›
›

Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài cây thuộc họ thầu dầu của Việt Nam

pdf 183 trang vanle 3500
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài cây thuộc họ thầu dầu của Việt Nam", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_an_nghien_cuu_thanh_phan_hoa_hoc_va_hoat_tinh_sinh_hoc.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của 3 loài cây thuộc họ thầu dầu của Việt Nam

  1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC TRỊNH THỊ THANH VÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 3 LOÀI CÂY THUỘC HỌ THẦU DẦU CỦA VIỆT NAM LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI-2011
  2. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC TRỊNH THỊ THANH VÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 3 LOÀI CÂY THUỘC HỌ THẦU DẦU CỦA VIỆT NAM Chuyên ngành:Hóa Hữu cơ Mã số: 62.44.27.01 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC HÀ NỘI-2011
  3. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả, số liệu nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu trước đây. Hà nội, ngày tháng 5 năm 2012 Tác giả Trịnh Thị Thanh Vân
  4. LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn chân thành và sâu sắc: Đầu tiên, tôi xin đặc biệt cảm ơn tới hai thầy hướng dẫn của tôi là PGS. TS. Nguyễn Văn Hùng và TSKH. Phạm Văn Cường đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu thực hiện luận án. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học, Viện Hóa sinh biển – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và các cán bộ trong Phòng Phân tích cấu trúc , Bộ phận Đào tạo và các phòng chức năng đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Dự án Pháp-Việt đã tài trợ kinh phí cũng như thử hoạt tính sinh học, xin cảm ơn Th.s Nguyễn Quốc Bình và Th.s. Đào Đình Cường đã thu hái mẫu và xác định tên cây. Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến các cô chú, anh chị và các bạn đồng nghiệp Phòng Tổng hợp Hữu cơ và Trung tâm nghiên cứu phát triển thuốc – Viện Hóa sinh biển đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ tôi, đến chồng và con tôi và những người thân trong gia đình đã cổ vũ và động viên tôi rất nhiều để tôi hoàn thành tốt bản luận án này. Hà nội, ngày tháng 5 năm 2012 Tác giả Trịnh Thị Thanh Vân
  5. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT NMR: Nucleur Magnetic Resonance, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NMR: Phổ cộng hưởng từ proton 13C NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C. COSY: Correlated Spectroscopy, phổ COSY. DEPT: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer, phổ DEPT. HMBC: Heteronuclear Multiple Bond Correlation, phổ HMBC. HMQC: Heteronuclear Multiple Quantum Coherence, phổ HMQC. HSQC: Heteronuclear Single Quantum Coherence, phổ HSQC. NOESY: Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy, phổ NOESY. s: singlet o: overlapping dd: double doublet d: doublet q: quartet dt: double triplet t: triplet br: broad dq: double quartet H, C: Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon. ppm: parts per million, phần triệu. EIMS: Electron Impact Mass Spectroscopy, Phổ khối va chạm electron. ESIMS: Electronspray Ionization Mass Spectroscopy HRMS: High Resolution Mass Spectrscopy, Phổ khối phân giải cao. X-ray: Tia X. DMSO: Dimethylsulfoxide. đnc. Điểm nóng chảy. TLC: Thin Layer Chromatography, Sắc kí bản mỏng. CC: Column Chromatography, Sắc kí cột thường. Tên riêng của các hợp chất tự nhiên phân lập được được viết theo nguyên bản tiếng Anh cho tiện tra cứu
  6. DANH MỤC CÁC BẢNG trang Bảng 4.1 Dữ liệu phổ NMR của CLF3.20 86 Bảng 4.2: Dữ liệu phổ NMR của CLF4.6 . 90 Bảng 4.3: Dữ liệu phổ NMR của CLF6.4 91 Bảng 4.4: Dữ liệu phổ NMR của CLF6.3 93 Bảng 4.5: Dữ liệu NMR của CLQF11 100 Bảng 4.6: Dữ liệu NMR của CLQF12.3 103 Bảng 4.7: Dữ liệu NMR của CLQF15.3 105 Bảng 4.8: Dữ liệu NMR của CLQF17.1 107 Bảng 4.9: Dữ liệu NMR của CLQF16 109 Bảng 4.10: Dữ liệu NMR của CLQF17.2 . 111 Bảng 4.11: Dữ liệu NMR của CLQFM4.4 113 Bảng 4.12: Dữ liệu NMR của CLQFM4.5 114 Bảng 4.13: Dữ liệu NMR của CLQFM4.3 116 Bảng 4.14: Dữ liệu NMR của MKF9.5 . 118 Bảng 4.15: Dữ liệu NMR của MKF 8.3 120 Bảng 4.16: Dữ liệu NMR của MKF 11.4.1 122 Bảng 4.17: Dữ liệu NMR của MKF 11.5.3 123 Bảng 4.18: Dữ liệu NMR của MKF 11.5.1 124 Bảng 4.19: Dữ liệu NMR của MTF10C 134 Bảng 4.20: Dữ liệu NMR của MTF8 136 Bảng 4.21: Dữ liệu NMR của MTF16A 138 Bảng 4.22: Kết quả thử hoạt tính sinh học sơ bộ các dịch chiết 145 Bảng 4.23: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng KB của các phân đoạn của dịch chiết CH2Cl2 và MeOH của lá cây Cách hoa đông dương 146 Bảng 4.24: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng KB của các phân đoạn của quả loài Cách hoa đông dương 147
  7. Bảng 4.25: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB của các hợp chất được phân lập từ quả Cách hoa đông dương 148 Bảng 4.26: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng KB và hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các phân đoạn của cặn chiết lá loài Săng bù 149 Bảng 4.27: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng KB và hoạt tính ức chế enzyme acetylcholinesterase của các chất từ lá loài Săng bù 150 Bảng 4.28: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB của một số hợp chất được phân lập từ quả cây Bạch đàn nam 151 Bảng 4.29: Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB của các dẫn xuất Cleistantoxin 152
  8. DANH MỤC CÁC HÌNH trang Hình 3.1: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Cách hoa đông dương 32 Hình 3.2: Sơ đồ phân tách cặn CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương 34 Hình 3.3: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của lá cây Cách hoa đông dương . 35 Hình 3.4: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Cách hoa đông dương 43 Hình 3.5: Sơ đồ phân tách cặn CH2Cl2 của quả cây Cách hoa đông dương 44 Hình 3.6: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của quả cây Cách hoa đông dương . 45 Hình 3.7: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Săng bù 51 Hình 3.8: Sơ đồ phân tách cặn EtOAc của lá cây Săng bù 53 Hình 3.9: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của lá cây Săng bù 54 Hình 3.10: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Bạch đàn nam 63 Hình 3.11: Sơ đồ phân tách cặn EtOAc từ quả cây Bạch đàn nam 64 Hình 4.1: Cấu trúc các hợp chất được phân lập từ lá cây Cách hoa đông dương 83 Hình 4.2: Tương tác spin-spin trên phổ COSY của CLF3.20 . 84 Hình 4.3: Tương tác giữa 13C - 1H trên phổ HMBCcủa CLF3.20 85 Hình 4.4. Cấu trúc nhiễu xạ tia X của CLF3.20 87 Hình 4.5. Giả thiết con đường sinh tổng hợp của CLF3.20 . 88 Hình 4.6: Cấu trúc hóa học của CLF3.1 88 Hình 4.7: Cấu trúc hóa học của CLF4.6 89 Hình 4.8: Cấu trúc chất CLF6.3 93 Hình 4.9: Cấu trúc chất CLF3.14 94 Hình 4.10: Cấu trúc chất CLFM4.5.1 95 Hình 4.11: Cấu trúc chất CLFM8.1.1 96 Hình 4.12: Cấu trúc chất CLFM10.6 96 Hình 4.13: Cấu trúc chất CLFM10.3 97 Hình 4.14: Cấu trúc chất CLFM4.1 98 Hình 4.15: Cấu trúc chất axit gallic CLFM4.1 và squalene CLF2.1 98
  9. Hình 4.16: Cấu trúc các chất phân lập từ quả cây Cách hoa đông dương 99 Hình 4.17: Tương tác HMBC chính của CLQF11 101 Hình 4.18: Phổ CD của hợp chất CLQF11 102 Hình 4.19: Tương tác HMBC chính của CLQF12.3 104 Hình 4.20: Tương tác HMBC chính của CLQF15.3 105 Hình 4.21: Phổ CD của hợp chất CLQF15.3 106 Hình 4.22: Tương tác HMBC chính của CLQF17.1 108 Hình 4.23: Cấu trúc hóa học của CLQF16 109 Hình 4.24: Tương tác HMBC chính của CLQF17.2 111 Hình 4.25: Cấu trúc hóa học của CLQFM4.4 112 Hình 4.26: Cấu trúc hóa học của CLQFM4.5 115 Hình 4.27: Tương tác HMBC chính của CLQFM4.3 . 116 Hình 4.28: Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ lá cây Săng bù 117 Hình 4.29: Tương tác HMBC chính của MKF9.5 119 Hình 4.30: Tương tác HMBC chính của MKF 8.3 120 Hình 4.31: Tương tác HMBC chính của MKF 11.4.1 . 121 Hình 4.32: Tương tác HMBC chính của MKF 11.5.3 . 123 Hình 4.33: Tương tác HMBC chính của MKF 11.5.1 . 124 Hình 4.34: Cấu trúc hóa học của MKF11.5.2 125 Hình 4.35: Cấu trúc hóa học của MKF9 126 Hình 4.36: Cấu trúc hóa học của MKF10 126 Hình 4.37: Cấu trúc hóa học của MKF11.4 . 127 Hình 4.38: Cấu trúc hóa học của MKF9.4 128 Hình 4.39: Cấu trúc hóa học của MKF9.7 129 Hình 4.40: Cấu trúc hóa học của MKFM2 129 Hình 4.41: Cấu trúc hóa học của MKF2.2 130 Hình 4.42: Cấu trúc hóa học của MKF8.1 130 Hình 4.43: Cấu trúc hóa học của MKF8.4 131
  10. Hình 4.44: Cấu trúc hóa học của MKF1.1 132 Hình 4.45: Các hợp chất phân lập từ quả cây Bạch đàn nam 132 Hình 4.46: Tương tác HMBC chính của MTF10C 133 Hình 4.47: Cấu trúc hóa học của MTF12.6A 135 Hình 4.48: Tương tác HMBC chính của MTF8 136 Hình 4.49: Tương tác HMBC chính của MTF16A 137 Hình 4.50: Cấu trúc hóa học của MTF10B 139 Hình 4.51: Cấu trúc hóa học của MTF10 140 Hình 4.52: Cấu trúc hóa học của MTF12.5B 140 Hình 4.53: Cấu trúc hóa học của MTF12.5A 141 Hình 4.54: Sơ đồ cơ chế phản ứng thế nitril 143 Hình 4.55: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất của Cleistantoxin 144 Hình 4.56: Hoạt tính gây độc tế bào của Cleistantoxin (CLQF 11) trên các dòng tế bào ung thư khác nhau 148
  11. DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Trang Phụ lục 1: Phổ các hợp chất phân lập từ lá cây Cách hoa đông dương PL1 PL1.1: Phổ của hợp chất squalen (CLF2.1) PL2 PL1.2: Phổ của hợp chất epifriedelanol (CLF 3.1) PL3 PL1.3: Phổ của hợp chất lupeol (CLF3.14) PL5 PL1.4: Phổ của hợp chất cleistanone (CLF3.20) PL7 PL1.5: Phổ của hợp chất cis-p-cumaroyl epifriedelanol (CLF4.6) PL12 PL1.6: Phổ của hợp chất trans-p-cumaroyl β-sitosterol (CLF6.3) PL18 PL1.7: Phổ của hợp chất trans-p-cumaroylepifriedelanol (CLF6.4) PL24 PL1.8: Phổ của hợp chất axit galic (CLF8.1) PL28 PL1.9: Phổ của hợp chất axit 4-hydroxycinnamic (CLFM4.1) PL30 PL1.10: Phổ của hợp chất sequoiaflavon (CLF4.5.1) PL31 PL1.11: Phổ của hợp chất amentoflavon (CLF 8.1.1) PL34 PL1.12: Phổ của hợp chất 3-O-metyl ellagic-4’-O-α-rhamnopyranosid (CLF10.3) PL35 P1.13: Phổ của hợp chất axit ellagic (CLF10.6) PL38 Phụ lục 2: Phổ các hợp chất phân lập từ quả cây Cách hoa đông dương PL41 PL2.1: Phổ của hợp chất cleistantoxin (CLQF11) PL42 PL2.2: Phổ của hợp chất demethoxycleistantoxin (CLQF12.3) PL48 PL2.3: Phổ của hợp chất podocleistantoxin (CLQF15.3) PL53 PL2.4: Phổ của hợp chất cleindoside B (CLQF16) PL58 PL2.5: Phổ của hợp chất cleindoside A (CLQF17.1) PL63 PL2.6: Phổ của hợp chất cleindoside C (CLQF17.2) . PL69 PL2.7: Phổ của hợp chất cleindoside F (CLQ4.3) PL74 PL2.8: Phổ của hợp chất cleindoside D (CLQF4.4) PL79 PL2.9: Phổ của hợp chất cleindoside E (CLQF4.5) PL84
  12. PL2.10: Phổ của hợp chất axit galic (CLQF2) PL88 PL2.11: Phổ của hợp chất amentoflavone (CLQF7) PL89 Phụ lục 3: Phổ các hợp chất phân lập từ lá cây Săng bù PL90 PL3.1: Phổ của hợp chất 3,5-dimetoxy-trans-stilben (MKF8.1) PL91 PL3.2: Phổ của hợp chất β-amyrine (MKF8.4) PL92 PL3.3: Phổ của hợp chất izalpinin (MKF9) PL93 PL3.4: Phổ của hợp chất 5,7-đihydroxy 6-prenyl flavanon (MKF9.4) PL94 PL3.5: Phổ của hợp chất macakurzin A (MKF9.5) PL96 PL3.6: Phổ của hợp chất glabranin (MKF9.7) PL101 PL3.7: Phổ của hợp chất glepidotin A (MKF10) . PL103 PL3.8: Phổ của hợp chất 8-prenyl galangin (MKF11.4) PL105 PL3.9: Phổ của hợp chất macakurzin E (MKF11.4.1) PL107 PL3.10: Phổ của hợp chất galangin (MKF11.5.2) PL111 PL3.11: Phổ của hợp chất macakurzin D (MKF11.5.3) PL112 PL3.12: Phổ của hợp chất macakurzin C (MKF8.3) PL116 PL3.14: Phổ của hợp chất macakurzin B (MKF11.5.1) PL119 Phụ lục 4: Phổ các hợp chất phân lập từ quả cây Bạch đàn nam PL123 PL4.1: Phổ của hợp chất macatanarin G (MTF8) PL124 PL4.2: Phổ của hợp chất broussoflavonol F (MTF10) PL128 PL4.3: Phổ của hợp chất glyasperin A (MTF10B) PL132 PL4.4: Phổ của hợp chất macatanarin H (MTF10C) PL136 PL4.5: Phổ của 6-farnesyl-3',4',5,7-tetrahydroxyflavanon (MTF12.6A) PL141 PL4.6: Phổ của hợp chất isolicoflavonol (MTF12.5A) PL142 PL4.7: Phổ của hợp chất broussonol E (MTF 12.5B) PL143 PL4.8: Phổ của hợp chất macatanarin K (MTF16A) PL144 PL4.9: Phổ của hợp chất macatanarin E (MTF17C) PL150 Phụ lục 5: Phổ các hợp chất được tổng hợp từ hợp chất Cleistantoxin PL151
  13. PL5.1: Phổ của hợp chất 1 (CLQF11CN) . PL152 PL5.2: Phổ của hợp chất 2 (CLQF11Ax) PL156 PL5.3: Phổ của hợp chất 3a (CLQF11Fur) PL160 PL5.4: Phổ của hợp chất 3c (CLQF11Pent) PL165 PL5.5: Phổ của hợp chất 3d (CLQF11Hept) . PL170 PL5.6: Phổ của hợp chất 3h (CLQF11Pipe) PL176 PL5.7: Phổ của hợp chất 3b (CLQF11Imid) . PL181 PL5.8: Phổ của hợp chất 3e (CLQF11Dibenz) . PL186 PL5.9: Phổ của hợp chất 3g (CLQF11Diclo) PL191 PL5.10: Phổ của hợp chất 3f (CLQF11Flo) PL196 Kết quả thử hoạt tính sinh học Số liệu X-ray của hợp chất CLF3.20
