›
›

Luận án Nghiên cứu tổng hợp và đặc trưng vật liệu Nanocomposit giữa hydroxyapatit và một số polyme tự nhiên

pdf 155 trang vanle 3090
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu tổng hợp và đặc trưng vật liệu Nanocomposit giữa hydroxyapatit và một số polyme tự nhiên", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_tong_hop_va_dac_trung_vat_lieu_nanocompos.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu tổng hợp và đặc trưng vật liệu Nanocomposit giữa hydroxyapatit và một số polyme tự nhiên

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC  NGUYỄN THỊ LAN HƢƠNG NGHI£N CøU TæNG HîP Vµ §ÆC TR¦NG VËT LIÖU NanoCOMPOSIT GI÷A HYDROXYAPATIT Vµ MéT Sè POLYME Tù NHI£N Chuyên ngành: Hóa vô cơ Mã số: 62.44.01.13 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Đào Quốc Hƣơng 2. PGS. TS. Phan Thị Ngọc Bích HÀ NỘI – 2015
  2. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Đào Quốc Hương và PGS.TS. Phan Thị Ngọc Bích. Hầu hết các số liệu, kết quả trong luận án là nội dung từ các bài báo đã và sắp được xuất bản của tôi và các thành viên của tập thể khoa học. Các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, tháng 12 năm 2015 Tác giả Nguyễn Thị Lan Hƣơng
  3. LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin gửi lời cảm ơn tới hai người Thầy của tôi là PGS.TS. Đào Quốc Hương và PGS.TS. Phan Thị Ngọc Bích, những người Thầy đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất cho tôi hoàn thành bản luận án. Các Thầy đã tận tình chỉ bảo tôi cả về lĩnh vực khoa học cũng như trong cuộc sống. Sự tận tâm dạy bảo của các Thầy đã giúp tôi ngày càng vững bước hơn trên con đường nghiên cứu khoa học mà mình đã lựa chọn. Trong quá trình thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ nhiệt tình của các cán bộ nghiên cứu thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nhân dịp này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các cô chú, anh chị em thuộc Phòng Vô cơ, Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người đã luôn giúp đỡ, khích lệ, động viên và dành những tình cảm tốt đẹp cho tôi trong suốt thời gian làm luận án. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý Tổng hợp đã luôn quan tâm tới tiến độ công việc và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi học tập, nghiên cứu và làm việc. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Chủ nhiệm Khoa Sư phạm Hóa – Sinh - Kỹ thuật Nông nghiệp, Ban Giám hiệu Trường Đại học Đồng Tháp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi về thời gian trong quá trình học tập nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn Chương trình Khoa học và Công nghệ trọng điểm cấp Nhà nước “Nghiên cứu, ứng dụng và phát triển công nghệ sau thu hoạch” (KC.07/11-15) của Bộ Khoa học và Công nghệ đã hỗ trợ kinh phí thực hiện nghiên cứu này. Nhân dịp này, tôi muốn dành những tình cảm sâu sắc nhất, trân trọng nhất và xin kính tặng thành quả nhỏ bé mà tôi đạt được tới những người thân trong gia đình: Ba Mẹ - những người đã hết lòng nuôi dạy tôi khôn lớn, luôn động viên hỗ trợ tôi về mọi mặt, các anh chị em đã chia sẻ những khó khăn, thông cảm và giúp đỡ tôi. Cuối cùng tôi xin dành những tình cảm đặc biệt tới gia đình nhỏ thân yêu của tôi, đó là chồng và con gái tôi, những người đã luôn sẻ chia, giúp đỡ, cho tôi nghị lực và tinh thần để hoàn thành luận án, là nguồn động viên giúp tôi vượt qua mọi khó khăn và thử thách trong cuộc sống. Tác giả Nguyễn Thị Lan Hƣơng
  4. MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN 4 1.1. Hydroxyapatit (HA - Ca10(PO4)6(OH)2) 4 1.1.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và phương pháp điều chế 4 1.1.2. Tính chất 7 1.2. Polyme tự nhiên 8 1.2.1. Tinh bột (TB) 9 1.2.2. Maltodextrin (MD) 14 1.2.3. Alginat (Alg) 16 1.3. Vật liệu composit HA/polyme 20 1.3.1. Sự tạo thành vật liệu composit HA/polyme 20 1.3.2. Các phương pháp tổng hợp composit HA/polyme 24 1.3.3. Đặc trưng của vật liệu composit HA/polyme 30 1.3.4. Ứng dụng của composit HA/polyme 34 Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1. Hóa chất và các nguyên liệu đầu 38 2.2. Tổng hợp HA ở vùng nhiệt độ thấp 42 2.3. Nghiên cứu tổng hợp các composit HA/polyme 43 2.3.1. Composit HA/tinh bột (HA/TB) 43 2.3.2. Composit HA/tinh bột sắn (HA/TBS) 45 2.3.3. Composit HA/maltodextrin (HA/MD) với các DE khác nhau 45 2.3.4. Composit HA/alginat (HA/alg) và HA/oligoalginat (HA/olig) 46 2.4. Các phƣơng pháp xác định đặc trƣng 46 2.4.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) 46 2.4.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) 47 2.4.3. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) 47 2.4.4. Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) 48 2.4.5. Phương pháp phân tích nhiệt (TGA-DTA) 48 2.4.6. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 49
  5. Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1. Tổng hợp HA bằng phƣơng pháp kết tủa ở vùng nhiệt độ thấp 50 3.1.1. Đặc trưng XRD 50 3.1.2. Đặc trưng SEM 51 3.1.3. Đặc trưng FT-IR 53 3.1.4. Đặc trưng nhiệt 54 3.2. Nghiên cứu tổng hợp composit HA/tinh bột (HA/TB) 55 3.2.1. Phương pháp trộn HA bột 55 3.2.2. Phương pháp trộn HA huyền phù 59 3.2.3. Phương pháp kết tủa trực tiếp 71 3.2.4. So sánh hai phương pháp tổng hợp vật liệu composit HA/tinh bột (HA/TB) 88 3.3. Nghiên cứu tổng hợp composit HA/tinh bột sắn (HA/TBS) 90 3.3.1. Đặc trưng XRD 90 3.3.2. Đặc trưng SEM và TEM 91 3.3.3. Đặc trưng FT-IR 93 3.3.4. Đặc trưng nhiệt 94 3.4. Nghiên cứu tổng hợp các composit HA/maltodextrin (HA/MD) với DE khác nhau 95 3.4.1. Nghiên cứu tổng hợp các composit HA/MD với DE 12, 16, 20 và 25 95 3.4.2. Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần đến các đặc trưng của composit HA/MD với DE 12 99 3.4.3. So sánh các composit HA/MD với DE khác nhau 105 3.5. Nghiên cứu tổng hợp composit HA/alginat (HA/alg) và HA/oligoalginat (HA/olig) 106 3.5.1. Nghiên cứu tổng hợp composit HA/alginat (HA/alg) 106 3.5.2. Đặc trưng các oligome của alginat 113 3.5.3. Nghiên cứu tổng hợp composit HA/olig 117 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 122 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
  6. DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 1. Viết tắt CaP: Canxi photphat DE: Đương lượng đường khử - Destrose Equivalent DP: Độ polyme hóa - Degree of Polymerization DTA: Phân tích nhiệt vi sai - Differential Thermal Analysis FT-IR: Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier - Fourier Transform Infrared Spectroscopy GPC: Sắc ký thẩm thấu gel - Gel Permeation Chromatography HA: Hydroxyapatit - Ca10(PO4)6(OH)2 PDI: Độ phân tán khối lượng phân tử - Polydispersity Index SEM: Hiển vi điện tử quét - Scanning Electron Microscopy TEM: Hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy TGA: Phân tích nhiệt trọng lượng -Thermal Gravimetric Analysis XRD: Nhiễu xạ tia X - X-Ray Diffraction 2. Kí hiệu alg: alginat D: Kích thước tinh thể trung bình của HA tính theo công thức Scherrer G: -L-guluronic M: -D-mannuronic MD: Maltodextrin Mw: Khối lượng phân tử trung bình olig: oligoalginat PVA: Poly(vinyl alcohol) PAA: Polyacrylic axit PCL: Poly (-caprolacton) TB: Tinh bột TBS: Tinh bột sắn XC: Độ tinh thể của HA
  7. DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Tính chất của amylozơ, amylopectin 11 Bảng 2.1. Các hóa chất và nguyên liệu đầu sử dụng trong luận án 38 Bảng 2.2. Đương lượng đường khử (DE) của các polysaccarit 40 Bảng 3.1. Kích thước tinh thể trung bình và độ tinh thể của HA tổng hợp ở vùng nhiệt độ thấp 51 Bảng 3.2. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA ở mẫu HA và HT 56 Bảng 3.3. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong các mẫu composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp trộn huyền phù 60 Bảng 3.4. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong composit HA/TB tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 65 Bảng 3.5. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong mẫu HN và HE 66 Bảng 3.6. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong composit HA/TB có và không có tác động của sóng siêu âm 68 Bảng 3.7. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong composit HA/TB được sấy nhiệt và đông khô 69 Bảng 3.8. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong các mẫu composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp kết tủa trực tiếp 72 Bảng 3.9. Số sóng của các nhóm chức trong HA, TB và các composit HA/TB 76 Bảng 3.10. Kích thước trung bình và độ tinh thể của các mẫu composit tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 79 Bảng 3.11. Kích thước trung bình và độ tinh thể của các mẫu composit với tốc độ cấp axit khác nhau 82 Bảng 3.12. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA của các mẫu composit HA/TB có và không có sóng siêu âm 85 Bảng 3.13. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong mẫu HD1 và HD2 87 Bảng 3.14. Kích thước và độ tinh thể của HA tổng hợp theo các phương pháp khác nhau 88
  8. Bảng 3.15. Kích thước và độ tinh thể của HA trong các mẫu composit HA/TBS 91 Bảng 3.16. Kích thước và độ tinh thể của các composit HM12, HM16, HM20 và HM25 96 Bảng 3.17. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong các composit HA/MD 100 Bảng 3.18. Số sóng đặc trưng của các nhóm chức trong HA, MD và các composit HA/MD 101 Bảng 3.19. Kích thước trung bình và độ tinh thể của HA trong các composit HA/alg 108 1 Bảng 3.20. Kết quả phân tích phổ H-NMR của alginat 116
  9. DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Các dạng hình thái học của tinh thể HA 7 Hình 1.2. Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể HA 8 Hình 1.3. Cấu trúc phân tử amylozơ (a), amylopectin (b) 10 Hình 1.4. Ảnh hiển vi quang học của hạt tinh bột ngô ở các nhiệt độ khác nhau trong quá trình hồ hóa [88] 13 Hình 1.5. Đặc trưng cấu trúc của alginat: a) Các monome của alginat; b) Cấu trúc chuỗi, cấu dạng ghế; c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch alginat 16 Hình 1.6. Mô hình liên kết giữa ion Ca2+ và alginat a) Mô hình tạo hạt gel canxi alginat; b) Liên kết của block G với ion canxi 18 Hình 1.7. Sự tạo mầm của HA trên chất nền polyme. (a) Các nhóm chức trên phân tử polyme là các vị trí tạo mầm cho tinh thể HA, (b) Sự tạo mầm và phát triển tinh thể HA trên các polyme được gắn đế trên đế Au 22 Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của (a) mô hình “hộp trứng” của canxi alginat, (b) mô hình “hộp trứng” với các ion tiền chất cho sự tạo mầm HA và (c) cấu trúc “hộp trứng” khoáng hóa và (d) sợi nano composit HA/alginat tổng hợp trực tiếp 23 Hình 1.9. Sơ đồ mô tả các hạt HA bị “mắc kẹt” vật lí trong chất nền collagen (a). Theo ảnh SEM, HA kết tập trong chất nền collagen tổng hợp bằng phương pháp trộn (b) 25 Hình 1.10. Sơ đồ thí nghiệm (a) và cơ chế (b) của quá trình EPD điều chế lớp phủ composit GO-HY-HA trên chất nền Ti 27 Hình 1.11. Sơ đồ chế tạo màng sợi composit HA/gelatin theo phương pháp điện xoay tròn 28 Hình 1.12. Sự chuyển pha từ brushit sang HA theo thời gian 31 Hình 1.13. Giản đồ DT-TGA của các vật liệu composit HA/chitosan với hàm lượng khác nhau 32 Hình 1.14. Các dạng hình thái học của composit: hạt micro (a), nano (b), khung xốp (c), sợi (d), giàn khung (e), màng đa lớp (f) 33
  10. Hình 2.1. Quy trình điều chế oligome từ alginat [118, 119] 40 Hình 2.2. Phương pháp tổng hợp HA từ Ca(OH)2 và H3PO4 42 Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp thực nghiệm tổng hợp composit HA/TB theo phương pháp trộn huyền phù 43 Hình 2.4. Sơ đồ quy trình thực nghiệm tổng hợp composit HA/TB theo phương pháp kết tủa trực tiếp 44 o Hình 3.1. Giản đồ XRD của các mẫu HA tổng hợp ở -15, -10 và 0 C 50 Hình 3.2. Ảnh SEM của các mẫu HA tổng hợp ở vùng nhiệt độ thấp 52 o Hình 3.3. Phổ FT-IR của mẫu HA tổng hợp ở 0 C 53 o Hình 3.4. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu HA tổng hợp ở 0 C 54 Hình 3.5. Giản đồ XRD của HA, tinh bột (TB) và composit HA/TB (HT) 55 Hình 3.6. Ảnh SEM của các mẫu TB1, TB2, HA và HT 56 Hình 3.7. Phổ FT-IR của HA, TB và composit HA/TB (HT) 57 Hình 3.8. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu TB 58 Hình 3.9. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu HT 58 Hình 3.10. Giản đồ XRD của các mẫu composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp trộn huyền phù 60 Hình 3.11. Phổ FT-IR của HA, tinh bột và các composit tổng hợp bằng phương pháp trộn huyền phù 61 Hình 3.12. Ảnh SEM của các composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp trộn huyền phù 62 Hình 3.13. Ảnh TEM của các composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp trộn huyền phù 63 Hình 3.14. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu HT50 64 Hình 3.15. Giản đồ XRD của các mẫu composit HA/TB tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 64 Hình 3.16. Ảnh SEM của các composit HA/TB tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 65 Hình 3.17. Giản đồ XRD của các mẫu composit HA/TB tổng hợp ở dung môi nước và etanol 66 Hình 3.18. Ảnh SEM của các composit HA/TB tổng hợp ở dung môi nước và etanol 67 Hình 3.19. Giản đồ XRD của các mẫu HF và HF2 67
