Công nghệ thực phẩm - Một số kỹ thuật kiểm tra hiên đại

Nội dung text: Công nghệ thực phẩm - Một số kỹ thuật kiểm tra hiên đại

1. MỘT SỐ KỸ THUẬT KiỂM TRA HIÊN ĐẠI
2. ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
3. Kỹ thuật ELISA? Là kỹ thuật dùng để phát hiện các phân tử đặc trưng trong mẫu (e.g. proteins & carbohydrates, vi khuẩn, virus, độc tố ) Là cơng nghệ của lĩnh vực miễn dịch: sử dụng kháng thể (antibodies). Dùng để định tính và định lượng mẫu. Rất nhạy. Được ứng dụng nhiều trong y học và thực phẩm
4. Antibodies  Là những Proteins được tiết ra bởi tế bào B- lymphocytes (bạch cầu) ở động vật cĩ Fab xương sống. fragments  Cĩ khả năng phát hiện và liên kết với kháng Fc fragments nguyên (antigens) IgG molecule
5. Các bước cơ bản của phương pháp ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay 1. Antigen được hấp thu trên bề mặt plastic (‘sorbent’). 2. Antigen được nhận biết bởi các antibody đặc trưng (‘immuno’). 3. Antibody được nhận diện bởi antibody (‘immuno’) thứ 2 cĩ gắn với enzyme (‘enzyme-linked’). 4. Phản ứng cơ chất với enzym được thực hiện (thường tạo hợp chất màu) Màu của sản phẩm= đo được sự hiện diện của antigen
6. Secondary Substrate antibody Coloured product Primary antibody Different antigens in sample
7. Botrytis cinerea conidiophore
8. Chuẩn bị mẫu Place half a Filter into Add 2ml Break up raspberry in PBS new tube tube tissue with using glass rod muslin
9. Coating the wells  Nhỏ 1 giọt mẫu vào giếng (well)  Giữ yên trong khoảng 10 phút để mẫu hấp thu vào bề mặt plastic.
10. Thêm kháng thể (primary antibody)  Thêm vào khoảng 4 giọt primary antibody (mouse monoclonal) vào mỗi giếng
11. Sản xuất kháng thể đơn dịng (Monoclonal antibody) Inject mouse with antigen Obtain Grow mouse Mouse spleen myeloma (tumour) B-lymphocytes cells in culture Fuse B-lymphocytes with myeloma cells Antibody-producing hybridoma cells
12. B-lymphocyte and Unlimited supply myeloma mixture of antibody specific for single epitope Keep clone Select fused producing antibody and reproducing which best detects hybridoma cells antigen via growth medium Make Screen clones from hybridomas individual for antibody antibody- production producing cells
13. Sản xuât kháng thể thứ hai (Secondary antibody) Mouse serum Polyclonal injected into a antibodies which different species, can recognise any e.g. rabbit, goat. mouse antibody Animal makes various antibodies against the Select anti-mouse different antigens antibodies from in serum plasma Take blood from animal
14. Thêm vào kháng thể thứ 2 secondary antibody  Được liên kết với enzyme horseradish peroxidase.  Thêm vào 4 giọt secondary antibody (anti- mouse polyclonal) vào mỗi giếng  Để yên trong khoảng 20 phút.
15. 8. Observe colour development 7. Add substrate 1. Add antigen for enzyme 2. Wash with 6. Wash with PBST PBST 4. Wash with PBST 3. Add primary 5. Add secondary antibody antibody
16. Ứng dụng ELISA Phát hiện bệnh ở người, động vật và thực vật. Phát hiện các tác nhân gây dị ứng trong thực phẩm. Phát hiện các hormones, kháng sinh trong thực phẩm. Phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm
17. PCR PCR và real-time PCR là một kỹ thuật hồn tồn mở do vậy chúng ta cĩ khả năng khơng phải bị lệ thuộc vào các hãng sản xuất kit ở nước ngồi, nhờ vậy giá thành sẽ rẽ
18. KHÁI NIỆM • PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction • PCR là Phản ứng chuỗi trùng hợp hay gọi là "phản ứng khuếch đại gen". • PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà khơng cần sử dụng các sinh vật sống như E. coli hay nấm men. • PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đốn những bệnh nhiễm trùng, tách dịng gene, và xác định huyết thống
19. LỊCH SỬ Phương pháp căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh, ơng đã đoạt giải Nobel về Hĩa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ơng đưa ra ý tưởng. Ý kiến của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA cĩ thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase
20. THỰC NGHIỆM PCR • PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đĩ cĩ thể là một gen đơn, hay một phần của gen. • PCR cần rất nhiều thành phần. - DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại - Cặp mồi (primer), - DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA. - Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới. - Dung dịch đệm, cung cấp mơi trường hĩa học cho DNA- polymerase
21. THỰC NGHIỆM PCR Chu kỳ nhiệt: Đây là máy đun nĩng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng. Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCR cũng được đun nĩng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta cho một lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản PCR machine ứng.
22. Nguyên tắc PCR DNA đích 4 1 Biến tính (94oC 1 ) 2 2 Bắt cặp (55-65o C) 3 5’ 3’ 3’ 5’ 3 Kéo dài (72o C) n 2n
23. 1. Đoạn mồi Mồi là những đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – khơng quá 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường là sợi đơi, chiều dài của nĩ được xác định bằng số lượng cặp base (bp); chiều dài của sợi đơn DNA được đo bằng base hay nucleotides)
24. Mồi Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 DNA đích (Template) PCR MIX
25. 2. Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 45 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước: - Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến tính, nĩ phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. - Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi cĩ thể gắn vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. - Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nĩ bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài
26. 30X-40X 94oC/15s-1min 55-65oC/15s-1min 72oC/30s-3min Phát hiện  qua kích thước (điện di)  hay qua trình tự (lai)
27. Real-time PCR chạy PCR và đồng thời phát hiện sản phẩm khuếch đại Ct curve Standard curve Melt curve
28. Camera Laser or UV Thiết bị Real-time PCR
29. Primers Taq polymerase dNTP PCR buffer + MgCl2 Chất phát huỳnh quang Target DNA (Template) Real-time PCR MIX Real-time PCR mix
30. PCR cĩ đặc hiệu khơng? Nuôi cấy PCR PCR đặc hiệu tương đương nuơi cấy Định danh dựa vào kiểu hình sinh vật hóa Xác định dựa vào kích thước đoạn học biểu hiện từ các kiểu gen gen hay một trình tự đặc hiệu của đoạn gen
31. Các bước trong xét nghiệm PCR phát hiện tác nhân vi sinh vật Mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử Tách chiết nucleic acid Chạy PCR Phát hiện sản phẩm PCR và phân tích kết quả
32. Một xét nghiệm PCR định tính chuẩn mực
33. Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực
34. Một xét nghiệm qPCR định lượng chuẩn mực
35. Những ứng dụng của PCR • Vân tay di truyền • Kiểm tra huyết thống • Chuẩn đốn bệnh di truyền • Tách dịng gen • Gây đột biến điểm • Phân tích mẫu DNA cổ • Xác định gen của các đột biến • So sánh mức độ biểu hiện của gen