Tài liệu Cnshtp_chuong3_2_ungdungvsvtrongcntp2_5543_379717_20180607_031009

Nội dung text: Tài liệu Cnshtp_chuong3_2_ungdungvsvtrongcntp2_5543_379717_20180607_031009

1. Chương 3: Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP 3.3. Tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật 3.3.1. Bản chất của quá trình 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh
2. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Acid amin ▫ Axit amin là những hợp chất hữu cơ mạch thẳng hoặc mạch vòng trong phân tử có chứa ít nhất một nhóm amin(-NH2) và một nhóm cacboxyl (-COOH) ▫ Tính chất của từng amino axit phụ thuộc vào cấu tạo, kích thước và diện tích của(-R) ▫ amino axit mang cả tính bazơ lẫn tính axit (lưỡng tính) ▫ Amino axit ở trạng thái tinh thể rắn, không màu hầu hết hòa tan dễ trong nước
3. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin ▫ Phương pháp thủy phân ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học ▫ Phương pháp kết hợp ▫ Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi sinh vật
4. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin ▫ Phương pháp thủy phân:  Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein  Phương pháp này có nhược điểm là cần thiết bị chịu acid hoặc chịu kiềm  Trong trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D  Trong trường hợp sử sụng acid để thủy phân sẽ tạo ra ô nhiễm môi trường không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân  Giá thành thường cao
5. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học:  Đây cũng là phương pháp được áp dụng nhiều trong thực tế. Tuy nhiên, phương pháp này cũng lại cho ra những acid amin raxemic ( hỗn hợp acid amin dạng D và dạng L )  Việc tách 2 loại acid amin này ra rất tốn kém
6. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin ▫ Phương pháp kết hợp:  Người ta kết hợp phương pháp hóa học và phương pháp sinh học  Bằng con đường hóa học, người ta thu nhận hợp chất dạng L – Keto và các tiền chất của acid amin  Sau đó người ta sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành acid amin
7. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Các phương pháp sản xuất acid amin ▫ Phương pháp tổng hợp acid amin bằng công nghệ vi sinh vật :  Phương pháp này lợi dụng khả năng sinh tổng hợp thừa một số loại acid amin của một số vi sinh vật, người ta nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin.  Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L  Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm  Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao  Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ những phương pháp khác
8. 3.3.1. Bản chất của quá trình tổng hợp acid amin bằng phương pháp vi sinh vật • Cơ chất cho pp vi sinh vật: ▫ Nguồn Cacbon: hydrohydrate (glucose , fructose, sucrose, maltose, lactose, dịch thủy phân tinh bột , cellulose, mật rỉ ), các acid hữu cơ, rượu ▫ Nguồn nitơ:  N vô cơ: anoniac lỏng hay khí, amoni sulfate, amoni nitrate, amoni phosphate, amoni clorua, amoni carbonate  N hữu cơ: amoni acetate, nước chiết nấm men, nước chiết thịt , nước chiết malt,ure, peptone và các amino acid ▫ Nguồn khoáng và các nguyên tố vết: KH2PO4 ▫ Nguồn Vitamin: vitamin H và vitamin B1
9. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Axit glutamic: C5H9NO4 ▫ Axit glutamic (Glu) là một loại axit amin có trong protein thiên nhiên, thường thấy trong cơ thể động vật và thực vật dưới nhiều dạng khác nhau ▫ Glutamine(Gln) là một axit amin rất quan trọng trong cơ thể người • Bột ngọt: C5H8NO4Na ▫ Bột ngọt (hay mì chính) là tên thường gọi của Monosodium Glutamate (viết tắt là MSG), ▫ Là muối của axit glutamic, một trong hơn 20 loại axit amin để kiến tạo nên protein cơ thể ▫ Tên thường gọi: Natri glutamat ▫ Mã quốc tế và cộng đồng châu Âu: INS 621, EEC 621
10. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Vai trò axit glutamic và bột ngọt ▫ Axit glutamic  Trao đổi chất của người và động vật  Xây dựng protit, cấu tử tế bào, tổng hợp các aa khác  Tham gia vào phản ứng chuyển amin, giúp cho cơ thể chuyển hóa nhóm amin và tách NH3 ra khỏi cơ thể  Tổng hợp chất hoạt động bề mặt N-acetylglutamat  Acetylglutamat dùng trong xử lý ô nhiễm nước biển do dầu hỏa và dầu thực vật  Làm thuốc chữa bệnh thần kinh và tâm thần, hôn mê gan, bại liệt ▫ Bột ngọt  Chất điều vị: giống với vị của thịt  Chuyển hóa chất bổ dưỡng trong cơ thể con người
11. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các phương pháp sản xuất axit glutamic ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học ▫ Phương pháp thủy phân protit ▫ Phương pháp lên men ▫ Phương pháp kết hợp
12. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các phương pháp sản xuất axit glutamic ▫ Phương pháp tổng hợp hóa học  Ứng dụng các phản ứng tổng hợp hóa học để tổng hợp nên các axit glutamic và các aminoaxit khác từ các khí thải của công nghiệp dầu hỏa và các ngành công nghiệp khác  Ưu điểm: có thể sử dụng các nguồn nguyên liệu không phải là thực phẩm, tận dụng được phế liệu CN dầu hỏa  Nhược điểm: thực hiện ở các nước có CN dầu hỏa phát triển và yêu cầu kỹ thuật cao. Tạo ra hỗn hợp không quay cực D, L – axit glutamic, việc tách L- axit glutamic ra lại khó khăn làm tăng giá thành sản phẩm
13. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các phương pháp sản xuất axit glutamic ▫ Phương pháp thủy phân protit  Sử dụng các tác nhân xúc tác là các hóa chất hoặc fecmen để thủy phân protit thành hỗn hợp amino axit, từ đó tách các axit glutamic ra và sản xuất bột ngọt  Ưu điểm: dễ khống chế quy trình sản xuất và được ứng dụng vào các cơ sở sản xuất thủ công, bán cơ giới và cơ giới dễ dàng  Nhược điểm: cần sử dụng nguyên liệu giàu protit hiếm và đắt, cần nhiều hóa chất và các thiết bị chống ăn mòn, hiệu suất thấp nên giá thành cao
14. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các phương pháp sản xuất axit glutamic ▫ Phương pháp lên men  Lợi dụng một số VSV (Micrococcus glutamicus, Brevi bacterium) có khả năng tổng hợp ra các axit amin từ các nguồn gluxit và đạm vô cơ  Ưu điểm : không sử dụng nguyên liệu protit, không cần dùng nhiều hóa chất và các thiết bị chống ăn mòn , hiệu suất cao, hạ giá thành, tạo ra L- axit glutamic có hoạt tính sinh học cao
15. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các phương pháp sản xuất axit glutamic ▫ Phương pháp kết hợp  Là phương pháp tổng hợp hóa học và vi sinh vật học  Phương pháp vi sinh vật học tổng hợp nên các axit amin từ các nguồn đạm vô cơ và gluxit mất nhiều thời gian, do đó người ta lợi dụng các phản ứng tổng hợp tạo nên những chất có cấu tạo gần giống axit amin ,từ đó lợi dụng vi sinh vật tạo ra axit amin.  Phương pháp này tuy nhanh nhưng yêu cầu kỹ thuật cao, chỉ áp dụng vào nghiên cứu, ít áp dụng vào công nghiệp sản xuất
16. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các chủng vi sinh tham gia vào quá trình tổng hợp axit glutamic ▫ VSV thường sử dụng: Corynebacterium Glutanicum, Brevibacterium Lactofermentus, Micrococus Glutamicus; chủ yếu là Corynebacterium Glutamicum (do Kinosita phát hiện từ 1956) ▫ Giống vi khuẩn thuần khiết này được lấy từ ống thạch nghiêng tại các cơ sở giữ giống, sau đó được cấy truyền, nhân sinh khối trong môi trường lỏng, nhân lên đến yêu cầu sản xuất đại trà ▫ Chủng vi khuẩn giống phải có khả năng tạo ra nhiều axit glutamic, tốc độ sinh trưởng phát triển nhanh, có tính ổn định cao trong thời gian dài, chịu được nồng độ axit cao, môi trường nuôi cấy đơn giản, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất
17. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • QTCN theo pp lên men Tinh bột Rỉ đường Thủy phân Xử lí Trung hòa Lọc dịch xử lí Ống gốc Lọc Pha loãng Pha chế dịch lên men Nhân giống cấp I Thanh trùng Nhân giống cấp II Làm nguội Lên men Nhân giống cấp
18. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • QTCN theo pp lên men Pha loãng Trao đổi ion Sấy Kết tinh Tinh thể Nước Ly tâm Bao gói cái Axit glutamic Bảo quản ẩm Sản phẩm
19. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Các sản phẩm của quá trình lên men ▫ Sản phẩm chính: L-Glu và CO2 (hiệu suất lý thuyết: 81,66% , thực tế SX: 45 - 50%) Glucoza + NH3 + 1,5 O2 L-Glu + CO2 + 3 H2 3 axetat + NH3 + 1,5 O2 L-Glu + CO2 + 3 H2 ▫ Sản phẩm phụ:  Acid lactic: chiếm tỉ lệ nhỏ, do quá dư thừa biotin hay thiếu hụt O2  Acid Succinic: cũng tạo ra khi thừa biotin hay thiếu O2  Acid -xetoglutaric: khi thiếu NH4+ và pH acid  Sp khác: glutamin, L-acetylglutamin, alanin và aspartic
20. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Công đoaṇ trao đổi ion: Tách lấy acid Glutamic khỏi dịch lên men bằng hạt nhựa Polyetylen sunfuric (Rezin). Quá trình trao đổi nhựa ion gồm các quá trình sau: + - ▫ Quá trình hấp phụ : R’-SO3H + NH3ROO  R’SO3NH3RCOOH ▫ Quá trình tách: R’SO3NH3RCOOH +NaOH  R’SO3Na + NH2RCOOH + H2O Dịch lên men Dịch thải/nước Pha chế dịch lên men Acid HCl Xử lý nhựa Rafin Dịch rửa Nước Trao đổi ion Acid glutamic và dịch thải