  11. Hình 3.20. Ảnh SEM của các mẫu composit HF1 và HF2 68 Hình 3.21. Giản đồ XRD của mẫu sấy nhiệt (HC1) và đông khô (HC2) 69 Hình 3.22. Ảnh SEM của mẫu sấy nhiệt (HC1) và đông khô (HC2) 70 Hình 3.23. Giản đồ XRD của các mẫu composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp kết tủa trực tiếp 71 Hình 3.24. Ảnh SEM của các mẫu composit HA/TB với tỉ lệ thành phần khác nhau 73 Hình 3.25. Ảnh TEM của các mẫu composit HA/TB với tỉ lệ thành phần khác nhau 74 Hình 3.26. Phổ FT-IR của các composit HA/TB tổng hợp theo phương pháp kết tủa trực tiếp 75 Hình 3.27. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu HT-5 77 Hình 3.28. Giản đồ XRD của các mẫu composit tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 78 Hình 3.29. Ảnh SEM của các composit tổng hợp ở các nhiệt độ khác nhau 79 Hình 3.30. Giản đồ XRD của các mẫu composit với tốc độ cấp axit khác nhau 81 Hình 3.31. Ảnh SEM của các mẫu composit HA/TB với tốc độ cấp axit khác nhau 82 Hình 3.32. Giản đồ XRD của các mẫu HA/TB tổng hợp ở các dung môi khác nhau 83 Hình 3.33. Ảnh SEM của các composit tổng hợp ở các dung môi khác nhau 84 Hình 3.34. Giản đồ XRD của composit HP1 và HP2 85 Hình 3.35. Ảnh SEM của mẫu HP1 và HP2 86 Hình 3.36. Giản đồ XRD của mẫu HD1 và HD2 86 Hình 3.37. Ảnh SEM của mẫu HD1 và HD2 87 Hình 3.38. Mô hình liên kết hydro giữa HA và tinh bột 89 Hình 3.39. Sơ đồ sự hình thành HA trên chất nền tinh bột theo phương pháp kết tủa trực tiếp 89 Hình 3.40. Giản đồ XRD của các composit HA/TBS 90 Hình 3.41. Ảnh SEM của các composit HA/TBS 91 Hình 3.42. Ảnh TEM của các composit HA/TBS 92 Hình 3.43. Phổ FT-IR của TBS (a), HA (b) và composit HS50 (c) 93
  12. Hình 3.44. Giản đồ DTA-TGA của mẫu composit HS50 94 Hình 3.45. Giản đồ XRD của các composit HA/MD với DE khác nhau 95 Hình 3.46. Ảnh SEM của các composit HM12, HM16, HM20 và HM25 97 Hình 3.47. Ảnh TEM của MD và các composit HA/MD với DE khác nhau 98 Hình 3.48. Giản đồ XRD của các mẫu composit HA/MD 99 Hình 3.49. Phổ FT-IR của các mẫu composit HA/MD với tỉ lệ thành phần khác nhau 101 Hình 3.50. Ảnh SEM của các mẫu composit HA/MD với tỉ lệ thành phần khác nhau 102 Hình 3.51. Ảnh TEM của các composit HA/MD 103 Hình 3.52. Giản đồ DTA-TGA của mẫu HM-55 104 Hình 3.53. Giản đồ XRD của các composit HA/alg 107 Hình 3.54. Ảnh SEM của các composit HA/alg 109 Hình 3.55. Ảnh TEM của mẫu HG5 và mẫu HG1 110 Hình 3.56. Phổ FT-IR của alg và các composit HA/alg 111 Hình 3.57. Giản đồ phân tích nhiệt của alginat 112 Hình 3.58. Giản đồ phân tích nhiệt của mẫu composit HG5 112 Hình 3.59. Giản đồ XRD của alginat và các oligoalginat 114 Hình 3.60. Phổ FT-IR của alginat và các oligoalginat 114 Hình 3.61. Cấu trúc chuỗi mạch alginat 115 1 Hình 3.62. Phổ H-NMR của mẫu alginat 115 1 Hình 3.63. Phổ H-NMR của oligoalginat A2 116 1 Hình 3.64. Phổ H-NMR của oligoalginat A2 117 Hình 3.65. Giản đồ XRD của các mẫu HA/olig 118 Hình 3.66. Phổ FT-IR của các mẫu HA/oligoalginat 118 Hình 3.67. Ảnh SEM của các mẫu HA/oligoalginat 119 Hình 3.68. Ảnh TEM của các mẫu HA/oligoalginat 120
  13. MỞ ĐẦU Hydroxyapatit (HA) là thành phần chính trong chất khoáng sinh học của xương, răng và các mô cứng của động vật có xương sống. Chất khoáng sinh học chiếm 65-70% khối lượng của xương, nước chiếm khoảng 5-8% và phần còn lại là pha hữu cơ, mà chủ yếu là collagen. Collagen đóng vai trò là chất nền cho sự lắng đọng và tăng trưởng của pha tinh thể HA. Trong nhiều thập kỷ qua, việc nghiên cứu tổng hợp HA đã được các nhà khoa học vật liệu quan tâm do tính tương thích sinh học cao, gần gũi với các polyme sinh học và có khả năng tạo xương tốt. Hiện nay, HA là vật liệu được lựa chọn cho các ứng dụng y sinh khác nhau, ví dụ: thay thế cho xương và các khuyết tật nha chu, cấy ghép tai giữa, hệ thống kỹ thuật mô, tác nhân truyền dẫn thuốc, điều trị bệnh loãng xương, vật liệu nha khoa và lớp phủ hoạt tính sinh học lên miếng cấy ghép xương bằng kim loại Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, vật liệu HA kích thước nanomet có tính tương thích, tái hấp thu và hoạt tính sinh học cao hơn nhiều so với vật liệu có kích thước micromet. Ở kích thước siêu mịn, các hạt nano HA có hoạt tính bề mặt cao do đó nhanh chóng giải phóng các ion canxi tương tự như apatit sinh học. Vì vậy, trong những năm gần đây, gốm sinh học và composit sinh học chứa HA kích thước nanomet rất được quan tâm nghiên cứu. Một xu hướng mới hiện nay là chế tạo các nanocomposit mô phỏng sinh học, vật liệu lai vô cơ-hữu cơ với chất điền vào là HA và chất nền là các polyme. Trong các vật liệu nanocomposit HA/polyme, polyme đóng vai trò là chất nền cung cấp các vị trí tạo mầm, điều chỉnh sự phát triển và hình thái học của tinh thể nano HA. Sự hình thành liên kết hóa học giữa HA và polyme, như liên kết hydro, lực Van der Waals, hoặc phức chất cacboxyl-Ca-cacboxyl, cho phép phân tán đồng đều HA trong pha hữu cơ. Các polyme tổng hợp như poly(L-lactic), poly(vinyl alcohol), poly(- caprolacton) đã được sử dụng. Tuy nhiên, polyme tự nhiên thường được ưa chuộng hơn do chúng tương thích, không độc, gần gũi với hệ sinh học. Chúng có 1
  14. thể là các protein như: collagen, gelatin, hoặc các polysaccarit như: chitosan, tinh bột, alginat, dextran, chondroitin sunfat và các dẫn xuất. Ở nước ta, từ năm 2005, đã có những công bố bước đầu nghiên cứu tổng hợp HA đơn chất dạng bột, xốp, màng định hướng ứng dụng trong dược học và y sinh học. Riêng vật liệu composit HA/polyme mới chỉ có một số ít nghiên cứu chế tạo composit chứa HA với chitosan, collagen, PLA Mặt khác, là một nước nhiệt đới, chúng ta có nguồn tinh bột từ ngũ cốc và alginat từ rong biển rất phong phú. Để tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có trong nước và góp phần tạo ra một loại vật liệu có nhiều ưu điểm và khả năng ứng dụng trong dược học và y sinh học, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu tổng hợp và đặc trưng vật liệu nanocomposit giữa hydroxyapatit và một số polyme tự nhiên”.  Mục tiêu của luận án Nghiên cứu tổng hợp được các composit chứa HA với một số polysaccarit từ ngũ cốc và rong biển Việt Nam: - HA/tinh bột, HA/tinh bột sắn; - HA/maltodextrin với các DE khác nhau; - HA/alginat và HA/oligoalginat. Xác định các đặc trưng và đưa ra được mối liên hệ giữa đặc trưng của composit HA/polyme và các thông số cấu trúc của polyme.  Nội dung của luận án Để hoàn thành các mục tiêu đề ra, luận án bao gồm các nội dung nghiên cứu sau: 1. Tổng hợp HA ở vùng nhiệt độ thấp (-15, -10, 0oC), nhằm làm giảm kích thước, độ tinh thể của HA và để so sánh với pha HA trong các vật liệu composit HA/polyme. 2. Nghiên cứu chế tạo composit HA/tinh bột bằng hai phương pháp: phương pháp trộn và phương pháp kết tủa trực tiếp. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến đặc trưng của sản phẩm như tỉ lệ thành phần, nhiệt độ, dung môi, tốc độ cấp axit, sóng siêu âm, kỹ thuật làm khô. Từ đó, lựa chọn phương pháp và điều kiện thích hợp để tổng hợp các composit tiếp theo. 3. Tổng hợp các composit HA/tinh bột sắn, HA/maltodextrin với DE khác 2
  15. nhau bằng phương pháp đã lựa chọn. Khảo sát ảnh hưởng của giá trị DE đến đặc trưng của các composit. 4. Điều chế oligome của alginat, tổng hợp và khảo sát các đặc trưng của composit HA/alginat, HA/oligoalginat. 3
  16. Chƣơng 1 TỔNG QUAN 1.1. Hydroxyapatit (HA - Ca10(PO4)6(OH)2) 1.1.1. Tình hình nghiên cứu, ứng dụng và phương pháp điều chế Các muối canxi photphat (CaP) là thành phần khoáng trong xương và răng của động vật có xương sống [1-4]. Xương và các mô cứng khác có thể được xem là vật liệu composit tự nhiên gồm chất khoáng sinh học gắn trong chất nền polyme, các chất hữu cơ khác và nước [1, 3]. Pha khoáng sinh học là một hoặc nhiều loại muối CaP, chiếm 65-70% khối lượng của xương, nước chiếm khoảng 5-8% và phần còn lại là pha hữu cơ, mà chủ yếu là collagen [1-3, 5]. Collagen đóng vai trò là chất nền cho sự lắng đọng và tăng trưởng của các chất khoáng [1, 3, 6, 7]. Trong số các muối CaP, hydroxyapatit (HA) với công thức Ca10(PO4)6(OH)2 là thành phần chủ yếu của pha khoáng sinh học [2, 3]. Trong nhiều thập kỷ qua, việc nghiên cứu tổng hợp HA đã được các nhà khoa học vật liệu quan tâm do tính tương thích sinh học tuyệt vời [8, 9], gần gũi với các polyme sinh học [10, 11] và có khả năng dẫn xương tốt [12, 13]. HA đã được chứng minh là có thể thúc đẩy sự phát triển của xương mới thông qua cơ chế dẫn xương mà không gây ra độc tính cục bộ hoặc toàn thân, viêm hoặc dị ứng [12, 14-16]. Khi cấy ghép vật liệu gốm chứa HA vào cơ thể, một lớp mô mới được hình thành trên bề mặt của nó và góp phần vào sự liên kết của các mô cấy vào xương, dẫn đến định hình vượt trội mô cấy đến các mô xung quanh [14-17]. Hơn nữa, một số nghiên cứu cho thấy HA hoặc các muối CaP có thể được khai thác như một hợp chất mô hình để nghiên cứu quá trình khoáng hóa sinh học trong cơ thể con người [6, 7, 18-22]. Các nghiên cứu gần đây cũng đã chỉ ra rằng, các hạt HA ức chế sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư [23, 24]. Hiện nay, HA là vật liệu được lựa chọn cho các ứng dụng y sinh học khác nhau, ví dụ: thay thế cho xương và các khuyết tật nha chu [25, 26], ổ răng [27], cấy ghép tai giữa [28], hệ thống kỹ thuật mô [29], tác nhân truyền dẫn thuốc [30], điều trị bệnh loãng xương [31], vật liệu nha khoa và lớp phủ hoạt tính sinh học lên miếng cấy ghép xương bằng kim loại [32]. Ngoài lĩnh vực dược học và y sinh học, HA và các muối CaP ngày càng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp khác. Ví dụ: chất xúc tác 4
  17. cho các phản ứng cộng hợp kiểu Michael và oxy hóa metan [33, 34], nguyên liệu phát laser [35], vật liệu huỳnh quang [36], dây dẫn ion và cảm biến khí [37]. HA tổng hợp cũng có thể được sử dụng trong phương pháp sắc ký cột để tách phân đoạn đơn giản và nhanh chóng các protein và axit nucleic [38, 39]. Hơn nữa, HA còn là vật liệu có giá trị cho quá trình xử lý nước và hấp phụ kim loại nặng trong đất [40]. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vật liệu HA kích thước nanomet có tính tương thích, tái hấp thu sinh học và hoạt tính sinh học cao hơn nhiều so với vật liệu có kích thước micro [41, 42]. Bởi vì ở kích thước siêu mịn, các hạt nano HA có hoạt tính bề mặt cao, do đó nhanh chóng giải phóng các ion canxi tương tự như apatit sinh học. Ngoài ra, phản ứng khử khoáng ở men răng và xương có thể bị ức chế khi kích thước hạt đạt đến mức nanomet, vì thế ngăn ngừa bệnh sâu răng và loãng xương [43]. Một số nghiên cứu cũng cho thấy, nano HA có khả năng giảm đáng kể tế bào chết do tự hủy hoại nên cải thiện sự tăng sinh tế bào và hoạt tính tế bào liên quan đến sự phát triển xương [44]. Vì vậy, trong những năm gần đây, gốm sinh học và composit sinh học chứa HA kích thước nanomet được xem là các vật liệu hứa hẹn nhất cho một loạt các ứng dụng y sinh học [46-48]. Để phản ánh sự quan tâm ngày càng tăng trong việc nghiên cứu chế tạo vật liệu HA, M. Sadat-Shojai đã tìm kiếm các nghiên cứu trong cơ sở dữ liệu Scopus, kết quả cho thấy số lượng các ấn phẩm về các dạng vật liệu chứa HA tăng lên gấp ba lần từ năm 1999 đến 2011 [49]. Tuy vậy, việc điều chế HA với các đặc trưng xác định vẫn là một thách thức thú vị. Cụ thể là tìm ra một phương pháp mới có thể kiểm soát chính xác cấu trúc tinh thể, thành phần hóa học, độ tinh thể hóa, sự phân bố kích thước, trạng thái kết tập vẫn là động lực chính cho các nhà nghiên cứu vật liệu chứa HA hiện nay trên thế giới [17, 48]. Đã có rất nhiều phương pháp tổng hợp HA được phát triển. Nhìn chung, có thể phân loại thành năm nhóm phương pháp: phương pháp khô bao gồm phản ứng pha rắn và hóa cơ; phương pháp ướt gồm kết tủa, sol-gel, nhũ tương, siêu âm, thủy nhiệt; quá trình nhiệt độ cao gồm phân hủy và thiêu kết; tổng hợp từ các nguồn gen sinh học và nhóm thứ năm kết hợp nhiều phương pháp. Tuỳ thuộc vào mục đích ứng dụng, có thể lựa chọn phương pháp điều chế phù hợp. Để tổng hợp HA dạng bột, các phương pháp ướt thường được sử dụng, bởi 5
