích hợp 30 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Chất lượng các loại thịt được nâng cao - Thời gian chin của thịt rút xuống nhiều lần - Kỹ thuật làm mềm thịt không phức tạp lắm. Có thể : + Ngâm thịt trong phức hệ enzyme cần thiết ở pH, nhiệt đô, nồng độ thích hợp + Rải lên bề mặt thịt chất làm mềm dạng bột có chứa enzyme và chất phụ gia + Tiêm dung dịch enzyme vào mô + Đưa dung dịch enzyme vào máu động vật trước khi giết thịt  Trong công nghệ chế biến sữa - Protease có khả năng làm đông tụ sữa - Tính chất này từ lâu được ứng dụng vào công nghiệp thực phẩm - Ứng dụng chính : sản xuất phomát - Rennin đóng vai trò quan trọng nhất trong công nghệ này - Người ta đang cố gắng tìm chủng vi sinh vật có tính chất tương tự hay thay thế một phần rennin  Trong công nghệ sản xuất nước chấm - Sử dụng enzym từ các nguồn tự nhiên: + Động vật: trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phân protease như: pepsin, tripsin, cathepsin. + Thực vật: có một vài loại thực vật cũng có enzym protease như trong đu đủ có enzym papain, khóm có enzym bromelin + Vi sinh vật: trong quá trình hoạt động sống nhiều hệ enzym sinh ra từ nấm mốc Aspergillus oryzae, Asp. niger. - Phương pháp sử dụng + Sử dụng dưới dạng thô: cho các nguyên liệu có enzym đó vào chượp với tỉ lệ nhất định. 31 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang + Sử dụng dưới dạng chiết xuất: chiết enzym từ các nguyên liệu trên thành dạng tinh chế sau đó cho vào trong chượp  Trong công nghiệp sản xuất bia rượu - Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế - Giảm thời gian lên men - Hiệu suất thu hồi tăng - Bia, rượu thành phẩm đạt các chỉ tiêu quy định tốt hơn khoảng 30% - Nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm chi phí sản xuất.  Trong công ngiệp sản xuất bánh mỳ bánh quy: Protease làm giảm thời gian đảo trộn , tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột , tạo độ xốp và nở tốt hơn. b. Trong công nghiệp thuộc da - Chất quan trọng nhất của da là collagen, dưới tác dụng của protease, các chất nhờn tách ra, một số liên kết sơi collagen bị phá hủy. Kết quả là da thu được có độ mềm nhất định. - Trước đây, thường dùng các protease thu từ đường tiêu hóa động vật, ngày nay hiệu quả hơn cả là các enzyme thu từ vi khuẩn và nấm mốc - Rút ngắn thời gian làm mềm, tách long xuống nhiều lần, chất lượng tốt hơn, số lượng lông thu được nhiều hơn, không cần xử lý them - Người ta có thể ngâm nguyên liệu da trong dung dịch enzyme hoặc phết hồ enzyme lên bề mặt c. Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa - Công dụng của proteaza là phân hủy vết bẩn dạng protein trên vải. - Tên thương mại: Savinase và Relase. - Proteaza có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa, nước rau, đậu, nước xốt thức ăn, và chỉ có hoạt tính trong dung dịch giặt. - Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất tẩy rửa: 32 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang + Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy. + Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh + Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp. + Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao. + Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có thể phân hủy sinh học. + Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại. d. Trong sản xuất tơ tằm - Quá trình làm sạch tơ sợi tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn - Sợi sau khi kéo kén thường có khoảng 30% xerixin. Muốn tách xerixin phải nấu trong dung dịch xà phòng. Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa. - Để tách lượng xerixin còn lại người ta thường dùng chế phẩm protease từ nấm mốc, vi khuẩn e. Trong sản xuất hương phẩm, mỹ phẩm - Hiện nay, một số nước sản xuất những loại kem chứa enzyme để xoa mặt, xoa tay, cạo râu - Dưới tác dụng của protease trong kem, các biểu bì da đã chết tách ra, da non và mới sẽ xuất hiện trên bề mặt, sự phát triển của lông, tóc, chậm lại f. Trong y học - Trong công nghiệp y học, protease cũng được sử dụng để sản xuất các môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein dùng trong nuôi cấy vi khuẩn và các vi sinh vật khác - Dùng các chế phẩm protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc, vì peotease sẽ tiêu hủy các protein đệm mà không gây ảnh hưởng đến chất kháng độc - Ứng dụng chữa một số bệnh về đường tiêu hóa 2. Ứng dụng protease trong sản xuất nước mắm ngắn ngày 2.1 Giới thiệu 33 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Nước mắm là dung dịch đạm mà chủ yếu là các acid amin, được tạo thành do quá trình thủy phân protein cá nhờ hệ enzym protease có trong cá và ruột cá làm cho nước mắm có mùi vị đặc trưng. Để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm, người ta sử dụng enzyme từ bên ngoài đưa vào để tăng quá trình thủy phân protein nhằm rút thời gian sản xuất nước mắm từ 6 tháng đến một năm xuống còn 30 đến 60 ngày. Tuy nhiên phương pháp này còn hạn chế vì chưa đáp ứng được mùi vị của nước mắm Có thể sử dụng enzyme dạng thô, dạng tinh hoặc bán tinh chế để cho vào chượp, thông thường thường sử dụng enzyme protease từ chủng nấm mốc Asp.Oryaze để bổ sung vào nước mắm ngắn ngày. Bản chất của quy trình sản xuất nước mắm là: Ủ Cá + muối nước mắm. Bản chất của quá trình này chính là quá trình thủy phân protein trong cá nhờ hệ Enzyme protease pepton polypeptid peptid acid amin 2.2 Phân loại nước mắm  Đặc biệt: độ đạm >300N Nước mắm đặc biệt hay còn gọi là nước mắm nhỉ vì được kéo chảy nhỏ giọt đến thật nhỏ, nhỉ từng giọt, có màu nâu cánh gián, có mùi thơm nồng, vị ngọt dịu đậm, độ đạm cao 30g/lit, càm đểlâu càng ngon.  