21. 3.3.2. Sản xuất acid glutamic và bột ngọt • Chỉ tiêu chất lượng sản phẩm (TCVN 1459-1996, QĐ 867/98 QĐ-BYT) STT Chỉ tiêu thử nghiệm Phương pháp Yêu cầu 1 Độ ẩm TCVN 5533-91 99.00 6 Hàm lượng chì Pb (mg/kg). AOAC 96 (973.82) <2.00 7 Hàm lượng Asen As (mg/kg) AOAC 96 (993.14) <5.00 8 Tổng lượng vi khuẩn hiếu khí/g TCVN 5667-92 104 9 Coliform/g TCVN 4882-01 102 10 E.coli/g TCVN 5155-90 3
22. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Giới thiệu: ▫ Là aa “ không thay thế” ▫ Giúp chuyển hóa protein, tổng hợp hemoglobin, điều hòa hệ thần kinh, sinh dục nam, chuyển hóa axit nucleic, chuyển hóa canxi, dự trữ N ▫ Giảm độc tính của gossypol trong khô dầu bóng ▫ Tăng cường tiết dịch tiêu hóa ▫ Trộn 0.1-0.4% lysine vào thức ăn, sẽ làm tăng hiệu quả sử dụng thức ăn, giảm chi phí thức ăn, tăng trọng, tăng khả năng chống đỡ bệnh tật
23. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Các phương pháp san̉ xuất lysine ▫ Phương pháp thuỷ phân ▫ Phương pháp tông̉ hợp hóa học ▫ Phương pháp lên men ▫ Phương pháp chuyên̉ hóa sinh học
24. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Các phương pháp san̉ xuất lysine ▫ Phương pháp thuỷ phân  Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein. Cơ chất là bột mì, bột đậu nành, Protein từ máu, keratin  Phương pháp này đơn giản dễ thực hiện nên được sử dụng rộng rãi  Hiệu suất rất thấp, khó thực hiện, và khó điều khiển các thông số  Vấn đề tinh sạch rất khó khăn nên dạng sản phẩm tạo ra sẽ nằm dưới dạng tổ hợp và ứng dụng làm thức ăn cho gia súc, gia cầm  Cần thiết bị chịu acid hoặc chịu kiềm  Giá thành sản phẩm cao
25. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Các phương pháp san̉ xuất lysine ▫ Phương pháp tông̉ hợp hóa hoc̣  Ưu điểm là sản xuất ổn định, có thể chuẩn hóa điều kiện sản xuất và hiệu suất  Nhược điểm là tạo ra các đồng phân dạng D mà cơ thể không thể sử dụng được nên vấn đề tách ra khó khăn  Ứng dụng trong công nghệ hóa học hay là làm thức ăn cho 1 số loài gia cầm
26. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Các phương pháp san̉ xuất lysine ▫ Phương pháp lên men  Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thức ăn để lấy acid amine  Đây là phương pháp thông dụng nhất, sản lượng và sản phẩm tạo ra có chất lượng cao hơn, giá thành sản phẩm rẻ hơn  Tận dụng được những nguồn cơ chất rẻ tiền , đơn giản  Phương pháp tiến hành và điều khiển thông số dễ dàng
27. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Các phương pháp san̉ xuất lysine ▫ Phương pháp chuyên̉ hóa sinh hoc̣  Dùng những sinh khối của vi sinh vật để chuyển hóa 1 cơ chất thành sản phẩm thông qua 1 hay 2 phản ứng  Vấn đề tinh sạch và điều khiển thông số khó hơn phương pháp lên men  Khó thực hiện vì phản ứng có thể là nội bào hay ngoại bào nên không có cơ chế điều hòa của vi sinh vật  Cơ chất tham gia phải có cấu tạo tương tự như sản phẩm. Nên phạm vi ứng dụng bị hạn chế  Để khắc phục người ta kết hợp với phương pháp hóa học: tổng hợp ra các tiền thân của các acid amine sau đó dùng vi sinh vật để chuyển thành L- lysine
28. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Các VSV tổng hợp lysine : ▫ Có nhiều loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp được Lysine: Corynebacterium acetophilum, Micrococcus glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Bacillus methanolicus, Ustilago maydis, Torulopsis utilis, Bacillus megaterium, Aerobacter derogences, Escherichia coli, Streptomyces coloniformis, Mycobacterium tuberculosis,, Pseudomonas fluorescens ▫ VSV dùng trong công nghiệp :  Micrococcus glutamicum  Brevibacterium flavum  Brevibacterium lactofermentum  Corynebacterium glutamicum Corynebacterium Brevibacterium glutamicum lactofermentum
29. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Con đường sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn Corynebacterium glutamicum :
30. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Quy trình công nghệ:
31. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Hệ thống lên men:
32. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Hệ thống lọc:
33. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Sấy phun:
34. 3.3.3. Sản xuất Lysin bằng phương pháp vi sinh • Sản phẩm: ▫ Sản phẩm lysine dưới dạng bột L - Lysine – HCl L- lysine sulphate ▫ Sản phẩm lysine dưới dạng thuốc bổ
35. Chương 3: Ứng dụng vi sinh vật trong CNTP 3.4. Tổng hợp enzyme bằng phương pháp vi sinh 3.4.1. Phương pháp tổng hợp enzyme từ vi sinh 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease 3.4.4. Tổng hợp pectinase 3.4.5. Tổng hợp cellulase
36. 3.4.1. Phương pháp tổng hợp enzyme từ vi sinh • Nguyên tắc: ▫ Nuôi cấy tăng sinh khối chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều enzyme mong muốn trong môi trường dinh dưỡng thích hợp ▫ Tách chiết, tinh sạch enzyme từ sinh khối vi sinh vật
37. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Giới thiệu ▫ QT thủy phân Tinh bột thành đường glucose dùng trong SX rượu, bia, giấy, thuộc da ▫ Có thể dùng acid để thủy phân tinh bột, nhưng rất khó kiểm soát và tạo SP không mong muốn, không ATTP, giá thành lại cao ▫ Dùng amylase có nhiều ưu điểm: năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị, giảm chi phí tinh sạch ▫ Amylase có ở TV, ĐV và VSV VSV thích hợp nhất
38. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • PHÂN LOẠI ▫ Hiện nay có 6 loại Enzyme Amylase được xếp làm 2 nhóm:  Endoamylase (Enzyme nội phân)  Exoamylase (Enzyme ngoại phân)
39. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Enzyme alpha-Amylase (EC3.2.1.1): ▫ M = 50.000 – 60.000 Dal ▫ Cắt lk 1,4 α-glucoside tại vị trí bất kỳ ▫ Chuỗi mạch acid amin có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau:
40. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2) ▫ Phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm ▫ Thủy phân các liên kết 1,4 α-glucoside từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch tinh bột ▫ M ~ 64.000 Dal
41. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Enzyme γ-amylase (Glucoamylase) ▫ Thủy phân được 2 kiểu lk 1,4 và 1,6 ▫ Chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật. ▫ M = 27.000 – 112.000 Dal ▫ Chứa các gốc methioni, tritophan và cystein
42. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Enzyme pullulanase (EC 3.2.1.41) ▫ Thủy phân được liên kết α-1,6 của tinh bột, glucogen, pullulan và các dextrin tới hạn ▫ Nhiều loại nấm sợi sản sinh ra loại enzyme này
43. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ▫ Enzyme có ở hầu hết mọi thực vật, động vật và vi sinh vật nhưng chỉ một số có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định. ▫ Nguồn enzyme ở VSV phong phú nhất:  VSV có khả năng chuyển hóa một khối lượng cơ chất lớn hơn khối lượng cơ thể hàng chục ngàn lần sau một ngày đêm  Enzyme thu nhận từ VSV có hoạt tính cao hơn  Tốc độ sinh sản của vi sinh vật mạnh  VSV có cơ thể nhỏ bé nên vận hành SX đơn giản  VSV thích hợp cho sản xuất quy mô công nghiệp  VSV không đòi hỏi quá khắc khe về dinh dưỡng rẻ tiền  VSV có thể sinh tổng hợp cùng lúc nhiều loại enzyme khác nhau
44. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ▫ Nguồn động vật:  Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật  Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn, nằm ngang phía sau dạ dày, giữa lá lách và tá tràng  Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết  Thu nhận amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng  98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến  Các tế bào này tiết enzyme tiêu hoá vào trong tá tràng
45. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • NGUỒN THU NHẬN ENZYME AMYLASE ▫ Nguồn thực vật:  Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng), trong đó người ta sử dụng loại hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc  Lúa (Oryse sativa L): Chủ yếu ở vùng Đông Nam Á  Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá, ngô bột, ngô răng ngựa. Hạt ngô có màu trắng,màu vàng hay màu hồng. Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ, ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có anthocyanin
46. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • Nguồn vi sinh vật: ▫ Nấm sợi Aspergillus, Rhizopus ▫ Nấm men và giả nấm men thuộc các giống: Candida, Saccharomyces, Endomycopsy, Endomyces. ▫ Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn Amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonasdestructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila.
47. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề mặt:
48. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề sâu: Asp. Oryzae
49. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề sâu:
50. 3.4.2. Tổng hợp enzyme amylase • TH amylase từ VSV theo pp nuôi cấy bề sâu:
51. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Giới thiệu: ▫ Nhóm enzyme protease(peptit-hidrolase) xúc tác qt thuỷ phân lk peptit(-CO-NH-)n của protein, polypeptit thành axit amin ▫ Protease cũng có kha ̉ năng thuỷ phân liên kết ester và vâṇ chuyển axit amin.
52. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Phân loaị protease ▫ Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase Endopeptidase (E.C. 3.4.11-17) (E.C. 3.4.21-99) Serine proteinase Aminopeptidase Cystein proteinase Carboxypeptidase Aspartic proteinase Metallo proteinase
53. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Phân loại protease: Protease được phân chia thành hai loại: Endopeptidase và exopeptidase. ▫ Exopeptidase: Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân chia thành hai loại:  Aminopeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu N tự do cuả chuỗ̉i polypeptide đê ̉ giaỉ phóng ra một amino axit, một dipeptide hoặc một tripeptide.  Cacboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptide ở đầu C cuả chuôĩ polypeptide và giaỉ phóng ra một amino axit hoặc một dipeptide.
54. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Phân loại protease: ▫ Endopeptidase: Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm:  Serin proteinase: chứa nhóm –OH cuả gốc Serin trong trung tâm hoạt động, gồm chymotrypsin và subtilisin, hoạt động mạnh ở pH kiềm  Cyteine proteinase: chứa nhóm –SH trong trung tâm hoaṭ động, gồm papayin,bromelin  Aspartic proteinase: chứa nhóm -COOH, gồm pepsin, chymosin, cathepsin, renin , pH trung tính.  Metallo proteinase: chứa KL, pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA
55. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Phân loại protease: ▫ Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:  Protease acid: pH 2-4  Protease trung tính: pH 7-8  Protease kiềm: pH 9-11
56. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Nguồn thu nhận enzym protease: ▫ Nguồn thực vât:̣  Papain thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya)  Bromelain thu từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). dùngchống lại hiện tượng tủa trắng của bia khi làm lạnh (chilling proofing) và trong công nghệ làm mềm thịt  Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica)
57. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Nguồn thu nhận enzym protease: ▫ Nguồn động vật  Tụy tạng: Trypsin, chymotrypsin  Dạ dày bê: renin dùng trong công nghệ phomat, biến đổi cazein thành paracazein gây đông tụ sữa
58. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Nguồn thu nhận enzym protease: ▫ Nguồn vi sinh vâṭ  Vi khuẩn: Bacillus subtilis, B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống Clostridium  Nấm mốc: Aspergillus oryzae, A. terricola, A. fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum, A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti  Xạ khuân:̉ Streptomyces grieus, S. fradiae, S. Trerimosus
59. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Thu nhận enzym bromelin từ cây dứa: Quả, thân,chồi Chế phẩm Xay nhuyễn bromelin thô Chiết lọc Kết tủa Dịch Ly tâm lọc Sấy khô Ly tâm Tinh sạch Dịch ly tâm Sản phẩm enzym tinh khiết
60. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Thu nhận enzyme pepsin từ dạ dày heo: Dạ dày heo (mới mổ, tươi) Sấy nhẹ ở 30- Bóc màng nhầy 35 Xay bằng máy nghiền Nghiền nhuyễn Dung dich tự phân Cân chính xác một tách mỡ lượng màng nhầy Phế phẩm pepsin thô Lọc dung dịch Kết tủa Tinh bột hòa tan Ly tâm kết tủa
61. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Tông̉ hợp enzyme protease Bacillus subtilis ▫ Giai đoạn nuôi cấy và thu canh trường Protease