  14. MỤC LỤC trang ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Sơ lược về thực vật họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) 4 1.2. Sơ lược về thực vật chi Cách hoa (Cleistanthus) và chi Mã rạng (Macaranga) 5 1.2.1. Giới thiệu về chi Cách hoa (Cleistanthus) . 5 1.2.2. Giới thiệu về chi Mã rạng (Macaranga) 6 1.3. Các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học về chi Cleistanthus và chi Macaranga 8 1.3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Cleistanthus 8 1.3.1.1. Các hợp chất lignan 9 1.3.1.2 Các hợp chất khác 12 1.3.1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ chi Cleistanthus 13 1.3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Macaranga 15 1.3.2.1. Các hợp chất flavonoit 15 1.3.2.2. Các hợp chất khác . 19 1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu 3 loài Cách hoa đông dương (C. indochinensis), Săng bù (M. kurzii) và Bạch đàn nam (M. tanarius) 22 1.4.1. Tình hình nghiên cứu loài Cách hoa đông dương (C. indochinensis) 22 1.4.2. Tình hình nghiên cứu loài Săng bù (M. kurzii) 22 1.4.3. Tình hình nghiên cứu loài Bạch đàn nam (M. tanarius) 23 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1. Mẫu thực vật 28 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu 28 2.3. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu cây . 29 2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập 30
  15. được từ các mẫu cây nghiên cứu và các hợp chất thu được từ các phản ứng tổng hợp . 2.5. Phương pháp bán tổng hợp các chất 30 2.6. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào . 31 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 32 3.1. Lá cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) 32 3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 32 3.1.2. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được 35 3.2. Quả cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) 42 3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 43 3.2.2. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được 46 3.3. Lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) 51 3.3.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 51 3.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được 55 3.4. Quả cây Bạch đàn nam (Macaranga taranius) 63 3.4.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách 63 3.4.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được 65 3.5. Bán tổng hợp các dẫn xuất amide từ hợp chất Cleistantoxin CLQF11 70 3.5.1. Hợp chất 1 70 3.5.2. Hợp chất 2 71 3.5.3. Tổng hợp các dẫn xuất amide từ hợp chất 2 72 3.5.3.1. Hợp chất 3a 72 3.5.3.2. Hợp chất 3b 74 3.5.3.3. Hợp chất 3c 74 3.5.3.4. Hợp chất 3d 75 3.5.3.5. Hợp chất 3e 76 3.5.3.6. Hợp chất 3f 78
  16. 3.5.3.7. Hợp chất 3g 79 3.5.3.8. Hợp chất 3h 80 3.6. Quy trình thủy phân các hợp chất lignan glycoside từ quả cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) 81 3.7. Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được và/ hoặc các hợp chất tổng hợp được 81 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 83 4.1. Các hợp chất phân lập được từ lá cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) 83 4.2. Các hợp chất được phân lập từ quả cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) 98 4.3. Các hợp chất phân lập được từ lá cây Săng bù (M.kurzii) 117 4.4. Các hợp chất phân lập được từ quả cây Bạch đàn nam (M. tanarius) 132 4.5. Tổng hợp các dẫn xuất của hợp chất Cleistantoxin CLQF11 141 4.6. Khảo sát hoạt tính sinh học của các dịch chiết, các phân đoạn các hợp chất phân lập được từ cây Cách hoa đông dương, cây Săng bù và cây Bạch đàn nam và các hợp chất bán tổng hợp từ Cleistantoxin 145 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 153 TÀI LIỆU THAM KHẢO 157 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 166
  17. ĐẶT VẤN ĐỀ Thực vật, động vật, vi sinh vật, các sinh vật trên cạn và sinh vật dưới biển là một kho tàng vô cùng phong phú các hợp chất thiên nhiên. Hàng trăm nghìn các hợp chất thiên nhiên đã được tìm ra và được nghiên cứu để phục vụ cho nhiều lĩnh vực của cuộc sống, đặc biệt là trong y học. Các kết quả thống kê gần đây cho thấy trong 877 các phân tử nhỏ mới được đăng ký làm thuốc trên toàn thế giới giai đoạn 1981-2002 thì 61 % là các hợp chất thiên nhiên hoặc các chất có liên quan tới chúng. Trong số đó 6 % là các hợp chất thiên nhiên, 27 % là các dẫn xuất của các hợp chất thiên nhiên, 5 % là các hợp chất tổng hợp có mang các pharmacophor bắt nguồn từ các hợp chất thiên nhiên và 23 % là các hợp chất tổng hợp được thiết kế trên cơ sở các tri thức thu được từ các hợp chất thiên nhiên (hay còn gọi là các chất mô phỏng các hợp chất thiên nhiên). Trong một số lĩnh vực trị liệu, tỷ lệ này còn cao hơn nữa: 78 % các hoạt chất dùng làm thuốc kháng sinh và 74 % các hoạt chất dùng làm thuốc chữa ung thư là các hợp chất thiên nhiên hoặc có nguồn gốc từ các hợp chất thiên nhiên [5]. Trong những năm đầu thập kỷ 90, hóa học tổ hợp (combinatorial chemistry) đã được các hãng dược lớn của thế giới lựa chọn làm công cụ chủ chốt để nghiên cứu tìm thuốc mới, khi đó vai trò của hợp chất thiên nhiên đã ít nhiều bị coi nhẹ. Kết quả là hiệu quả đầu tư để tìm ra các hoạt chất có cấu trúc kiểu mới đã giảm đi trông thấy. Sau đó, phương hướng nghiên cứu đã được hoạch định lại và các hợp chất thiên nhiên lại tiếp tục đóng vai trò chủ chốt trong công cuộc tìm kiếm các thuốc mới chống lại các căn bệnh hiểm nghèo đang hàng ngày cướp đi sinh mạng của nhiều người. Việt Nam có diện tích thiên nhiên là 329 420 km2, có 75 % diện tích là đồi núi, có bờ biển dài với hàng trăm hòn đảo lớn nhỏ, có khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa mưa điển hình ở miền Nam và thời tiết ôn đới hơn ở miền Bắc. Về mặt sinh địa, Việt Nam là giao điểm của vùng Ấn Độ, Nam Trung Quốc và Malayxia. Do đó, đây là một vùng có tính đa dạng sinh học rất cao. Riêng về 1
  18. hệ thực vât, Việt Nam có khoảng 12000 loài thực vật bậc cao, 800 loài rêu và 600 loài nấm. Hơn 2300 loài thực vật đã được sử dụng làm lương thực, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, lấy gỗ, tinh dầu, vật liệu xây dựng Đây là một nguồn hợp chất thiên nhiên vô cùng quý báu cần được nghiên cứu về mặt hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học để tìm ra các hoạt chất có thể sử dụng làm thuốc phục vụ cho việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cho nhân dân. Từ những năm 1960 trở lại đây, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng nhiều cơ quan nghiên cứu trong và ngoài nước đã quan tâm nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên có trong các loài cây Việt Nam nhằm đóng góp vào việc sử dụng chúng trong các ngành công nghiệp dược, hương liệu, mỹ phẩm và xuất khẩu. Theo đuổi hướng nghiên cứu nói trên, luận án này là sự tham gia có hiệu quả trong khuôn khổ của dự án Pháp - Việt (Nghiên cứu hóa thực vật thảm thực vật Việt Nam). Trong đó 3 loài cây thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) của Việt Nam là cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochiensis), cây Săng bù (Macaranga kurzii) và cây Bạch đàn nam (Macaranga tanarius) đã được thu hái, định tên và thử sơ bộ hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên (CNRS - Cộng hòa Pháp). Kết quả cho thấy, dịch chiết etylaxetat của lá và quả cây Cách hoa đông dương, quả cây Bạch đàn nam, lá cây Săng bù ức chế tương ứng 30 %, 94 % và 62,7 % và 21,6 % sự phát triển của tế bào ung thư KB ở 1µg/ml. Vì vậy, 3 loài thực vật trên được lựa chọn làm đối tượng nghiên cứu của luận án. Mục tiêu của luận án là nghiên cứu hóa thực vật cây Cleistanthus indochinensis, Macaranga kurzii và cây Macaranga tanarius (Euphorbiaceae) nhằm phát hiện ra các chất có hoạt tính sinh học như chống khối u. Từ các kết quả nghiên cứu thành phần hóa học của 3 cây nói trên, tiến hành bán tổng hợp một số dẫn xuất của chất phân lập được. Cuối cùng là khảo sát hoạt tính sinh học của các chất phân lập cũng như tổng hợp được để làm cơ sở khoa học cho việc định hướng sử dụng cho các chất này. 2
  19. Hình ảnh cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) Hình ảnh cây Bạch đàn nam (ba soi) (Macaranga tanarius) Hình ảnh cây Mã rạng Kurz (săng bù) (Macaranga kurzii) 3
  20. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Sơ lược về thực vật họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Họ Euphorbiaceae trước đây bao gồm 5 phân họ: Acalyphoideae, Crotonoideae, Euphorbioideae, Oldfieldioideae và Phyllanthoideae. Ba phân họ đầu tiên là các phân họ đơn noãn (một noãn) trong khi hai phân họ sau là đôi noãn (hai noãn) [4]. Hình thái học về họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) Họ Thầu dầu (danh pháp khoa học là Euphorbiaceae) hay còn gọi là họ Đại kích là một họ lớn của thực vật có hoa với 240 chi và khoảng 6000 loài. Phần lớn là thân cây thảo, nhưng ở khu vực nhiệt đới cũng tồn tại các loài cây bụi hoặc cây thân gỗ. Một số loài cây chứa nhiều nước và tương tự như các loại xương rồng. Họ này phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới, với phần lớn các loài tập trung trong khu vực Indomalaya và sau đó là khu vực nhiệt đới châu Mỹ. Tại khu vực nhiệt đới Châu Phi cũng có nhiều loài, giống, thứ, nhưng không đa dạng như hai khu vực kể trên. Tuy nhiên, chi Euphobia cũng có nhiều loài trong các khu vực không nhiệt đới như Địa Trung Hải, Trung Đông, miền nam châu Phi hay miền nam Hoa kỳ. Lá mọc so le, hiếm khi mọc đối, với các lá kèm. Hình dạng lá chủ yếu là các lá đơn, nhưng cũng có loài lá phức, chủ yếu là loại dạng chân vịt, không thấy dạng lông chim. Các lá kèm có thể bị suy thoái thành gai, lông tơ hay các tuyến nhỏ. Hoa đối xứng xuyên tâm thường là đơn tính, với hoa đực và hoa cái thường trên một cây. Ở đây có một sự đa dạng lớn về cấu trúc hoa. Chúng có thể là cùng gốc hay khác gốc. Các nhị hoa có thể từ 1 đến 10 (có thể nhiều hơn). Hoa cái là loài dưới bầu, nghĩa là với bầu nhụy lớn. 4
  21. Quả thường là loại quả nứt, đôi khi là quả hạch. Loại quả nứt điển hình là regma, một loại quả nang với 3 hoặc nhiều hơn các ô, mỗi ô tách ra khi chín thành các phần riêng biệt và sau đó nổ để phân tán các hạt nhỏ. Các loài cây trong họ này chứa một lượng khá lớn các độc tố thực vật chủ yếu là các este diterpen, ancaloid, glycoside và các chất độc dạng ricin. Nhựa (mủ) dạng sữa hay latex là tính chất đặc trưng của các phân họ Euphorbioideae và Crotonoideae, nhựa mủ này là độc hại ở phân họ Euphorbioideae nhưng lại không độc hại ở phân họ Crotonoideae. Nhiều cây trong họ Thầu dầu có tầm quan trọng về mặt kinh tế. Các loài cây đáng chú ý nhất là sắn (Manihot esculenta), thầu dầu (Ricinnus communis) và cao su (Hevea brasiliensis). Một số loài cây khác được trồng làm cây cảnh như hoa trạng nguyên (Euphorbia pulcherrima) [2]. 1.2. Sơ lược về thực vật chi Cách hoa (Cleistanthus) và chi Mã rạng (Macaranga) 1.2.1. Giới thiệu về chi Cách hoa (Cleistanthus) Cleistanthus (do chữ latin cleisto, từ chữ Hy lạp kleistos: đóng, không mở và anthos: hoa) – cách hoa, cọc rào. Là cây gỗ hay nhỡ, lá mọc so le xếp hai dãy, nguyên. Cụm hoa ở nách lá, thành xim đơn hoặc bông, nhiều hoa hoặc ít hoa; lá bắc thường ngắn hơn hoa; hoa không cuống hoặc có cuống, cùng gốc hoặc khác gốc; đài hợp ở gốc. Hoa đực có 4-6 lá đài, thường là 5, xếp van. Cánh hoa 5 nhỏ, thường nguyên. Đĩa mật phẳng hay lồi. Bầu không lông hoặc có lông nhung. Quả nang có 3 mảnh vỏ tròn ở lưng; hạt hình trứng - 3 góc [4]. Chi Cleistanthus gồm tới 140 loài mọc tự nhiên từ châu Phi, Ấn Độ đến Australia. Ở nước ta theo sách “Cây cỏ Việt Nam” của tác giả Phạm Hoàng Hộ thì chi Cleistanthus có 14 loài đó là [3]: - C. acuminatus - Cách hoa nhọn 5
  22. - C. concinnus Croiz - Cách hoa ca - C. indochinensis Merr.ex Croiz - Cách hoa đông dương - C. annamensis Gagn. - Cách hoa ganep - C. eberhardtii Gagn - Cách hoa eberhardi - C. tonkinensis Jabl - Chà chôi - C. sumatranus (Miq.). Muell.-Arg - Cách hoa Sumatra - C. longipedicellatus - Cách hoa cọng dài - C. myrianthus Kurz - Cách hoa nhiều hoa - C. peteloti Merr. Ex Croiz - Cách hoa Petelot - C. hirsutulus Hook.f - Cách hoa phún - C. tometosus Hana - Cách hoa đầy lông - C. pierrei (Gagn.) Croiz. - Cách hoa Pierre - C. sageretoides Merr - Cách hoa dạng Chanh châu Trong 14 loài tìm được ở Việt Nam, một số loài đã được sử dụng trong dân gian với nhiều mục đích khác nhau phục vụ cuộc sống [1,2]: - C. sumatranus (Miq.). Muell.-Arg (cách hoa Sumatra): Có thể sử dụng trong các công trình thủy lợi, làm cầu cống, tàu thuyền, xe cộ, cọc cột, cửa, ván sàn, phụ tùng máy, nông cụ, dụng cụ gia đình. Hạt chứa nhiều dầu, tỷ lệ đến 35%, dầu này màu lục nhạt thuộc loại dầu không khô, dùng thắp đèn, chế xà phòng. Lá được dùng làm thuốc giải độc, trừ ho; ở Vân Nam (Trung Quốc) được dùng trị sỏi phổi (phổi bị nhiễm silic) và trúng độc benzen. - C. tometosus Hana (cách hoa đầy lông): hay còn gọi là cây lương trắng, dân gian dùng cành lá trị ban hạch, nhức mỏi, cũng dùng để chữa cảm sốt, nhức đầu, khát nước, môi khô, phổi nóng và còn được dùng để giải độc rượu. Ngoài ra còn được phối hợp với các vị thuốc khác sắc uống. - C. tonkinensis Jabl (chà chôi, cọc rào): Ở Vân Nam (Trung Quốc), lá được dùng làm thuốc trị sỏi phổi (do nhiễm silic) và ngộ độc benzen. 1.2.2. Giới thiệu về chi Mã rạng (Macaranga) 6