Thượng hạng: độ đạm >250N Nước mắm thượng hạn hay còn gọi là nước mắm cốt cóa màu vàng rơm đến cánh gián, hương thơm, vị ngọt dịu đậm, đọ đạm cao 25g/lit, càng để lâu càng thơm ngon và có màu nâu đen lại, làm gia vị cho thức ăn.  Hạng 1: độ đạm > 150N Do nước kéo qua chượp đã rút 90% nước cốt, hàm lượng đạm 15g/lít, dung làm nước mắm chấm.  Hạng 2: độ đạm >100N Do nước kéo qua bã chượp đã rút hết 90% laoij 1, hàm lượng đmạ 10g/lít, dung để nấu nếm thức ăn. 34 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang  Hạng 3: độ đạm <100N Do nước mắm kéo qua bã chượp đã rút 90% loại 2, hàm lượng đạm thấp, dung làm nước mắm chượp cho mùa nước mắm sau. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm.  Các chất đạm: Chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm, gồm 3 loại đạm: + Đạm tổng số: là tổng lượng nitơ có trong nước mắm (g/l), quyết định phân hạng nước mắm. + Đạm amin: là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/l), quyết định giá trị dunh dưỡng của nước mắm. + Đạm amon: càng nhiều nước mắm càng kém chất lượng. Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế: valin, leucin,methionin, isoleucin, pheylalanin, alanin các phần trung gian này làm cho nước mắm dễ bị hư hỏng do hoạt đọng của vi sinh vật, thành phần dinh dưỡng của nước mắm phụ thuộc vào nguyên liệu mang đi chế biến.  Các chất bay hơi: - Rất phức tạp và quyết định đến hương vị của nước mắm. - Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm . - Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm mg/100g nước mắm: + Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde) + Các acid bay hơi : 104-533 (propionic) + Các acid amin bay hơi : 9,5- 11,3 (izopropylamin) + Các chất trung tính bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde) - Mùi trong nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của vi sinh vật yếm khí trong quá trình sản xuất nước mắm tạo ra.  Các chất khác Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250-280g/l và một số chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br. Vitamin : B1 ,B12 , PP. Bảng thành phần các chất vô cơ 35 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang P (g/l) 0.266 – 0.566 Ca (g/l) 0.439 – 0.541 Mg (g/l) 2.208 – 2.310 S (g/l) 0.546 – 1.163 I (mg/l) 5.08 – 7.62 Br (mg/l) 68.80 – 97.50 Bảng hàm lượng vitamin trong nước mắm Vitamin Vitamin Vitamin Vitamin B1(mg) B2 (mg) B12 (mg) PP (mg) 7 8.7 3.3 4.4 2.3. Các hệ enzyme trong sản xuất nước mắm a. Hệ enzyme Metalo-protease Hệ enzyme này tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme có hoạt tính khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid. Đây là nhóm enzyme thủy phân trung tính pH tối thích từ 5-7, pI từ 4-5, nó ổn định với ion Mg2+, Ca2+ và mất hoạt tính với Zn2+, Ni2+, Pb2+, Hg2+. b. Hệ enzyme serin-protease Điển hình là enzyme tripsin tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Hệ enzyme luôn bị ức chế bởi chuỗi acid amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B. Nhưng nó lại dễ bị ức chế bởi nồng độ muối cao.Vì vậy để men cathepsin B hoạt động nguời ta thực hiện cho muối nhiều lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 5-10, mạnh nhất ở pH= 9. c. Hệ enzyme acid-protease Có trong thịt và nội tạng cá điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme bị ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường tồn tại trong một thời gian ngắn ở thời kì đầu của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trò thiết yếu trong sản xuất nước mắm. 36 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 2.4. Vi sinh vật trong sản xuất nước mắm Nguồn gốc: + Có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, môi trường ( nước, không khí ) + Bổ sung hệ enzyme protease được sản xuất từ vi khuẩn Asp.oryzae + Ngày nay với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học nói chung và ngành công nghệ sản xuất chế phẩm enzyme nói riêng thì người ta thường sử dụng phương pháp bằng sinh vật bằng cách cho thêm một ít chế phẩm enzyme vào nguyên liệu trong quá trình ủ chượp sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân và rút ngắn thời gian sản xuất từ 6 – 12 tháng xuống còn 15 – 30 ngày. Tuy nhiên phương pháp này cũng có những nhược điểm lớn như không có hương vị thời gian sản xuất ngắn, bị chua do tinh bột lên men lactic hoặc do sinh ra acid dễ bay hơi khi cá bị ươn, đắng do xác vi sinh vật còn tồn tại hoặc do chất lượng của muối kém có nhiều ion Ca2+, Mg2+. Và một điều cần lưu ý khi cho thêm vào nguyên liệu một lượng enzyme thì đảm bảo môi trường không ức chế sự hoạt động của enzyme cho vào hoặc cấy vào một lượng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp protease cao thì vi khuẩn đó phải chống chịu được với điều kiện bất lợi trong quá trình ủ chượp. 