  18. ưu điểm của nó là có thể điều chỉnh được kích thước của hạt theo mong muốn. Trong đó, phương pháp kết tủa hóa học được sử dụng nhiều nhất, chiếm đến 25% trong tổng số các nghiên cứu từ năm 1999 đến 2011 [49]. Có nhiều quy trình khác 2+ 3- nhau để kết tủa HA từ các ion Ca và PO4 , có thể phân ra thành hai cách chính: 2+ 3- Thứ nhất là kết tủa từ các muối chứa ion Ca và PO4 dễ tan trong nước, các muối hay được dùng là Ca(NO3)2, CaCl2, (NH4)2HPO4, NH4H2PO4 Phản ứng diễn ra theo phương trình (1.1) được coi là phương pháp cơ bản để tổng hợp HA [50]: 10Ca(NO3)2 + 6(NH4)2HPO4 + 8NH4OH Ca10(PO4)6(OH)2 + 20NH4NO3 + 6H2O (1.1) Thứ hai là kết tủa từ các hợp chất chứa Ca2+ ít tan hoặc không tan trong nước. Phản ứng xảy ra giữa Ca(OH)2, CaO, CaCO3 với axit H3PO4 tạo thành HA trong môi trường kiềm [51]. Ví dụ: 10Ca(OH)2 + 6H3PO4 = Ca10(PO4)6(OH)2 + 18H2O (1.2) Ở nước ta, việc nghiên cứu tổng hợp các hợp chất vô cơ có khả năng ứng dụng làm vật liệu sinh học nói chung và vật liệu HA nói riêng còn nhiều hạn chế. Năm 2005, lần đầu tiên nhóm nghiên cứu của Đỗ Ngọc Liên tại Viện Công nghệ Xạ hiếm đã triển khai đề tài chế thử gốm HA theo công nghệ của Italia và đã bước đầu thử nghiệm thành công trên động vật [52]. Khoa Hoá học, Đại học Bách khoa Hà Nội đã nghiên cứu và công bố kết quả sơ bộ về phương pháp tổng hợp bột và màng gốm HA [53]. Từ năm 2005 đến nay, Viện Hoá Học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã công bố các kết quả nghiên cứu chế tạo HA bột kích thước nanomet bằng phương pháp hoá học từ Ca(OH)2 và Ca(NO3)2 [54, 55]. Các nghiên cứu đã được ứng dụng vào sản xuất bột HA làm nguyên liệu cho một số thực phẩm chức năng bổ sung canxi như Fecafovit, Caotot, Growbust, Viên dưỡng khớp Vũ Duy Hiển [56] đã nghiên cứu chế tạo HA xốp bằng phương pháp nén ép - thiêu kết HA bột với các chất tạo xốp chitosan, xenlulo, đường sacaro và phương pháp phản ứng pha rắn giữa Ca(OH)2 và Ca3(PO4)2. Việc chế tạo gốm HA từ khung xốp tự nhiên của san hô, mai mực, vỏ sò bằng phản ứng thuỷ nhiệt ở áp suất cao cũng đã được thực hiện. Riêng về vật liệu composit HA/polyme, một số nghiên cứu chế tạo đã được công bố trong những năm gần đây. Bằng phương pháp đồng kết tủa từng bước, Lê Anh Tuấn và các cộng sự đã tổng hợp được các composit HA/collagen với tỉ lệ 6
  19. thành phần khác nhau và khảo sát các đặc trưng của chúng [57]. Đinh Thị Mai Thanh và các cộng sự [58] đã nghiên cứu chế tạo nanocomposit HA/PLA dạng xốp ứng dụng làm vật liệu cấy ghép xương trong phẫu thuật chỉnh hình. Bằng phương pháp trộn nóng chảy kết hợp với sử dụng chất tương hợp polyetylen oxit (PEO) và chất tạo xốp NaCl đã chế tạo được nanocomposit có tính chất cơ lý tương tự như xương. Các thử nghiệm in vitro của nanocomposit HA/PLA trong dung dịch giả dịch thể người (Simulated Body Fluids-SBF) đã được thực hiện. Nguyễn Kim Ngà và cộng sự [59] cũng đã thực hiện chế tạo vật liệu composit HA/PLA theo phương pháp mô phỏng sinh học. Kích thước và sự phân bố lỗ xốp của vật liệu khung xốp tương tự như cấu trúc xương tự nhiên, đồng thời sự kết dính và tăng sinh tế bào là khá tốt. 1.1.2. Tính chất HA tinh thể có màu trắng, trắng ngà, vàng nhạt hoặc xanh lơ, tuỳ theo điều kiện hình thành, kích thước hạt và trạng thái tập hợp [60]. HA có nhiệt độ nóng chảy 1760oC và nhiệt độ sôi 2850oC, độ tan trong nước 0,7 g/l, khối lượng mol phân tử 1004,60 g, khối lượng riêng là 3,156 g/cm3, độ cứng theo thang Mohs bằng 5. Hình thái học của tinh thể HA có rất nhiều dạng: từ hình cầu, hình sợi, hình que đến hình phiến, tùy thuộc vào phương pháp điều chế (Hình 1.1). Hình 1.1. Các dạng hình thái học của tinh thể HA [50] 2+ 3- - Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể HA gồm các ion Ca , PO4 và OH được sắp xếp như Hình 1.2. Ô mạng ở hệ tinh thể lục phương, thuộc nhóm không gian 0 P63/m với các hằng số mạng a = 0,9423 nm và c = 0,6875 nm, α = β = 90 và γ = 7
  20. 1200 [61]. Đây là cấu trúc thường gặp của HA tổng hợp, HA trong thành phần của xương và ngà răng [62, 63]. Hình 1.2. Cấu trúc ô mạng cơ sở của tinh thể HA HA không phản ứng với kiềm nhưng phản ứng với axit tạo thành các muối canxi và nước: Ca10(PO4)6(OH)2 + 2HCl 3Ca3(PO4)2 + CaCl2 + 2H2O (1.3) HA tương đối bền nhiệt, bị phân huỷ chậm trong khoảng nhiệt độ từ 800oC đến 1200oC tạo thành oxy-hydroxyapatit theo phản ứng: Ca10(PO4)6(OH)2 Ca10(PO4)6(OH)2-2xOx + xH2O (0 x 1) (1.4) o Ở nhiệt độ lớn hơn 1200 C, HA bị phân huỷ thành β - Ca3(PO4)2 (β – TCP) và Ca4P2O9 hoặc CaO: Ca10(PO4)6(OH)2 2β – Ca3(PO4)2 + Ca4P2O9 + H2O (1.5) Ca10(PO4)6(OH)2 3β – Ca3(PO4)2 + CaO + H2O (1.6) 1.2. Polyme tự nhiên Polyme là những hợp chất cao phân tử, cấu tạo từ các đơn vị mắt xích cơ sở lặp đi lặp lại nhiều lần. Xuất phát từ nguồn gốc, có thể phân chia các hợp chất polyme thành: polyme tự nhiên và polyme tổng hợp. Polyme tự nhiên hay polyme sinh học có ba nhóm chính là protein, axit nucleic và polysaccarit. Chúng là những đại phân tử sinh học quan trọng nhất trong khoa học sự sống. Ngày nay, polyme tự nhiên được ứng dụng nhiều trong dược phẩm và y sinh học do chúng sẵn có, rẻ, không độc, một số còn có khả năng phân hủy sinh học và tương thích sinh học [64, 65]. Polysaccarit là nhóm polyme sinh học phong phú nhất trong tự nhiên, được cấu tạo bởi nhiều đơn vị monosaccarit nối với nhau bởi liên kết glicozit. Trong phân tử, polysaccarit có nhiều nhóm ưa nước có thể liên kết với các mô tạo nên sự kết 8
  21. dính sinh học. Có nhiều cách khác nhau để phân loại polysaccarit như dựa vào cấu trúc, thành phần hóa học, độ tan, nguồn gốc và ứng dụng. Nếu dựa vào thành phần hóa học, polysaccarit có thể chia làm 2 loại, polysaccarit đồng thể hay homo- glycan, được tạo nên từ một loại monosaccarit, ví dụ như xenlulozơ, tinh bột, glycogen chỉ chứa glucozơ. Polysaccarit dị thể hay heteroglycan chứa nhiều hơn một loại monosaccarit như alginat, carrageenan, heparin. Phân loại theo cấu trúc, polysaccarit gồm mạch thẳng (như amylozơ, xenlulozơ, pectin, alginat), mạch nhánh ngắn (guar gum, xanthan gum) và mạch nhiều nhánh (như amylopectin, gum arabic). Dựa vào nguồn gốc, có thể phân loại polysaccarit từ cây (như tinh bột, xenlulozơ), từ rong (như alginat, carrageenan, fucoidan), từ vi khuẩn (như dextran, xanthan) và một số polysaccarit có nguồn gốc từ động vật như heparin, chondroitin sunfat và hyaluronan [66, 67]. Trong nhiều thập kỷ gần đây, các phương pháp biến tính khác nhau, như thủy phân một phần, oxy hóa khử, ete hóa, este hóa và tạo liên kết ngang đã thu được các dẫn xuất polysaccarit có tính chất mong muốn. Do đó, việc sử dụng các polysaccarit và dẫn xuất của chúng ngày càng gia tăng, đặc biệt là trong các ứng dụng mới như công nghệ mô, dược phẩm, vật liệu y sinh, thực phẩm dinh dưỡng, nhiên liệu sinh học, dẫn truyền thuốc, chữa trị vết thương, ngăn ngừa ung thư, chẩn đoán và điều trị bệnh do vi khuẩn và virus [68, 69]. Luận án này sử dụng các polysaccarit có nguồn gốc từ ngũ cốc (tinh bột sắn, tinh bột, maltodextrin có giá trị DE thay đổi) và rong biển (alginat và các oligoalginat) đều là những nguyên liệu sẵn có ở nước ta. 1.2.1. Tinh bột (TB) Tinh bột là polysaccarit chủ yếu có trong hạt, củ, thân cây và lá cây. Tinh bột được tổng hợp nhờ quá trình quang hợp của cây và nguồn năng lượng dự trữ tiềm tàng. Hàm lượng tinh bột có trong các loại cây là khác nhau và có thể thay đổi theo thời tiết, mùa vụ, thổ nhưỡng Trong tự nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào, chỉ đứng sau xenlulozơ [70, 71]. Tinh bột có vai trò dinh dưỡng đặc biệt lớn vì trong quá trình tiêu hóa, chúng bị thủy phân thành đường glucozơ là chất tạo nên nguồn năng lượng chính từ thực phẩm cho con người [72, 73]. Tinh bột cũng giữ vai trò quan trọng trong nhiều ngành công nghiệp do những tính chất lý 9
  22. hóa của chúng [74, 75]. 1.2.1.1. Cấu trúc phân tử Tinh bột gồm các đơn vị glucozơ được nối nhau bởi các liên kết α- glicozit, có công thức phân tử là (C6H10O5)n với n trong khoảng từ 50 đến hơn một triệu [74]. Tinh bột gồm hai thành phần chính là amylozơ và amylopectin. Tỷ lệ amylozơ và amylopectin ảnh hưởng nhiều tới tính chất của tinh bột. Nhìn chung trong tinh bột sắn, hàm lượng amylozơ và amylopectin thông thường tương ứng là 20 và 80%, tỷ lệ này thay đổi tùy theo nguồn gốc loại thực vật và điều kiện canh tác, sinh trưởng. Trong tinh bột nếp (gạo nếp, ngô nếp), amylopectin chiếm gần như 100%, còn trong tinh bột đậu xanh, dong riềng, hàm lượng amylozơ chiếm trên 50% [75, 76]. Amylozơ là polysaccarit mạch thẳng gồm các đơn vị glucozơ liên kết với nhau bởi liên kết -1,4-glicozit (Hình 1.3a). Phân tử amylozơ có một đầu khử và một đầu không khử. Chuỗi phân tử amylozơ xoắn lại với nhau theo dạng xoắn lò xo. Dạng lò xo là do sự hình thành các liên kết hydro giữa các glucozơ. Mỗi vòng xoắn có 6 đơn vị glucozơ và được duy trì bởi liên kết hydro với các vòng xoắn kề bên. Khoảng không gian giữa các vòng xoắn có kích thước phù hợp để liên kết với một số phân tử khác, ví dụ như iot. Khi phân tử iot liên kết với vòng xoắn sẽ làm cho các phân tử glucozơ thay đổi và tạo nên phức màu xanh thẫm đặc trưng. Ái lực của amylozơ với iot phụ thuộc tuyến tính với chiều dài của mạch polyme. Dạng xoắn của amylozơ chỉ tạo thành trong dung dịch ở nhiệt độ thường. Ở nhiệt độ cao, chuỗi xoắn sẽ bị duỗi thẳng ra và không có khả năng liên kết với các phân tử khác [77, 78]. Hình 1.3. Cấu trúc phân tử amylozơ (a), amylopectin (b) 10
  23. Amylopectin là polysaccarit mạch nhánh. Ngoài mạch chính có liên kết - 1,4-glicozit, còn có mạch nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết -1,6-glicozit (Hình 1.3b). Amylopectin có cấu tạo phức tạp hơn, cứ khoảng 20 - 30 đơn vị glucozơ trên mạch sẽ có một liên kết α-1,6-glicozit để tạo mạch nhánh. Trên mạch nhánh cấp 1 lại hình thành mạch nhánh cấp 2, cứ như vậy phân tử amylopectin phân nhánh nhiều cấp [79]. Người ta có thể phân biệt được amylozơ và amylopectin dựa trên sự khác nhau về khối lượng phân tử cũng như về khả năng gắn kết đặc hiệu với dung dịch iot. Amylopectin có phân tử lượng trong khoảng 107 đến 108, trong khi phân tử lượng của amylozơ chỉ khoảng từ 105 đến 106. Ở nhiệt độ 20oC, khả năng gắn của amylopectin với iot chỉ khoảng 0,2% khối lượng, còn của amylozơ là 20% khối lượng [80]. Bảng 1.1 nêu tóm tắt các tính chất của amylozơ và amylopectin. Một điểm để phân biệt amylozơ và amylopectin là khả năng liên kết với các chất khác nhau. Nhiều nghiên cứu cho thấy, amylozơ (đặc biệt từ ngũ cốc) có thể kết hợp với một lượng tương đối lớn lipit. Khác với amylozơ, amylopectin, đặc biệt từ các loại củ, có các liên kết cộng hóa trị với photphat [81]. Bảng 1.1. Tính chất của amylozơ, amylopectin Tính chất Amylozơ Amylopectin Cấu trúc chung Chủ yếu mạch thẳng Mạch nhánh Màu với iot Xanh Tím max của phức chất với iot 650 nm 540 nm Ái lực với iot 19-20% <1% Chiều dài mạch trung bình (đơn vị 100 - 10 000 20 – 30 glicozit) Độ polyme hóa (đơn vị glicozit) 100 - 10 000 10 000 - 100 000 Chuyển thành maltozơ bởi -amylaza 70% 55% 1.2.1.2. Tính chất Tinh bột là chất rắn, màu trắng, không tan trong nước lạnh, tan được trong nước nóng. Trong nước nóng, các hạt hấp thụ nước phồng lên, dần dần vỡ ra tạo thành dung dịch nhớt. Để nguội, thu được dung dịch đồng nhất gọi là hồ tinh bột. 11
  24. Sự tạo hồ là quá trình bất thuận nghịch, tức là từ hồ không trở lại dạng bột được. Dung dịch hồ tinh bột cũng có tính quang hoạt, hiệu suất quay cực D = +201  210o [82]. Tinh bột không tác dụng với thuốc thử Fehling và Tollens, vì phân tử tinh bột chứa một số lượng lớn các mắt xích D-glucozơ, nhưng chỉ có rất ít mắt xích cuối mạch còn nhóm OH hemiaxetal. Tinh bột tác dụng với dung dịch iot cho màu xanh tím. Màu của dung dịch này là màu của hợp chất bọc do phân tử amylozơ ở dạng xoắn bọc các phân tử iot nằm ở phía trong vòng xoắn. Khi đun nóng, màu xanh tím biến mất, do liên kết hydro giữa các vòng xoắn bị phân cắt, mạch phân tử amylozơ tạm thời duỗi ra, nên các phân tử iot tách ra khỏi phân tử amylozơ. Khi để nguội, màu xanh lại xuất hiện trở lại. Tinh bột không tác dụng với dung dịch Cu(OH)2 để tạo ra dung dịch màu xanh như các hợp chất chứa nhiều nhóm OH khác. Trong mỗi mắt xích monosaccharide, D-glucozơ chỉ còn 3 nhóm OH tự do. Người ta cũng đã điều chế được triaxetylamylozơ C6H7O2(OCOCH3)3n hoặc trimetylamylozơ C6H7O2(OCOCH3)3n [83-85]. Tinh bột có thể bị thủy phân trong dung dịch axit hoặc enzym cho dextrin, rồi maltozơ và cuối cùng là D-glucozơ: H+ hoặc enzym (C6H10O5)n + nH2O (C6H10O5)m C12H22O11 C6H12O6 Tinh bột Dextrin Maltozơ D-Glucozơ 1.2.1.3. Sự hồ hóa tinh bột Sự hồ hóa là một tính chất quan trọng và độc đáo của tinh bột liên quan tới việc phá vỡ cấu trúc hạt làm cho phân tử tinh bột hòa tan trong nước. Hạt tinh bột có cấu trúc bán tinh thể, lớp tinh thể xen kẽ lớp vô định hình. Chính cấu trúc bao gói chặt chẽ như thế làm cho tinh bột không hòa tan trong nước ở nhiệt độ thường. Khi tinh bột được đun nóng trong nước, các hạt hấp thụ nước, trương nở và kết quả là mất tính lưỡng chiết và làm tăng độ nhớt của dung dịch. Kéo dài thời gian xử lý nhiệt có thể gây nổ vỡ hạt tinh bột, thủy phân từng phần và hòa tan các phần tử cấu thành tinh bột, kèm theo sự giảm độ nhớt của dung dịch. Nhiệt độ hồ hóa không 12