  23. Chi Mã rạng hay chi Ba soi (danh pháp khoa học là Macaranga) là một chi lớn bao gồm các loại cây thân gỗ hoặc nhỡ của khu vực nhiệt đới và là chi duy nhất của phân tông Macaranginae. Có nguồn gốc từ châu Phi, châu Á, châu Đại dương, chi Macaranga gồm khoảng hơn 300 loài khác nhau. Lá mọc so le, thường chia thùy, có lá kèm. Hoa khác gốc xếp thành chùm hay bông đơn hoặc kép. Hoa đực có đài xếp van và một số lượng nhiều nhị có bao phấn mở nắp ngang. Hoa cái có bầu rời, không có đĩa mật [4]. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ ở Việt Nam có 16 loài Macaranga [3], đó là các loài: - M. henricorum Hemsl. - Mán bầu - M. triloba (Bl.) Muell.-Arg - Mã rạng ba thùy, long màng - M. tanarius (L.) Muell-Arg - Mã rạng - M. thorelli Gagn. - Mã rạng Thorel - M. indica Wight. - Mã rạng ấn - M. kurzii (O. Ktze) Pax & Hoffm - Mã rạng Kuzr - M. denculata (Bl.) Muell.-Arg - Mã rạng răng, Ba soi - M. henryi (Pax & Hoffm) - Mã rạng henry - M. sampsonii Hance. - Mã rạng sầm sơn - M. microcarpa (Pax & Hoffm) - Mã rạng trái nhỏ - M. trichocarpa (Reichb. & Zoll.) Muell-Arg - Mã rạng trái có lông - M. andamanica Kurz - Mã rạng Andaman - M. auriculata (Merr.) A.-Shaiv - Mã rạng tai - M. kampotensis Gagn - M. balansae Gagn. - Mã rạng Balansa, lá nến - M. trigonostemoides Croiz. - Mã rạng Trong số các loài thuộc chi Macaranga, nhiều cây đã được dùng làm thuốc chữa bệnh như [1][2]: 7
  24. - M. denticulata (ba soi): nhiều bộ phận của cây được sử dụng làm thuốc ở một số nước châu Á như ở Vân Nam, Trung quốc rễ cây được dùng trị viêm gan thể hoàng đàn, vỏ thân dùng trị bụng trướng nước và bí tiểu tiện. Ở Hải nam, người ta dùng nước sắc lá cây làm thuốc lọc máu và phòng bệnh cho phụ nữ lúc sinh đẻ để tránh các rối loạn. Ở các nước Đông dương, nước sắc của cây được dùng cho phụ nữ sinh đẻ uống liên tục trong 15 ngày đầu sau khi sinh, vỏ cây dùng ăn nhai với trầu như vỏ chay. Ở Malayxia, người ta cũng dùng nước sắc lá cây uống sau khi sinh đẻ và để rửa các vết thương. - M. henryi (mã rạng henry): trong thành phần rễ cây có chứa độc tố, được dùng ngoài trị một số bệnh như phong thấp, đau xương và đòn ngã tổn thương. - M. indica (mã rạng ấn): trong y học dân gian Trung Quốc lá cây được dùng làm thuốc trị đòn ngã tổn thương, còn ở Ấn Độ người ta lấy chất gôm từ cây đắp lên vết thương. - M. triloba (mã rạng ba thùy, long màng): Ở Malayxia lá cây được dùng làm thuốc giã đắp mụn nhọt ở đầu, trong khi người dân Java sử dụng nước sắc lá và quả trị đau dạ dày. - M. gigantea (mã rạng): được nhiều địa phương tại Malayxia dùng để điều trị một số bệnh dịch như tiêu chảy, lỵ. 1.3. Các nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học về chi Cleistanthus và chi Macaranga. 1.3.1. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Cleistanthus Các nghiên cứu hóa học về chi Cleistanthus ở trên thế giới còn rất hạn chế. Hiện nay mới có 4 loài thuộc chi này đã được nghiên cứu hóa học, đáng kể nhất là C. collinus (Roxb.) Benth. & Hook.f., từ Ấn độ. Bên cạnh đó C. patulus Muell. Arg. và C. schlechteri var. schlechteri từ Nam Phi đã được 8
  25. khảo sát về thành phần hóa học. Và mới đây, các hợp chất mới đã được báo cáo từ loài C. gracilis Hook.f. được thu hái ở Tây nam Thái Lan [6]. Các hợp chất được phân lập từ các cây thuộc chi Cleistanthus có thể được phân loại như sau: Các hợp chất lignan, các hợp chất terpen và một vài hợp chất khác. 1.3.1.1. Các hợp chất lignan Có 3 loại lignan đã được phân lập từ C. collinus và C. patulus đó là các arylnaphthalid lignan, furofuranoid lignan và dibenzylbutane lignan. - Các hợp chất arylnaphthalid lignan: Đây là thành phần chủ yếu trong các loài Cleistanthus. Chúng được phân lập ở cả hai dạng, dạng tự do và dạng glycoside. Thành phần đường của các hợp chất glycoside thường chủ yếu ở dạng O-metyl xylose, ít hơn là dạng D-glucose và dẫn xuất O-metyl của nó. Năm 1969, Govindachari và các cộng sự đã phân lập được từ lá của loài C. collinus diphyllin (1) và hợp chất lignan mới đặt tên là collinusin (2) [7,8]. Hợp chất diphyllin lần đầu tiên được phân lập từ rễ của loài Diphylleia grayi và còn được tìm thấy ở loài C. patulus [9, 10] và lõi gỗ của C. collinus [8], trong khi collinusin (2) và hợp chất 3 còn được tìm thấy trong cả phần rễ phụ [11]. OH OH O O O O O O O O O O O O O O O O 1 O 2 O 3 O Bên cạnh diphyllin, một vài hợp chất arylnaphthalid tự do khác cũng được phân lập từ loài C. collinus. Các hợp chất taiwanin C (4), 3,4 9
  26. dihydrotaiwanin C (5) và taiwanin E (6) được tách ra từ lõi gỗ [8]. Hợp chất taiwanin C (4) còn được tìm thấy trong lõi gỗ của cây C. patulus [9]. Một vài hợp chất glycoside của arylnaphthalid mà phần aglycol là diphyllin đã được phân lập và hầu hết chúng đều có phần đường được nối với carbon C-7 của diphyllin. Cleistanthin A (7), cleistanthin B (8) và 7-O-(3-O-metyl-β-D- glucopyranosyl)-diphyllin (9) đã được phân lập từ lá và lõi gỗ của C. collinus [7, 11, 12], trong khi cleistanthoside B (10) được phân lập từ C. patulus [13]. Các hợp chất 8 - 10 đều là các monoglycoside mà có phần đường tương ứng là 3,4-di-O-metyl-β-D-xylopyranose, β-D-glucose, 3-O-metyl-β-D-glucose và 4- O-metyl-β-D-xylopyranose. Đáng quan tâm là hợp chất cleistanthin D (11) có phần đường là 2,3,5 tri-O-metyl-D-xylofuranose [8, 14]. Ngoài ra, hai hợp chất diglycoside là cleistanthin C (12) có chứa 2,3-di-O-metyl- β-D-xylopyranosyl [1→4]- β-D- glucopyranose được phân lập từ lõi gỗ của C. collinus [10, 13] và 10
  27. cleistanthoside A (13) được tìm thấy trong lõi gỗ loài C. patulus [9] có phần đường là β-D-glucopyranosyl-[1→2]-3,4 di-O-metyl-β-D-xylopyranose. Hợp chất triglycoside duy nhất cho tới nay được biết đến trong chi này là cleistanthin E (14) cũng được phân lập từ C. collinus có gốc glycoside là 2,3,5 tri-O-metyl-D-xylofuranosyl-2,3-di-O-metyl-D-xylofuranosyl-[1→4]- 2,3 -di-O-metyl-β-D-glucopyranose [8]. Ngoài ra cũng từ phần gỗ của loài C. collinus, Anjaneyulu và cộng sự còn phân lập được một monoglycoside là 7- O-3,4-di-O-metyl-β-D-xylopyranosyl, taiwanin E (15) [8]. - Các hợp chất furofuranoid lignan Một vài hợp chất furofuranoid lignan đã được tìm thấy trong chi Cleistanthus. Từ năm 1975, Anjaneyulu và cộng sự đã phân lập được hợp chất Wodeshiol (16), một lignan mới có cấu trúc là 1,5 dihydroxy-2e-6e dipiperonyl-3,7 dioxabicyclo [3,3,0] octan, chất đầu tiên của một chuỗi mới 11
  28. các hợp chất dihydroxy lignan được phân lập từ loài C. collinus [8, 9]. Tiếp tục quá trình nghiên cứu trên, các hợp chất furofuranoid lignan khác là paulownin (17), sesamin (18), 4-hydroxy sesamin (19) đã được phân lập từ gỗ của loài cây này [8]. - Hợp chất dibenzylbutane lignan: Chỉ có duy nhất một hợp chất dibenzylbutanlignan được tìm thấy cho tới nay trong chi Cleistanthus là dihydrocubebin (20). Hợp chất này được phân lập từ lõi gỗ của loài C. collinus [8]. H O CH2OH O CH2OH H O O 20 1.3.1.2 Các hợp chất khác Gần đây, hai hợp chất triterpen đã được tìm thấy trong chi Cleistanthus, đó là lupeol (21) và 3-oxofriedelin (22) phân lập từ cành và rễ của loài C. gracilis [15]. Bên cạnh các triterpens, các hợp chất diterpen khung pimarane là ent-isopimara-8(14), 15-diene-3β-ol (23), ent-3β-hydroxy isopimara-8(14), 15-diene-12-one (24) và ent-isopimara-8(14), 15-diene-3β-12β-diol (25) cùng với một diterpene aromatic là cleistanthol (26) đã được phân lập từ lõi gỗ loài Cleistanthus của Nam phi là C. schlechteri var. schlechteri [16, 17]. 12
  29. Ngoài các hợp chất lignan và các terpen ở trên, người ta còn phân lập được từ lõi gỗ của loài C. collinus axit ellagic (27) [7] và mới đây hợp chất gracicleistanthoside (28) đã được phân lập từ cành và rễ của loài C. gracilis Hook. f., thu hái ở Thái lan [15]. O HO O HO HO 21 22 23 24 OH H OH OH O O OH H OH H HO O H HO O HO O OH HO O O H HO HO OH NH H 25 26 27 28 1.3.1.3. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập từ chi Cleistanthus Ở chi Cleistanthus, người ta mới chỉ biết đến hoạt tính chống ung thư từ dịch chiết cồn của loài Cleistanthus collinus kháng lại ung thư biểu mô nuôi cấy trong mũi hầu người [11]. Sau đó một vài thành phần của dịch chiết được nghiên cứu hoạt tính sinh học này. Hai hợp chất là cleistanthin A (7) và cleistanthin B (8) đã được nghiên cứu sâu hơn cho khả năng sử dụng chúng như là thuốc chống ung thư. Hợp chất cleistanthin A (7) đã thể hiện độc tính ưu tiên trên một số dòng tế bào ung thư. Giá trị GI50 của nó đối với các dòng tế bào thường là khoảng 10-6 và 10-7 M trong khi đối với các dòng tế bào ung thư thì giá trị này trong khoảng từ 10-7 đến 10-9 M. Khi so sánh độc tính của cleistanthin A với 5 thuốc chống ung thư thì nó có tác dụng tốt nhất đối với các dòng tế bào ung thư biểu mô KB và dòng tế bào ung thư biểu mô vòm họng (SiHa). Tính hiệu quả của cleistanthin A trong việc kìm hãm sự phát triển của các khối u được 13
  30. đánh giá trên chuột Dalton bị xưng cổ bởi u bạch huyết và bởi các u rắn ung thư S-180. Trong cả hai trường hợp, thể tích khối u được giảm mạnh khi xử lý với Cleistanthin A. Hợp chất này cũng làm tăng tuổi thọ của chuột bị ung thư S-180 ở mức độ tương tự như khi sử dụng cisplatin và etoposide. Hơn thế nữa, cleistanthin A (7) ít độc hại hơn 2 loại thuốc trên vì nó không ảnh hưởng đến trọng lượng cơ thể và số lượng tế bào bạch huyết ở động vật được điều trị. Các thí nghiệm ngẫu nhiên chỉ ra rằng cleistanthin A kìm hãm sự tăng trưởng của tế bằng cách ức chế sự tổng hợp DNA và sự phân chia tế bào và bằng cách lái các tế bào theo cơ chế gây chết tế bào theo chương trình [18] đối với các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung quốc (CHO), ở các tế bào ung thư vòm họng (SiHa) và ở các dòng tế bào K567 khuyết p53. cleistanthin A (7) cũng ức chế sự kết hợp của [3H] thymidine vào trong DNA nhưng không ảnh hưởng đến sự vận chuyển [3H] thymidine vào trong các tế bào này [19]. Một hợp chất khác, cleistanthin B (8) cũng được phát hiện có độc tính đối với các tế bào thường và các tế bào ung thư. Khi so sánh với các tế bào thường, các tế bào ung thư rất nhạy cảm với liều lượng thấp hơn của hợp chất. -5 -4 Giá trị GI50 của các dòng tế bào thường là từ 2.10 đến 4,7.10 M, và đối với các dòng ung thư thì giá trị này trong khoảng từ 1,6.10-6 đến 4.10-5 M. Khi cho cleistanthin B tiếp xúc ngắn với các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung quốc ở 1-6 µg/ml dẫn đến các thanh nhiễm sắc thể và các nhánh nhiễm sắc thể bị bẻ gẫy và gián đoạn. Tuy nhiên, có sự gia tăng không đáng kể các tế bào chết và các chuỗi DNA bị bẻ gẫy trong các tế bào được điều trị dưới các điều kiện nêu trên. cleistanthin B cũng gây ra sự hình thành các nhân sinh sản (nhân nhỏ) trong các tế bào bạch huyết nuôi cấy ở liều lượng-phụ thuộc (dose- dependent manner). Các nhà khoa học cũng chỉ ra rằng các tế bào ung thư vòm họng (SiHa) khi tiếp xúc với cleistanthin B, thanh nhiễm sắc bị co lại và phân mảnh hạt nhân, đặc điểm của cơ chế gây chết tế bào theo chương trình [20]. 14
  31. Hợp chất 3 và dẫn xuất axetyl của nó cũng được đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào MT2 sử dụng etoposide làm chất chuẩn. Giá trị LD50 của hai hợp chất được xác định tương ứng là 38,1 µM và 27,2 µM trong khi giá trị LD50 của etoposide là 22,1 µM [11]. 1.3.2. Nghiên cứu hóa học và hoạt tính sinh học của chi Macaranga Trong thực tế nhân dân ta đã sử dụng nhiều loài cây thuộc chi Macaranga làm thuốc chữa bệnh, nhưng chưa có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi này phân bố ở Việt nam. Tuy nhiên ở các quốc gia khác, các loài thuộc chi Macaranga đã thu hút sự quan tâm của nhiều nhóm nghiên cứu. Nhiều loài Macaranga đã được nghiên cứu kỹ về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học như loài M. conifera, M. tanarius, M. triloba, M. alnifolia, M. sampsonii, và gần đây nhất là loài M. gigantea, M. pruinosa. Các kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Macaranga cho thấy lớp chất flavonoid là các hợp chất chính. 1.3.2.1. Các hợp chất flavonoit Với chi Macaranga các nghiên cứu hóa thực vật cho thấy các hợp chất flavonoid xuất hiện chủ yếu ở dạng flavonoid prenylat. Từ dịch chiết etyl axetat lá của loài Macaranga conifera, ở phân đoạn có hoạt tính ức chế enzym cyclooxygenase-2 in vitro, 2 dẫn xuất prenylat flavonoid mới là 5-hydroxy-4’-methoxy-2”,2”-dimethylpyrano-(7,8: 6”,5”) flavanone (29) và 5,4’-dihydroxy-[2”-(1-hydroxy-1-metyletyl)-dihydro furano]-(7,8:5”,4”)-flavanone (30) cùng 8 hợp chất đã biết, 31 - 37. Tất cả các chất này đã được thử nghiệm tác dụng ức chế kháng lại cả enzym cyclooxygenases-1 và -2 [21]. 15
  32. Trong một nghiên cứu khác, từ phân đoạn có hoạt tính (sử dụng phép thử sinh học dựa trên cơ sở ức chế enzym cyclooxygenase-2) từ dịch chiết lá cây M. triloba, các nhà khoa học đã phân lập được các hợp chất là 3,7,3’,4’- tetramethylquercetin (37), 3,7,3’-trimetylquercetin (38) và 3,7- dimetylquercetin (39). Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cho thấy, các chất này thể hiện khả năng ức chế enzym cyclooxygenase-1 và -2 [22]. Ngoài ra, từ lá loài M. triloba của Việt Nam, 1 hợp chất geranyl flavanone mới là 2’-hydroxy-macarangaflavanone A (40) và 4’,7-dihydroxy- 8-metylflavan (41) đã được phân lập [23]. 16