2.5. Nguồn nguyên liệu Nguyên liệu chính dùng để chế biến nước mắm là các loại cá và muối ăn. Bất cứ loại cá nào cũng có thể sử dụng làm nước mắm. Ngoài ra tùy theo tập quán sản xuất và thị hiếu tiêu dùng của từng đại phương , người ta thêm các phụ kiện như: thính gạo, thính ngô, thính vừng, mắm ruốc, ớt, riềng 2.5.1 Cá a. Giới thiệu và phân loại Nước mắm có thể được làm từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau nhưng đặc trưng nhất vẫn là sản phẩm nước mắm từ cá. Việc lựa cá trong sản xuất có ý nghĩa hết sức quan trọng quyết định đến chất lượng sản phẩm sau này. Cơ thể cá gồm nhiều phần, gồm: đầu cá, xương da, vây, vảy, thịt cá, nội tạng. Sản xuât nước mắm chỉ phân hủy phần thịt cá còn xương vây, vảy hầu như không bị thủy phân. 37 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Bảng: Thành phần khối lượng một số loài cá Thịt Đầu Xương Vây Nội STT Tên cá cá(%) cá(%) cá(%) vảy(%) tạng(%) 1 Nhồng 65,2 19,4 8,36 1,67 4 2 Mòi 51,9 17,3 13,5 4,1 10,5 3 Nục sồ 55,8 22,9 10,08 3,82 5,6 Phần hai 4 49,4 22,3 13,9 9,65 5,00 sọc Mối 5 53,1 19,1 10,7 5,67 9,70 thường Có nhiều yếu tố để phân loại cá:  Phân loại theo đạm (protid) - Dựa vào hàm lượng nitơ của cá và thời gian chế biến, người ta chia thành cá loại sau: + Cá có độ đạm cao: >300N (>= 20% protid) như: cá cơm Kiên Giang, cá ve, cá nục + Cá có độ đạm thấp:<30 0N (<=18,5% protid) như: cá cơm Duyên Hải, cá linh non,cá bò  Phân loại theo chất béo (lipid) - Dựa vào lượng mỡ hay dầu trong cá ,mà người ta chia cá thành các loại cá sau: + Cá ít mỡ: nhỏ hơn 4% lipid ở hầu hết các loại cá nước mắm kể cả cá linh non. + Cá có mỡ vừa: 4-8% lipid như: cá linh, cá trích + Cá có lượng mỡ nhiều lớn hơn 15% lipid: đa số là cá nước ngọt, nước lợ như cá basa, cá tra Biển Hồ  Phân loại theo tập tính sống - Cá sinh sống ở tầng nổi và tầng lơ lửng( cá ăn nổi) gồm cá cơm, ca trích, cá lầm, cá mòi, các nục - Cá sinh sống ở tầng đáy và tần lơ lửng (cá ăn đáy gồm cá liệt thịt, cá xô tạp, cá bò  Phân loại theo giá trị sử dụng làm nước mắm - Cá nhóm I: :gồm cá cơm Kiêng Giang (than,sọc tiêu), ve, trích, vừa có đọ đạm cao, vừa cho sản phẩm đặc trưng chất lượng cao. Cá nhóm I thường được sử 38 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang dụng lâu dài trong quá trình chế biến đẻ tạo ra sản phẩm có hương vị đặc trưng, ngoài ra còn được dung đẻ tạo hương cho loài cá không có hương hoặc ít hương( hương không tốt). - Cá nhóm II: gồm cá sơn, cá nục, cá cơm Duyên Hải chủ yếu là cá linh, sử dụng khử mùi cho các giống cá tạp, một phần dung tạo hương riêng biệt cho một số loại sản phẩm. Cá nhóm II thường được sủ dụng lâu dài trong qua strinhf sản xuất, đặc biệt là cá linh được sử dụng lâu dài từ 12-24 tháng. - Cá nhóm III: gồm cá xô tạp, cá liệt thịt, cá bò, cá liệt Đồng Tháp, chủ yếu dung đẻ lấy đạm để làm nền cho sản phẩm. Loại này được sử dụng triệt để với thời gian sử dụng tương đối ngắn 4-6 tháng. b. Thành phần hóa học của cá - Thành phần hóa học của cá khác nhau rất nhiều tùy từng loài, từng cá cụ thể, phụ thuộc vào tuổi giống, môi trường sống và mùa vụ. - Sự biến đổi thành phần của cá có liên quan mật thiết với thức ăn mà chúng ăn, với sự di cư và biến đổi sinh dục liên quan đến sự sinh sản. Bảng: thành phần hóa học chính của cá Thành phần Nước Protein Lipid Muối vô cơ Chỉ tiêu Thịt cá 48-85.1 10.3 - 24,4 0.1 - 5.4 0.5 -5.6 Trứng cá 60-70 20 – 30 1 - 11 1 – 2 Gan cá 40-75 8 - 18 3 - 5 0.5 – 1.5 Da cá 60-70 7 - 15 5 - 10 1 - 3 Sự khác nhau về thành phần hoá học của cá và sự biến đổi của chúng có ảnh hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm, việc bảo quản tươi nguyên liệu và quy trình chế biến. 39 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Bảng: Thành phần hoá học của cá nước ngọt: Thành phần hoá học (% S khối lượng) Nước Protide Lipide STT Tên loại cá 1 Cá diếc 85 13,0 1,1 1 2 Cá chép 79 18,1 1,5 2 3 Trắm đen 77 17,9 3,8 3 4 Mè đen 82 14,5 0,6 4 5 Mè trắng 86 10,0 1,0 5 6 Lòng canh 76 15,6 2,3 6 Bảng: Thành phần hoá học cá biển: Thành phần hoá S học (% khối lượng) Nước Protide Lipide STT Tên cá 1 Nục sổ 76,80 21,75 0,85 1 2 Mối thường 77,50 19,26 1,80 2 3 Trích 75,90 21,76 3,15 3 4 Phèn hai sọc 76,20 20,35 2,20 4 5 Lương ngắn 79,30 19,03 1,21 5 6 Cơm 75,14 11,25 2,10 6 7 Mòi 76,60 9,37 14,40 7 8 Lẹp 81,84 10.00 1,40 8 40 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang c. Yếu tố ảnh hưởng rõ nhất đến thành phần hoá học của cá là thành phần thức ăn  Phế liệu trong ngành chế biến thủy sản - Đầu cá, da, xương, vây, vảy Trong thành phần của loại phế liệu này chứa collagen là thành phần có thể sản xuất của sản phẩm khác nhau, phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Ngoài ra chúng còn chứa các thành phần có giá trị khác nhau, phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, Ngoài ra chúng còn chứa các thành phần có giá trị tận dụng khác như : protein dễ tan, chất béo, chất khoáng Hiện nay người ta tận dụng collagen trong da, xương, vây cá để sản xuất gelatin, nấu keo, thuộc da - Máu . Thành phần chủ yếu của máu cá là H 2O ( khoảng 8,5%) còn lại là protein và các chất khoáng, trong đó thành phần có giá trị tận dụng nhất là protein. Từ đây người ta có thể sảm xuất bột máu dung làm thức ăn gia súc, chất nhuộm màu gần đây cũng có một số nghiên cứu sản xuất protein từ máu cá để làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ sinh học và thực phẩm. Bên cạnh những loại trên, thịt vụn cũng là một loại phế liệu của quy trình sản xuất. Đây là phế liệu của quá trình xử lý sơ bộ thịt cá, fillet chiếm 10% khối lượng của cá nguyên liệu. Tính riêng tại công ty Agifish An Giang, mỗi ngày có khoảng 200 tấn cá nguyên liệu được chế biến tương ứng sẽ có khoảng 20 tấn phế liệu thịt vun bị thải ra. Con số này chác chắn còn lớn hơn gấp nhiều lần nếu tính trên tổng số nguyên liệu đưa vào chế biến mỗi ngày của tất cả các nhà máy chế biến cá da trơn. 2.5.2 Muối a. Sơ lược về muối - Muối trong tự nhiên gồm các mỏ, muối giếng, muối ở đáy hồ nước mặn và muối bể. Tùy theo phẩm chất và công dụng mỗi loại muối người ta chia ra: muối ăn, muối công nghiệp, muối làm phân. Muối dung đẻ ướp cá thuộc các loại muối ăn và do ở gần biển nên thường chỉ dung bể để ướp cá. - Muối là nguyên liệu quan trọng cho quá trình sản xuất nước mắm, thiếu muối nước mắm không hình thành được. - Yêu cầu muối trong sản xuất nước mắm phải là muối ăn, càng tinh khiết càng tốt, kết tinh hạt nhỏ, có độ rắn cao, mùa trắng óng ánh(không vón cục, ẩm ướt, vị đắng chat) 