  25. phải là một điểm mà là một khoảng, nhiệt độ thấp nhất là nhiệt độ mà tại đó các hạt tinh bột bắt đầu mất tính lưỡng chiết, còn nhiệt độ cao nhất là nhiệt độ tại đó còn khoảng 10% hạt tinh bột chưa mất đi tính lưỡng chiết [86, 87]. Theo nghiên cứu của Wajira S. Ratnayake và David S. Jackson, trong suốt quá trình đun nóng, hạt tinh bột ngô vẫn giữ nguyên vẹn cho đến 50oC [88]. Theo quan sát của Jing-ming và Sen-lin, các hạt đánh mất tính toàn vẹn của chúng và hình thành một mạng lưới phân tử tại 64oC [89]. Trong khi đó, Wajira S. Ratnayake và David S. Jackson cho thấy, các hạt bị phá vỡ hoàn toàn và tạo thành một dung dịch hồ hóa ở trên 70oC. Sự khác biệt này có thể là do sự khác nhau về nồng độ và nguồn gốc thực vật. Ảnh hiển vi quang học cho thấy, các hạt tinh bột lớn trương nở đầu tiên và bắt đầu phá vỡ vào khoảng 55-60oC, các hạt nhỏ bắt đầu tan rã sau 65oC, hầu như tất cả các hạt bị phá vỡ không thể hồi phục tại hoặc trước 80oC (Hình 1.4). Hình 1.4. Ảnh hiển vi quang học của hạt tinh bột ngô ở các nhiệt độ khác nhau trong quá trình hồ hóa [88] Những sự thay đổi diễn ra suốt quá trình hồ hóa được cho là do vai trò của nước, sự ổn định tinh thể trong hạt, sự khác nhau giữa vùng tinh thể và vùng vô định hình và sự hóa dẻo liên quan đến sự tăng nhiệt độ nóng chảy. Tùy thuộc vào điều kiện hồ hóa như nhiệt độ, nguồn gốc tinh bột, kích thước hạt và pH môi trường mà nhiệt độ phá vỡ và trương nở hạt có thể biến đổi trong một khoảng khá rộng [84, 90]. 13
  26. 1.2.2. Maltodextrin (MD) 1.2.2.1. Cấu trúc, phân loại và đương lượng đường khử (DE) Thủy phân tinh bột bằng nhiệt, axit hoặc enzym hoặc cả axit và enzym tạo ra một dãy oligome. Do vậy, quá trình thủy phân cần được kiểm soát để đạt được điểm kết thúc mong muốn và được xác định thông qua giá trị đương lượng đường khử (DE), một thước đo định lượng về mức độ thủy phân tinh bột. DE là đại lượng cho biết lượng đường khử có trong sản phẩm, so với dextrozơ (hay glucozơ) và tính theo phần trăm trên khối lượng chất khô. Giá trị DE cho biết mức độ chuyển hóa từ tinh bột đến dextrozơ. Tinh bột tự nhiên, ví dụ tinh bột sắn, có DE gần bằng không, glucozơ hay dextrozơ là 100, còn maltodextrin có DE từ 3 đến 20, dextrin từ 1 đến 13 và si rô glucozơ có DE lớn hơn 20 [91, 92]. Theo định nghĩa của Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA-Food and Drug Administration) thì maltodextrin là các loại polysaccarit không ngọt, có công thức (C6H10O5).nH2O, là sản phẩm thủy phân tinh bột không hoàn toàn, có DE từ 3 đến 20. Đặc tính của maltodextrin phụ thuộc vào chỉ số DE của chúng. Sản phẩm có thể ở dạng bột màu trắng hoặc dạng dung dịch đậm đặc. Maltodextrin được công nhận là phụ gia an toàn đối với thực phẩm và dược phẩm cho người dùng. Maltodextrin bao gồm một hỗn hợp của polysaccarit, chủ yếu là D-glucozơ, maltozơ và một loạt các oligosaccarit và do đó, khối lượng phân tử là một khoảng giá trị biến đổi rộng [93-95]. Maltodextrin thường được phân loại theo giá trị DE. Sản phẩm có DE lớn thể hiện sự chuyển đổi thủy phân cao hơn và có khối lượng phân tử trung bình thấp hơn so với sản phẩm có DE nhỏ. Các tính chất đặc trưng của maltodextrin được cho là tương quan với DE và dựa vào DE có thể xác định các ứng dụng của chúng. Ví dụ, sản phẩm có DE từ 4-7 được sử dụng để tạo màng mỏng dễ tan và tự hủy, dùng để bọc kẹo, bọc trái cây khi bảo quản, làm phụ gia cho kem và các loại nước sốt, làm chất độn tạo viên trong công nghiệp dược. Sản phẩm có DE từ 9-12 được dùng trong công nghiệp sản xuất đồ uống, đặc biệt là đồ uống cho trẻ em, đồ uống và thức ăn riêng cho vận động viên thể thao, làm kẹo gum mềm, làm chất trợ sấy, chất giữ mùi hương, yếu tố tạo hình. Sản phẩm có DE từ 15-18 14
  27. được dùng làm chất kết dính, chất tăng vị cho đồ uống, đưa vào thành phần bơ, sữa bột, cà phê hòa tan, làm chất mang các thành phần không phải đường, làm tá dược trong công nghệ dược phẩm [96, 97]. Trong công nghiệp, maltodextrin được sản xuất từ tinh bột tự nhiên thông qua quá trình thủy phân không hoàn toàn, lọc rửa và sấy phun. Những phương pháp chế biến bằng vật lý và enzym dẫn đến sự mất đi cấu trúc dạng hạt của tinh bột. Khác với tinh bột, maltodextrin tan trong nước lạnh, đây là một thuận lợi cho các ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm [98]. 1.2.2.2. Tính chất a. Khả năng hút ẩm và ổn định lưu trữ Hút ẩm là một trong những thuộc tính quan trọng nhất quyết định tuổi thọ và thời gian ổn định lưu trữ của maltodextrin. Ảnh hưởng của độ ẩm tương đối từ 40 đến 95% đã được nghiên cứu trong tài liệu [99]. Mẫu tiếp xúc với môi trường có độ ẩm tương đối 75% và cao hơn nữa bị hóa dẻo sau 6 ngày, với mẫu có độ ẩm tương đối thấp (40-60%) sẽ đạt độ ẩm cân bằng sau 18 ngày kể từ ngày bảo quản mà không trải qua bất kỳ thay đổi nào về kết cấu [100, 101]. b. Kết tủa Kết tủa maltodextrin tại các nhiệt độ khác nhau có ảnh hưởng lớn đến khả năng ổn định lưu trữ, thời hạn sử dụng, chất lượng cuối cùng của thực phẩm chế biến. Kennedy và các đồng nghiệp [102] khi nghiên cứu maltodextrin có DE từ 14 đến 25, đã phát hiện thấy kết tủa xảy ra từ 4° đến 25°C với tốc độ khá nhanh. Kích thước hạt kết tủa nhỏ hơn 3,5 m chiếm 90%. Đối với maltodextrin có DE trong khoảng 14-18, các hạt kết tủa chứa thành phần chính là các oligosaccarit với độ polyme hóa DP 11 trở lên, không thấy các oligosaccarit nhỏ với DP dưới 7 . Các nghiên cứu cũng cho rằng, kết tủa được tạo ra thông qua một cơ chế tương tự như sự thủy phân cắt mạch trong amylozơ, cụ thể là, các phân tử mạch thẳng liên kết với nhau bằng liên kết hydro tạo ra các khối kết tập và cuối cùng là kết tủa [102, 103]. c. Nước trong mạng lưới và nước tự do Cấu trúc mạch thẳng hoặc phân nhánh của các phân tử polysaccarit ảnh hưởng không đáng kể đến tương tác giữa nước và chúng. Sự gắn kết của các 15
  28. phân tử nước với maltodextrin trong mạng gel là yếu, các phân tử nước có khả năng di chuyển rất cao và có thể trao đổi nhanh với nước tự do trong dung dịch. Mức độ hydrat hóa của tinh bột phụ thuộc vào nguồn gốc chúng được phân lập và tăng trong chuỗi tinh bột thủy phân: maltodextrin < tinh bột đậu < tinh bột mì < tinh bột ngô [98, 100]. 1.2.3. Alginat (Alg) Alginat là loại polysaccarit sinh học phong phú có nguồn gốc từ biển, tồn tại trong rong nâu với hàm lượng cao nhất, lên đến 40% khối lượng chất khô và được nhà hóa học người Anh E.C.C Stanford tìm ra năm 1881. Alginat nằm trong hệ thống gian bào ở dạng gel chứa các ion natri, canxi, magie, stronti và bari. Chức năng chính của chúng là tạo nên bộ khung có cấu trúc bền vững lẫn mềm dẻo của mô rong [104-107]. 1.2.3.1. Đặc điểm cấu trúc Alginat là tên gọi chung các muối của axit alginic. Về mặt cấu tạo, alginat là một copolyme mạch thẳng gồm các gốc β-D-mannuronic (M) và α-L-guluronic (G) liên kết với nhau bằng liên kết 1-4 glicozit theo trình tự và tỉ lệ khác nhau, phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu dùng để tách chiết. Cấu trúc của alginat khác nhau phụ thuộc vào vị trí của các monome trong chuỗi mạch, tạo nên các đoạn polyme đồng thể (MM hoặc GG) lẫn các polyme dị thể (MG hoặc GM) với khối lượng phân tử nằm trong khoảng 50 – 1000 kDa [105, 106, 108-110]. a) b) c) Hình 1.5. Đặc trưng cấu trúc của alginat: a) Các monome của alginat; b) Cấu trúc chuỗi, cấu dạng ghế; c) Các kiểu phân bố các khối trong mạch alginat 16
  29. 1.2.3.2. Tính chất của alginat a. Độ bền Độ bền của alginat phụ thuộc vào nhiệt độ và ion kim loại và được sắp xếp theo thứ tự: natri alginat > amoni alginat > axit alginic. Natri alginat tinh khiết dạng bột khô có thể ổn định trong khoảng vài tháng với điều kiện được bảo quản nơi mát mẻ, khô ráo, tránh chiếu sáng trực tiếp. Ở nhiệt độ thấp, natri alginat có thể để được trong vài năm mà khối lượng phân tử giảm không đáng kể. Ngược lại, axit alginic khô có độ bền hạn chế ở điều kiện thường do sự cắt mạch nội phân tử với các xúc tác axit. Alginat có độ nhớt cao kém bền hơn alginat có độ nhớt trung bình hoặc thấp. Dung dịch alginat ổn định ở pH từ 5,5 - 10 tại nhiệt độ phòng một thời gian dài, nhưng sẽ chuyển sang dạng gel ở pH nhỏ hơn 5,5 [104, 106, 111]. b. Độ tan Có ba yếu tố quan trọng quyết định độ tan của alginat trong nước, đó là: độ cứng của nước, độ pH và lực ion tổng của các chất tan. Độ cứng của nước (ví dụ như hàm lượng ion Ca2+) được xem là yếu tố chính ảnh hưởng đến độ tan. Ở nồng độ Ca2+ dưới 3 mM, gần như tất cả alginat ở dạng tan, ngược lại khi nồng độ ion Ca2+ vượt quá 3 mM, chỉ có 1 đến 3% alginat tan trong dung dịch. Giới hạn này không phụ thuộc nồng độ alginat. Độ pH của dung môi là yếu tố quan trọng bởi vì nó xác định điện tích trên các gốc uronic trong alginat. Phương pháp chuẩn độ điện thế đã xác định được hằng số điện ly (pKa) của các axit mannuronic và axit guluronic lần lượt là 3,38 và 3,65. Giá trị pKa giữa các gốc uronic monome chỉ khác nhau rất ít. Giá trị pH giảm đột ngột xuống dưới pKa sẽ gây kết tủa các phân tử axit alginic, ngược lại khi giảm pH từ từ sẽ dẫn đến sự tạo thành gel axit alginic. Lực ion của môi trường cũng đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến độ tan của alginat. Alginat có thể được kết tủa và tách phân đoạn thành những phân đoạn giàu các gốc mannuronat ở nồng độ cao của các muối vô cơ như kali clorua [106, 112]. 17
  30. c. Độ nhớt Nhìn chung, các dung dịch alginat đều có độ nhớt cao. Tính chất này là do cấu dạng cồng kềnh của phân tử alginat và khả năng tạo thành dung dịch nhớt. Alginat có khối lượng phân tử trung bình lớn thì độ nhớt càng lớn. Tỷ lệ mannuronic/guluronic (M/G) cũng ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm. Do tính chất đa cực và cấu dạng của phân tử alginat, tính chất tạo nhớt của alginat cũng phụ thuộc vào lực ion của dung dịch. Khi lực ion cao, phân tử sẽ có cấu dạng ít duỗi dài và có khả năng tạo nhớt thấp hơn [104, 106, 110]. d. Tính chất tạo gel Dung dịch natri alginat có khả năng tạo gel khi có mặt những ion hóa trị II và III. Khi nhỏ một giọt dung dịch natri alginat vào dung dịch CaCl2, sự tạo gel xảy ra gần như tức thời trên bề mặt của giọt và hạt gel có dạng hình cầu. Các gel được tạo thành ở bất kỳ nhiệt độ nào (dưới 100oC) và không bị chảy ra khi đun nóng. Khả năng tạo gel này được giải thích bằng mô hình cấu trúc “hộp trứng” của phân tử canxi alginat. Các phân tử sắp xếp song song, các phần gấp nếp của đoạn GGGG tạo thành khoảng không gian như “chỗ đặt trứng”. Các ion canxi chui vào khoảng trống này, liên kết với các nhóm cacboxyl và các nguyên tử oxy vòng trong của mỗi đoạn song song. Lúc này, các phân đoạn GGGG nối với nhau qua các ion Ca2+ làm cho các phân tử gần nhau hơn và ép nước thoát ra ngoài, khi đó gel alginat được hình thành. (a) (b) Hình 1.6 . Mô hình liên kết gi ữa ion Ca2+ và alginat a) Mô hình tạo hạt gel canxi alginat; b) Liên kết của block G với ion canxi Khả năng tạo gel và độ bền phụ thuộc vào hàm lượng các đoạn guluronic (G). Phản ứng tạo liên kết gel sẽ không xảy ra ở những đoạn poly - mannuronic và 18
  31. những đoạn MG (mannuronic - guluronic). Tỷ lệ G lớn hơn so với M thì khả năng tạo gel của alginat sẽ tốt hơn [104, 106, 110]. e. Tính chất sinh học Alginat có các đặc tính như không độc, tương thích sinh học và hoạt tính sinh học. Hiệu ứng sinh học của alginat được thể hiện qua điều trị bệnh tiểu đường và các yếu tố gây hoại tử khối u. Khả năng miễn dịch của các polymannuronat đến nay đã được quan sát trong các mô hình thử nghiệm trên cơ thể động vật ở những vùng khác nhau để ngăn ngừa các bệnh nhiễm khuẩn và bức xạ nguy hiểm, làm tăng khả năng miễn dịch không đặc hiệu. Qua nghiên cứu in vitro và in vivo, hoạt tính của các thành phần trong phân tử alginat là khác nhau. Ví dụ, alginat có hàm lượng M cao sẽ có khả năng miễn dịch mạnh gấp 10 lần so với alginat hàm lượng G cao [105, 106]. 1.2.3.3. Oligosaccarit từ alginat Oligoalginat được dùng để chỉ các oligosaccarit xuất phát từ alginat. Sự đa dạng về cấu trúc và tính chất của alginat là do sự sắp xếp khác nhau về tỉ lệ và trình tự của các gốc M và G trong phân tử. Các phân đoạn polyme ở dạng các chuỗi homopolyme của axit mannuronic được gọi là các khối M, còn các chuỗi homopolyme của axit guluronic được gọi là các khối G và các chuỗi hỗn hợp của cả hai axit này, được gọi là các khối MG hoặc các khối xen kẽ. Thường alginat bao gồm 3 loại khối và mỗi khối thường chứa 3 đến 30 đơn vị monome. Gần đây, các oligome của alginat thu được bằng việc cắt mạch alginat nhờ enzym với những tính năng đặc biệt như kích thích tăng trưởng vi khuẩn đường ruột bifidobacteria [113, 114], thúc đẩy quá trình nảy mầm hạt giống và phát triển rễ, thân, lá của cây, có khả năng kháng virut [115]. Các oligoalginat với thành phần và trật tự monome thích hợp có những ứng dụng quan trọng như oligoalginat giàu các khối G được dùng để loại bỏ các ion kim loại độc hại như chì, stronti và bari. Trong khi đó, các oligoalginat giàu các khối M có tác dụng kích thích các tế bào trong cơ chế bảo vệ bằng miễn dịch chống lại sự nhiễm trùng và các tổn thương do phóng xạ [116, 117]. Hiện nay, để điều chế các oligoalginat có thể dùng các enzym đặc hiệu hoặc dùng axit thủy phân [105, 118-120]. 19