  33. Một loài Macaranga ở rừng mưa nhiệt đới Madagasca là M. alnifolia cũng đã được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Dịch chiết etanol từ quả của loài này có hoạt tính chống tăng sinh thử nghiệm trên dòng tế bào A2780 ung thư buồng trứng người với giá trị IC50 là 3,5 µg/ml. Ở phân đoạn có hoạt tính đã phân lập được 4 hợp chất stilbene prenyl hóa mới và 1 hợp chất geranylat dihydroflavonol mới là alnifoliol (42) cùng với các geranylat flavonoid là bonanniol A (43), diplacol (44), bonannione A (45) và diplacone (46) [24]. Các loài Macaranga đang được quan tâm nghiên cứu, trong một số các công trình công bố về loài M. trichocarpa, M. sampsonii, M. gigantea và loài M. pruinosa năm 2009 và 2010 thì các hợp chất prenylflavonoids được phân lập là khá điển hình. Như từ dịch chiết axeton lá của loài M. trichocarpa 2 hợp chất isoprenylat flavanone mới là macatrichocarpin A (47) và B (48) cùng 2 isoprenylate dihydrochalcone là macatrichocarpin C (49) và D (50) đã được phân lập. Đây là bài báo đầu tiên cho thấy sự có mặt của các dẫn xuất dihydrochalcone trong các loài thuộc chi Marcaranga [25]. 17
  34. Từ lá loài M. sampsonii 4 hợp chất prenylflavonol mới là macaranone A-D (51-54) cũng được tìm thấy. Các hợp chất này đã được đánh giá hoạt tính kháng lại một số dòng tế bào ung thư ở người. Hợp chất flavonol macaranone C (53) và D (54) có khung peltogynoid dặc biệt, được hình thành từ 2’- geranylflavonol bằng sự vòng hóa thông qua cầu ete giữa C-3 và C-1” của nhóm thế 2’-geranyl của flavonol [26]. Trong một công trình khác, các nhà khoa học Indonesia đã phân lập một dẫn xuất mới của farmesylat flavonol là macagigantin (55) cùng với các hợp chất đã biết glyasperin A (56) và apigenin từ dịch chiết axeton của lá cây M. gigantea. Các hợp chất này đều có hoạt tính gây độc tế bào kháng lại dòng tế bào ung thư P-388, giá trị IC50 của chúng tương ứng là 11,3; 6,0 và 5,1 µM [27]. 18
  35. Từ loài M. pruinosa 2 hợp chất dẫn xuất flavonoid mới là macapruinosins B (57) và C (58) cùng papyriflavonol A (59) và nymphaeol C cũng được tách ra từ dịch chiết axeton. Hợp chất macapruinosins B là ví dụ đầu tiên của các hợp chất tự nhiên có chứa mạch sesquiterpenyl với khung cyclobutan không theo quy luật [28]. 1.3.2.2. Các hợp chất khác Năm 1998, các nhà nghiên cứu Mỹ đã phân lập 3 hợp chất geranyl stylben mới là schweinfurthin A, B và C (60-62) từ loài M. schweinfurthii. Các chất trên đã được tiến hành nghiên cứu khả năng gây độc tế bào trên dãy 60 tế bào ung thư. Các kết quả thử nghiệm cho thấy hai hợp chất schweinfurthin A và B thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rất đáng quan tâm. Khi nghiên cứu cơ chế tác dụng của chúng, các nhà khoa học Mỹ nhận thấy hai hợp chất này không tác dụng nhanh theo kiểu phá vỡ màng tế bào, tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư chỉ nhận thấy rõ sau 24h [29]. Trong một nghiên cứu khác vào năm 2001 về loài M. mappa, một hợp chất stylbene là mappain (63) đã được phân lập từ lá của loài cây này bằng phương pháp phân lập định hướng phép thử sinh học dẫn đường. Hợp chất này 19
  36. cho thấy khả năng ức chế tế bào ung thư buồng trứng với giá trị IC50 là 1,3 μM [30]. Trong quá trình nghiên cứu về loài M. alnifolia năm 2007, 5 hợp chất mới là schweinfurthin E-H (64-67) và vedelianin (68) đã được phân lập từ dịch chiết quả của loài cây này. Tất cả các hợp chất trên đã được khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư buồng trứng ở người A280. Kết quả cho thấy hợp chất vedelianin (68) hoạt động mạnh nhất với giá trị IC50 = 0,13 μM. Ngoài ra hợp chất schweinfurthin E (64) cũng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rất đáng quan tâm với giá trị IC50 = 0,26 μM [24] Trong một chương trình sàng lọc tìm kiếm các chất có hoạt tính chống oxy hóa, các nhà khoa học trường Đại học Illinois nhận thấy dịch chiết lá cây M. triloba thể hiện hoạt tính ức chế enzyme cyclooxygenase-2. Nghiên cứu thành phần hóa học của dịch chiết này, ngoài các hợp chất flavonoid còn một số các hợp chất khác như (69), ferulic axit (70), abscisic (71), (72), loliolide (73), scopoletin (74) và α-amyrin (75) β-amyrin (76) [22]. 20
  37. Ngoài các hợp chất prenylat flavonoid, các hợp chất triterpen khung olean như axit 20-epibryonoloc (87) cũng đã được phân lập từ dịch chiết etylaxetat của lá cây M. conifera, [21]. Gần đây, một hợp chất ellagitannin với nhóm 2,4-acyl được đặt tên là macabarterin (78) và một axit ellagic glycoside mới là 3-O-metylellagic axit 4- O-β-D-xylopyranoside (79) cùng với 5 hợp chất phenolic đã biết là axit ellagic (80), 3-O-methylellagic axit (81), galic axit (82), methyl gallate (83) và scopoletin được phân lập từ cành loài M. barteri. Các hợp chất này được thử nghiệm tác dụng kháng khuẩn trên các tế bào đường hô hấp người, trong đó hợp chất 78 thể hiện tác dụng ức chế sự sản sinh peoxit trên các tế bào thử nghiệm [31]. 21
  38. 1.4. Tổng quan về tình hình nghiên cứu 3 loài Cách hoa đông dương (C. indochinensis), Săng bù (M. kurzii) và Bạch đàn nam (M. tanarius) 1.4.1. Tình hình nghiên cứu loài Cách hoa đông dương (C. indochinensis) Cây Cách hoa đông dương có tên khoa học là Cleistanthus indochinensis Merr. ex Croiz., là loại cây tiểu mộc, lá có phiến bầu dục thon, Quả nang có đường kính 10 mm, mảnh vỏ 2-3 hạt, hình cầu to 5 mm, nâu tái. Cây phân bố ở miền Bắc và miền Trung nước ta [2, 4]. Cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học ở trong và ngoài nước về loài cây này. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu loài Săng bù(M. kurzii) Cây Săng bù có tên khoa học là Macaranga kurzii (Kuntze) Pax & Hoffm., còn có các tên gọi khác là lá nến gai, mã rạng kurz, ba soi lá bắc. Đây là cây gỗ nhỏ cao từ 3-8 m, có khi dạng cây bụi, lá đơn mọc so le, phiến lá hình trái xoan-tam giác, có lông hoặc không lông. Cây mọc ở rừng lá rộng ở độ cao lên đến 1500-1600 m, phân bố ở Đông Nam Á và Tây nam Trung Quốc. Ở nước ta cây được tìm thấy ở Bắc Cạn, Yên Bái, Nghệ An, Khánh Hòa và Lâm Đồng. Y học dân gian Trung Quốc sử dụng cành và lá cây làm thuốc bôi ngoài trị lở loét [2, 3]. 22
  39. Về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học: Hiện nay chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên thế giới cũng như ở Việt Nam về loài cây này. 1.4.3. Tình hình nghiên cứu loài Bạch đàn nam (M. tanarius) Cây Bạch đàn nam hay còn được gọi dưới các tên khác như cây ba sọi lông mềm, ba sọi quả một ô, ba sọi núi cao, ba sọi mép trắng có tên La tinh là Macaranga tanarius (L.) Muell.-Arg, Cây nhỡ cao 6 m, lá có phiến hình lọng, nguyên hình trái xoan hay tam giác, đầu nhọn, có nhiều lông lúc non, lá kèm hình tam giác. Quả nang có đường kính 8 mm, phủ tuyến màu da cam, có gai nhọn, mảnh vỏ 2-3 hạt, hình cầu to 5 mm, ráp. Cây phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, trung tâm phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam, Thái Lan, Malaixia, Indonexia, Philipin, Úc. Ở nước ta, có gặp ở Lào Cai, Lai Châu, Lạng Sơn, Hòa Bình và các tỉnh phía nam [2]. Nhân dân ta thường dùng nước sắc của lá để chữa lỵ, nước sắc của rễ để chữa sốt và cầm máu. Nhựa của thân dùng làm keo dán. Y học dân gian Malayxia dùng lá giã nhuyễn để đắp lên vết thương, và cùng dùng rễ để nấu nước trị sốt. Ở Indonexia, nước nấu của vỏ cây dùng uống trị lỵ, vỏ cũng là một vị thuốc dùng cho phụ nữ sinh đẻ uống, nước chiết của lá có tác dụng kháng sinh đối với chủng Staphylococus. Còn ở Phyllipin, nhựa lấy từ lát cắt vỏ cây tươi cũng dùng điều trị vết thương, nước sắc rễ dùng trị ho ra máu. Ở một số nơi của nước này người ta còn lấy vỏ và cả lá rụng dùng chế rượu uống. Ở Thái lan M. tanarius được biết đến với tên gọi là “mek”, thuốc sắc từ rễ cây này dùng để hạ sốt, giảm ho. Rễ cây phơi khô được sử dụng như là một thuốc gây nôn. Tại một số địa phương người ta dùng lá cây tươi để đắp lên vết thương với mục đích chống viêm [1,34]. Cho đến nay với những tài liệu tham khảo đã biết, chưa thấy có tài liệu nghiên cứu về thành phần hóa học của quả cây M. tanarius. Qua tra 23
  40. cứu tài liệu chúng tôi nhận thấy một số công trình đã công bố tập trung nghiên cứu về lá và vỏ cây M. tanarius. Kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học của loài này cho thấy lớp chất flavonoid là nhóm chất chính được tìm thấy. Ngoài ra sự có mặt của một số lớp chất khác cũng được ghi nhận. - Các hợp chất flavonoid: Trong một nghiên cứu của các nhà khoa học Đài loan ở Đại học quốc gia Đài loan, 2 prenylflavanone mới là tanariflavanone A (84) và tanariflavanone B (85) cùng nymphaeol C (86) được phân lập từ lá của loài cây M. tanarius. Hai hợp chất mới có khả năng ức chế sự trưởng thành của loài Lactuca sativa L (cây rau diếp) [32]. Tiếp tục quá trình nghiên cứu đó, các hợp chất flavonoid là nymphaeol A (87), nymphaeol B (88) và quercetin đã được tìm thấy [33]. Đến năm 2005, nghiên cứu của các nhà khoa học Thái lan cho thấy, dịch chiết n-hexan và chloroform của lá cây M. tanarius thể hiện hoạt tính chống oxy hóa. Từ các dịch chiết này, 2 hợp chất prenyl flavonoid mới là tanariflavanone C (89) và tanariflavanone D (90) đã được phân lập. Ngoài ra 4 hợp chất đã biết cũng đã được tìm thấy là tanariflavanone B (85) nymphaeol C (86), nymphaeol A (87), nymphaeol B (88). Các nghiên cứu cho thấy các chất này thể hiện hoạt tính ức chế enzym cyclooxygenase-2 [34]. 24
  41. Gần đây, Kawakami và các cộng sự đã phân lập được bảy hợp chất flavanone prenyl hóa mới là macaflavanone A-G (91-97). Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất này đã được các tác giả khảo sát trên hai dòng tế bào ung thư là KB và A549. Kết quả cho thấy, hợp chất 97 cho hoạt tính mạnh nhất đối với cả hai dòng tế bào ung thư trên, với các giá trị IC50 vào khoảng 12 - 13 µM [35]. 25
  42. - Các hợp chất khác: Năm 2003, một nhóm nghiên cứu khoa học của trường cao đẳng sư phạm Đài Bắc, Đài Loan, Trung Quốc đã phân lập và xác định từ lá cây M. tanarius hợp chất blumenol A (vomifoliol) (98), blumenol B (7,8 dihydro vomifoliol) (99) và roseoside II (100) [34]. Năm 2006, Matsunami và các cộng sự tại trường đại học y sinh học và trường đại học Hiroshima, Nhật Bản đã phát hiện 4 hợp chất mới megastigmane glucosides, được đặt tên macarangiosides A-D (101-104). Ngoài ra, khi nghiên cứu về vỏ cây M. tanarius, các nhà khoa học tại 26
  43. trường đại học Hong Kong đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất diterpenoid 105 và 106. Trong khi trước đó không lâu, các nhà khoa học Nhật Bản cũng đã nghiên thành phần hóa học của vỏ cây này và đã phân lập được hợp chất diterpenoid là macaragonol (107) [36]. 27
  44. CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mẫu thực vật Mẫu lá và quả loài Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) được thu hái tại huyện Quỳ Châu, tỉnh Nghệ An, vào tháng 5 năm 2003. Tên cây được Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên. Mẫu số tiêu bản VN 1086 được lưu trữ tại Phòng Tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Mẫu lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) được thu hái tại huyện Trạm Tấu, tỉnh Yên Bái ngày 06 tháng 3 năm 2001, được nhận dạng và định tên bởi Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu số tiêu bản VN 0810 được lưu trữ tại Phòng Tiêu bản của Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Quả cây Bạch đàn nam (M.tanarius) được thu hái tại Á Lưới, tỉnh Thừa Thiên Huế ngày 22 tháng 5 năm 2005 và được Thạc sỹ Nguyễn Quốc Bình (Bảo tàng thiên nhiên -Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) định tên. Tiêu bản số VN 1507 được lưu giữ tại phòng Thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu Các mẫu thực vật sau khi thu hái đều được xử lý như sau: Mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ. Bột mẫu lá Cleistanthus indochinensis được ngâm chiết với CH2Cl2 5 lần (mỗi lần 24 giờ) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ /1 lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. 28
  45. Tương tự như trên, bột mẫu quả cây Cleistanthus indochinensis được ngâm chiết với CH2Cl2 6 lần (24 giờ /1 lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ /1 lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. Đối với bột lá cây Macaranga kurzii và bột quả cây Macaranga tanarius được ngâm chiết với EtOAc 4 lần (24 giờ /1 lần) sau đó là với MeOH 3 lần (24 giờ /1 lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được các cặn chiết thô EtOAc và MeOH tương ứng. 2.3. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất từ mẫu cây Việc phân tích, phân tách các phần dịch chiết của cây cũng như các hỗn hợp sau các phản ứng tổng hợp được thực hiện bằng các phương pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC) dùng để khảo sát, sắc ký cột thương (CC) với pha tĩnh là silica gel (Merck), sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP 18 (Merck), sắc ký cột loại trừ với pha tĩnh là sephadex LH-20 (Merck) và sắc ký điều chế pha tĩnh là silica gel. Sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế đều được thực hiện trên bản mỏng đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung môi triển khai là hỗn hợp một số dung môi thông dụng như n-hexan, diclometan, etyl axetat, axeton, metanol, etanol, nước, axit focmic. Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm (230 – 400 mesh) của Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như n-hexan/diclometan, n-hexan/etylaxetat, n-hexan/axeton, diclometan/metanol Sắc ký cột loại trừ với pha tĩnh là sephadex LH-20 được rửa giải bằng hỗn hợp dung môi methanol hoặc methanol/diclometan 8: 2. 29