41 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Đối với muối ăn yêu cầu có độ tinh khiết cao tức là: + Hàm lượng: NaCl >90% + Hàm lượng:Mg++ ≤ 0,1% + Hàm lượng: Ca++ ≤ 0,6% + Hàm lượng cát sạn ≤ 0,5% + Hàm lượng K+ ≤ 0,1% b. Thành phần muối - Thành phần của muối chủ yêú là NaCl, ngoài ra ít nhiều đều có tạp chất. Những tạp chất có thể chia làm hai loại: + Những chất không có hoạt tính hóa học như nước và các chất không hòa tan như sỏi, cát.vv. + Những chất có hoạt tính hóa học như: hợp chất Clor của Ca 2+ , Mg2+, Fe2+, Fe3+, và muối của gốc sulfat. - Muối ăn kết tinh là chất kết tinh, không màu, khối lượng riêng d = 2,161, điểm nóng chảy: 8030C, điểm sôi 14390C. - Muối ăn có màu trắng, tan trong nước, glycerin, hơi tan trong cồn, dễ hút ẩm, có vị mặn. - Lượng nước trong muối luôn thay đổi. Nếu trong không khí có dộ ẩm trên 75% muối sẽ hút nhiều nước. Nếu độ ẩm dươi 75% thì muối sẽ khô rất nhanh. Ngoài ra lượng nước trong muối còn phụ thuộc vào độ to nhỏ của hạt muối, hạt muối to có hàm lượng nước ít hơn hạt muối có tinh thể nhỏ. c. Ảnh hưởng của muối đến quá trình lên men cá.  Tác dụng phòng thối của muối ăn - Muối ăn thẩm thấu vào nguyên liệu làm cho nước thoat ra, vi khuẩn thiếu nước không thể phát triển được. - NaCl khi hòa tan sẽ cho ra ion Cl -, Cl- kết hợp với protide ở liên kết peptide làm cho men phân hủy của vi sinh vật không còn khả năng phá vỡ protide để lấy chất dinh dưỡng để sinh sống. - Nồng độ muối càng lớn thì áp suất thẩm thấu càng mạnh, vì vậy có thể làm rách màng tế bào vi khuẩn, gây cho chúng sát thương. - Do có muối nên oxy ít hòa tan trong môi trường ướp muối. Vì vậy nhóm vi sinh vật hiếu khí không có điều kiện phát triển. Ngoài ra trong môi trường nước 42 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang muối, quá trình tự phân giải bị kềm chế, sản phẩm phân giải sinh ra ít do đó làm cho vi khuẩn phát triển chậm. Nồng độ nước muối từ 4,4% trở lên có thể làm ngừng phát triển của vi khuẩn gây bệnh và nói chung nồng độ nước muối đạt tới 10% thì có thể kiềm chế được sự phát triển của vi khuẩn thông thường. Tuy vậy, không phải là giới hạn tuyệt đối vì các loại vi khuẩn khác nhau thì có khả năng chịu muối khác nhau. Thông thường, loại cầu khuẩn chịu muối mạnh hơn loại trực khuẩn, trong họ trực khuẩn thì loại không gây bệnh chịu muối mạnh hơn loại trực khuẩn. Nấm men, nấm mốc có khả năng cịu muối tương đối tốt. Giới hạn phát triển của khuẩn lên men ở nồng độ muối 15% và của khuẩn mốc 20-30%.  ảnh hưởng của thành phần khác trong muối ăn - trong muối ăn còn có các muối khác như CaCl2 , MgCl2 Các muối này đều làm trở ngại tốc độ thẩm thấu của NaCl vào cơ thể cá, vì độ hòa tan của chúng lớn hơn. Ngoài ra, còn làm cho máu sắc, mùi vị và độ vững chắc của sản phẩm kém đi.  Tính thẩm thấu và khuyếch tán - Do tính hút nước của muối nên ướp cá với muối, nước trong cá thoát ra làm tan muối( gọi là quá trinh khuyếch tán). Song song quá trình muối thấm vào cá( gọi là thẩm thấu). Sau cùng nước cá không thoát ra nữa nhưng muối trong dung dịch muối cá( nước bổi) vẫn tiếp tục ngấm vào cơ thể cá cho đến khi bão hòa muối. Độ bão hòa muối ở cá thường thấp hơn nước bổi. cá càng tươi thì tốc độ thấm muối càng nhanh và càng nhiều. 2.5.3 Nguyên liệu phụ. Thính : ở Nghệ An thanh hoá hay dùng thính, thính có tác dụng làm cho nước mắm có màu đỏ đẹp và tăng mùi thơm, át mùi tanh của cá. Có nhiều loại thính như: thính gại tẻ, thính gạo nếp, thính vừng, thính ngô . Nước hàng: từ Nghệ An trở vào người ta hay cho thêm nước hàng vào để làm cho nước mắm ngọt dịu, ngọt giọng, nước sánh, màu vàng đẹp. Cách làm nước hàng: đun mật hoặc đường đến độ ngả màu cánh dán hoặc thử vào nước lã thấy đông cục, cắn giòn là được. Sau đó cho thêm nước, chượp xấu hoặc bã chượp vào tỉ lệ là 2kg mật, 1kg mắm tôm. 1 kg chượp hoặc bã và 6 lít nước là dược. Dùng vảy phim trắng lọc lấy nước hàng để pha chế vào nước mắm. Nước màu: ở miền Nam người ta sử dụng nước màu để làm nước mắm được dịu ngọt, màu vàng đẹp. 43 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Ớt, riềng: ở Quảng Bình người ta cho thêm ớt, riềng khô vào trong khi muối cá để cho nước mắm sau này có vị cay, ít mùi tanh. Quă thơm: ở Phú Quốc Phan Thiết, Cần Thơ người ta hay dung mít chín hoặc dứa chín thêm vào khi muối cá để làm cho nước mắm sau này cí vị ngột, hương thơm. Mắm ruốc, ruột cá: khi cho mắm ruốc, ruột cá (đã chín ngấu thì càng tốt) vào chượp tì sẽ mau chín, làm tăng mùi thơm đặc trưng của nước mắm cao đạm. 44 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 2.6. Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày Nguyên liệu (Cá) Rửa Tạp chất Xử lý (cơ, nhiệt) Muối Lên men Protease từ A.oryaze Lọc Nước Cô đặc Bã Chượp có hương tốt Bổ sung hương Chai vô Đóng chai trùng Sản phẩm 45 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 3.1: Quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày 2.7. Giải thích quy trình. 2.7.1. Rửa: a. Mục đích: chuẩn bị Quá trình rửa sẽ làm sạch và loại trừ các tạp chất cơ học như đất, cát, bụi và làm giảm lượng VSV. b. Các biến đổi của nguyên liệu: Sinh học: giảm lượng VSV Vật lý: Loại tạp chất như cát đất bụi bám lên bề mặt con cá Các biến đổi khác không đáng kể. c Thiết bị: Sử dụng thiết bị ngâm rửa xối tưới , dạng băng tải, có thể sử dụng rửa cá, ốc  Cấu tạo : - Máy được cấu tạo gồm một băng tải bằng thép không rỉ và thùng chứa nước rửa có thể tích tương đối lớn. Băng tải được chia làm 3 phần, phần nằm ngang ngập trong nước, phần nghiêng có các ống phun nước mạnh và một phần nằm ngang ở phía cao. Bên dưới băng tải phần ngập trong nước có bố trí các ống thổi khí nhận không khí từ một quạt đặt bên ngoài.  