  32. 1.2.3.4. Ứng dụng của alginat Do có thành phần, cấu trúc và tính chất đa dạng, alginat là một trong những polysaccarit có nhiều ứng dụng nhất. Các ứng dụng này trải rộng từ các ứng dụng có tính chất kỹ thuật truyền thống, đến thực phẩm và y sinh học. - Trong kỹ thuật Ứng dụng kỹ thuật quan trọng phổ biến nhất của alginat (chiếm 50% tổng sản lượng alginat trên toàn thế giới) là trong kỹ thuật giấy và in ấn do khả năng tạo ra màu sắc nét và đồng đều. Ngoài ra, alginat cũng là tác nhân gắn kết trong sản xuất que hàn [108]. - Trong thực phẩm Alginat được sử dụng làm chất phụ gia để cải thiện, bổ sung và ổn định kết cấu bên ngoài của thực phẩm dựa trên các tính chất như làm tăng độ nhớt, khả năng tạo gel và làm ổn định hỗn hợp với nước chống đông và nhũ hóa. Trong ứng dụng làm mứt, thạch, tạo mùi hoa quả cho thực phẩm, khả năng đồng tạo gel giữa alginat giàu G và pectin este hóa cao có vai trò rất hữu ích. Hệ alginat/pectin có thể tạo ra gel thuận nghịch, ngược với gel alginat có liên kết ngang ion thuần túy [104]. - Trong dược phẩm và y sinh học Alginat là vật liệu sinh học đã được nghiên cứu và sử dụng cho nhiều ứng dụng y sinh, do tính tương thích sinh học, độc tính thấp, tạo gel ở điều kiện êm dịu và chi phí thấp [105, 106]. Khả năng gắn kết tế bào bên trong các hạt cầu Ca-alginat đã trở thành kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi nhất để cố định tế bào sống [121]. Gel alginat điều chế bằng phương pháp liên kết ngang có cấu trúc tương tự như chất nền ngoại bào của mô sống nên được dùng trong việc làm lành vết thương, là tác nhân có hoạt tính sinh học dẫn truyền thuốc và gen. Ngoài ra, gel alginat rất hứa hẹn cho việc cấy ghép tế bào trong công nghệ mô, sản xuất insulin để điều trị bệnh tiểu đường type I dưới dạng thuốc uống hoặc thuốc tiêm [105, 110, 122]. 1.3. Vật liệu composit HA/polyme 1.3.1. Sự tạo thành vật liệu composit HA/polyme Từ “composit” có nguồn gốc từ tiếng Latinh có nghĩa là cho các chất, các thành phần, trộn vào cùng nhau. Trong khoa học, composit là loại vật liệu được 20
  33. tạo nên từ hai hay nhiều thành phần có các tính chất lý hóa khác nhau đáng kể [123]. Mặc dù, tính chất của các thành phần vẫn giữ nguyên, nhưng sự kết hợp giữa chúng lại tạo ra một vật liệu mới có các đặc tính tốt hơn các thành phần riêng lẻ ban đầu. Composit có thể là vật liệu tự nhiên hoặc tổng hợp. Các ví dụ cho composit tự nhiên là: gỗ, vỏ sò, xương, răng Lấy cảm hứng từ những vật liệu đó, hiện nay, có một xu hướng mới là phát triển các vật liệu composit mô phỏng sinh học, vật liệu lai vô cơ/hữu cơ với pha vô cơ là HA và chất nền là các polyme [124-126]. Xương là vật liệu composit vô cơ/hữu cơ chứa HA dạng hình que kích thước nanomet gắn trong chất nền collagen loại I. Vì vậy, composit của HA và collagen được xem là vật liệu hấp dẫn để chế tạo miếng cấy ghép mô xương. HA hoặc collagen khi sử dụng riêng lẻ đều có tính dẫn xương nhưng khi được kết hợp trong vật liệu composit cho thấy khả năng thúc đẩy quá trình tạo xương vượt trội. Tính chất mềm dẻo của collagen làm tăng độ dẻo dai cho vật liệu và làm giảm độ cứng, độ giòn của HA, còn việc bổ sung HA vào chất nền collagen giúp cải thiện độ ổn định cơ học của miếng cấy ghép [127, 128]. Các polyme tổng hợp mà chủ yếu là các polyeste đã được sử dụng như: poly (L-lactic)[26], poly(vinyl alcohol) [129], poly(-caprolacton) [130, 131] Tuy nhiên, xu hướng hiện nay là sử dụng các polyme tự nhiên do chúng tương thích sinh học, không độc, gần gũi với hệ sinh học như: các protein (collagen [127], gelatin [177] ) hoặc các polysaccarit (chitosan [132], tinh bột [133], alginat [134], dextran [135], chondroitin sunfat [136]) và các dẫn xuất của chúng. Trong sự hình thành vật liệu composit HA/polyme, polyme đóng vai trò là chất nền cung cấp các vị trí tạo mầm và điều chỉnh sự phát triển và hình thái học của tinh thể HA. Các nhóm cacboxyl trên phân tử polyme có vị trí quan trọng trong sự tạo mầm của tinh thể HA [137]. Z. X. Liu và cộng sự [138] đã gắn các nhóm cacboxyl, amin và metyl trên đế Au và đánh giá sự hình thành và tăng trưởng của mầm tinh thể HA trong dung dịch giả dịch thể người (SBF). Ở bề mặt chứa nhóm cacboxyl, lượng tinh thể HA hình thành dày gấp ba lần so với bề mặt amin, còn trên bề mặt chứa nhóm metyl gần như không có tinh thể HA nào được tìm thấy. Bằng phương pháp hiển vi lực nguyên tử (AFM), Nonoyama và cộng 21
  34. sự [139] đã quan sát giai đoạn đầu tiên của quá trình tạo mầm HA và thấy rằng, ban đầu các nhóm cacboxyl có sự tương tác với ion canxi và sau đó ion photphat sẽ gắn lên ion canxi (Hình 1.7). Hình 1.7. Sự tạo mầm của HA trên chất nền polyme. (a) Các nhóm chức trên phân tử polyme là các vị trí tạo mầm cho tinh thể HA, (b) Sự tạo mầm và phát triển tinh thể HA trên các polyme được gắn đế trên đế Au [139] Bên cạnh các nhóm cacboxyl, nhóm cacbonyl trên collagen cũng có ưu thế cao cho sự tạo mầm tinh thể [140]. Đối với chất nền tơ sợi Fibroin, có những vị trí tạo mầm khác như nhóm amin và hydroxyl. Các nhóm amin trên chitosan mang điện dương cũng được xem là có tương tác với các ion canxi và tạo thành phức chitosan - ion canxi trước khi tạo mầm [141]. Hunter và cộng sự [142] đã sử dụng phương pháp mô phỏng động lực học phân tử (Molecular Dynamics – MD), cho thấy tương tác giữa các phân tử chất nền polyme và HA chủ yếu là lực tĩnh điện. Thông thường, các nhóm mang điện tích âm trên phân tử polyme được xem là có liên kết mạnh với các ion canxi trong tinh thể HA, trong khi các nhóm tích điện dương có liên kết với các ion photphat. Vì vậy, các polyme tự nhiên phân cực như chitosan [132], alginat [134], tinh bột [133], sẽ có khả năng kết dính và tương tác tốt với HA. Tương tác hóa học giữa HA và 22
  35. polyme như liên kết hydro, lực Van der Waalls, hoặc phức chất cacboxyl-Ca- cacboxyl, cho phép phân tán đồng đều HA trong pha hữu cơ. Sự liên kết giữa các thành phần trong composit là tùy thuộc vào mức độ tương tác giữa HA và polyme. Nếu chỉ xảy ra tương tác yếu thì các hạt HA chỉ được gắn cơ học trong nền polyme, ở mức độ tương tác tốt nhất sẽ tạo ra vật liệu lai vô cơ-hữu cơ. Bằng các kết quả phân tích XRD, SEM, TEM, FT-IR và TG-DTA, các nghiên cứu đã cho thấy sự tạo thành vật liệu lai vô cơ-hữu cơ HA/polyme với cấu trúc đồng nhất giữa pha vô cơ và hữu cơ [48, 143]. T. Chae và cộng sự đã mô phỏng quá trình khoáng hóa sợi collagen trong mô xương bằng cách chế tạo composit HA/alginat khi kết tủa trực tiếp HA trên các sợi alginat [144]. Cơ chế của sự hình thành trực tiếp tinh thể HA trên sợi alginat được mô tả trên Hình 1.8. Ban đầu, alginat tạo phức dạng “hộp trứng” với ion canxi, tiếp 2+ - 3- đến các ion Ca , OH , PO4 trong dung dịch khuếch tán đến các vị trí -COO Ca COO- trên sợi alginat để hình thành mầm tinh thể HA. Do đó, các tinh thể nano HA kết tủa và phát triển trên các vị trí tạo mầm dọc theo các sợi nano alginat có chức năng như một khuôn dưỡng để quá trình khoáng hóa xảy ra. Hình 1.8. Cấu trúc hóa học của (a) mô hình “hộp trứng” của canxi alginat, (b) mô hình “hộp trứng” với các ion tiền chất cho sự tạo mầm HA và (c) cấu trúc “hộp trứng” khoáng hóa và (d) sợi nano composit HA/alginat tổng hợp trực tiếp [143] Các composit HA/chitosan đã được nghiên cứu tổng hợp bằng nhiều phương pháp khác nhau. Do chitosan tan tốt trong dung dịch nước chứa các axit 23
  36. hữu cơ như axit axetic, axit lactic, axit malic và axit xitric, nên ảnh hưởng của dung dịch axit hữu cơ đối với vi cấu trúc của sản phẩm đã được khảo sát [145]. HA ở dạng tinh thể hình thành khi sử dụng axit axetic và axit lactic, trong khi đó HA tồn tại ở dạng vô định hình khi dùng các axit hữu cơ có nhiều hơn hai nhóm cacboxyl. Theo một số nghiên cứu, sự tăng trưởng của các tinh thể HA bị ức chế bởi các axit hữu cơ có nhiều hơn hai nhóm cacboxyl [146]. Kato và cộng sự đã chỉ ra rằng, axit polyacrylic (PAA) là một chất ức chế sự kết tinh của tinh thể HA [147]. Các nhóm cacboxylic liên kết mạnh với các nguyên tử canxi và hình thành cấu trúc chelat. Sự tương tác giữa các ion anion PAA và cation Ca tạo ra hợp chất - 2+ 2+ 3- trung gian dạng PAA -Ca trì hoãn sự tương tác của các ion Ca và PO4 trong việc hình thành HA [148]. 1.3.2. Các phương pháp tổng hợp composit HA/polyme 1.3.2.1. Phương pháp trộn HA và polyme Phương pháp phổ biến nhất để chế tạo composit HA/polyme là trộn HA ở dạng bột hoặc ở dạng huyền phù với các polyme. Phương pháp này có thể tạo ra vật liệu composit dạng bột, màng, khung xốp [149, 150]. Trộn HA với polyme và thay đổi tỉ lệ khối lượng các thành phần sẽ tạo ra các composit có tính chất khác nhau. HA là sản phẩm thương mại, hoặc được điều chế bằng các phương pháp hóa lí, hoặc được chiết tách từ pha khoáng tự nhiên của xương động vật, vỏ trứng, san hô Tinh thể HA có nhiều hình dạng khác nhau, hình cầu, hình que, hình kim, hình phiến và thường kết tập thành từng khối do năng lượng bề mặt tương đối lớn của các tinh thể nano [151]. Murugan và cộng sự [152] đã sử dụng phương pháp này để chế tạo các hệ composit cấu trúc nano của HA với chitosan theo hai bước: kết tủa HA trong môi trường kiềm (ở pH = 10,0 bằng NH4OH) từ các muối CaCl2, (NH4)2HPO4 và tiếp theo là trộn HA cấu trúc nano với các dung dịch chitosan nồng độ khác nhau trong axit axetic ở nhiệt độ cố định. Finisie và các cộng sự [150] đã sử dụng phương pháp trộn để chế tạo composit HA và chitosan cấu trúc xốp từ hỗn hợp của HA, nhôm và chitosan với tỉ lệ khác nhau. Vai trò của nhôm là tạo ra các lỗ xốp có kích thước hơn 100 m được tạo thành qua quá trình tương tác giữa natri 24
  37. aluminat với dung dịch đậm đặc NaOH giải phóng hydro. Composit HA/collagen cũng được chế tạo đơn giản bằng cách trộn bột HA và dung dịch hoặc gel collagen rồi tiến hành đông khô [149, 153]. Xác định cấu trúc của các composit thu được bằng quy trình chế tạo này cho thấy, các hạt HA bị “mắc kẹt vật lí” trong chất nền collagen được thể hiện trên Hình 1.9. Phương pháp này đơn giản nhưng rất khó để phân tán đồng nhất HA trong chất nền polyme do thiếu sự tương tác giữa pha vô cơ và pha hữu cơ. Hình 1.9. Sơ đồ mô tả các hạt HA bị “mắc kẹt” vật lí trong chất nền collagen (a). Theo ảnh SEM, HA kết tập trong chất nền collagen tổng hợp bằng phương pháp trộn (b) [127] 1.3.2.2. Phương pháp cơ nhiệt Phương pháp cơ nhiệt để chế tạo vật liệu composit HA/polyme gồm các bước: nghiền trộn HA với polyme sau đó nén hoặc ép phun. Bước đầu tiên bị ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các yếu tố như nhiệt độ, tốc độ nghiền trộn và thời gian xử lý và được xem là quan trọng nhất để đạt được sự phân bố đồng nhất của các hạt vô cơ trong composit [154, 155]. Mathieu và các cộng sự [156] đã so sánh ba phương pháp điều chế composit HA/poly(L-lactic). Kỹ thuật đầu tiên là trộn bột HA khô và các viên polyme rồi nén khuôn. Quá trình thứ hai dựa trên sự phân tán của các hạt HA vào dung dịch chứa polyme và dung môi. Phương pháp thứ ba là ép đùn hỗn hợp HA/polyme nóng chảy. Phương pháp trộn bột khô dẫn đến sự phân tán không đồng đều các hạt vô cơ xung quanh các viên polyme, trong khi đó phương pháp thứ hai và thứ ba tạo ra một sự phân tán khá đồng nhất của HA trong poly(L-lactic) cũng như các polyme khác như poly(ε-caprolacton) [156], poly(hydroxybutyrat-co-hydroxyvalerat) [11], 25