  46. Sắc ký cột pha đảo với pha tĩnh là RP-18, hệ dung môi rửa giải là metanol/nước. 2.4. Các phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ các mẫu cây nghiên cứu và các hợp chất thu được từ các phản ứng tổng hợp. Độ quay cực được đo trên máy Polartronic D của hãng Haensch (Viện Hóa học) và trên máy Jasco P-2000 Series của Viện Hóa Sinh biển. Điểm nóng chảy được đo trên máy Boetius B-545 của Viện Hóa học. Việc nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được và các chất bán tổng hợp được thực hiện nhờ sự phối hợp các dữ kiện thu được từ các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối va chạm electron (EI-MS) hoặc phổ khối phun bụi điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HRMS) và các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H- NMR, 13C-NMR và DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) Phổ hồng ngoại được đo trên máy FTIR-Impact-410 bằng phương pháp viên nén KBr. Phổ khối được đo trên máy MS-Engine-5989-HP theo kiểu va chạm electron ở 70 eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc được ghi trên máy HP 5989 B serie II. Phổ khối phân giải cao biến đổi Fourrier FT-ICR-MS được đo trên máy Variance 320-MS. Phổ NMR (cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều được ghi trên máy Bruker Avance 500 với TMS làm chất nội chuẩn. Các thiết bị trên thuộc Viện Hóa học –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.5. Phương pháp bán tổng hợp các chất Việc tổng hợp các chất được tiến hành theo các phương pháp tổng hợp hữu cơ thông thường: thực hiện các phản ứng hóa học trong các điều kiện và tác nhân thích hợp để thu được các sản phẩm mong muốn với hiệu suất cao. 30
  47. Việc tinh chế sản phẩm được sử dụng các phương pháp sắc ký hoặc kết tinh trong các điều kiện dung môi thích hợp. 2.6. Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào Các dịch chiết của lá và quả loài C. indochinensis, lá loài M. kurzii và quả loài M. tanarius, các phân đoạn và các chất sạch phân lập được từ 3 cây trên được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào KB tại Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên tại Gif-sur-Yvette (CNRS - Cộng hòa Pháp). Các hợp chất bán tổng hợp được thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB tại Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam. Phép thử hoạt tính gây độc tế bào của các chất phân lập và các dịch chiết của loài C. indochinensis, lá loài M. kurzii và quả loài M. tanarius được tiến hành trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB. Các tế bào KB được bảo quản trong môi trường Dullbecco’s (D-MEM: Dullbecco Medium), sau đó được thêm vào 10% huyết thanh, L-glutamine (2mM), penicilin G (100 UI/ml), steptomycin (100 µg/ml) và gentamicin (10 µg/ml). Dung dịch gốc của các chất đem thử được pha trong hỗn hợp dung môi DMSO /H2O tỉ lệ thể tích 1/9, phép thử gây độc tế bào của các chất được tiến hành trên khay 96 giếng làm ba lần với dòng tế bào ung thư biểu mô vòm họng của người KB (3A0 ~103 tế bào/mL) dùng phương pháp cải tiến so với phương pháp đã công bố [37, 38]. Sau khi nuôi cấy trong vòng 72 giờ tại nhiệt độ 370C trong môi trường hỗn hợp không khí /CO2 (95:5) có hoặc không có hợp chất cần thử, sự phát triển của các tế bào được đánh giá bằng phương pháp đo màu. Các tế bào còn sống được nhuộm màu bằng chất chỉ thị neutral red. Mật độ quang được đo tại bước sóng 540 nm trên máy đo quang Titertek Multiscan. Giá trị IC50 được xác định là nồng độ của mẫu cần thiết để ức chế 50% sự phát triển của tế bào. 31
  48. CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM 3.1. Lá cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) 3.1.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Lá cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ thành bột (0,96 kg). Bột mẫu lá được ngâm chiết với CH2Cl2 5 lần (24 giờ/ lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được 28,8 g và 80 g các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. Quá trình ngâm chiết được thể hiện trong hình 3.1. Lá cây (0,96 kg) C. indochinensis - Ngâm chiết CH2Cl2 (5 lần x 24 h) - Cất loại dung môi Cặn CH2Cl2 Bã còn lại 28,8 g - Ngâm chiết MeOH (24 h/lần) - Cất loại dung môi Cặn MeOH Bã còn lại 80 g Hình 3.1: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Cách hoa đông dương Cặn chiết CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương (28,8 g) được phân tách sơ bộ trên cột silica gel (190 g silica gel) với hệ dung môi rửa giải là n- hexan/EtOAc bắt đầu từ 5% EtOAc sau đó tăng dần đến 100 % EtOAc để thu được 80 phân đoạn nhỏ (mỗi phân đoạn từ 100-120 ml dung môi), gộp các 32
  49. phân đoạn bằng cách kiểm tra trên TLC nhận được 20 phân đoạn thô được ký hiệu từ CLF1 đến CLF 20. Phân đoạn CLF2 (11,2 g) được đưa lên cột silica gel, dung môi là n- hexan/ CH2Cl2 nhận được 4 phân đoạn nhỏ, ở phân đoạn CLF2.1 tinh chế lại một lần nữa trên cột silica gel dung môi là 100 % n-hexan thu được 27 mg một chất dầu ký hiệu là CLF2.1 (12 mg). Phân đoạn CLF 6 có khối lượng 2,36 g được hòa lại trong n-hexan, phần chất rắn không tan có khối lượng 0,4 g được phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi là n-hexan/CH2Cl2 (6: 4) thu được 6 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn nhỏ CLF 6.3 kết tinh thu được 1 chất sạch ký hiệu là CLF6.3 (16 mg) và phân đoạn CLF 6.4 được tinh chế lại bằng sắc ký bản mỏng điều chế thu được 2 mg chất rắn ký hiệu CLF6.4. Phân đoạn CLF3 (3,54 g) được đưa lên cột silica gel, dung môi rửa giải là n-hexan/CH2Cl2 bắt đầu từ (8,5:1,5) thu được 25 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn CLF3.1, CLF3.14 và phân đoạn F3.20 kết tinh lại trong hệ n-hexan/axeton và etanol thu được tương ứng hợp chất CLF3.1 (12 mg), hợp chất CLF3.14 (23 mg) và hợp chất CLF 3.20 (15 mg). Gộp phân đoạn CLF4 và CLF5 lại được 1,95 g, phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi là n-hexan/axeton, tăng dần từ 1,5% đến 20% axeton, nhận được 9 phân đoạn. Phân đoạn CLF4.6 kết tinh thu được hợp chất sạch là CLF4.6 (16 mg). Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong hình 3.2. Cặn chiết MeOH (80 g) được hòa lại trong hỗn hợp dung môi n- hexan/axeton (2,5:7,5), phần dung dịch cất loại dung môi được 20 g, ký hiệu là CLFM. Cặn này sau đó được phân tách trên 140 g silica gel, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2/MeOH (98,5:1,5 →50:50) thu được 14 phân đoạn, ký hiệu là CLFM1-CLFM14. 33
  50. Cặn CH2Cl2 lá cây C. indochinensis 28,8 g - CC, SiO2 n-hexan: EtOAc, gradient F1 F2 F3 F4-5 F6 F7-11 F12-15 F16-20 - CC, SiO CC, SiO2 2 - CC, SiO2 Hoà lại n-hexan n-hx: ax n-hexan: CH2Cl2 n-hexan: CH2Cl2 F2.1 F4.6 Kết tinh - CC, SiO2 n-hexan F3.1 F3.20 F6 tan F6 ko tan CLF2.1 Kết tinh CLF4.6 - CC, SiO2 n-hexan: CH2Cl2 27 mg Kết tinh 16 mg CLF3.1 CLF3.20 12 mg 15 mg F6.3 F6.4 TLC điều chế F3.14 Kết tinh Kết tinh CLF6.3 CLF6.4 CLF3.14 16 mg 2 mg 23 mg Hình 3.2: Sơ đồ phân lập cặn CH2Cl2 của lá cây Cách hoa đông dương Phân đoạn CLFM4-5 (1,68 g) được tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là CH2Cl2/EtOAc (8,5:1,5), sau đó tăng dần EtOAc đến 100%. Ở phân đoạn CLFM 4.1 nhận được chất bột màu vàng sậm ký hiệu là CLFM4.1 (9 mg), còn ở phân đoạn CLFM 4.5 được tinh chế lại trên cột sephadex LH 20, dung môi là MeOH nhận được chất sạch, ký hiệu là CLFM4.5.1 (9 mg). Phân đoạn CLFM 8 (400 mg) có phần không tan trong CH2Cl2, lọc và rửa lại bằng CH2Cl2, thu được một chất sạch ký hiệu là CLFM 8.1 (15 mg). Dung dịch còn lại cô khô có khối lượng 380 mg được đưa lên tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là CH2Cl2/axeton, thu được một chất sạch ký hiệu là CLFM8.1.1 (5 mg). Phân đoạn F10 (1 g) được đưa lên cột pha đảo RP-18, hệ dung môi là H2O: MeOH (30 – 100% MeOH). Phân đoạn nhỏ FM10.3 được tinh chế lại 34
  51. trên cột sephadex LH-20 dung môi là MeOH thu được chất sạch ký hiệu là CLFM10.3 (6 mg). Phân đoạn nhỏ FM10.6 có phần chất rắn không tan được rửa lại với CH2Cl2 thu được chất sạch là CLFM10.6 (7 mg). Quá trình phân lập chi tiết được trình bày trong hình 3.3. Cặn MeOH lá C. indochinensis 80 g Hoà n-hexan: axeton 2,5: 7,5 CLFM Phần 20 g không tan CC, SiO2 CH2Cl2: MeOH, grad FM1 -3 FM4-5 FM6-7 FM8 FM9 FM10 FM11-14 CC, SiO2 CC, RP-18 Hoà = CH2Cl2 CH2Cl2: EtOAc MeOH: H2O FM4.1 FM4.5 Chất rắn FM8A FM10.3 FM10.6 ko tan Sephadex Sephadex CC, SiO Rửa = CH2Cl2 MeOH 2 MeOH CH2Cl2: axeton CLFM4.1 CLFM4.5 Kết tinh CLFM10.3 CLFM10.6 9 mg 8 mg 6 mg 7 mg CLFM8.1 CLFM8.1.1 10 mg 5 mg Hình 3.3: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của lá cây Cách hoa đông dương 3.1.2. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được Squalen: CLF2.1: Chất dầu, màu vàng nhạt. 35
  52. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 1,60 (s, H-1; H-24; H-26; H-27, H-28; H-29; 18H); 1,68 (H-25; H-30, 6H); 2,05 (m, H-4; H-5; H-8; H-9; H-12; H- 13; H-16; H-17; H-20; H-21, 20H); 5,18 (m, H-3; H-7; H-11; H-14; H-18; H- 22, 6H). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 16,0 (C-26); 16,1 (C-27); 17,7 (C-25); 25,7 (C-24); 26,7 (C-3); 26,80 (C-7); 28,3 (C-11); 39,8 (C-4); 39,8 (C-8); 124,3 (C-2); 124,3 (C-10); 124,4 (C-6); 131,3 (C-1); 134,9 (C-9); 135,1 (C-5). Lupeol (CLF3.14) Tinh thể hình kim, màu trắng (n-hexan/axeton), điểm nóng chảy 213-215 oC; + -1 ESI-MS [M+H] m/z 427; IR νmax (cm ): 3411, 2937, 1639, 1456, 1379, 1041. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 0,93 (s, H-27, 3H); 0,77 (s, H-24, 3H); 1,03 (s, H-26, 3H); 0,79 (s, H-28, 3H); 1,69 (s, H-30, 3H); 0,96 (s, H-23, 3H); 0,83 (s, H-25, 3H); 2,38 (dd, J = 5,5; 11 Hz, H-19, 1H); 3,19 (dd, J = 5,0; 11,5 Hz, H-3, 1H); 4,56 (d, J= 2 Hz, H-29, 1H); 4,68 (d, J = 2 Hz, H-29, 1H). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 14,6 (C-27); 15,4 (C-24); 16,0 (C-26); 16,1 (C-25); 18,0 (C-28); 18,3 (C-6); 19,3 (C-30); 20,9 (C-11); 25,2 (C-12); 27,4 (C-2); 27,5 (C-15); 28,0 (C-23); 29,9 (C-21); 34,3 (C-7); 35,6 (C-16); 37,2 (C-10); 38,1 (C-13); 38,7 (C-1); 38,9 (C-4); 40,0 (C-22); 40,9 (C-8); 42,9 (C-14); 43,0 (C-17); 48,0 (C-19); 48,3 (C-18); 50,5 (C- 9); 55,3 (C-5); 79,0 (C-3); 109,3 (C-29); 151,0 (C-20). Epifridelanol (CLF3.1) 36
  53. Tinh thể hình kim, màu trắng (n-hexan/axeton); điểm nóng chảy 304-305 0C. + -1 Phổ EI-MS [M] m/z 428. IR νmax (cm ): 3482, 2937, 1596, 1448, 1385. 1 H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 0,86 (s, H-25, 3H); 0,93 (d, J= 7 Hz, H-23, 3H); 0,94 (s, H-24, 3H); 0,97 (s, H-29, 3H); 0,99 (s, H-28, 3H); 0,99 (s, H-27, 3H); 1,01 (s, H-26, 3H); 1,12 (s, H-30, 3H), 0,94 (m, 1H, H-22); 1,20 (m, 1H, H-19); 1,28 (m, 1H, H-6); 1,28 (m, 1H, H-21); 1,30(m, 1H, H-11); 1,33 (m, 1H, H-15); 1,33 (m, 1H, H-7); 1,34 (m, 1H, H-12); 1,36 (m, 1H, H- 19); 1,37 (m, 1H, H-8); 1,37 (m, 1H, H-16); 1,40 (m, 1H, H-12); 1,45 (m, 1H, H-11); 1,47 (m, 1H, H-7); 1,47 (m, 1H, H-21); 1,48 (m, 1H, H-15); 1,53 (m, 1H, H-22); 1,54 (m, 1H, H-10); 1,54 (m, 1H, H-19); 1,55 (m, 1H, H-16); 1,75 (dt, 1H, H-6); 1,90 (dt, 1H, H-2); 3,73 (br.s, 1H, H-3). Cis-p-cumaroyl epifriedelanol (CLF4.6) o 30 Chất bột màu trằng, điểm nóng chảy 273-274 C; Độ quay cực [α] D 0 (c, + 0,5; CHCl3); Phổ HRESI-MS [M+Na] ở m/z: 597,4430 tương ứng với CTPT + là C39H58O3Na (theo tính toán lý thuyết [MNa] có m/z =597,4386); IR νmax (cm-1): 3427, 2925, 1712, 1605, 1450, 1385, 1168, 996. Dữ liệu phổ NMR xem trang 90 chương 4. 37
  54. Trans-p-cumaroyl β-sitosterol (CLF6.3) o 30 Tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 202-203 C; Độ quay cực [α] D +52 (c, - 0,5; CHCl3). Phổ HRESI-MS [M-H] ở m/z: 559,3666 tương ứng với CTPT là - -1 C38H56O3 (theo tính toán lý thuyết [M-H] có m/z = 559,3651); IR νmax (cm ): 3397, 2937, 1680, 1601, 1515, 1444, 1172, 1297. Dữ liệu phổ NMR xem trang 93 chương 4. Trans-p-cumaroyl epifriedelanol (CLF6.4) o 30 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy là 273-275 C; độ quay cực [α] D +13 (c, - -1 0,5; CHCl3); Phổ ESI-MS: m/z 559 ([M-H] ); IR νmax (cm ): 3421, 2928, 1701, 1682, 1608, 1442, 1383, 1264, 1166, 1050. Dữ liệu phổ NMR xem trang 91 chương 4. Cleistanone (CLF3.20) o 30 Tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng chảy 332-333 C; độ quay cực [α] D -32,0 (c, 0,5; CHCl3). 38