Hoạt động : - Trong giai đoạn ngâm, nguyên liệu ở trên phần băng nằm ngang ngập trong nước, các cặn bẩn bám trên ngoài bề mặt nguyên liệu bị bong ra. Băng tải di chuyển sẽ mang nguyên liệu đi dần về phía phần băng nghiêng. Hiệu quả của quá trình ngâm được tăng cường nhờ thổi khí làm xáo trộn nước và nguyên liệu trên mặt băng, làm tăng diện tích tiếp xúc của nguyên liệu và nước nên thời gian ngâm được rút ngắn. Khi nguyên liệu di chuyển đến phần nghiêng của băng, các vòi phun nước với áp suất cao đến 2-3 at sẽ rửa sạch cặn bẩn. Ở cuối quá trình rửa, nguyên liệu di chuyển đến phần nằm ngang phía trên để được làm ráo nước. - Tùy thuộc loại nguyên liệu và mức độ bẩn, có thể điều chỉnh tốc độ di chuyển của băng chuyền cho phù hợp. Nếu nguyên liệu quá bẩn, cho băng chuyền đi chậm lại, làm tăng thời gian rửa. Ngược lại, nếu cặn bẩn bám trên ngoài nguyên liệu ít, có thể cho băng chuyền đi nhanh hơn nhằm tăng năng suất quá trình. Nước sạch từ vòi phun vào thùng ngâm sẽ bổ sung nước cho hệ thống, còn cặn bẩn được tháo ra liên tục qua van xả và nước thừa theo máng chảy tràn ra ngoài. 46 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Hình 3.2: Máy rửa băng chuyền 2.7.2. Xử lý  Mục đích - Xử lý cơ : xay nhỏ giúp tăng diện tích tiếp xúc giữa cá với nấm mốc - Xử lý nhiệt: đối với nguyên liệu là đầu cá,xương, do tính chất cơ cứng nên cần xử lý sơ bộ nhằm làm mềm biến tính một phần protein  Cách tiến hành - Sau quá trình rửa tách tạp chất, nguyên liệu sẽ được đưa vào thiết bị xay cắt cá nhằm làm giảm kích thước cá trước khi phối trộn với muối. 2.7.3. Lên men: a. Mục đích: chế biến,bảo quản. - Chế biến: Thủy phân protein thành các acid amin nhờ hệ enzyme trong bản thân nguyên liệu cá và chế phẩm enzyme protease bổ sung để rút ngắn thời gian lên men. - Bảo quản:dưới tác động cuả muối làm ức chế VSV gây thối , kéo dài thời gian bảo quản sản phẩm b. Cách tiến hành phối trộn: Cá sau khi xử lý nguyên liệu xong, được băng tải vận chuyển đến thiết bị phối trộn. Lúc này ta cho lượng enzyme protease vào đến lượng cần thiết, rồi để yên trong 30 phút. Quá trình phối trộn này giúp tăng diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và cá hơn, thúc đẩy quá trình thủy phân protein cá nhanh hơn. Sau đó trộn hỗn hợp khác theo từng bước trong khi lên men. 47 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang c. Các biến đổi của nguyên liệu:  Vật lý: - Nồng độ muối trong cá tăng lên. Do sự dịch chuyển của các tiểu phần muối vào trong cá và sự khuếch tán của nước vào trong thịt cá. - Trong quá trình thủy phân một số tính chất vật lý của mẫu thủy phân sẽ bị thay đổi: nhiệt độ tăng, thể tích khối chượp thay đổi, tỷ trọng khối chượp cũng thay đổi, thay đổi về màu sắc : - Sự biến đổi về màu sắc là do 2 nguyên nhân: + Do sắc tố trong nguyên liệu tạo nên. + Do phản ứng của các acid amin gây nên như phản ứng tạo melanoidin, phản ứng oxy hóa tạo màu sẫm cho sản phẩm.  Hóa lý: - Quá trình thủy phân cũng làm nên một số biến đổi về pha, như từ thịt cá rắn chuyển thành dạng huyền phù. Khi quá trình lên men kết thúc ta thu được khối chượp là dạng huyền phù.  Hóa học - Trong quá trình chế biến nước mắm hàm lượng protein trong cá giảm xuống theo thời gian còn hàm lượng acid amin, peptide và các đạm bay hơi khác trong nước chượp đều tăng lên rõ rệt. - Trong quá trình chế biến nước mắm có hiện tượng sinh tổng hợp một số acid amin của vi sinh vật trong chượp. Một số acid amin có chiều hướng tăng lên nhưng cũng có một số acid amin có chiều hướng giảm đi. Nguyên nhân có thể do chúng tham gia vào các phản ứng melanoidin, polyphenolamin, oxy hóa còn khi bị phân hủy thành các sản vật thối rữa nên hàm lượng giảm đi khá nhiều.  Hóa sinh: - Do tác dụng của hệ enzyme protease tác động vào thủy phân protein thịt cá qua các dạng trung gian như peptone, polypeptide, peptide và cuối cùng là acid amin. Protein Peptone Polypeptid Peptid acid amin - Vi sinh vật gây thối thì có tác dụng làm rữa nát thịt cá có khi ở ngay giai đoạn đầu hay trong quá trình chế biến, hoặc nếu không khống chế kịp thời sau khi tạo thành nước mắm cũng dễ bị thối do vi sinh vật gây nên. - Quá trình phân giải thịt cá chuyển từ protein đến acid amin là một quá 48 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang trình rất phức tạp với sự tham gia của rất nhiều enzyme. Mỗi enzyme có tính đặc hiệu riêng đối với cơ chất hay vị trí tác dụng. Ví dụ như peptidase chỉ tác dụng lên mỗi liên kết peptide để thủy phân mối liên kết này. nước , peptidase -CO-NH- -COOH + -NH2  Sinh học: - Biến đổi quan trọng là sự trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật - Do nồng độ muối cao vi khuẩn gây thối hầu như ngừng hoạt động và các vi khuẩn khác cũng bị ức chế cao độ. - Mặt khác một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp acid amin nên có một số acid amin tăng lên trong quá trình chế biến: acid glutamic, alanin, serin, prolin, cystin, cystein d. Thiết bị: Nồi hai vỏ có áo điều nhiệt có cánh khuấy. Hình 3.3 : Thiết bị lên men Cấu tạo: - Nồi hai vỏ có áo nhiệt để nâng nhiệt độ khối chượp luôn đạt 45 0C ± 20 C và giữ nhiệt độ trong quá trình thủy phân . Dùng nồi dung tích 500 – 1000l. - Thiết bị hình trụ , nắp và đáy elipse được gắn vào thân nhờ 2 mối ghép bích . Mặt trong thiết bị có lớp cao su chịu acid, chịu áp lực cao. Trên thân thiết bị có ống dẩn hơi trực tiếp vào dịch thủy phân . Trên nắp thiết bị có cửa nhập nhập liệu và đáy thiết bị có cửa tháo liệu . Bên thành thiết bị còn có cửa để dễ dàng vệ sinh và sửa chữa thiết bị . 