  38. poly(D, L-lactic) [157], poly(ete ete xeton) [158] và polyamit 66 [159]. Nhược điểm chính của phương pháp thứ hai là nguy cơ dư lượng dung môi hữu cơ độc hại. Phương pháp thứ ba cho phép điều chế một cách khá đồng nhất composit HA/polyme. Li và cộng sự đã dùng sóng siêu âm hỗ trợ phân tán hạt nano HA hình kim vào monome anhydrit methacrylat, rồi sử dụng tia cực tím kích thích quá trình quang trùng hợp để tạo ra một mạng lưới liên kết ngang. Sản phẩm composit cuối cùng chứa tinh thể nano HA phân bố đồng nhất với các tính chất cơ học được cải thiện [160]. 1.3.2.3. Phương pháp điện hóa Các phương pháp điện hóa có thể tạo ra vật liệu composit HA/polyme dạng màng, màng đa lớp, sợi và ống. a. Kỹ thuật mạ điện Lắng đọng điện hóa (mạ điện) là một quá trình, trong đó các hạt composit lơ lửng trong môi trường lỏng, di chuyển trong một điện trường và được lắng đọng trên một điện cực. Cho đến nay, hai quá trình mạ điện đã được phát triển để tạo thành màng composit: lắng đọng điện di (EPD) và lắng đọng điện phân (ELD) [161]. Kỹ thuật này cho phép kiểm soát chặt chẽ các tính chất của màng về độ dày, tính đồng nhất và tỷ lệ lắng đọng. Phương pháp mạ điện đặc biệt thích hợp cho sự hình thành của màng đồng nhất trên nền của một hình dạng phức tạp hoặc lắng đọng trên các vùng được lựa chọn của chất nền. Pang và cộng sự [162] đã phát triển một phương pháp điện di đồng lắng đọng từng lớp composit HA/chitosan bảo vệ vật liệu thép khiến cho việc tiếp xúc với các dung môi sinh lý ít gây ra nhiễm trùng. Thành phần và độ dày của màng composit phụ thuộc vào hàm lượng HA và thời gian lắng đọng trong dung dịch chitosan. Grandfield và đồng nghiệp [163] chế tạo một lớp phủ HA/silica/chitosan sử dụng phương pháp EPD chế tạo lớp phủ có độ dày khác nhau (lên đến 100 µm). Thành phần lắng đọng, vi cấu trúc, độ xốp của lớp phủ phụ thuộc vào nồng độ HA, silica và chitosan trong dung dịch cũng như thời lượng lắng đọng. Để thay đổi bề mặt và bảo vệ hợp kim titan-niken trong môi trường sinh lý cơ thể, Sun và cộng sự [164] đã điều chế vật liệu composit dạng 26
  39. màng của HA, heparin và thủy tinh sinh học trên nền chitosan, lắng đọng trên catot từ hợp kim nói trên. Redepenning và cộng sự [165] cũng điều chế composit HA và chitosan bằng phương pháp điện hóa từ pha brushit (một pha của CaP) và chitosan trong môi trường kiềm phủ trên miếng ghép titan. Hình 1.10 trình bày phương pháp EPD để chế tạo lớp phủ composit chống ăn mòn gồm HA, hyaluronic axit và graphen oxit (GO-HY-HA) trên bề mặt titan [167]. Hình 1.10. Sơ đồ thí nghiệm (a) và cơ chế (b) của quá trình EPD điều chế lớp phủ composit GO-HY-HA trên chất nền Ti [167] b. Kỹ thuật điện xoay tròn (electrospining technique) Để chế tạo vật liệu composit dạng sợi với các tính năng độc đáo và thú vị, kỹ thuật điện xoay tròn được xem là một phương pháp đơn giản và hiệu quả. Vật liệu polyme được sử dụng trong kỹ thuật này có thể là các polyme tự nhiên như collagen, chitosan, tơ sợi; các polyme tổng hợp phân hủy sinh học như axit polyglycolic (PGA) và poly(-caprolacton) (PCL) [155]. Ito và cộng sự [168] đã chế tạo màng sợi nano của poly (3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyvalerat) (PHBV) bằng phương pháp điện xoay tròn và sau đó tạo composit với HA bằng cách ngâm màng trong dung dịch giả dịch thể người (SBF- Simulated Body Fluids). Các sợi 27
  40. nano với đường kính trung bình dao động từ 100 đến 2000 nm liên kết với nhau làm tăng diện tích bề mặt riêng. Đặc biệt, quá trình phân hủy sinh học của màng HA/PHBV khá nhanh do sự xâm nhập của các enzym vào màng làm tăng tính ưa nước của bề mặt. H. W. Kim và cộng sự [169] đã sử dụng phương pháp điện xoay tròn chế tạo composit HA/gelatin dạng sợi với kích thước 200-400 nm thể hiện trên Hình 1.11. Kết tủa HA Đông khô Dung dịch Kỹ thuật điện Liên kết ngang composit HA/gelatin xoay tròn tạo màng sợi Hình 1.11. Sơ đồ chế tạo màng sợi composit HA/gelatin theo phương pháp điện xoay tròn [169] Kết tủa HA/gelatin được đông khô và hòa tan trong một dung môi hữu cơ hexafluoro-2-propanol (HFP), dạng sợi của composit HA/gelatin được chế tạo bằng phương điện xoay tròn, sau đó được liên kết ngang tạo màng sợi. 1.3.2.4 . Phương pháp kết tủa trực tiếp Mặc dù các phương pháp trộn, cơ nhiệt, điện hóa nêu trên có nhiều ưu điểm, nhưng các composit thu được thường không đồng nhất ở mức vi cấu trúc vì khó có được sự phân bố đồng đều của pha vô cơ trong chất nền polyme. Điều này có thể làm suy giảm các đặc tính lý, hóa, cơ, tương thích sinh học và phân hủy sinh học của vật liệu. Vì vậy, trong mấy thập niên gần đây, các nhà nghiên cứu đang tập trung vào một phương pháp mới nhiều triển vọng là phương pháp kết tủa trực tiếp (in situ method) [129, 133, 170, 171]. Phương pháp này mô phỏng quá trình tạo thành composit vô cơ-hữu cơ trong tự nhiên. Kết tủa trực tiếp HA trong chất nền polyme cho phép kiểm soát cấu trúc và thành phần của composit với các tinh thể HA có kích thước nhỏ, độ tinh thể thấp, phân tán đồng đều trên nền polyme, tương 28
  41. tự như HA sinh học [21, 27, 143]. Theo phương pháp kết tủa trực tiếp, các polyme có thể được trộn đồng thời hoặc riêng biệt với các tiền chất vô cơ của HA. Tỉ lệ các thành phần và điều kiện phản ứng khác nhau sẽ làm thay đổi các tính chất đặc trưng của composit HA/polyme. Tampieri và cộng sự [126] đã chế tạo composit HA/collagen và so sánh với mô xương tự nhiên bằng cách sử dụng hai phương pháp khác nhau. Phương pháp thứ nhất là phân tán HA trong dung dịch collagen rồi thu sản phẩm bằng kỹ thuật đông khô. Phương pháp thứ hai là kết tủa trực tiếp HA trên các sợi collagen. Composit thu được bằng cách thứ nhất có cấu trúc tương tự như collagen ban đầu không khoáng hóa. Kích thước tinh thể HA không đồng nhất, thường kết tập và phân bố ngẫu nhiên vào chất nền, chứng tỏ rằng không có tương tác thực sự của HA với các sợi collagen. Trong khi đó, phương pháp thứ hai cho phép quá trình tạo mầm tinh thể nano HA trực tiếp trên các sợi collagen. Do vậy, hai thành phần (HA và collagen) có sự tương tác mạnh, hình thành một vật liệu hoàn toàn tương tự với mô xương tự nhiên. S. C. Liou và cộng sự [172] đã chế tạo vật liệu composit HA/polyacrylic axit (PAA) bằng phương pháp kết tủa trực tiếp. Tinh thể HA hình kim, độ tinh thể kém, có cấu trúc nhân vỏ được kết tinh trực tiếp khi nhỏ dung dịch H3PO4 vào hỗn hợp chứa (CH3COO)2Ca và PAA. Hình thái học của HA tạo thành phụ thuộc vào pH của dung dịch và hàm lượng của PAA. Yamaguchi [173] đã phát triển phương pháp đồng kết tủa bằng cách nhỏ chitosan trong dung dịch axit photphoric vào huyền phù Ca(OH)2. Redepenning và cộng sự [174] trộn một dung dịch của polyme sinh học với tiền chất vô cơ để tạo thành pha khoáng CaP, tiếp theo kết tủa composit ở dạng hydrogel hoặc dạng hạt riêng biệt. Hu và cộng sự [175] đã đưa ra phương pháp, sử dụng chitosan dạng hydrogel và khoáng hóa nó thông qua phản ứng kết tủa trực tiếp HA khi kiểm soát quá trình khuếch tán các ion. M. Meskinfam và cộng sự [176] đã dùng phương pháp mô phỏng sinh học điều chế HA trong chất nền gelatin-tinh bột. Việc thay đổi hàm lượng polyme làm biến đổi cấu trúc và hình thái học của composit HA/gelatin/tinh bột. Ái lực mạnh của gelatin với HA cùng với tính phân cực của tinh bột làm cho HA được phân tán đồng đều trong chất nền polyme. 29
  42. Chang và cộng sự [177] đã trình bày một quá trình tương tự để điều chế composit HA và gelatin, thông qua việc khuếch tán và điều chỉnh nồng độ các ion 2+ 3- Ca và PO4 trong quá trình hòa tan tiền chất và đồng kết tủa composit. Các phương pháp kết tủa trực tiếp nói trên đã tạo ra cấu trúc composit kết hợp đầy đủ tính chất giữa HA và chất nền polyme ở cấp độ micro hay nanomet. Đáng chú ý, mỗi phương pháp lại tạo ra một loại hình cụ thể của vật liệu composit với cấu trúc và tính chất đặc trưng. 1.3.3. Đặc trưng của vật liệu composit HA/polyme Tính chất của vật liệu composit chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi một số yếu tố như hình dạng, kích thước, tính chất, tỷ lệ cũng như tương tác giữa HA và polyme. 1.3.3.1. Thành phần Sự tồn tại cũng như kích thước và độ tinh thể của HA trong vật liệu composit thường được đánh giá bởi phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) [131, 133, 146, 170, 173, 177-181]. Thành phần pha vô cơ tạo thành phụ thuộc vào lượng chất ban đầu và các điều kiện phản ứng. Để chế tạo HA, thường phải chuẩn bị các dung dịch với tỉ lệ mol Ca/P là 1,67 đúng như tỉ lệ phân tử HA và duy trì pH phản ứng ở vùng kiềm. Giản đồ XRD của các composit với các polyme như collagen [127], gelatin [169], chitosan [182], tinh bột [133, 176], alginat [183] thường có các đỉnh nhiễu xạ đặc trưng của HA mở rộng, chứng tỏ HA tạo thành có kích thước nhỏ và độ tinh thể thấp tương tự như pha khoáng sinh học. Phương pháp XRD cũng phát hiện ra cơ chế hình thành pha HA trong composit thông qua các pha khoáng trung gian CaP. Các polyme đã hạn chế việc chuyển pha từ các CaP vô định hình sang tinh thể HA 2+ 3- - và cản trở việc khuếch tán các ion Ca , PO4 , OH tạo mầm và phát triển tinh thể HA. Rusu và cộng sự [48] đã dùng kỹ thuật XRD để nghiên cứu sự hình thành cũng như xác định kích thước tinh thể HA trong nền chitosan bằng phương pháp kết tủa trực tiếp từ các dung dịch CaCl2 và Na2HPO4 (Hình 1.12). Một mẫu được giữ ở pH 5,6; các mẫu khác được điều chỉnh pH tăng lên 11 bằng cách nhỏ NaOH và giữ ở 0,3; 1; 2; 4; 8 và 24 giờ rồi đông khô. Ở pH 5,6, chỉ có pha brushit hình thành, còn ở pH 11, pha brushit và các pha CaP vô định hình chuyển dần theo thời gian sang pha HA bền hơn. 30
  43. Hình 1.12. Sự chuyển pha từ brushit sang HA theo thời gian [48] Sau 24 giờ già hóa, quá trình chuyển pha xảy ra gần như hoàn toàn, chỉ còn tồn tại pha brushit ở lượng vết. Kích thước trung bình và tốc độ phát triển tinh thể tăng lên cùng với thời gian phản ứng và thời gian già hóa tại nhiệt độ 22oC. Ngoài ra, hàm lượng chitosan càng cao, kích thước tinh thể HA càng nhỏ. Hàm lượng của các thành phần trong hệ composit thường được xác định bởi phương pháp DTA-TGA [150]. Khối lượng thực của các pha thường có khác biệt một ít so với lượng chất tính toán ban đầu. Bằng phương pháp TGA, W. Y. Choi [131] đã xác định khối lượng cuối cùng của HA là 10,2, 18,4, và 32,8% tương ứng với khối lượng ban đầu 10, 20, và 30% trong composit HA/PCL. Hình 1.13 trình bày giản đồ phân tích nhiệt (DTA-TGA) của các vật liệu composit HA/chitosan với tỉ lệ thành phần thay đổi [144]. 31
  44. Hình 1.13. Giản đồ DT-TGA của các vật liệu composit HA/chitosan với hàm lượng khác nhau [144] Đường TGA cho thấy, trọng lượng mẫu giảm nhanh chóng khi nhiệt độ tăng, đặc biệt là trong phạm vi 40-130oC và 250-600oC. Một pic thu nhiệt rộng được quan sát xung quanh 80oC trên đường DTA được gán cho sự mất nước, trong khi hai đỉnh tỏa nhiệt ở 345oC và trên 540oC được gán cho sự phân hủy nhiệt của chitosan. Như vậy, các composit có khả năng chịu nhiệt cao hơn 250oC và nhiệt độ phân hủy giảm khi tăng hàm lượng HA. Các đường TGA không cho thấy sự thay đổi trọng lượng trên 800oC, hàm lượng chitosan trong composit được xác định từ sự thay đổi khối lượng giữa 250 đến 800oC trên đường TGA. Hàm lượng composit được tìm thấy gần như phù hợp với lượng chất ban đầu thêm vào trong quá trình điều chế chứng tỏ chitosan kết hợp tốt với HA trong composit. 1.3.3.2. Hình thái học Hình thái học của composit là một tính chất đặc trưng quan trọng, quyết định đến các tính chất khác và khả năng ứng dụng của vật liệu. Nó bị ảnh hưởng bởi các điều kiện phản ứng, như: nồng độ, nhiệt độ, pH, thời gian, hình thái học của polyme cũng như tương tác giữa polyme và HA. Composit HA/polyme có thể ở dạng hạt (micro hoặc nanomet), màng đơn lớp, màng đa lớp, ống, sợi, khung xốp, Thông thường, hình thái học, kích thước và phân bố của composit được xác định bằng kỹ thuật TEM và SEM như thể hiện trên Hình 1.14. 32
  45. a b c d e f Hình 1.14. Các dạng hình thái học của composit: hạt micro (a), nano (b), khung xốp (c), sợi (d), giàn khung (e), màng đa lớp (f) Xiao và cộng sự [136] đã sử dụng một loại proteoglycan là chondroitin sunfat có nhiều trong sụn để điều tiết sự kết tinh HA và khảo sát hình thái học trong composit HA/chondroitin sunfat. Ở nồng độ chondroitin sunfat cao, thu đươc các hạt nano HA dạng hình vảy, trong khi ở nồng độ thấp, thu được các tinh thể ở dạng sợi ngắn. Nghiên cứu [167] đã sử dụng axit hyaluronic, một loại glycosaminoglycan không sunfat phân bố đều trong các mô mềm, làm chất nền để điều tiết sự tạo thành các tinh thể HA. Kết quả đã chỉ ra rằng, giá trị pH ban đầu và nồng độ của axit hyaluronic có ảnh hưởng đến các lỗ trống canxi, hàm lượng cacbonat và hình thái học của HA. 1.3.3.3. Tương tác giữa HA và polyme Trong vật liệu composit, các thành phần riêng lẻ vẫn cho thấy có tính lý, hóa ổn định; nói cách khác, thành phần này không hợp nhất, cũng không tách biệt hoàn toàn với thành phần kia. Như vậy, có thể xác định một cách độc lập pha vô cơ và chất nền polyme. Tuy nhiên, chúng có thể tương tác thông qua các nhóm photphat, hydroxyl, ion canxi của HA và các nhóm chức của polyme. Thông thường, phổ FT- IR được sử dụng để xác định các nhóm chức có trong các thành phần của composit và sự tương tác giữa các thành phần đó. Sự xuất hiện dải mới hay thay đổi về cường 33