  55. Phổ EI-MS: m/z [M]+ 440. Phổ HRESI-MS: m/z 463,3556 [M+Na]+ tương + ứng với CTPT là C30H48O2Na (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z -1 =463,3552); IR νmax (cm ): 3514, 2950, 1694, 1459, 1383. Dữ liệu phổ NMR xem trang 86 chương 4. Sequoiaflavon (CLFM4.5.1) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 341-342 oC; Phổ ESI-MS: m/z 553 + -1 [M+H] ; IR νmax (cm ): 3426, 1655, 1600, 1497, 1435, 1335, 1164. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)  (ppm): 3,82 (s, 7-OCH3 ,3H); 6,32 (s, H-6”, 1H); 6,34 (d, J = 2,5 Hz, H-6, 1H); 6,68(d, J = 8,5 Hz, H-3”’, H-5’”, 2H); 6,72 (d, J = 2,5 Hz, H-8, 1H); 6,77 (s, H-3”, 1H); 6,89 (s, H-3, 1H); 7,09 (d, J = 8,5 Hz, H-5’, 1H); 7,58 (d, J = 8,5 Hz, H-2”’, H-6”’, 2H); 8,01 (dd, J = 8,5 và 2,5 Hz, H-6’, 1H); 8,06 (d, J = 2,5 Hz, H-2’, 1H); 10,20 (s, OH); 12,98 (s, OH); 13,11 (s, OH). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)  (ppm) : 55,9 (7-OCH3); 92,6 (C-8); 98,0 (C-6); 99,2 (C-6”); 102,5 (C-3”); 102,8 (C-3); 103,2 (C-8”); 104,6 (C-10; C- 10”); 115,6 (C-3”’; C-5”’); 116,8 (C-5’); 120,1 (C-3’); 121,4 (C-1’; C-1”’); 39
  56. 127,6 (C-6’); 128,1 (C-2”’; C-6’”) 131,4 (C-2’); 154,5 (C-9”); 157,3 (C-9); 160,5 (C-4’; C-4”’); 160,9 (C-5”); 161,1 (C-5; C-7”); 163,4 (C-2”); 164,2 (C- 2); 165,0 (C-7); 181,8 (C-4”); 181,9 (C-4). Amentoflavon (CLF8.1.1) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 229-231 oC; Phổ khối ESI-MS: m/z 539 ([M+H]+). 1H-NMR (500 MHz, MeOD)  (ppm): 6,21 (d, J = 2,0 Hz, H-6, 1H); 6,41 (s, H-6”, 1H); 6,44 (d, J = 2,0 Hz, H-8, 1H); 6,63 (s, H-3”, 1H); 6,65 (s, H-3, 1H); 6,75 (d, J = 8,5 Hz, H-5”; H-3’”, 2H); 7,16 (d, J = 9,0 Hz, H-5’, 1H); 7,55 (d, J = 9,0 Hz, H-2”’; H-6’”, 2H); 7,94 (m, H-2’; H-6’, 2H). Axit galic (CLFM8.1) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 169-170 oC. 1H-NMR (500 MHz, MeOD)  (ppm): 7,02 (s, H-2; H-6, 2H). 13C-NMR (125 MHz, MeOD)  (ppm): 110,3 (C-2; C-6); 121,9 (C-1); 139,5 (C-4); 146,3 (C-3; C-5); 170,4 (C-7). Axit 4-hydroxycinnamic (CLFM4.1) Chất bột màu nâu nhạt, điểm nóng chảy 213-214 oC. 40
  57. 1H-NMR (500 MHz, MeOD)  (ppm): 6,28 (d, J = 16,0 Hz, H-8, 1H); 6,83 (d, J = 8,5 Hz, H-3; H-5, 2H); 7,02 (d, J = 16,0 Hz, H-7, 1H); 7,45 (d, J = 8,5 Hz, H-2; H-6, 2H). 13C-NMR (125 MHz, MeOD)  (ppm): 115,6 (C-8); 116,8 (C-3; C-5); 127,2 (C-1); 131,1 (C-2; C-6); 146,7 (C-7); 161,1 (C-4); 171,0 (C-9). Axit ellagic (CLFM10.6) Chất bột màu trắng có điểm nóng chảy là 300-301 oC; Phổ ESI-MS m/z: 303 + -1 [M+H] ; IR νmax (cm ): 3064, 1713, 1618, 1581, 1441, 1333, 1184, 1104. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)  (ppm): 7,45 (s, H-5; H-5’, 2H). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)  (ppm) : 107,6 (C-1; C-1’); 110,2 (C-5; C- 5’); 112,4 (C-6; C-6’); 136,4 (C-3; C-3’); 139,7 (C-2; C-2’); 148,1 (C-4; C- 4’); 159,2 (C-7; C-7’). 3-O-metyl ellagic-4’-α- rhamnopyranoside (CLFM10.3) + -1 Chất bột màu trắng; Phổ ESI-MS: m/z 463 ([M+H] ); IR νmax (cm ): 3450, 2922, 1738, 1614, 1570, 1494, 1352. 41
  58. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d6)  (ppm): 1,13 (d, J = 6,0 Hz, H-6”, 3H); 3,54 (dd, J = 9,0 và 9,0 Hz, H-4’’, 1H); 3,74 (dd, J = 4,0 và 9,0 Hz, H-5”, 1H); 4,21 (s, 4-OCH3, 3H); 4,02 (dd, J = 4,0 và 9,0 Hz, H-2’’, 1H); 4,22 (dd, J = 2,0 và 4,0 Hz, H-2”, 1H); 5,53 (d, J = 2,0 Hz, H-1”, 1H); 7,61 (s, H-5, 1H); 7,88 (s, H-5’, 1H). 13 C-NMR (125 MHz, DMSO-d6)  (ppm) : 17,8 (C-6”); 60,9 (C- O-3); 69,8 (C-5”); 69,9 (C-2”); 70,1 (C-3”); 71,8 (C-4”); 100,1 (C-1”); 111,3 (C-5); 111,4 (C-5’); 111,6 ( C-1’); 112,9 (C-6; C-6’); 114,3 (C-1); 136,2 (C-2’); 140,1 (C-3; C-3’); 141,8 (C-2); 146,8 (C-4’); 152,6 (C-4); 158,6 (C-7); 158,7 (C-7’). Kết luận Như vậy, từ lá cây Cách hoa đông dương (C.indochinensis) 13 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc là: squalen (CLF2.1), epifriedelanol (CLF3.1), lupeol (CLF3.14), cleistanone (CLF3.20), cis-p-cumaroyl epifriedelanol (CLF4.6), trans-p-cumaroyl-β-sitosterol (CLF6.3), trans-p- cumaroyl epifriedelanol (CLF6.4), axit 4-hydroxy cinamic (CLFM4.1), sequoiaflavon (CLFM4.5.1), axit galic (CLFM8.1), amentoflavon (CLFM8.1.1), 3-O-metylellagic-4’-α-rhamnopyranoside (CLFM10.3) và axit ellagic (CLFM10.6). Trong đó có 4 hợp chất mới là cleistanone (CLF3.20), cis-p-cumaroyl friedelanol (CLF4.6), trans-p-cumaroyl-β-sitosterol (CLF6.3), trans-p-cumaroyl friedelanol (CLF6.4). Các kết quả trên cho thấy các hợp chất tritecpen mà có khung friedelin và các hợp chất như lupeol, axit ellagic là thành phần chính của lá loài Cách hoa đông dương, điều này cũng phù hợp với các kết quả nghiên cứu trước đây về các loài Cleistanthus. Các hợp chất này cũng đã được tìm thấy từ loài C. gracilis được thu hái ở Thái lan. 3.2. Quả cây Cách hoa đông dương (Cleistanthus indochinensis) 42
  59. 3.2.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Quả cây Cách hoa đông dương (C. indochinensis) sau khi thu hái được phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ thành bột (100 g). Bột mẫu quả được ngâm chiết với CH2Cl2 5 lần (24 giờ/lần) sau đó là với MeOH 4 lần (24 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được 4,0 g và 5,5 g các cặn chiết thô CH2Cl2 và MeOH tương ứng. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Cách hoa đông dương được trình bày trong hình 3.4. Quả cây (100 g) C.indochinensis - Ngâm chiết CH2Cl2 (24h/lần) - Cất loại dung môi Cặn CH2Cl2 Bã còn lại 4,0 g - Ngâm chiết MeOH (24h/lần) - Cất loại dung môi Cặn MeOH Bã còn lại 5,5 g Hình 3.4: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Cách hoa đông dương Cặn CH2Cl2 (4 g) được phân tách trên cột silica gel, dung môi là n-hexan: aceton thu được 17 phân đoạn ký hiệu từ F1-F17. Phân đoạn F11 (150 mg) được kết tinh trong hỗn hợp n-hexan: CH2Cl2 thu được chất CLQF11 (95 mg). Phân đoạn F12 (335 mg) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi là CH2Cl2:MeOH (0 – 98% MeOH). Phân đoạn nhỏ F12.3 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 (MeOH:CH2Cl2, 8: 2), sau đó tinh chế lại một lần nữa trên cột pha đảo RP-18, dung môi là MeOH: H2O (2:8 - 10:0), thu được CLQF12.3 (10 mg). 43
  60. Phân đoạn F14 và F15 được gộp lại (115 mg) và tinh chế trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (98:2) thu được 8 phân đoạn thứ cấp F15.1 đến F15.8. Phân đoạn F15.3 sau khi tinh chế trên cột sephadex LH 20 CH2Cl2: MeOH, (1,5:8,5) thu được hợp chất CLQF15.3 (5 mg). Tương tự, phân đoạn F17 (400 mg) được phân tách trên cột silica gel, với hệ dung môi CH2Cl2: MeOH (95: 5) nhận được 5 phân đoạn nhỏ F17.1 đến F17.5. Phân đoạn F17.1 được tinh chế lại trên cột sephadex (MeOH) thu được chất CLQF17.1 (18 mg). Phân đoạn F17.2 được rửa với MeOH, thu được CLQF17.2 (10 mg). Cặn CH2Cl2 4,0 g F1 F8 F9-10 F11 F12 F13 F14-15 F16 F17 Kết tinh - CC, SiO2 - CC, SiO2 n-hx: CH2Cl2 CH2Cl2: MeOH CH2Cl2: MeOH CLQF11 F12.3 F15.3 95 mg - Sephadex, Chất rắn F16A - Sephadex, MeOH MeOH: CH Cl - CC, RP-18 2 2 MeOH: H2O - CC, SiO2 - CC, SiO2 MeOH: H2 O CLQF15.3 CH2Cl2: MeOH CH2Cl2: MeOH CLQF12.3 5 mg 10 mg F16.2 β-sitosterol Rửa = ete glucosid CLQF16 7 mg F17.1 F17.2 - Sephadex, Rửa = MeOH MeOH MeOH:CLQF17.1 H2O CLQF17.2 18 mg 10 mg Hình 3.5: Sơ đồ phân tách cặn CH2Cl2 của quả cây Cách hoa đông dương 44
  61. Phân đoạn F16 được rửa bằng CH2Cl2. Chất rắn không tan được xác định là β-sitosterol glucosid bằng cách đo điểm chảy và so sánh bằng TLC với chất β-sitosterol glucosid chuẩn có trong phòng thí nghiệm. Phần nước rửa được cất loại dung môi (40 mg) và được phân tách trên cột silica gel (CH2Cl2:MeOH, 97:3) thu được 3 phân đoạn nhỏ F16.1 đến F16.3. Phân đoạn F16.2 được rửa lại với ete thu được CLQF16 (7 mg). Quá trình phân tách cặn chiết CH2Cl2 được tóm tắt trong hình 3.5. Cặn chiết MeOH (5,5 g) của quả cây Cách hoa đông dương được phân tách trên cột pha đảo RP-18 với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O (5–100% MeOH trong H2O), thu được 10 phân đoạn ký hiệu là FM1-FM10. Phân đoạn FM2 (95 mg) được phân tách trên cột silica gel CH2Cl2:MeOH:HCOOH (91:7:2) thu được chất CLQFM2 (8 mg). Cặn MeOH 5,5g - CC, RP-18 H2O: MeOH, grad FM1 FM2 FM3 FM4 FM5-6 FM7 FM8-11 - CC, SiO - CC, SiO2 Hoà tan MeOH 2 CH Cl : MeOH CH2Cl2: MeOH: HCOOH 2 2 FM7.2 CLQFM2 - CC, SiO2 CH2Cl2: MeOH 8 mg - Sephadex Chất rắn MeOH CLQFM7 5 mg FM4.1 FM4.2 FM4.3 FM4.4 CLQFM4.5 Rửa = MeOH - Sephadex 5 mg MeOH - Rửa = axeton CLQF17.1 CLQF17.2 CLQFM4.3 CLQFM4.4 6 mg 10 mg Hình 3.6: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của quả cây Cách hoa đông dương 45
  62. Phân đoạn FM4 có phần chất rắn không tan trong MeOH, lọc phần không tan, rửa lại với MeOH nhận được CLQFM4.5 (5 mg). Phần dung dịch MeOH được cô lại và được phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH (95:5) thu được 5 phân đoạn nhỏ FM4.1 đến F4.5. Phân đoạn FM4.3 được rửa bằng MeOH thu được CLQFM4.3 (6 mg). Phân đoạn FM4.4 được tinh chế lại trên cột sephadex (MeOH) nhận được CLQFM4.4 (10 mg). Phân đoạn FM7 (55 mg) được tinh chế trên cột silica gel (CH2Cl2:MeOH, 97:3). Phân đoạn nhỏ FM7.2 được tinh chế tiếp trên cột sephadex LH 20 (MeOH) thu được CLQFM7 (5 mg) dưới dạng chất bột màu vàng. Quá trình phân tách cặn MeOH của quả cây Cách hoa đông dương được trình bày trong hình 3.6. 3.2.2. Dữ liệu phổ của các chất phân lập được Cleistantoxin (CLQF11) O O 2' 1' O 7' O 9' O O 1 6 7 9 OMe OH o 32 Chất bột màu vàng nhạt, điểm nóng chảy 195-196 C; Độ quay cực [α]D -148 + (c, 0,5; CHCl3); Phổ khối lượng ESI-MS có m/z ở [M+Na] 421, phổ khối + phân giải cao HRESI-MS: m/z 381,0929 [M-H2O+H] tương ứng với CTPT là + C21H18O8 (theo tính toán lý thuyết [M-H2O+H] có m/z =381,0974); Phổ IR -1 νmax (cm ): 3565, 3466, 2931, 1773, 1617, 1483, 1297, 1230, 1142, 1047; UV (CHCl3) λ max nm (log ε): 207,3 (3,39); 240,0 (4,18); 286,7 (3,83). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 100 chương 4. 46
  63. Demethoxycleistantoxin: CLQF12.3 o 32 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 259-260 C; Độ quay cực [α]D +14,0 (c, + 0,5; CHCl3). Phổ khối lượng ESI-MS: m/z ở [M+Na] 391, phổ khối phân giải + cao HRESI-MS: m/z 391,0793 [M+Na] tương ứng với CTPT là C20H16O7 + -1 (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z =391,0794); Phổ IR νmax (cm ): 3494, 3444, 1750, 1624, 1479, 1444, 1253, 1179, 1036; Phổ UV (CHCl3) λ max nm (log ε): 215,4 (3,38); 240,4 (4,11); 290,5 (4,05). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 103 chương 4. Podocleistantoxin: CLQF15.3 o 30 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 225-226 C; Độ quay cực [α]D -44,4 (c, + 0,225; CHCl3); Phổ khối lượng ESI-MS: m/z [M+Na] 421; phổ khối phân giải + cao HRESI-MS: m/z 399,1052 [M+H] tương ứng với CTPT là C21H18O8 (theo + -1 tính toán lý thuyết [M+H] có m/z =399,1080); Phổ IR νmax (cm ): 3447, 2923, 1753, 1621, 1483, 1377, 1242, 1084, 1040; Phổ UV (CHCl3) λmax nm (log ε): 212,3 (3,40); 240,0 (4,23); 286,7 (3,82). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 105 chương 4. 47
  64. Cleindoside A: CLQF17.1 o 30 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 261-262 C; Độ quay cực [α]D - 188 (c, 0,5; MeOH); Phổ khối lượng ESI-MS: m/z 583 [M+Na]+; phổ khối phân giải cao HRESI-MS (negative): m/z 559,1416 [M-H]- tương ứng với CTPT là - C27H28O13 (theo tính toán lý thuyết [M-H] có m/z =559,1452); Phổ IR νmax (cm-1): 3419, 2932, 1772, 1619, 1475, 1235, 1073, 1035; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 222,7 (4,37); 286,7 (3,82). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 107 chương 4. Cleindoside B: CLQF16 0 30 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 265-266 C; Độ quay cực [α]D -196 (c, 0,5; MeOH); Phổ khối lượng ESI-MS: m/z 625 [M+Na]+; Phổ khối phân giải + cao HRESI-MS: m/z 625,15337 [M+Na] tương ứng với CTPT là C29H30O14 + -1 (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z =625,1533); Phổ IR νmax (cm ): 3427, 2925, 1775, 1740, 1615, 1479, 1373, 1236, 1077, 1035; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 212,2 (3,59); 239,8 (4,19); 287,5 (3,82). 48
  65. Dữ liệu phổ NMR, xem trang 109 chương 4. Cleindoside C: CLQF17.2 o 30 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 261-262 C; Độ quay cực [α]D -50 (c, 0,3; MeOH); Phổ khối lượng ESI-MS: m/z 553 [M+Na]+; Phổ HRESI-MS: m/z + 553,1323 [M+Na] tương ứng với CTPT là C26H26O12 (theo tính toán lý thuyết + -1 [M+Na] có m/z =553,1322); Phổ IR νmax (cm ): 3444, 2910, 1773, 1626, 1491, 1244, 1382, 1080, 1034; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 215,4 (4,32); 287,5 (3,98). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 111 chương 4. Cleindoside F: CLQFM4.3 o 30 Chất bột màu trắng, điểm nóng chảy 261-262 C; Độ quay cực [α]D -50 (c, 0,3; MeOH); Phổ HRESI-MS: m/z 523,1251 [M+Na]+ tương ứng với CTPT là + C25H24O11 (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z =523,1216); Phổ IR νmax (cm -1): 3463, 2899, 1725, 1636, 1598, 1508, 1359, 1207, 1074, 1036. Dữ liệu phổ NMR, xem trang 116 chương 4. 49