49 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang e. Thông số công nghệ : + Chế phẩm enzyme : 3 – 5 % so với cá + Nước : 4 – 6% so với cá + Thời gian : 10 – 20 ngày + Nhiệt độ: Nhiệt độ tối thích cho enzyme hoạt động là từ 30 - 47 0C. Nhiệt độ càng cao quá trình phân giải thịt cá càng nhanh. Nhiệt độ 70 0C trở lên hầu hết các hệ enzyme trong cá mất hoạt tính. Trong quá trình thủy phân tiến hành nâng nhiệt lên từ từ lên 50- 550C, nhiệt độ này có tác dụng ức chế sự hoạt động của vi khuẩn gây thối vì lượng muối cho vào lúc đầu rất hạn chế. Chú ý nhiệt không quá 60 0C . Sau đó khuấy đảo, khi lượng muối cho vào nhiều hơn thì tiến hành hạ nhiệt và giữ nhiệt độ ở 450C. - PH: Enzyme rất nhạy cảm với độ pH của môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh ở độ pH xác định. Trong quá trình phân giải có rất nhiều enzyme tham gia cho nên ta phải xem loại enzyme nào có nhiều nhất và đóng vai trò chủ yếu trong quá trình thủy phân để tạo môi trường thích hợp cho nó hoạt động.  Enzyme protease trong bản thân nguyên liệu:  Pepsin và tripsin là 2 enzyme chủ yếu. Pepsin hoạt động tốt ở môi trường acid có pH = 1.5 - 2.2 . Môi trường muối mặn cũng như môi trường có muối MgSO4, NH4Cl môi trường kiềm ức chế sự hoạt động của enzyme này. Tripsin giữ vai trò quan trọng nhất hoạt động mạnh ở môi trường pH = 8-9, nồng độ muối NaCl cao tripsin cũng hoạt động được. Enzyme tripsin phát triển tốt khi gặp môi trường có chất keo như albumin, peptone, gelatin ở nhiệt độ thích hợp. Do đó trong quá trình chế biến cần phải tạo điều kiện tốt cho enzyme này phát triển mạnh ở giai đoạn đầu. Trong điều kiện tự nhiên thì tripsin hoạt động mạnh ở giai đoạn giữa của quá trình chế biến. Chượp chế biến bằng phương pháp tự nhiên có môi trường pH = 5.5-6.5. Khi dùng hóa chất acid hay bazơ để điều chỉnh pH môi trường thì thấy chất lượng nước mắm không bằng so với chế biến chượp tự nhiên. Qua thí nghiệm đã phát hiện được nếu điều chỉnh pH=1.5-2 thấy màu sắc của chượp đẹp nhưng tốc độ thủy phân chậm và mùi vị so với chượp chế biến bằng phương pháp tự nhiên thì kém hơn. Còn nếu giữ pH=7.5-8.5 (thích hợp cho enzyme tripsin hoạt động) thấy tốc độ thủy phân nhanh hơn nhưng đạm thối nhiều hơn và màu sắc không bằng so với chượp chế biến bằng phương 50 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang pháp tự nhiên. Ở môi trường tự nhiên pH = 5.5- 6.5 tuy không ưu tiên phát triển loại enzyme nào, nhưng cả hai loại enzyme chính là pepsin và tripsin đều phát triển được. Mặt khác lại có tác dụng ức chế một phần sự hoạt động của vi sinh vật. Enzyme protease trong nấm mốc: hoạt động tốt nhất ở pH= 7 Vậy pH tự nhiên của môi trường là thích hợp cho các enzyme trong cá và vi sinh vật hoạt động. - Muối : Lượng muối cho vào cá chia làm nhiều lần. Lúc đầu cho một lượng muối hạn chế để không ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme và ức chế vi khuẩn gây thối. Sau đó lượng muối cho được tăng dần lên để khống chế lượng vi khuẩn gây thối và hệ enzyme vẫn hoạt động tốt . Khi cho đủ lượng muối cần thiết thì hạ nhiệt độ xuống 40- 45 0C. Chế độ cho muối vào như sau : + Sau 12-18 giờ cho 7% muối so với cá . + Sau 30- 48 giờ cho 3% muối so với cá + Sau 3 ngày nữa cho thêm 15 - 17 % để đủ lượng muối tổng cộng là 25 – 27 % so với cá. Hàm lượng đạm (đạm toàn phần , đạm formon và đạm amin) bắt đầu ổn định từ ngày thứ 7 . Sau 10 – 15 ngày kéo rút được nước mắm. 2.7.4. Lọc : a. Mục đích: khai thác cấu tử hòa tan trong chượp chín. b. Biến đổi của nguyên liệu : Vật lý: sau khi lọc ta thu được dịch lọc và bã lọc. Một số chỉ tiêu vật lý của dịch lọc sẽ thay đổi so với huyền phù ban đầu như : tỷ trọng , độ trong. Hóa học: quá trình lọc không gây ra những biến đổi hóa học trong huyền phù . Tuy nhiên trong điều kiện tiếp xúc với không khí thì các cấu tử trong nguyên liệu có thể bị biến đổi hoặc tương tác với nhau tạo ra một số hợp chất hóa học mới nhưng không đáng kể. Hóa lý: phân riêng hai pha một là rắn (bã chượp) và lỏng ( dịch thủy phân). Một số cấu tử dễ bay hơi như chất mùi trong dịch lọc có thể bị tổn thất Sinh học : quá trình lọc không gây ra biến đổi sinh học. Nhưng nếu thời gian lọc huyền phù kéo dài thì hệ vi sinh vật có sẵn trong huyền phù hoặc trong môi trường sản xuất bị nhiễm vào huyền phù sẽ phát triển. Vì vậy cần phải lọc nhanh và trong điều kiện kín. Hóa sinh : không xảy ra. c. Thiết bị: 51 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang  Cấu tạo : Máy lọc kiểu ống tinh vi loại PG là do nhiều lỗ cứng cáp kết cấu thành thiết bị lọc, đơn vị lọc có thể đạt đến micrômét, các vật liệu có chất dính tỉ mỉ khoảng 0.5μm-100μm chỉ cần qua một lần lọc, đã đạt được hiệu quả lọc chất lỏng.  Đặc điểm của máy lọc tinh vi kiểu ống: - Độ tinh chất lọc cao, phạm vi rộng, có thể thỏa mãn được yêu cầu các độ tinh chất lọc khác nhau. - Chịu được acid, kiềm, muối và các dung môi hữu cơ, không độc, không mùi, không tróc di vật. - Kết cấu theo hình lập đứng, chiếm diện tích đặt máy nhỏ. - Dễ dàng thao tác, lượng xử lý lớn, giá thành đầu tư thấp. - Dùng máy nén khí hoặc “hơi nước” tái sinh bài cặn rửa trở lại, cũng có thể tái sinh lại khóa học, làm cho tuổi thọ sử dụng của tâm lọc dài hơn. Máy lọc kiểu ống tinh vi PG ống polyetylen (PE) lỗ micrômét Hình 3.4: Máy lọc tinh vi kiểu ống d. Thông số công nghệ: - Kích thước lỗ lọc: 40-80 μm - Áp suất lọc P = 3at - Thời gian lọc t = 40 ph/mẻ 2.7.5 Cô đặc chân không: a. Mục đích: khai thác, bảo quản - Khai thác: quá trình cô đặc làm tách bớt nước ra khỏi nước mắm do đó làm tăng độ đạm của nước mắm thành phẩm. 52 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Bảo quản: quá trình cô đặc làm bay hơi nước từ nước mắm, do đó làm giảm hàm lượng nước và làm tăng hàm lượng chất khô trong sản phẩm do đó hoạt độ của nước trong nước mắm thành phẩm cũng giảm đi, đây là yếu tố gây ức chế hệ vi sinh vật trong nước mắm, giúp kéo dài thời gian bảo quản. b. Các biến đổi của nguyên liệu: - Vật lý: hàm lượng chất khô tăng, độ nhớt, khối lượng riêng tăng tăng khối lượng và thể tích nước mắm giảm, hoạt độ của nước trong nước mắm giảm. - Hóa học : cô đặc chân không ở nhiệt độ thấp nên hạn chế được sự biến đổi, mất mát acid amin do các phản ứng caramen, maillard. - Hóa lý: sự chuyển pha của nước, nước tồn tại ở trạng thái lỏng trong nước mắm trước cô đặc sẽ chuyển sang trạng thái hơi và thoát ra khỏi nước mắm. - Sinh học: một số vi sinh vật bị ức chế. c. Thiết bị: Thiết bi cô đặc chân không.  