  46. độ và bước sóng các dải sẽ là dấu hiệu tương tác hóa học giữa các pha [129, 135, 146, 183, 186]. Trong phổ FT-IR của composit HA/chitosan, không quan sát thấy dải ở 1047 và 493 cm-1 của nhóm P-OH trong chitosan ở composit, có thể là do sự tạo thành muối polyphotphonat. Cường độ dải ở 991, 1088 cm-1 của P-OH của chitosan giảm sau khi tạo thành composit, chứng minh các nhóm P-OH của chitosan đã tham gia liên kết với HA. Xu hướng tương tự (cường độ giảm) trong trường hợp nhóm OH- của HA (631, 3571 cm-1) là dấu hiệu của sự liên kết giữa HA và polyme. Hầu hết các dải hoặc trong polyme hoặc trong HA đã cho thấy sự thay đổi rõ ràng sau khi tạo thành composit. Như vậy, việc so sánh các phổ FT-IR đã chỉ ra rằng có một liên kết hóa học tại bề mặt tương tác giữa hạt nano HA và polyme [144]. Chae và cộng sự [184] đã mô phỏng quá trình khoáng hóa sợi collagen trong mô xương bằng cách chế tạo composit HA/alginat khi kết tủa trực tiếp HA trên các sợi alginat. Sự tách 3- -1 đôi dải của PO4 tại 564 và 602 cm và các dải đối xứng và bất đối xứng của dao động nhóm -COO chuyển về bước sóng thấp hơn chứng tỏ sự hình thành phức dạng “hộp trứng” với ion canxi có vai trò là vị trí tạo mầm cho sự hình thành tinh thể HA. 1.3.4. Ứng dụng của composit HA/polyme Vật liệu chứa HA có tính tương thích sinh học, hoạt tính sinh học, dẫn xương và polyme tương thích sinh học, phân hủy sinh học, không độc tạo ra loại vật liệu composit có nhiều ứng dụng trong công nghệ mô [125, 127], cấy ghép, sửa chữa mô xương [26] và răng [167], xi măng chữa xương và răng [10], truyền dẫn và nhả chậm thuốc và gen [121, 130], ngăn ngừa sự phát triển của tế bào ung thư [23, 24] Một số ứng dụng chính được trình bày dưới đây. 1.3.4.1. Sửa chữa xương Các xương đặc có một cấu trúc phân cấp điển hình. Ở cấp độ nanomet, các tinh thể HA được tạo thành dưới sự điều chỉnh của các sợi collagen. Tại cấp độ micromet, các sợi collagen khoáng hóa hình thành osteons, osteocytes, canaliculi, đó là những đơn vị cơ bản của xương đặc. Như vậy, chất nền collagen điều chỉnh sự khoáng hóa là cơ sở cho toàn bộ cấu trúc của mô xương [1, 9]. Do đó, chu trình mô phỏng sinh học sử dụng polyme làm chất nền điều tiết sự tạo thành tinh thể nano 34
  47. HA được xem là phương pháp chế tạo vật liệu composit sinh học có tính dẫn xương và sinh xương tốt nhất [127]. Các khung xốp composit HA/polyme đã được chế tạo đơn giản bằng cách pha trộn vật lý các hạt nano HA với dung dịch polyme và sau đó loại bỏ dung môi bằng cách bay hơi [127, 155, 156]. Một số vật liệu đã được các công ty thương mại hóa như Collapat II (BioMet), Healos (Depuy Spine), Collagraft (Neucoll) [128] Sự phát triển của công nghệ mô mang lại nhiều hứa hẹn cho việc chế tạo các vật liệu cấy ghép xương mô phỏng sinh học. Hiện nay, nhiều nhà nghiên cứu đã đề xuất kỹ thuật chế tạo composit HA/polyme xốp, đóng vai trò là giàn khung 3-D (3- D scaffold) cho sự di trú và gắn tế bào trong kĩ thuật mô xương. HA kích thước nanomet làm tăng sự bám dính tế bào, tính chất cơ học và tương thích sinh học của vật liệu. Ngoài ra, kích thước lỗ xốp, sự phân bố các lỗ xốp và tốc độ phân hủy polyme là các tính chất quan trọng của giàn khung composit 3-D. Nhiều nghiên cứu được thực hiện để sản xuất xương nhân tạo từ HA và collagen, hai thành phần chính của xương động vật. Tuy nhiên, bằng cách mô phỏng cả thành phần và kết cấu đặc biệt của xương từ các polyme tổng hợp như poly (vinyl alcohol)-PVA [129, 170], poly(lactic axit)-PLA [58], poly(glycolic axit)-PGA [185], poly(lactic-coglycolic) axit- PLGA [148] cho việc điều chế nanocomposit xốp 3-D cũng cho thấy có khả năng sửa chữa và tái tạo mô xương. 1.3.4.2. Sửa chữa răng Từ trước đến nay, đối với các khiếm khuyết lớn trong răng, kim loại và hợp kim, như vàng và hỗn hợp, thường được sử dụng để thay thế và trang trí. Gốm sứ và polyme cũng được sử dụng rộng rãi để thay thế hoặc hàn, trám các khuyết tật của răng [31, 36]. Ngày nay, sự kết hợp giữa HA và polyme trong vật liệu composit được xem là phù hợp nhất cho việc sửa chữa răng và các mô nha chu nhằm kích thích sự tái tạo mô đã bị hư hỏng [27, 29]. Kim và cộng sự [29] đã tiến hành khử khoáng phần bên trong của răng và thu được chất nền collagen xốp. Sau đó, làm đầy nền xốp này bằng các composit ở thể lỏng chứa nano CaP để tái tạo pha khoáng bên trong chất nền collagen có khả năng truyền dẫn phần bên trong và lớp men răng bên ngoài. Ngoài ra, phương pháp sử dụng các gel composit HA/aga có thể bọc các bề mặt men răng để điều trị răng nhạy cảm và sâu răng. 35
  48. 1.3.4.3. Truyền thuốc và gen Các vật liệu composit HA/polyme dạng xốp có khả năng giữ các loại thuốc và gen rồi nhả chúng một cách có kiểm soát [121]. Các hạt nano HA có tương tác mạnh mẽ với nhiều protein và các vật liệu di truyền, điều này sẽ có ích cho việc mang và vận chuyển protein và gen [130]. Composit HA/polyme có khả năng truyền dẫn các loại thuốc chống ung thư, thuốc kháng sinh hoặc protein sinh xương giúp cho việc điều trị có hiệu quả các khối u ác tính, viêm tủy xương, gãy xương. Composit HA/alginat mang thuốc kháng sinh gentamicin ở dạng hình cầu kích thước trung bình 16 µm có khả năng chống viêm [187]. Li và cộng sự [36] đã nghiên cứu các huyết thanh albumin như một loại thuốc protein và đưa chúng vào các lớp phủ HA bằng cách đồng kết tủa trên hợp kim titan. Các lớp phủ phỏng sinh học này đã làm chậm lại việc nhả protein và triển vọng đầy hứa hẹn làm tác nhân dẫn truyền thuốc. Một số điểm rút ra từ tổng quan: Từ những nội dung trên cho thấy, việc nghiên cứu chế tạo vật liệu chứa HA nói chung và nanocomposit HA/polyme đang là một xu hướng sôi nổi trên thế giới. Ở trong nước, các polyme như chitosan, collagen, PLA đã được sử dụng chế tạo composit dạng khối xốp ứng dụng trong phẫu thuật chỉnh hình. Luận án này, lần đầu tiên sử dụng các polysaccarit có nguồn gốc từ ngũ cốc và rong biển Việt Nam chế tạo vật liệu nanocomposit dạng bột định hướng làm thực phẩm chức năng và thuốc bổ sung canxi. Khác với vật liệu composit dạng khối xốp ứng dụng cho sửa chữa và cấy ghép mô xương, trong đó, tính chất cơ lý, kích thước và sự phân bố các lỗ xốp là những tính chất quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của vật liệu cấy ghép. Đối với vật liệu nanocomposit HA/polyme dạng bột định hướng ứng dụng làm thực phẩm chức năng và thuốc bổ sung canxi, các tính chất như kích thước, độ tinh thể của HA, sự phân tán và tương tác giữa HA và polyme sẽ quyết định khả năng hấp thu của vật liệu trong cơ thể. Nhằm đưa ra quy trình đơn giản, không sử dụng các dung môi hữu cơ độc hại và chế tạo được vật liệu composit chứa HA có độ tinh thể thấp, kích thước 36
  49. nanomet, phân tán đồng đều và tương tác tốt với polyme. Phương pháp trộn và phương pháp kết tủa trực tiếp đã được lựa chọn để tổng hợp nanocomposit HA/polyme. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm được khảo sát chi tiết, nhằm tìm ra điều kiện chế tạo vật liệu thích hợp. Các polyme trong luận án này, có thể được chia làm hai nhóm. Nhóm thứ nhất là các polysaccarit từ tinh bột và các dẫn xuất của tinh bột. Nhóm thứ hai là alginat và các oligome từ alginat. Các nhóm chức và cấu trúc mạng lưới phân tử polyme cung cấp vị trí tạo mầm, điều chỉnh sự phát triển của tinh thể nano HA trong vật liệu composit. Mặt khác, mối quan hệ giữa khối lượng phân tử hay giá trị DE của các dẫn xuất của tinh bột hoặc cấu trúc khối G hay M của oligoalginat và các đặc trưng của composit cũng được xác định. 37
  50. Chƣơng 2 THỰC NGHIỆM VÀ CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Hóa chất và các nguyên liệu đầu Các hóa chất và nguyên liệu đầu được sử dụng trong luận án và độ tinh khiết, xuất xứ của chúng được đưa ra ở Bảng 2.1. Bảng 2.1. Các hóa chất và nguyên liệu đầu sử dụng trong luận án STT Hóa chất Độ tinh khiết Xuất xứ 1 Ca(OH)2, H3PO4 PA Xilong (Trung Quốc) D-glucozơ, CuSO4.5H2O, 2 PA Merck (Đức) KNaC4H4O6.4H2O, NH4H2PO4 Công ty Đức Giang 3 Etanol 98o Tinh khiết (Việt Nam) Công ty Minh Dương 4 Tinh bột sắn (TBS) Tinh khiết (Việt Nam) 5 Tinh bột tan (TB) Tinh khiết Xilong (Trung Quốc) Maltodextrin (MD) Viện Công Nghệ Thực phẩm 6 Tinh khiết với DE 12, 20, 25 (Việt Nam) Maltodextrin (MD) 7 Tinh khiết Aldrich (Mỹ) với DE 14-19 Viện NC và ƯD Công nghệ Nha 8 Alginat (alg) Tinh khiết Trang-Viện HLKH&CN (Việt Nam)  Xác định đương lượng đường khử (DE) của tinh bột và các maltodextrin Hầu hết các phương pháp xác định DE của các maltodextrin dựa trên sự khử các ion kim loại. Theo phương pháp [188], DE được xác định dựa vào sự khử ion đồng (II) bởi các polysaccarit trong dung dịch Fehling. Phương pháp này được thực hiện theo bốn bước. 38
  51. Bước 1. Chuẩn bị dung dịch Fehling: - Dung dịch Feihling A: Hòa tan 34,64 g CuSO4.5H2O vào nước cất trong bình định mức 500 ml, sau đó thêm nước cất tới vạch định mức. - Dung dịch Feihling B: Hòa tan 173 g KNaC4H4O6.4H2O và 50 g NaOH trong bình định mức, sau đó thêm nước cất tới vạch định mức. Để có dung dịch Feihling cần trộn 25 ml dung dịch A và 25 ml dung dịch B ngay trước khi sử dụng. Bước 2. Chuẩn độ dung dịch Fehling: dung dịch Fehling được xác định chính xác nồng độ bằng phương pháp chuẩn độ với glucozơ [188]. Bước 3. Chuẩn bị dung dịch polysaccarit: - Xác định độ ẩm: Cân chính xác 10 g polysaccarit cần phân tích và sấy trong tủ sấy chân không ở 70oC trong 4 giờ. Sau đó, mẫu được cân lại và độ ẩm được tính theo công thức: (10 – m)  100 Độ ẩm = (2.1) 10 Trong đó, m (g) là khối lượng mẫu sau khi sấy. - Pha dung dịch polysaccarit: Cân chính xác một lượng polysaccarit (đã biết độ ẩm) và cho vào bình định mức 500 ml. Thêm khoảng 200 ml nước nóng và lắc cho tan hết, rồi để nguội. Bổ sung nước cất đến vạch định mức. Ở đây, khối lượng polysaccarit được sử dụng sao cho khi chuẩn độ, thể tích dung dịch polysaccarit tiêu tốn nằm trong khoảng từ 15 đến 25 ml. Bước 4. Xác định DE: - Tiến hành chuẩn độ bằng thuốc thử Fehling tương tự như đối với dung dịch glucozơ. Giá trị DE được tính theo công thức sau: 500 . 0,12 . 100 % Đường khử = (2.2) V . ms % Đường khử . 100 DE = (2.3) 100 - độ ẩm Trong đó, V (ml) là thể tích dung dịch polysaccarit tiêu tốn, ms (g) là khối 39
  52. lượng mẫu polysaccarit. Kết quả xác định DE của TBS, TB và các MD được đưa ra ở Bảng 2.2. Bảng 2.2. Đương lượng đường khử (DE) của các polysaccarit MD16 Polysaccarit TBS TB MD12 MD20 MD25 (Merck) DE 0 1,5 12 16 20 25  Điều chế oligome của alginat Quy trình thực nghiệm điều chế oligome từ alginat được thực hiện theo các nghiên cứu [118, 119], trình bày ở Hình 2.1 và được mô tả chi tiết như sau: Khuấy 10 g alginat trong 200 ml axit H3PO4 đậm đặc nồng độ 85% và để yên ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày. Lọc để tách phần không tan (kí hiệu A1), rửa cẩn thận nhiều lần bằng nước cất để loại axit dư. Đổ từ từ phần dịch lọc vào 400 ml nước cất. Kết tủa tạo thành được lọc tách tạo thành oligome A2. Các khối GG không bị thủy phân, nên oligoalginat A1 giàu các khối GG nhất. Các khối MM hòa tan tốt trong H3PO4 và kết tinh tốt trong nước, thu được oligoalginat A2. Alginat H3PO4 đậm đặc, Hỗn hợp alginat và axit ở nhiệt độ phòng 6 ngày Kết tủa (A1) Dịch lọc Nước cất Kết tủa (A2) Hình 2.1. Quy trình điều chế oligome từ alginat [118, 119] 40
  53.  Khối lượng phân tử trung bình (Mw) và độ phân tán khối lượng phân tử (PDI) Khối lượng phân tử trung bình (Mw) và độ phân tán khối lượng phân tử (PDI) của các polysaccarit được đo bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (Gel permeation chromatography – GPC). Sắc ký thẩm thấu gel là phương pháp phân tích hữu hiệu, nhanh chóng Mw và PDI các polyme. Ban đầu, mẫu được bơm vào cột sắc ký qua hệ thống bơm. Cột sắc ký với pha tĩnh là các vật liệu có cấu trúc xốp, vì thế trong cột sắc ký, ngoài lỗ trống giữa các hạt còn có cả lỗ trống bên trong các hạt. Khi mẫu được chạy qua cột, những phân tử có khối lượng nhỏ, ngoài việc chạy qua các lỗ giữa các hạt, chúng còn phải đi qua lỗ của chính các hạt vật liệu pha tĩnh. Vì thế, phân tử có khối lượng nhỏ sẽ đi ra khỏi cột chậm hơn, tức là thời gian lưu lớn hơn. Dựa vào thời gian lưu này, so sánh với mẫu chuẩn để từ đó xác định được khối lượng phân tử của polyme. Polyme chứa các mạch phân tử có độ dài khác nhau, vì thế khối lượng phân tử được biểu diễn bằng khối lượng phân tử trung bình khối (Mw) và khối lượng phân tử trung bình số (Mn). Tỉ lệ giữa Mw/Mn thể hiện mức độ phân tán khối lượng phân tử và được kí hiệu PDI (polydispersity index). Trong luận án, khối lượng phân tử trung bình và độ phân tán khối lượng phân tử của các polysaccarit được đo trên máy HP-GPC 1100 Agilent, detector RI GI362A, dùng cột Ultrahydrgel 250 & 2000 Å, nhiệt độ cột là 40oC, chất chuẩn: Pullulan có khối lượng phân tử 700 4.000.000 Dalton, tốc độ dòng là 1 ml/phút, tại Phòng Phân tích Trung tâm, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. Khối lượng phân tử trung bình và độ phân tán khối lượng phân tử của các polysaccarit được trình bày trong Bảng 2.3. Bảng 2.3. Khối lượng phân tử trung bình (Mw) và độ phân tán khối lượng phân tử (PDI) của các polysaccarit MD16 Polysaccarit TBS TB MD12 MD20 MD25 alg A1 A2 (Merck) Mw (g/mol) 215000 110300 93300 67900 53700 43800 362000 5890 5750 PDI 3,05 2,50 2,22 2,01 2,18 1,98 2,62 2,43 2,34 41