  66. Cleisindoside D: CLQFM4.4 o 30 Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 248-249 C; Độ quay cực [α]D -52 (c, 1,0; MeOH); Phổ khối lượng ESI-MS: m/z 685 [M+Na]+; Phổ HRESI-MS: m/z + 685,1745 [M+Na] tương ứng với CTPT là C31H34O16 (theo tính toán lý thuyết + -1 [M+Na] có m/z =685,1745); Phổ IR νmax (cm ): 3421, 2929, 1764, 1624, 1490, 1244, 1039; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 215,0 (4,36); 238,0 (3,96); 288,8 (3,96). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 113 chương 4. Cleisindoside E: CLQFM4.5 Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 278-279 oC; Phổ khối lượng ESI-MS: m/z 685 [M+Na]+; Phổ HRESI-MS: m/z 685,1744 [M+Na]+ tương ứng với CTPT + là C31H34O16 (theo tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z =685,1745); Phổ IR νmax (cm-1): 3418, 2916, 1752, 1624, 1487, 1234, 1036. Dữ liệu phổ NMR, xem trang 114 chương 4. Kết luận 50
  67. Từ quả loài Cách hoa đông dương (C. indochinensis), 11 hợp chất đã phân lập và xác định cấu trúc, trong đó có 9 hợp chất mới, là các hợp chất cleistantoxin (CLQF11), demethoxycleistantoxin (CLQF12.3), podocleistantoxin (CLQF15.3), cleindoside A (CLQF17.1), cleindoside B (CLQF16), cleindoside C (CLQF17.2), cleindoside D (CLQFM4.4), cleindoside E (CLQFM4.5), cleindoside F (CLQFM4.3), và hai hợp chất đã biết là axit gallic (CLQFM2) và amentoflavon (CLQFM7). Các hợp chất mới là thành phần chính của quả, đều có khung cơ sở là aryl tetralin lignan và các dẫn xuất glycoside của chúng. Điều này hoàn toàn trùng khớp với các nghiên cứu trước đây về các loài Cleistanthus, vì thành phần hóa học chính của các loài Cleistanthus là các hợp chất aryl tetralin lignan. 3.3. Lá cây Săng bù (Macaranga kurzii) 3.3.1 Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Lá cây Săng bù (M. kurzii) sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ thành bột (1,8 kg). Bột mẫu lá được ngâm chiết với EtOAc 4 lần (24 giờ/lần) sau đó là với MeOH 3 lần (24 giờ/lần). Dịch chiết sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất thấp để nhận được 100,8 g và 60 g các cặn chiết thô EtOAc và MeOH tương ứng. Quá trình ngâm chiết lá cây Săng bù được thể hiện trên hình 3.7. Lá cây M. kurzii (1,8 kg) - Ngâm chiết EtOAc (4 lần, 24 giờ/lần); Cất loại dung môi Cặn EtOAc (100,8 g) Bã còn lại - Ngâm chiết MeOH (3 lần 24 giờ/lần); Cất loại dung môi Cặn MeOH (60 g) Bã còn lại Hình 3.7: Sơ đồ ngâm chiết lá cây Săng bù 51
  68. Cặn chiết etyl axetat (100,8 g) của lá cây M. kurzii được phân tách trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi n-hexan/EtOAc (0 – 100% EtOAc trong n-hexan), sau đó với hỗn hợp EtOAc:MeOH (95:5) thu được 15 phân đoạn F1-F15. Phân đoạn F2 và F3 được gộp lại (9,8 g) được đưa lên cột silica gel (0 – 98% acetone trong n-hexan) thu 5 phân đoạn nhỏ F2.1 - F2.5. Phân đoạn thứ cấp F2.2 được tinh chế lại trên cột silica gel (n-hexan) nhận được MKF2.2 (8 mg). Phân đoạn F6, F7 và F8 được gộp lại (5,4 g) được phân tách trên cột silica gel, dung môi rửa giải là n-hexan:axeton (97:3) thu được 10 phân đoạn nhỏ F8.1 – F8.10. Phân đoạn F8.1 được tinh chế lại trên cột silica gel, (n- hexan:axeton, 98:2) thu được MKF 8.1 (8 mg). Phân đoạn F8.3 được kết tinh lại trong hỗn hợp (n-hexan: axeton) thu được MKF8.3 (6 mg). Phân đoạn F8.4 được tinh chế lại trên cột sephadex LH-20 (MeOH:CH2Cl2, (8:2) nhận được MKF8.4 (9 mg). Phân đoạn F9 được kết tinh lại trong axeton thu được MKF9 (15 mg). Phần dung dịch sau khi được cô khô (5,8 g) được tinh chế trên cột silica gel, sử dụng hệ dung môi n-hexan:axeton (95:5) thu được 8 phân đoạn thứ cấp F9.1 – F9.8. Phân đoạn F9.4 được tinh chế lại trên cột sephadex LH-20 (MeOH:CH2Cl2, 8:2), thu được MKF9.4 (7 mg). Tương tự, phân đoạn F9.7 được tinh chế lại trên cột sephadex LH-20 (MeOH:CH2Cl2, 8:2), nhận được hợp chất MKF9.7 (5 mg). Phân đoạn F9.5 được tinh chế trên cột silica gel, dung môi rửa giải là n-hexan:CH2Cl2 (7:3), sau đó kết tinh lại trong hệ n- hexan:CH2Cl2 nhận được MKF9.5 (9 mg). Phân đoạn F9 và F10 được gộp lại và kết tinh trong hỗn hợp n-hexan: EtOAc thu được MKF10 (20 mg). Phần dung dịch cô loại dung môi và được gộp với phân đoạn F11 (20,03 g) được phân tách trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi ban đầu là n-hexan:CH2Cl2 (60 – 100% CH2Cl2 trong n- hexan) và cuối cùng là hỗn hợp CH2Cl2:MeOH (95: 5) thu được 6 phân đoạn 52
  69. thứ cấp F11.1 – F11.6. Phân đoạn nhỏ là F11.4 được tinh chế trên cột silica gel, hệ dung môi là n-hexan:CH2Cl2 (1:9) nhận được MKF11.4 (7 mg) và MKF11.4.1 (5 mg). Tương tự, phân đoạn F11.4 được phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi là n-hexan:CH2Cl2 (1:9) thu được MKF11.5.1 (6 mg), MKF11.5.2 (10 mg) và MKF11.5.3 (5 mg). Quá trình phân tách cặn etyl axetat của lá cây Săng bù được trình bày chi tiết trong hình 3.8. . Cặn EtOAc lá cây M.kurzii 100,8 g - CC, SiO2 n-hexan/EtOAc, gradient F1 F2 -3 F4-5 F6-8 F9 F10 F11 F12-15 - CC, SiO - CC, SiO2 2 n-hx: axeton n-hx:axeton gradient F2.2 Chất rắn F9A - CC, SiO2 n-hx Kết tinh lại MKF2.2 MKF9 Chất rắn F11A 8 mg 15 mg Kết tinh - CC, SiO2 n-hx:CH2Cl2 MeOH: MKF10H2O F8.1 F8.3 F8.4 20 mg F11.4 F11.5 - Sephadex, - CC, SiO2 n-hx:axeton MeOH: CH2Cl2 - Sephadex - CC, SiO2 n-hx:CH Cl - Sephadex MKF8.1 MeOH: H2O 2 2 Kết tinh MKF8.4 - CC, SiO2 - CC, SiO2 8 mg 9 mg n-hx:axeton n-hx:CH2Cl2 MKF8.3 MKF11.4 MKF11.4.1 6 mg 7 mg 5 mg F9.4 F9.7 F9.5 - Sephadex, - CC, SiO2 MeOH n-hx:CH2Cl2 MKF11.5.1 MKF11.5.2 MKF11.5.3 Kết tinh 6 mg 10 mg 5 mg MeOH: H2O MKF9.4 MKF9.7 MKF9.5 7 mg 5 mg 9 mg Hình 3.8: Sơ đồ phân tách cặn EtOAc của lá cây Săng bù 53
  70. Phần cặn MeOH (80 g) của lá cây M.kurzii được hoà lại với MeOH, loại phần không tan trong MeOH, dung dịch MeOH cô lại được (45 g). Cặn MeOH này được phân tách trên cột pha đảo RP-18, hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O (0 – 100% MeOH trong H2O) thu được 4 phân đoạn thứ cấp FM1- FM4. Phân đoạn FM1 (3 g) được phân tách trên cột silica gel, sử dụng hệ dung môi gradient CH2Cl2:MeOH vói sự có mặt của 2% HCOOH thu 2 phân đoạn FM1.1 – FM1.2. Hai phân đoạn nhỏ FM1.1 và FM1.2 được tinh chế lại trên cột sephadex LH-20 dung môi là MeOH thu được hai hợp chất tương ứng MKFM1.1 (4 mg) và MKFM1.2 (4 mg). Phân đoạn FM2 được rửa lại bằng MeOH nhận được MKFM2 (4 mg). Sơ đồ phân tách được thể hiện trên hình 3.9. Cặn MeOH lá cây M.kurzii 80 g Hoà tan MeOH Cất loại MeOH MKFM Không tan 45 g trong MeOH CC, RP-18 MeOH: H2O, grad FM1 FM2 FM3 FM4 CC, SiO , grad 2 Rửa = MeOH CH2Cl2:MeOH:HCOOH MKFM2 4,0 mg FM1.1 FM1.2 Sephadex Sephadex MeOH MeOH MKFM1.1 MKFM1.2 4,0 mg 4,0 mg Hình 3.9: Sơ đồ phân tách cặn MeOH của lá cây Săng bù 54
  71. 3.3.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được Macakurzin A (MKF9.5) Tinh thể hình kim màu trắng, điểm nóng chảy 157-158 oC; Phổ khối ESI-MS: m/z - -1 335 ([M-H] ); Phổ IR νmax (cm ): 3312, 3029, 1610, 1499, 1424, 1387, 1278, 1147; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 218,1 (372); 250,7 (3,62); 310,4 (3,82). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 118 chương 4. Macakurzin B (MKF8.3) Tinh thể hình kim màu vàng, điểm nóng chảy 168-170 oC; Phổ khối phân giải + cao HRESI-MS: 337,1172 [M+H] tương ứng với CTPT là C20H16O5 (theo + -1 tính toán lý thuyết [M+H] có m/z =337,1176); Phổ IR νmax (cm ): 3305, 2926, 1651, 1592, 1551, 1484, 1310, 1163, 1037; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 205,3 (3,65); 227,7 (3,70); 346,7 (3,57). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 120 chương 4. Macakurzin C (MKF11.5.3) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 198-199 oC; Phổ khối phân giải cao + HRESI-MS: m/z 355,12270 [M+H] tương ứng với CTPT là C20H18O6 (theo tính toán lý thuyết [M+H]+ có m/z =355,1182). 55
  72. -1 Phổ IR νmax (cm ): 3401, 2981, 1657, 1600, 1551, 1485, 1327, 1138, 1054; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 208,0 (3,46); 269,3 (3,37); 320,5 (3,15); 365,9 (3,16). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 123 chương 4. Macakurzin D (MKF11.4.1) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 209-210 oC; Phổ khối phân giải cao + HRESI-MS: m/z 377,11144 [M+Na] tương ứng với CTPT là C20H18O6 (theo + -1 tính toán lý thuyết [M+Na] có m/z =377,1101); Phổ IR νmax (cm ): 3293, 2918, 1641, 1599, 1481, 1311, 1167, 1056; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 214,9 (2,60); 270,4 (3,51); 323,2 (3,31); 361,6 (3,26). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 122 chương 4. Glepidotin A (MKF10) Tinh thể hình kim, màu vàng (n-hexan/etyl axetat), điểm nóng chảy 198-199 oC; EI - MS (70 eV) m/z (%): 338 [M]+, 295, 283, 105, 77. 56
  73. 1 H-NMR (DMSO–d6, 500 MHz)  (ppm): 1,63 (s, 3H, H-11’), 1,73 (s, 3H, H- 10’), 3,24 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H-7’), 5,19 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-8’), 6,52 (s, 1H, H-8), 7,48 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-4’), 7,54 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H-3’; H5’), 8,14 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-2’; H-6’), 9,58 (s, 1H, OH), 10,88 (s, 1H, OH), 12,61 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (DMSO–d6, 125 MHz)  (ppm): 17,6 (C-10’); 20,97 (C-7’), 25,4 (C- 11’), 92,8 (C-8), 103,0 (C-6), 110,4 (C-10), 122,2 (C-8’), 127,5 (C-2’; C-6’), 128,5 (C-3’; C-5’), 129,8 (C-4’), 130,6 (C-1’), 131,0 (C-9’), 137,0 (C-3), 145,4 (C- 2), 154,2 (C-9), 157,5 (C-5), 162,1 (C-7), 176,2 (C-4). 8-prenyl galangin (MKF11.4) Tinh thể hình kim, màu vàng (n-hexan/axeton), điểm nóng chảy 222-223 oC; EI-MS (70 eV) m/z (%): 338 [M]+, 323, 283, 270, 165, 105, 77. 1 H-NMR (DMSO–d6, 500 MHz)  (ppm): 1,63 (s, 3H, H-11’), 1,74 (s, 3H, H- 10’), 3,43 (d, J = 6,5 Hz, 2H, H-7’), 5,18 (t, J = 6,5 Hz, 1H, H-8’), 6,32 (s, 1H, H-6), 7,50 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-4’), 7,57 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H-3’; H5’), 8,15 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-2’; H-6’), 9,58 (s, 1H, OH), 10,74 (s, 1H, OH), 12,23 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (DMSO–d6, 125 MHz)  (ppm): 17,7 (C-10’), 20,1 (C-7’), 25,3 (C- 11’), 97,8 (C-6), 103,1 (C-8), 105,6 (C-10), 122,4 (C-8’), 127,3 (C-2’; C-6’), 128,4 (C-3’; C-5’), 129,8 (C-4’), 130,8 (C-1’), 131,2 (C-9’), 136,8 (C-3), 145,6 (C- 2), 153,6 (C-9), 158,3 (C-5), 161,4 (C-7), 176,4 (C-4). Izalpinin (MKF9) 57
  74. Tinh thể hình kim, màu vàng (axeton), điểm nóng chảy 196-197 oC; EI-MS (70 eV) m/z (%): 284 [M]+, 105, 77. 1 H-NMR (DMSO–d6, 500 MHz)  (ppm): 3,84 (s, 3H, H-7’); 6,30 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8), 6,71 (d, J = 2,0 Hz, H-6), 7,49 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-4’), 7,54 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H-3’; H5’), 8,17 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-2’; H-6’), 9,76 (s, 1H, OH-3), 12,61 (s, 1H, OH-5). Flavastin B: MKF11.5.1 Chất bột vàng, điểm nóng chảy 176-177 oC; Phổ khối phân giải cao HRESI-MS: + m/z 281,1603 [M+H] tương ứng với CTPT là C19H20O2 (theo tính toán lý thuyết + -1 [M+H] có m/z =281,1562); Phổ IR νmax (cm ): 3418, 2924, 1593, 1443, 1315, 1135; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 211,7 (3,62); 301,9 (3,47). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 124 chương 4. 3,5-dimethoxy-trans-stilben (MKF8.1) Chất dầu màu trắng trong, EI - MS (70 eV) m/z (%): 240 [M]+, 209, 165, 152. 58
  75. 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 3,86 (s, 6H, OCH3-7’; OCH3-8’), 6,45 (t, J = 2,0 Hz, 1H, H-4), 6,72 (d, J = 2,0 Hz, 2H, H-2; H-6), 7,12 (d, J = 16,5 Hz, 1H, H-α), 7,07 (d, J = 16,5 Hz, 1H, H-β), 7,30 (t, J = 7,5 Hz, H-4’), 7,40 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H-3’; H-5’), 7,54 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-2’; H-6’). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 55,3 (C-7’; C-6’), 100,1 (C-4), 104,7 (C-2; C-6), 126,6 (C-2’; C-6’), 127,7 (C-α), 128,6 (C-3’; C-5’), 128,7 (C-β), 129,2 (C-4’); 137,2 (C-1’), 139,4 (C-1), 161,1 (C-3; C-5). 3, 5-dimetoxy-cis-stilben (MKF2.2) Chất dầu vàng nhạt; ESI-MS: m/z 239 [M-H]-. 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 3,63 (s, 3H, OCH3-7’), 3,64 (s, 3H, OCH3-8’), 6,32 (t, J = 2,0 Hz, 1H, H-4), 6,40 (d, J = 2,0 Hz, 2H, H-2+6), 6,53 (d, J = 12,0 Hz, 1H, H-β), 6,62 (d, J = 12,0 Hz, 1H, H-α), 6,26 (m, 5H, H-2’→ H-6’). β-amyrin (MKF8.4) o + Chất bột trắng, điểm nóng chảy 197-198 C; ESI-MS: [M-H2O+H] : 409. 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 0,85 (s, 3H, H-24), 0,94 (s, 3H, H-28), 0,99 (s, 3H, H-29), 1,01 (s, 3H, H-30), 1,10 (s, 3H, H-25), 1,11 (s, 3H, H-23), 59
  76. 1,14 (s, 3H, H-26), 1,17 (s, 3H, H-27), 3,46 (t, J=3,0 Hz, 1H, H-3), 5,63 (d, J = 6,0 Hz, 1H, H-12). 5,7-dihydroxy-6-prenyl flavanon (MKF9.4) Tinh thể hình kim, màu trắng, điểm nóng chảy 211,5-212,5 oC; ESI-MS (negative): m/z 323 [M-H]-. 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 1,76 (s, 3H, H-11’), 1,76 (s, 3H, H-10’), 2,83 (dd, J = 3,0; 17,5 Hz; 1H, H-3), 3,07 (dd, J = 13,0; 17,5 Hz; 1H, H-3), 3,36 (d, J = 17,5 Hz; 2H, H-7’), 5,26 (m, 1H, H-8’), 5,41 (dd, J = 3,0; 13 Hz; 1H, H-2), 6,02 (s, 1H, H-8), 7,41 (m, 5H, H-2’→ H-6’), 6,12 (s, 1H, OH-7), 12,38 (s, 1H, OH-5); 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 17, 9(C-10’), 21,2 (C-7’), 25,8 (C-11’), 43,5 (C-3), 79,1 (C-2), 95,6 (C-8), 103,1 (C-10), 107,5 (C-6), 121,5 (C-8’), 126,1 (C-2’+6’), 128,8 (C-4’), 128,9 (C-3’+5’), 135,6 (C-9’), 138,6 (C-1’), 161,1 (C-9), 161,4 (C-5), 163,8 (C-7), 195,8 (C-4). Glabranin (MKF9.7) Tinh thể hình kim, màu trắng, điểm nóng chảy 169-170 oC; ESI-MS: m/z 325 [M+H]+. 60