Cấu tạo: Thiết bị bao gồm các phần: Nồi cô đặc, bộ ngưng tụ sơ bộ dùng tách khí và nước. Bộ ngưng thứ hai dùng làm mát và thu hồi thành phẩm. Phần tiếp xúc nguyên liệu được chế tạo bằng thép không gỉ, máy hoàn toàn phù hợp cho việc vệ sinh, máy không bị gỉ, ăn mòn.  Nguyên tắc hoạt động: nguyên liệu được đưa vào khoang đun nóng. Hơi được cấp và khoang đun nóng và xảy ra hiện tượng bốc hơi. Phần hơi nước sẽ chuyển sang khoang ngưng, sau đó được làm mát và ngưng tụ. Quá trình bốc hơi sẽ làm cho nguyên liệu dần dần được cô đặc. Hình 3.5: Thiết bị cô đặc chân không d. Thông số công nghệ - Dung tích: tùy chọn: 200-500-700-1000-2000 (lít) - Năng suất bay hơi tương ứng: 60-100-130-150-350 (kg/h) 53 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang - Áp lực hơi: <0.1MPa - Độ chân không: 0.06 MPa 2.7.6. Bổ sung hương: Nước mắm sản xuất theo phương pháp ngắn ngày cho hương vị không tốt, để khắc phục điều này pha với nước mắm có hương vị tốt. a. Mục đích: hoàn thiện. tạo hương vị đặc trưng cho nước mắm thành phẩm. b. Phương pháp thực hiện: sử dụng chượp chín được làm từ cá nục, có hương thơm, đã rút nước mắm cốt. Lấy nước mắm cốt( ngắn ngày) đem trộn trong bã. Khi thấy nước lù chảy ra đạt độ trong thì bắt đầu lấy nước thứ nhất, rồi tiếp tục lấy nước chan khác lấy nước thứ 2 và thứ 3. Lưu ý rằng nước chan này được đi qua nhiều bã chượp chín liên hoàn nhằm mục đích nâng cao thêm độ đạm cho sản phẩm, đồng thời khi rút ở mỗi bể phải lưu lại một lượng nước, không nên rút cạn. c. Các biến đổi trên nguyên liệu: Hóa học: nồng độ cấu tử hương trong nước mắm tăng lên. Hóa lý: trích ly một số thành phần hòa tan trong bã chượp tạo hương vào trong nước mắm, sự khuếch tán của các phân tử chất tan từ trong bã chượp tốt vào nước mắm Các biến đổi khác không đáng kể d. Thiết bị và thông số công nghệ - Sự kéo rút được thực hiện trong thùng chượp có hương tốt được chế biến từ cá. Cá được lên men thành chượp chín có hương vị tốt , sau đó rút nước mắm thành phẩm ra thì kể từ đây thùng chượp này có thể được sử dụng để gây hương tạo vị cho nước mắm chưa có hương vị tốt. - Thời gian nước mắm ngắn ngày được ngâm trộn trong bã chượp : 2 – 3 ngày  Chỉ tiêu đánh giá chượp chín Chỉ tiêu cảm quan : - Màu sắc : màu nâu tươi , nâu xám , hoặc xám . Riêng nước cốt có màu vàng rơm đến cánh gián. - Mùi : mùi thơm đặc trưng , không có mùi chua , mùi lạ . - Trạng thái : Đối với chượp gài nén : cá còn nguyên con , nấu sẽ ra thịt cá tách khỏi xương , nếu khuấy thịt sẽ nát vụn. 54 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Đối với chượp cánh khuấy: cá nát nhuyễn , cái chượp sáng , khi đánh khuấy không có hiện tượng sủi bọt . Bảng: Các chỉ tiêu cảm quan của chượp Chỉ tiêu Chượp loại A Chượp loại B Chượp loại C Mùi Có mùi thơm Có mùi thơm nước Có mùi nước mắm, không có mùi mắm không có mùi còn có mùi tanh, tanh tanh, chua, úng chua. Vị Ngọt đậm, dịu, Ngọt đậm, không vị hơi hơi ngọt, không khé cổ có vị mặn chát, hoặc chát chua hoặc vị khác Màu sắc Nước còn màu Nước có màu cánh Nước có màu nước vàng rơm hoặc đỏ gián hoặc mặn chè. Bã đỏ xám lựu . Bã có màu chín. Bã đỏ hoặc hoặc đen đỏ màu trắng ngà Tình trạng chượp Lắng mặt dần, Lắng mặt dần, Bã lẫn với nước không lởn vởn không lởn vởn bột sền sệt , không bột cá cá trương sình Chỉ tiêu hóa học: Tỉ lệ nitơ amin trên đạm toàn phần của nước cốt >45% 55 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Bảng: Chỉ tiêu thành phần hóa học của chượp Thành phần Chượp loại A Chượp loại B Chượp loại C Nitơ toàn phần trong 20-30 14 -22 13 -17 Nitơ toàn phần trong 20 -22 13 -19 9 -13 chượp (g/Kg) amoniac ≤ 25% ≤ 27% ≤ 30% Tỉ lệ Nitơ toàn phân ≥ 40% 40% Tỉ lệ Nitơ toàn phân Một vài phương pháp khác : - Phương pháp phơi nắng hoặc sấy ở 50 0C , nếu nước mắm đó không có biến đổi gì so với mẫu đối chứng là nước mắm đã chín . Nếu từ màu vàng rơm hoặc cánh gián chuyển sang vàng nhạt mất hương vị đặc trưng vẩn đục thì chượp chưa chín - Phương pháp lắng đọng: người ta sử dụng phương pháp cơ học lắc mạnh mẫu nước mắm , lắc 30 – 40 lần sau đó để yên 20 phút . Nếu mẫu nước mắm đó không có biến đổi gì so với mẫu đối chứng đó là chượp đã chín 2.7.7. Đóng chai : trong điều kiện vô trùng. Sản phẩm sẽ được chiết rót theo chai tự động bằng máy. Bao bì sử dụng là chai nhựa, được vô trùng trước khi đi vào quy trình đóng chai. Sử dụng nắp nhựa kín. a. Mục đích: hoàn thiện. b. Biến đổi: không xảy ra biến đổi đáng kể. Yêu cầu chiết rót và đóng chai trong điều kiện kín để hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật và oxy của không khí vào sản phẩm. c. Thiết bị thông số công nghệ: Hệ thống chiết rót tự động. Đặc điểm của máy: + Mâm xoay cấp chai tự động. 56 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang + Băng tải bằng inox hoặc bằng nhựa + Nguyên tắc chiết: chân không, bơm hồi lưu. + Máy chiết rót được cho nhiều loại chai có hình dáng và kích cỡ khác nhau. + Dễ vệ sinh. Thông số công