  54. Số liệu ở Bảng 2.3 cho thấy, trong dãy các polysaccarit là dẫn xuất của tinh bột, tinh bột sắn (DE 0) có khối lượng phân tử lớn nhất, DE càng cao, khối lượng phân tử trung bình càng thấp. Alginat ban đầu có khối lượng phân tử trung bình tương đối lớn. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu khác là alginat có nguồn gốc từ rong sinh trưởng ở vùng nhiệt đới thường có khối lượng phân tử lớn [118, 119]. Từ giá trị khối lượng phân tử của các oligoalginat thấy rằng alginat đã được phân cắt tốt tạo thành các oligome. Mức độ phân tán khối lượng phân tử của các polysaccarit là khá lớn. 2.2. Tổng hợp HA ở vùng nhiệt độ thấp Phản ứng tổng hợp HA từ Ca(OH)2 và H3PO4 được thực hiện ở các nhiệt độ -15, -10 và 0oC. Các nhiệt độ này được tạo ra bằng cách sử dụng hỗn hợp nước đá và muối ăn NaCl. Các lượng chất ban đầu dùng để tổng hợp HA được lấy theo tỉ lệ số mol Ca/P 1,67; hỗn hợp phản ứng có pH 10 - 12. Phương pháp tổng hợp theo tài liệu [54] được trình bày trên Hình 2.2. Mô tả phương pháp thực nghiệm: Dung dịch H3PO4 0,3 M được nhỏ với tốc độ 2 ml/phút vào huyền phù Ca(OH)2 0,5 M. Hỗn hợp được khuấy bằng máy khuấy từ và duy trì nhiệt độ nghiên cứu trong suốt thời gian phản ứng. Nhiệt độ thí nghiệm được đo bằng nhiệt kế thủy ngân với sai số là 1oC. Sau khi nhỏ hết axit, tiếp tục khuấy hỗn hợp thêm 2 giờ. Sản phẩm thu được ở dạng huyền phù, màu trắng, được ly tâm và rửa nhiều lần bằng nước cất đến pH 7. Lấy sản phẩm ra mặt kính đồng hồ và sấy khô ở 50oC trong 48 giờ. Dung dịch H3PO4 Huyền phù Ly tâm, Sản phẩm Kết tủa Già hóa Sấy Ca(OH)2 rửa HA Khuấy, giảm nhiệt Hình 2.2. Phương pháp tổng hợp HA từ Ca(OH)2 và H3PO4 42
  55. 2.3. Nghiên cứu tổng hợp các composit HA/polyme 2.3.1. Composit HA/tinh bột (HA/TB) 2.3.1.1. Chuẩn bị dung dịch tinh bột Thực hiện quá trình chuẩn bị dung dịch tinh bột như sau: hòa tan tinh bột vào nước cất với hàm lượng 5g/100ml và khuấy 30 phút tại 70oC. Để nguội dung dịch tinh bột đến nhiệt độ phòng rồi mới chế tạo composit. 2.3.1.2. Phương pháp trộn Phương pháp trộn HA bột Một mẫu composit được tổng hợp bằng phương pháp trộn hai thành phần HA bột và dung dịch tinh bột theo tỉ lệ 1:1 về khối lượng. HA nguyên chất được điều chế bằng phương pháp kết tủa từ Ca(OH)2 ở nhiệt độ phòng, theo phương pháp ở Mục 2.2. Khuấy trộn bột HA và dung dịch tinh bột trên máy khuấy từ với tốc độ 600 vòng/phút trong 5 giờ, thu mẫu kí hiệu HT. Phương pháp trộn HA huyền phù Phương pháp điều chế composit HA/TB theo phương pháp trộn huyền phù được mô tả tóm tắt ở Hình 2.3. Mô tả phương pháp thực nghiệm: Sau khi điều chế HA từ Ca(OH)2 như quy trình ở Mục 2.2, ly tâm, rửa kết tủa và hòa tan vào dung môi (nước hoặc etanol) để thu được huyền phù HA. Cho dung dịch tinh bột trong nước vào huyền phù HA, khuấy 5 giờ với tốc độ 600 vòng/phút tại nhiệt độ xác định. Cho etanol vào hỗn hợp để kết tủa composit, ly tâm, rửa kết tủa với hỗn hợp etanol-nước, làm khô và thu sản phẩm. Dung dịch tinh bột Etanol Huyền Khuấy Hỗn hợp Ly tâm, Composit Làm khô phù HA 5 giờ HA/TB rửa HA/TB Hình 2.3. Sơ đồ phương pháp thực nghiệm tổng hợp composit HA/TB theo phương pháp trộn huyền phù  Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng: 43
  56. - Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần: Các thí nghiệm được tiến hành với tỉ lệ thành phần về khối lượng thay đổi (HA/TB: 1/9, 3/7, 5/5, 7/3) tại nhiệt độ phòng, sấy khô mẫu trong tủ sấy tại 50oC. - Ảnh hưởng của nhiệt độ: Các mẫu composit HA/TB với tỉ lệ thành phần 5/5, được điều chế ở các nhiệt độ 0, 10, 30, 50oC. - Ảnh hưởng của dung môi: Thực hiện quá trình trộn huyền phù HA và TB trong dung môi nước và etanol. - Ảnh hưởng sóng siêu âm: Bình phản ứng điều chế composit HA/TB được đặt trong bể siêu âm với tần số 46 kHz, công suất 200 W. Hỗn hợp phản ứng vẫn được khuấy bằng máy khuấy cơ. - Ảnh hưởng của kỹ thuật làm khô: Sản phẩm được làm khô bằng hai cách, sấy nhiệt ở 45oC trong tủ sấy và đông khô bằng máy Modulyod, Freeze Dryer (Mỹ). 2.3.1.3. Phương pháp kết tủa trực tiếp Sơ đồ phương pháp tổng hợp composit HA/TB từ Ca(OH)2, H3PO4 và tinh bột theo phương pháp kết tủa trực tiếp được thể hiện trên Hình 2.4. Mô tả phương pháp tổng hợp: Dung dịch Ca(OH)2 và H3PO4 được chuẩn bị riêng rẽ trong nước cất theo tỉ lệ mol Ca/P 1,67. Cho dung dịch tinh bột trong nước vào dung dịch Ca(OH)2, khuấy trên máy khuấy từ với tốc độ 600 vòng/phút, trong 2 giờ. Nhỏ dung dịch H3PO4 với tốc độ xác định vào hỗn hợp trên. Sau khi nhỏ hết axit, tiếp tục khuấy hỗn hợp 5 giờ và thêm etanol để kết tinh sản phẩm. Ly tâm và rửa kết tủa thu được nhiều lần bằng hỗn hợp etanol và nước, làm khô và thu sản phẩm. Dung dịch tinh bột Dung dịch H3PO4 Etanol Dung dịch Hỗn hợp Kết tủa Ca(OH)2 Khuấy 2 Ca(OH)2 và tinh bột Khuấy 5 giờ giờ Composit Ly tâm, Làm khô HA/TB rửa Hình 2.4. Sơ đồ phương pháp thực nghiệm tổng hợp composit HA/TB theo phương pháp kết tủa trực tiếp 44
  57.  Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng: Ảnh hưởng của các yếu tố được khảo sát tương tự như phần trộn HA huyền phù: - Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần; - Ảnh hưởng của nhiệt độ; - Ảnh hưởng của dung môi; - Ảnh hưởng của sóng siêu âm; - Ảnh hưởng của kỹ thuật làm khô. Ngoài ra, với phương pháp kết tủa trực tiếp, ảnh hưởng của tốc độ cấp axit H3PO4 cũng được khảo sát. Chế tạo composit HA/TB với các tốc độ cấp axit H3PO4 khác nhau: 0,5; 2,0; 10 ml/phút vào hỗn hợp Ca(OH)2 – TB. 2.3.2. Composit HA/tinh bột sắn (HA/TBS) 2.3.2.1. Chuẩn bị dung dịch TBS Chuẩn bị dung dịch TBS tương tự như quá trình chuẩn bị dung dịch TB ở Mục 2.3.1.1. 2.3.2.2. Tổng hợp composit HA/TBS Các mẫu composit HA/TBS với tỉ lệ thành phần khác nhau (HA/TBS: 1/9, 3/7, 5/5 và 7/3) được tổng hợp theo phương pháp kết tủa trực tiếp như với composit HA/TB ở Mục 2.3.1.3. Để so sánh, mẫu composit được tổng hợp bằng phương pháp trộn HA bột và dung dịch tinh bột sắn với tỉ lệ 1:1 về khối lượng theo phương pháp trộn huyền phù ở Mục 2.3.1.2. 2.3.3. Composit HA/maltodextrin (HA/MD) với các DE khác nhau 2.3.3.1. Chuẩn bị dung dịch MD Tiến hành hòa tan các MD vào nước cất theo tỉ lệ 50g/100ml. 2.3.3.2. Tổng hợp các composit HA/MD với DE 12, 16, 20 và 25 Để khảo sát ảnh hưởng của DE đến đặc trưng của composit HA/MD, các MD với DE bằng 12, 16, 20 và 25 được sử dụng để chế tạo composit theo phương pháp kết tủa trực tiếp. Tỉ lệ các thành phần HA/MD trong composit là 5/5 về khối lượng. Phương pháp tổng hợp được thực hiện theo quy trình ở Mục 2.3.1.3. Ảnh hưởng của tỉ lệ thành phần (HA/MD: 1/9, 3/7, 5/5 và 7/3) được khảo sát 45
  58. đối với composit HA/MD với DE 12. 2.3.4. Composit HA/alginat (HA/alg) và HA/oligoalginat (HA/olig) 2.3.4.1. Chuẩn bị dung dịch alginat và oligoalginat Hòa tan alginat hoặc các oligoalginat vào nước cất theo tỉ lệ 2g/100ml, khuấy 1giờ tạo thành dung dịch nhớt, màu vàng đồng nhất. 2.3.4.2. Tổng hợp các composit HA/alg và HA/olig Phương pháp tổng hợp composit HA/alg và HA/olig được thực hiện theo quy trình ở Mục 2.3.1.3. Tuy nhiên, do alginat có khả năng tạo gel rất mạnh với ion 2+ Ca , nên khi cho dung dịch alginat vào dung dịch Ca(OH)2 thì hỗn hợp sẽ tạo gel đặc, không thể khuấy trộn để tiếp tục phản ứng. Vì vậy, phải nhỏ đồng thời dung dịch alginat và H3PO4 vào huyền phù Ca(OH)2. Các bước thực nghiệm khác tương tự như quy trình trên. Với alginat, các mẫu composit HA/alg với tỉ lệ thành phần khác nhau được tổng hợp bằng phương pháp kết tủa trực tiếp tương tự như phần khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ thành phần của composit HA/TB (Mục 2.3.1). Với hai oligoalginat A1 và A2, chế tạo mẫu composit HA/olig theo tỉ lệ thành phần HA/olig là 3/7 bằng phương pháp kết tủa trực tiếp. 2.4. Các phƣơng pháp xác định đặc trƣng 2.4.1. Phương pháp nhiễu xạ tia X (XRD) Phương pháp nhiễu xạ tia X được dùng để nghiên cứu cấu trúc tinh thể của vật liệu, cho phép xác định nhanh, chính xác các pha tinh thể, định lượng pha tinh thể và kích thước tinh thể với độ tin cậy cao. Có thể dùng phương pháp XRD để xác định kích thước trung bình của các hạt tinh thể theo công thức Scherrer: 0,9.  D = (2.4) β002. cos B Trong đó: D là kích thước tinh thể trung bình, λ là bước sóng của tia X; β002 là bề rộng nửa chiều cao của vạch nhiễu xạ (radian); θB là vị trí của vạch nhiễu xạ. Đối với HA, người ta thường lấy vạch nhiễu xạ tại vị trí góc 2θ = 25,9o tương ứng với mặt (002) [48, 63, 179, 182, 183]. Tuy nhiên việc xác định kích thước tinh thể trung bình của HA từ giản đồ XRD theo công thức Scherrer được giả định là HA có 46
  59. cấu trúc hình cầu. Do đó, nếu tinh thể HA có dạng que hoặc trụ thì kết quả sẽ có tính chất gần đúng. Độ tinh thể (Xc) của HA trong vật liệu composit HA/polyme thường được xác định theo mối quan hệ giữa Xc và β002 và theo công thức [48, 129, 170]: 3 KA = β002. Xc (2.5) Trong đó: Xc là độ tinh thể của HA; o β002 (độ) là bề rộng ở nửa chiều cao của vạch nhiễu xạ tại 25,9 tương ứng với mặt (002); KA là hằng số có giá trị là 0,24. Trong luận án này, pha tinh thể của composit HA/polyme được xác định bằng XRD theo phương pháp nhiễu xạ bột. Giản đồ XRD được đo trên máy SIEMENS D5000 tại Viện Khoa học Vật liệu (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với điều kiện đo: CuKα (λ = 0,154 nm), U = 35 kV, I = 35 mA, góc quét (2θ) từ 0 – 70o. 2.4.2. Phương pháp phổ hồng ngoại (FT-IR) Phương pháp phổ hồng ngoại được dùng trong xác định cấu trúc phân tử của chất cần nghiên cứu, dựa vào vị trí và cường độ các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức có trong phân tử. Trong nghiên cứu về vật liệu composit HA/polyme, phương pháp phổ hồng ngoại được dùng để xác định các nhóm chức có mặt ở cả pha vô cơ và hữu cơ. Hơn nữa, sự thay đổi về cường độ và vị trí các dải hấp thụ là dấu hiệu tương tác hóa học giữa các pha [144, 145, 182-184]. Trong luận án này, các mẫu được ghi phổ hồng ngoại trên máy Impact 410- Nicolet FT-IR (Mỹ) tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo phương pháp ép viên KBr, dải đo 400 – 4000 cm-1. 2.4.3. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) SEM là một phương pháp thường được sử dụng để nghiên cứu hình thái bề mặt của vật liệu. Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là một chùm elcetron được tăng tốc trong điện trường, sau đó được đi qua các thấu kính từ tạo thành chùm hội tụ. Chùm tia này sẽ được quét lên trên bề mặt mẫu và tạo ra chùm electron thứ cấp. Các tia thứ cấp này sẽ được ghi nhận bằng detector và được 47
  60. chuyển đổi thành tín hiệu dưới dạng hình ảnh. Cũng như với các vật liệu nano khác, SEM được xem như là một công cụ hữu hiệu để phân tích hình thái học của composit HA/polyme. Trong luận án này, hình thái học của các mẫu được xác định bằng phương pháp SEM trên thiết bị S-4800 Hitachi tại Viện Khoa học Vật liệu (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). 2.4.4. Phương pháp hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Hiển vi điện tử truyền qua là phương pháp nghiên cứu vi cấu trúc của vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ phóng đại rất lớn. Ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang, trên film quang học hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số. Trong nghiên cứu cấu trúc của composit HA/polyme, TEM là một công cụ hữu hiệu để xác định hình dạng, kích thước và sự phân bố của tinh thể HA trên nền polyme. Các mẫu được phân tích TEM trên thiết bị JEM 1010 (Nhật Bản) tại Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương. 2.4.5. Phương pháp phân tích nhiệt (TGA-DTA) Năm 2004, Hiệp hội Quốc tế về phân tích nhiệt và đo nhiệt lượng đưa ra định nghĩa: “Phân tích nhiệt là nhóm các kỹ thuật nghiên cứu quan hệ giữa tính chất và nhiệt độ của mẫu”. Phân tích nhiệt cho phép xác định tính chất nhiệt của vật liệu hoặc trực tiếp hoặc thông qua ảnh hưởng của tác động nhiệt lên các tính chất cơ bản khác của nó. Ba dạng phổ biến trong phân tích nhiệt là: phân tích nhiệt trọng lượng TGA (theo dõi sự thay đổi khối lượng của mẫu theo thời gian hoặc nhiệt độ); phân tích nhiệt vi sai DTA (đo sự chênh lệch nhiệt độ giữa mẫu nghiên cứu và mẫu so sánh theo thời gian hoặc nhiệt độ) và phân tích nhiệt lượng vi sai quét DSC (đo sự thay đổi nhiệt lượng của mẫu theo nhiệt độ). Trong luận án này, giản đồ phân tích nhiệt của các mẫu được ghi trên máy TA – 60 Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hoá học (Trường Đại học Sư phạm Hà Nội) và máy Labsys Evo, Setaram (Pháp) tại Viện Hóa học (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với tốc độ gia nhiệt 10oC/phút, từ nhiệt độ phòng đến 800oC trong môi trường không khí. 48