  77. 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm): 1,73 (s, 6H, H-10’+11’), 2,84 (dd, J = 3,0; 17,5 Hz, 1H, H-3), 3,05 (dd, J = 12,0; 17,5 Hz; 1H, H-3), 3,33 (d, J = 7,5 Hz, 2H, H-7’), 5,23 (m, 1H, H-8’), 5,43 (dd, J = 3,0; 12,0 Hz; 1H, H-2), 6,03 (s, 1H, H-6), 7,42 (m, 5H, H-2’→ H-6’), 6,10 (s, 1H, OH-7), 11,97 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 17,8 (C-10’), 21,8 (C-7’), 25,8 (C-11’), 43,3 (C-3), 79,0 (C-2), 97,0 (C-6), 103,3 (C-10), 106,2 (C-8), 121,7 (C-8’), 126,00 (C-2’; C-6’), 128,7 (C-4’), 128,8 (C-3’; C-5’), 135,00 (C-9’), 138,8 (C- 1’), 159,7 (C-9), 162,4 (C-5), 163,7 (C-7), 196,2 (C-4). Galangin (MKF11.5.2) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 215-216 oC; ESI-MS: m/z 271 [M+H]+. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)  (ppm): 6,12 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-6), 6,47 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8), 7,51 (t, J = 7,5 Hz, 1H, H-4’), 7,55 (t, J = 7,5 Hz, 2H, H-3’; H-5’), 8,15 (d, J=7,5 Hz, 2H, H-2’; H-6’), 9,62 (s, 1H, OH), 10,83 (s, 1H, OH), 12,35 (s, 1H, OH-5). Luteolin-7-O-glucopyranoside (MKFM2) Chất bột màu vàng, điểm nóng chảy 257-258 oC; ESI-MS (negative): m/z 447 [M-H]-. 61
  78. 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz)  (ppm): 3,24 (m, 2H), 3,46 (m, 2H), 3,71 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 5,07 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 6,44 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8), 6,74 (s, 1H, H-3), 6,78 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-6), 6,91 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5’), 7,41 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-2’), 7,45 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz, 1H, H-6’), 4,60 (s, 1H, OH), 5,05 (s, 1H, OH), 5,10 (s, 1H, OH), 5,38 (s, 1H, OH), 9,38 (s, 1H, OH), 9,98 (s, 1H, OH), 12,98 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz)  (ppm): 60,6 (C-6”), 69,5 (C-4”), 73,1 (C- 2”), 76,4 (C-3”), 77,1 (C-5”), 94,7 (C-8), 99,5 (C-6), 99,9 (C-1”), 103,1 (C-3), 105,3 (C-10), 113,5 (C-2’), 115,9 (C-5’), 119,1 (C-6’), 121,4 (C-1’), 145,7 (C- 3’), 149,9 (C-4’), 156,9 (C-9), 161,1 (C-5), 162,9 (C-7), 164,4 (C-2), 181,8 (C-4). Axit 3,4-dihydroxy benzoic (MKFM1.1) Chất bột màu nâu nhạt, điểm nóng chảy 195-196 oC; ESI-MS: m/z 153 [M-H]-. 1H-NMR (MeOD, 500 MHz)  (ppm): 6,83 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H-5), 7,44 (dd, J = 2,0; 8,0 Hz, 1H, H-6), 7,47 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-2). Axit galic (MKFM1.2) Đã phân lập được từ bộ phận lá và quả loài Cách hoa đông dương. Kết luận Từ lá loài Săng bù (M. kurzii) 17 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Trong đó 4 hợp chất có cấu trúc mới là macakurzin A (MKF9.5), macakurzin B (MKF8.3), macakurzin C (MKF11.5.3), macakurzin D (MKF11.4.1) và 13 hợp chất đã biết là 3,5-dimetoxy-cis-stilben (MKF2.1), 3,5-dimetoxy-trans-stilben (MKF8.1), β-amyrin (MKF8.4), 5,7- dihydroxy-6-prenyl-flavanone (MKF9.4), glabranin (MKF9.7), izalpinin 62
  79. (MKF9), glepidotin A (MKF10), 8-prenyl-galangin (MKF11.4), flavastin B (MKF11.5.1), galangin (MKF11.5.2), axit 3,4-dihydroxy benzoic (MKFM1.1), axit gallic (MKFM 1.2) và luteolin-7-O-glucopyranoside (MKFM2). Từ kết quả trên cho thấy các hợp chất khung stilben và các hợp chất flavonoid mà ở đây là các prenyl flavonoid là thành phần chính của lá cây Săng bù, kết quả này cũng trùng hợp với các tài liệu đã được công bố về thành phần hóa học của các loài Macaranga. 3.4. Quả cây Bạch đàn nam (Macaranga tanarius) 3.4.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách Quả cây Bạch đàn nam (M. tanarius) sau khi thu hái được phơi trong bóng mát, sấy khô ở nhiệt độ 40-45 oC, sau đó được nghiền nhỏ thành bột (250 g). Bột mẫu quả, được chiết với EtOAc 4 lần, sau đó là MeOH 4 lần, dịch chiết được cô dưới áp suất giảm nhận được 32,4 g cặn chiết EtOAc và 5,4 g cặn chiết MeOH. Sơ đồ ngâm chiết quả cây Bạch đàn nam được trình bày trong hình 3.10. Quả cây (250 g) M. tanarius - Ngâm chiết EtOAc (4 lần x 24 h) - Cất loại dung môi Cặn EtOAc Bã còn lại 32,4 g - Ngâm chiết MeOH (4 lần x 24 h) - Cất loại dung môi Cặn MeOH Bã còn lại 5,4 g Hình 3.10: Sơ đồ ngâm chiết quả cây Bạch đàn nam 63
  80. Cặn chiết EtOAc (32,4 g) được phân tách trên cột silica gel, dung môi rửa giải là hệ n-hexan:EtOAc (0 – 100% EtOAc trong n-hexan) thu được 20 phân đoạn F1-F20. Phân đoạn F7 và F8 được gộp lại (340 mg) và được phân tách tiếp trên cột silica gel, nhận được 7 phân đoạn nhỏ. Phân đoạn nhỏ F8.6 được tinh bằng bản mỏng điều chế thu được MTF8 (8 mg). Phân đoạn F10 (1,03 g) được tinh chế trên cột silica gel, rửa giải với hệ dung môi gradient n-hexan:axeton nhận được 9 phân đoạn thứ cấp F10.1 - F10.9. Phân đoạn F10.5 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 (MeOH), sau đó lại tiếp tục tinh chế tiếp trên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:axeton (0 – 20% axton trong CH2Cl2) thu được MTF10 (11 mg), MTF10B (12 mg) và MTF10C (4 mg). Cặn EtOAc quả cây M.tanarius 32,4 g CC, SiO2 n-hx: EtOAc, gradient F1 F7 F8 F9 F10 F11 F12-13 F14-15 F16 F17-18 - CC, SiO CC, SiO2 CC, SiO2 CC, SiO2 2 MeOH: CH Cl MeOH: n-hx: CH2Cl2 n-hx: axeton 2 2 CH2Cl2 F8.6 F10.5 F16.2 TLC điều chê - Sephadex MeOH Sephadex MeOH - CC, SiO2 MTF8 CH2Cl2: axeton MTF16A 8 mg F12.5 F12.6 6 mg MTF10 MTF10B MTF10C 11 mg 12 mg 4,0 mg MTF12.6B 12 mg MTF12.5A MTF12.5B 3 mg 3 mg Hình 3.11: Sơ đồ phân tách cặn EtOAc từ quả cây Bạch đàn nam 64
  81. Phân đoạn F12 và F13 được gộp lại (1,46 g) và được phân tách trên cột silica gel, với hệ dung môi gradient CH2Cl2:MeOH thu được 10 phân đoạn nhỏ F12.1 – F12.10. Phân đoạn F12.5 được phân tách lại trên cột silica gel, với hệ dung môi rửa giải gradient CH2Cl2:MeOH thu được MTF12.5A (3 mg) và MTF12.5B (3 mg). Phân đoạn F12.6 được tinh chế trên cột sephadex LH 20 (MeOH) nhận được MTF12.6A (12 mg). Phân đoạn F16 (2,7 g) được phân tách trên cột silica gel (hệ dung môi gradient CH2Cl2:MeOH, sau đó được tinh chế lại trên cột sephadex LH 20 (MeOH) thu được MTF16A (6 mg). Sơ đồ phân tách cặn etyl axetat từ quả cây Bạch đàn nam được trình bày trong hình 3.11. 3.4.2. Hằng số vật lý và dữ liệu phổ của các chất phân lập được Macatanarin A (MTF10C) Chất bột màu nhạt (n-hexan/axeton), điểm nóng chảy 197-198 oC; Độ quay 25 cực [α]D -1,48 (c, 1,15; MeOH); Phổ khối phân giải cao HRESI-MS - (negative): m/z 475,1214 [M-H] tương ứng với CTPT là C30H36O5 (theo tính - -1 toán lý thuyết [M-H] có m/z =475,1245); Phổ IR νmax (cm ): 3430, 2924, 1744, 1631, 1590, 1455, 1118, 1059; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 223,5 (4,37); 293,9 (4,18). Dữ liệu phổ NMR, xem trang134 chương 4. Macatanarin B (MTF8) 65
  82. Chất bột màu vàng (n-hexan/axeton), điểm nóng chảy 181-182 oC. Phổ khối phân giải cao HRESI-MS: m/z 421,1805 [M+H]+ tương ứng với + CTPT là C25H24O6 (theo tính toán lý thuyết [M+H] có m/z =421,1751); Phổ -1 IR νmax (cm ): 3309, 2924, 1638, 1598, 1562, 1481, 1372, 1280, 1196; Phổ UV (CHCl3) λmax nm (log ε): 251,0 (4,27); 266,8 (4,23); 379,0 (4,25). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 136 chương 4. Macatanarin C (MTF16A) Chất bột màu vàng tươi (n-hexan/axeton), điểm nóng chảy 185-186 0C; Phổ khối phân giải cao HRESI-MS: m/z 439,1790 [M+H]+ tương ứng với CTPT là + C25H26O7 (theo tính toán lý thuyết [M+H] có m/z =439,1757); Phổ IR νmax (cm-1): 3395, 2931, 1731, 1643, 1613, 1481, 1371, 1154, 1039; Phổ UV (MeOH) λmax nm (log ε): 209,9 (3,29); 270,9 (2,98); 337,4 (2,94); 366,5 (2,96). Dữ liệu phổ NMR, xem trang 138 chương 4. Broussoflavonol F (MTF10) 66
  83. o -1 Tinh thể màu vàng, điểm nóng chảy 155-157 C; IR νmax (cm ): 3377, 1653; ESI-MS: m/z 445 [M+Na]+. 1 H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ (ppm): 1,70 (s, 3H, H-14); 1,76 (s, 3H, H-11’); 1,80 (s, 3H, H-10’); 1,85 (s, 3H, H-13); 3,44 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H-7’); 3,59 (d; J = 7,0 Hz, 2H, H-11); 5,32 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-12); 5,37 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-8’); 5,64 (br.s, 1H, OH-4’); 6,26 (br.s, 1H, OH-7); 6,31 (s, 1H, H-6); 6,61 (br.s, 1H, OH-3); 6,92 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5’); 7,98 (m, 2H, H-2’ + H- 6’); 11,77 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (CDCl3, 125MHz) δ (ppm): 17,9 (CH3-10’); 18,0 (CH3-14); 21,9 (C-11); 25,7 (CH3-11’); 25,8 (CH3-15); 29,7 (C-7’); 99,1 (C-6); 103,9(C-10); 105,2 (C-8); 116,0 (C-5’); 121,1 (C-8'); 121,2 (C-12); 123,6 (C-1’); 127,2 (C- 3’); 127,6 (C-6’); 129,5 (C-2’); 135,4 (C-13); 135,4 (C-3); 135,6 (C-9'); 145,7 (C-2); 153,9 (C-9); 156,2 (C-4’); 159,0 (C-5); 160,8 (C-7); 175,5 (C-4). Glyasperin A (MTF10B) o -1 Tinh thể màu vàng đậm, điểm nóng chảy 154,5- 156 C; IR νmax (cm ): 3379, 1637; ESI-MS: m/z 424 [M+H]+. 67
  84. 1 H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ (ppm) : 1,78 (s, 3H, H-15); 1,80 (s, 3H, CH3- 10'); 1,82 (s, 3H, CH3-14); 1,85 (s, 3H, CH3-11’); 3,48 (m, 4H, CH2-7’; CH2- 11); 5,29 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-12); 5,36 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-8’); 5,61 (br.s, 1H, OH); 6,26 (br.s, 1H, OH); 6,47 (s, 1H, H-8); 6,57 (br.s, 1H, OH); 6,92 (d, J = 9,0 Hz, 1H, H-5'); 7,98 (m, 2H, H-6'; H-2'); 12,11 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (CDCl3, 125MHz) δ (ppm) : 17,9 (C-11’); 18,0 (C-14); 21,5 (C-11); 25,8 (C-10’); 25,8 (C-15); 30,0 (C-7’); 94,2 (C-8); 103,6 (C-10); 109,3 (C-6); 116,0 (C-5’); 121,1 (C-8’); 121,3 (C-12); 123,4 (C-1’); 127,1 (C-6’); 127,6 (C-3'); 129,7 (C-2’); 135,5 (C-9'); 135,6 (C-13); 136,2 (C-2); 145,7 (C-9); 155,0 (C-4’); 156,3 (C-5); 157,7 (C-3); 161,5 (C-7); 175,2 (C-4). Broussonol E (MTF12.5B) Dạng bột, màu vàng, điểm nóng chảy 194-195 oC; ESI-MS: m/z 461 [M+Na]+. 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) δ (ppm): 1,78 (s, 3H, H-14); 1,81 (s, 3H, H-10’); 1,83 (s, 3H, H-15); 1,85 (s, 3H, H-11’); 3,45 (d, J = 8,0 Hz, 2H, H-7'); 3,49 (d, J = 6,5 Hz, 2H, H-11); 5,29 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-12); 5,37 (t, J = 7,0 Hz, 1H, H-8'); 6,46 (s, 1H, H-8); 7,60 (br.s, 1H, H-2’); 7,66 (br.s, 1H, H-6’); 12,1 (s, 1H, OH-5). Isolicoflavonol (MTF12.5A) 68
  85. Chất bột, màu vàng, điểm nóng chảy 118-119 oC; ESI-MS: m/z 377 [M+Na]+. 1 H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ (ppm): 1,81 (s, 3H, CH3-10’); 1,82 (s, 3H, CH3-11’); 3,45 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H-7’); 5,37 (d, J = 7,0 Hz, 1H, H-8’); 6,29 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-6); 6,45 (d, J = 2,0 Hz, 1H, H-8); 6,55 (brs, 1H, OH); 6,93 (d, J = 9,5 Hz, 1H, H-5’); 7,97 (m, 2H, H-2’; H-6’); 11,83 (s, 1H, OH-5). 6-farnesyl-3',4',5,7-tetrahydroxyflavanon (MTF12.6A) Chất rắn, màu vàng nhạt. 1 H-NMR (CDCl3, 500MHz) δ (ppm): 1,59 (s, 6H, CH3-19, CH3-25); 1,67 (s, 3H, CH3-14); 1,81 (s, 3H, CH3-24); 1,95-2,17 (m, 8H, CH2-15, CH2-16, CH2-20, CH2-21); 2,77 (dd, J = 3,0; 17,0 Hz, 1H, Hax-3); 3,02 (dd, J = 13,0; 17,0 Hz, 1H, Heq-3); 3,36 (d, J = 7,0 Hz, 2H, H-11); 5,09 (m, 2H, H- 17 + H-22); 5,26 (m, 1H, H-12); 5,27 (dd, J = 3,0; 13,0 Hz, 1H, H-2); 5,98 (s, 1H, H-8); 6,86 (brd, J = 8,0 Hz, 1H, H-2’); 6,87 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H- 3’); 6,97(br.s, 1H, H-6’); 12,32 (s, 1H, OH-5). 13 C-NMR (CDCl3, 125MHz) δ (ppm): 15,9 (C-19); 16,0 (C-14); 17,5 (C-25); 20,9 (C-11); 25,5 (C-24); 26,5 (C-16); 26,6 (C-21); 39,4 (C-20) 39,7 (C-15); 43,1 (C-3); 78,8 (C-2); 95,0 (C-8); 102,3 (C-10); 108,3 (C-6); 113,5 (C-6’); 69
  86. 115,2 (C-3’); 118,2 (C-2’); 122,2 (C-12); 124,1 (C-17); 124,3 (C-22); 130,5 (C-1’); 131,0 (C-23); 134,7 (C-18); 135,3 (C-13); 144,6 (C-5’); 145,0 (C-4’); 160,7 (C-9); 161,3 (C, C-5); 164,4 (C-7); 195,8 (C-4). Kết luận Nghiên cứu về thành phần hóa học quả cây Bạch đàn nam (M. tanarius) nhận được các kết quả là 8 hợp chất đã được phân lập và xác định cấu trúc hóa học. Trong số các hợp chất này, 3 hợp chất mới là macatanarin A (MTF10C), macatanarin B (MTF8), macatanarin C (MTF16A) và 5 hợp chất đã biết là broussoflavonol F (MTF10), glyasperin (MTF10B), isolicoflavonon (MTF12.5A), broussonol E (MTF12.5B), 6-farnesyl-3',4',5,7-tetrahydroxy flavanone (MTF12.6A). Các hợp chất này đều là các prenylat flavonol và prenylat flavanon và phù hợp với các nghiên cứu trước về loài M. tanarius của Thái lan cũng như các loài Macaranga trên thế giới. 3.5. Bán tổng hợp các dẫn xuất amide từ hợp chất Cleistantoxin (CLQF11) Quá trình bán tổng hợp các dẫn xuất từ hợp chất CLQF11 được trình bày chi tiết ở chương 4. Cấu trúc của các hợp chất thu được sau mỗi phản ứng được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ như: phổ IR, MS, NMR 1 chiều và 2 chiều. 3.5.1. Hợp chất 1 70