nghệ: + Áp lực khí nén: 5kf. + Đường kính sản phẩm: (16-30) / (20-60) mm. + Dung tích chai : (200-10000) ml. + Tốc độ băng tải : (10-20) m/ph Hình 3.6: Thiết bị chiết rót tự động Hình 7: Thiết bị đóng nắp tự động. 57 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang IV. SẢN PHẨM: 1. Cách tăng hương vị cho nước mắm ngắn ngày. - Pha đấu với nước mắm có hương vị tốt, sau đó để một thời gian ngắn cho vi sinh vật gây hương phát triển thêm - Đưa các loại nước mắm đã thủy phân bằng enzyme chưa có hương kéo rút qua bã chượp tốt (chượp cá cơm hoặc chượp cá nục 4-6 tháng). Phương pháp này cho hiệu quả đáng kể. - Phân lập vi sinh vật trong chượp tốt sau đó cấy vào nước mắm kém hương, hoặc sử dụng vi sinh vật gây hương để sản xuất ra hương liệu rồi cho vào nước mắm. Đây là hướng đang tiếp tục được nghiên cứu. - Ngoài ra một số nơi còn cho thêm dứa, mít vào ướp với mục đích vừa lợi dụng được enzyme vừa lợi dụng cả mùi hương của chúng. 2. Tiêu chuẩn của nước mắm thành phẩm Chỉ tiêu cảm quan: + Màu sắc: nước mắm có màu vàng rơm đến cánh gián. + Mùi thơm đặc trưng, không có mùi chua mùi lạ. - Chỉ tiêu đánh giá: (TCVN 5107:2003) Bảng: chỉ tiêu hóa hóa học phân loại nước mắm Loại Đặc biệt Thượng hạng Hạng 1 Hạng 2 Độ đạm > 30oN >25oN >15oN >10oN Chỉ tiêu vi sinh vật: - Vi khuẩn hiếu khí: <10 (khuẩn lạc/ml) - Staphylococcus aureus, E.coli: không được có - Nấm men, nấm mốc: <10 (khuẩn lạc/ml) - Coliforms: <100 (khuẩn lạc/ml) - Clostridium perfgingens: <10 (khuẩn lạc/ml) 3. Giá trị dinh dưỡng của nước mắm  Các chất đạm 58 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm. Gồm 3 loại đạm: + Đạm tổng số: là tổng lượng nitơ có trong nước mắm (g/l), quyết định phân hạng của nước mắm. + Đạm amin: là tổng lượng đạm nằm dưới dạng acid amin (g/l), quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm + Đạm amon: càng nhiều nước mắm càng kém chất lượng Ngoài ra trong nước mắm còn chứa đầy đủ các acid amin, đặc biệt là các acid amin không thay thế: valin, leucin, methionin, isoleucin, phenylalanin, alanin.v.v Các thành phần khác có kích thước lớn như tripeptid, peptol, dipeptid. Chính những thành phần trung gian này làm cho nước mắm dễ bị hư hỏng do hoạt động của vi sinh vật. Thành phần dinh dưỡng của nước mắm phụ thuộc vào nguyên liệu đem đi chế biến.  Các chất bay hơi Rất phức tạp và quyết định hương vị của nước mắm. Hàm lượng các chất bay hơi trong nước mắm mg/100g nước mắm - Các chất cacbonyl bay hơi: 407-512 (formaldehyde) - Các acid bay hơi: 404-533 (propionic) - Các amin bay hơi: 9,5-11,3 (izopropylamin) - Các chất trung tính bay hơi: 5,1-13,2 (acetaldehyde) Mùi trong nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của vi sinh vật yếm khí trong quá trình sản xuất nước mắm tạo ra.  Các chất khác - Các chất vô cơ: NaCl chiếm 250-280g/l và một số các chất khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br. - Vitamin: B1, B12, B2, PP. 59 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang 4. Một số sản phẩm nước mắm sử dụng phương pháp ngắn ngày trên thị trường.  Sản phẩm của Chin Su  Nước mắm của Phan Thiết  Nước mắm Hải Hậu. 60 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang  Nước mắm Cung Đình. 61 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Kết luận Về phần enzyme protease: Công nghệ sinh học ở nuớc ta đã và đang phát triển, đã và đang tiếp thu những thành tựu của nền công nghệ sinh học trên thế giới. Do vậy việc đi sâu tìm hiểu về enzyme protease, nguồn thu nhận protease từ vi sinh vật nói chung và chủng nấm mốc Asp. Oryzae và ứng dụng của nó mang lại là một nhiệm vụ cấp thiết từ đó làm tiền đề để tìm ra những enzyme mới và nâng cao hoạt lực của chúng góp phần đưa nền kinh tế Việt Nam hội nhập với nền kinh tế thế giới. Về nước mắm: Nước mắm là sản phẩm truyền thống của nước ta. Nó ra đời từ rất lâu nhưng hiện nay nghề làm nước mắm vẫn theo qui trình thủ công, thời gian quá dài, hiệu quả kinh tế thấp. Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu được thực hiện để cải tiến quá trình sản xuất nhưng chưa được triển khai rộng trong thực tế, chỉ dừng ở qui mô thí điểm với sản lượng nhỏ Việc sản xuất theo phương pháp ngắn ngày đã rút ngắn được thời gian chế biến nước mắm xuống còn 30-90 ngày Sản xuất ngắn ngày nên hương vị nước mắm sẽ không ngon như nước mắm truyền thống. Do đó ta phải bổ sung hương nước mắm hoặc có thể kéo rút qua bã chượp tốt làm bằng cá cơm hoặc cá nục. Nước mắm được sản xuất theo phương pháp ngắn ngày đang ngày càng được áp dụng rông rãi và phổ biến, hiện nay có rất nhiều thương hiệu nổi tiếng trên thị trường và chiếm thị phần lớn trong thị trường người tiêu dùng, điều này đồng nghĩa là nước mắm truyền thống đang càng ngày càng mất vị thế do có sự cạnh tranh diễn ra về giá và cách quảng cáo, tiếp thị và rất nhiều nguyên nhân khác ,nên đang mất đi dần truyền thống làm mắm của người dân nước ta. Vậy nên cần tìm ra phương pháp và cách giải quyết để nước mắm truyền thống vươn lên và được sử dụng rộng rãi trong người tiêu dùng. 62 Nhóm: 19
Enzyme protease và ứng dụng trong sản xuất nước mắm ngắn ngày Th.S Nguyễn Thị Thu Sang Tài liệu tham khảo 2. Website- Đường link -tailieu.vn_ - tailieu-book_ protease-tu-vi-sinh-vat-11313/ - luanvan.com_ 17229/ -tailieu.vn_ protease-tu-chung-nam-moc-aspergillus-oryzae-ung-dung-trong-s-1684344.html - doan.edu.vn_ enzyme-protease-25264/ -PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn_doan.edu.vn_ mam-cao-dam-ngan-ngay-tu-ca-nuc-25369/ -doan.edu,vn_ - PGS-TS Lê Văn Việt Mẫn_doan.edu.vn_ xuat-muoc-mam-ca-com-25551/ - Th.s Phan Thị Thanh Quế_doan.edu.vn_ cong-nghe-che-bien-nuoc-mam-16269/ 63 Nhóm: 19