62. 3.4.3. Tổng hợp enzyme protease • Tông̉ hợp enzyme protease Bacillus subtilis ▫ Quá trình tinh sạch enzym
63. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Pectin ▫ Pectin là polysaccharide dị thể, chủ yếu là một mạch chính gồm các gốc acid –α–D–1,4 galacturonic, liên kết với nhau bằng liên kết 1,4–O glucozic; còn gọi là acid polygalacturonic hay acid pectic ▫ Pectine hòa tan trong tự nhiên là ester metylic của acid pectic ▫ Trong thực tế không phải tất cả các nhóm –COOH ở C6 của đường galactose cũng bị metyl hóa (tạo ester metylic), mà đôi khi một số nhóm –COOH bị decacboxyl hóa (khử CO2), một số nhóm –COOH thay thế -H bằng kim loại, cũng có lúc giữ nguyên dạng –COOH ▫ Protopectine được cho rằng là hợp chất giữa pectine và araban, galactose hay tinh bột
64. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Phân loại: ▫ Theo nhóm methoxyl có trong phân tử:  HMP (High Methoxyl Pectin): Nhóm có chi số methoxyl cao (HMP): MI >7%, trong phân tử pectin có trên 50% các nhóm acid bị ester hoá (DE >50%)  LMP (Low Methoxyl Pectin): Nhóm có chỉ số methoxyl thấp: MI < 7 %, khoảng từ 3 – 5%, trong phân tử pectin có dưới 50% các nhóm acid ị ester hoá (DE ≤ 50%) ▫ Theo khả năng hoà tan trong nước  Pectin hoà tan (methoxyl polygalacturonic): Pectin hoà tan là polysaccharide cấu tạo bởi các gốc acid galacturonic trong đó một gốc acid có chưa nhóm thế methoxyl  Pectin không hoà tan (protopectin): là dạng kết hợp của pectin với araban (polysaccharide ở thành tế bào)
65. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Pectin
66. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Enzyme pactinase: ▫ Enzyme pectinase là enzym xúc tác sự phân hủy các polyme pectin. Sản phẩm tạo thành : acid galacturonic, galactose, arabinose, metanol ▫ Enzyme pectinase có ở thực vật bậc cao và các sản phẩm của vi sinh vật. Ở thực vật bậc cao : có nhiều trong lá, khoai tây, chanh, cỏ chẻ ba, trong các loại quả thường có enzyme pectinesterase ▫ Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Vì vậy enzym pectinase có vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả
67. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Enyme pactinase:
68. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Phân loại theo cơ chế tác dụng ▫ Pectinemathyllestarase là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết este trong phân tử pectine hay acid pectinic. Khi toàn bộ các nhóm metoxyl đều bị tách ra khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là methanol và các acid polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra ở các liên kết este trong phân tử pectine và acid polygalacturonic có thể bị thủy phân một phần hoặc hoàn toàn. ▫ Polygalacturonaselà các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết 1-4 glucozic trong phân tử pectine có nhiều polygalacturonase có tính đặc hiệu rất khác nhau:
69. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Phân loại: ▫ Polymethulgalacturonase: là enzyme tác dụng trên acid polygalacturonic đã được metoxyl hóa, chia làm 2 dạng nhỏ:  Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác sự thủy phân liên kết glucozic nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao  Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xúc tác thủy phân liên kết glucozic ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectine ,bắt đầu từ không khử. Enzyme này có ái lực với gốc galacturonic đã metoxyl hóa
70. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Phân loại theo cơ chế tác dụng ▫ Polymethulgalacturonase: là enzyme tác dụng trên acid polygalacturonic đã được metoxyl hóa, chia làm 2 dạng nhỏ:  Endo-glucosidase-polymethylesterase kiểu I xúc tác sự thủy phân liên kết glucozic nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được este hóa ở mức độ cao  Exo-glucosidase-polymethylesterase kiểu III: xúc tác thủy phân liên kết glucozic ở đầu mạch để tách từng gốc acid galacturonic ra khỏi phân tử pectine ,bắt đầu từ không khử. Enzyme nay có ái lực với gốc galacturonic đã metoxyl hóa
71. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Phân loại: ▫ Polygalactuironase là các enzyme tác dụng chủ yếu lên các axit pectic (acid polygalacturonic không bị este hóa) và acid pectinic (các acid polygalactironic bị este hóa ở mức độ thấp), gồm 2 dạng nhỏ :  Endo –glucosidase-polygalacturonase kiểu II: xúc tác sự thủy phân liên kết glucozic ở giữa mạch các phân tử acid pectic và acid pectinic. Các enzyme này tác dụng ở vị trí liên kết đầu nhóm cacboxyl tự do  Exo- glucosidase- polygalacturonase kiểu IV: xúc tác sự thủy phân các liên kết glucozit ở đầu mạch của acid pectic và acid pectinic. Enzyme này có ái lực với các liên kết glucozic ở đầu mạch gần với nhóm cacboxyl tự do
72. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Nguồn gốc thu nhận ▫ Từ thực vật: Pectinase có nhiều trong lá, than, củ và quả thực vật như: củ khoai tây, củ cà rốt, trong quả cafê, quả táo, vỏ cam, vỏ bưởi nhưng chỉ có enzyme pectinsterase ▫ Từ VSV: VSV phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như:  Nấm mốc: Asp.niger, Asp oryase, Asp.terreus, Asp.saito, Asp.japonicus  Nấm men: Sac.ellipsoideus, Sac.fragilis, Sac.ludwigii  Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum
73. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Thu nhận: ▫ Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu từ VSV ▫ Có hai phương pháp thu nhận chế phẩm thu nhận chế phẩm pectinase:  Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt  Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu
74. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Thu nhận chế phẩm pectinase từ canh trường bề mặt Dụng cụ Môi trường nuôi cấy Hấp khử trùng Hấp khử trùng Để nguội Để nguội Phối vào dụng cụ Cấy vào mt Nhân giống Giống vsv Nuôi cấy trong 36h Thu nhận Ezyme thô
75. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường bề sâu
76. 3.4.4. Tổng hợp pectinase • Ứng dụng của enzyme pectinase: ▫ Làm trong nước quả  Syrup quả  Nước quả đục ▫ Sản xuất rượu vang: cải thiện kết tủa màu và ổn định các loại rượu vang đỏ ▫ Trích ly dược liệu: khử pectin có trong dược liệu tạo điều kiện trích ly nội chất nhanh hơn và trích ly sau thời gian bảo quản không bị vẫn đục
77. 3.4.5. Tổng hợp cellulase
78. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Khái niệm: ▫ Cellulose là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, người và động vật không có khả năng phân giải cellulose. Nó chỉ có giá trị làm tăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa • Chế phẩm cellulase thường dùng để: ▫ Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc. ▫ Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật. ▫ Tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật. Đặc biệt là đối với thức ăn cho trẻ con ▫ Xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt, khoai tây, táo và lương thực như gạo, chè, các loại tảo biển ▫ Hỗ trợ qt đường hóa trong sản xuất bia
79. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Phân loại enzyme cellulase Dựa trên phương thức thủy phân và đặc điểm cấu trúc: ▫ Endoglucanase hoặc 1,4-β-Dglucan-4-glucanohydrolase (EC 3.2.1.4), phân cắt tại vị trí vô định hình bên trong phân tử cellulose tạo ra các chuỗi oligosaccharide ▫ Exoglucanase, bao gồm 1,4-β-D-glucan glucanohydrolase (cellodextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-Dglucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91). Exoglucanase phân cắt từ đầu khử hoặc không khử của chuỗi cellulose tạo ra sản phẩm chính glucose hay cellobiose. Exoglucanase hoạt động chủ yếu trên vùng cellulose tinh thể ▫ β-glucosidase hoặc β-glucoside glucohydrolase (EC3.2.1.21). Thủy phân cellodextrin hòa tan và cellobiose thành glucose
80. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Cấu trúc của enzyme cellulase ▫ Cellulase là một cấu trúc nhiều đơn vị bao gồm vị trí liên kết và thủy phân carbonhydrate (CBD) ▫ CBD là tiểu phần có trong cấu trúc của cellulases và được phân chia thành 54 họ khác nhau ▫ Chức năng chủ yếu của CBD gắn kết vùng xúc tác vào cellulose tinh thể ▫ Sự gắn kết đưa vùng xúc tác lại gần vùng cellulose tinh thể cho sự thủy giải hiệu quả ▫ Một vài CBD khác ưu tiên gắn kết với vùng cellulose vô định hình
81. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Tính chất của enzyme cellulase ▫ Enzyme cellulase thủy phân cellulose tự nhiên và các dẫn xuất như carboxymethyl cellulase (CMC) hoặc hydroxyethyl cellulase (HEC) ▫ Cellulase cắt liên kết β - 1,4 – glucosid trong cellulose, lichenin và các β – D – glucan của ngũ cốc ▫ Độ bền và tính đặc hiệu cơ chất có thể khác nhau ▫ Cellulase hoạt động ở pH từ 3-7, nhưng pH tối thích trong khoảng 4-5 ▫ Nhiệt độ tối ưu từ 40- 50oC ▫ Hoạt tính cellulase bị phá hủy hoàn toàn ở 80o C trong vòng 10-15 phút
82. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase
83. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • VSV tổng hợp enzyme cellulase ▫ Các loài vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose mạnh trong dạ cỏ:  Ruminococcus albus.  Ruminococcus flavefaciens  Buturivibrio fibrisolvens – Ruminobacter parum  Cillbacterium – cellulosolvens  Các vi khuẩn thuộc loài Bacteroides và Clostridium như: amylophilus, Bac. Succinogenes, Bac. Amylo-gense
84. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • VSV tổng hợp enzyme cellulase ▫ Trong môi trường:  Cellulase từ vi khuẩn: Pseudomonas fluorescens ; Acetobacter xyli-num; Cytophaga Sporocytophaga – myxococcoides; Cellvibrio gilvus, cellvibrio fulvus .  Cellulase từ xạ khuẩn như : Actimimyces coelicolor; Act. Sulfureus, Act. Cellulosae, Act. Diastaticus, Act. hydroscopicus; Act. Themofuscus, Act. bovis, Act. flavochromogenes, Thermonosporacurvala  Cellulase từ nấm: Asp. Flavus; Asp. Niger; Asp. Oryzae; Asp.Terreus; Asp. Amstelodamy; Asp. Fumigatus;Chaetomium globosum; chaeelatum; chae. Fumicolum; Mucor pusillus; Penicillium notatum, Pen. Variabite; Pen. Pusillum; Tricoderma koningi; Tr-lignorum Tr. Viride; Sporotrichum pruinosum; Myro thecium verrucaris; Chrysosporium lignorum
85. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Các phương pháp thu hồi enzymee cellulase từ vi sinh vật được sử dụng chủ yếu là phương pháp lên men rắn (SSF), phương pháp lên men lỏng (SmF), ▫ Phương pháp lên men lỏng SmF (lên men ngập nước) ▫ Phương pháp lên men rắn SSF
86. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Phương pháp lên men lỏng SmF (lên men ngập nước) ▫ SmF (Submerged Fermentation) là phương pháp lên men trong môi trường lỏng là sự nuôi cấy vi sinh vật trong nước có chứa các chất dinh dưỡng ▫ Ưu điểm:  Đo các thông số trong quá trình dễ dàng hơn so với quá trình lên men rắn  Tế bào vi khuẩn và nấm men được phân bố đều khắp môi trường  Có hàm lượng nước cao, là điều kiện lý tưởng cho vi khuẩn ▫ Nhược điểm:  Chi phí cao do môi trường dinh dưỡng đắt tiền  Lò phản ứng lớn làm chiếm diện tích, khó kiểm soát sự hoạt động của các vi sinh vật  Nguy cơ ô nhiễm cao do lượng nước thải ra môi trường sau quá trình nuôi cấy
87. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Phương pháp lên men lỏng SmF (lên men ngập nước)
88. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Phương pháp lên men rắn SSF ▫ SSF (Solid State Fermentation) là quá trình lên men xảy ra trong môi trường không hoặc gần như không có nước tự do ▫ Ưu điểm  Hiệu quả không gian lớn: cùng một thể tích lên men rắn, sử dụng được một khối lượng cơ chất 4-5 lần lên men lỏng  Môi trường rắn dễ bảo quản.  Lượng nước ít nên tiêu hao năng lượng cho việc khử trùng và xử lý SP ít  Hoạt tính nước thấp, ít bị nhiễm  Đòi hỏi thiết bị và kỹ thuật đơn giản  Năng suất cao ▫ Nhược điểm  Sự truyền nhiệt bị hạn chế làm ảnh hưởng đến sự khuếch tán qua bề mặt  Tính đồng nhất khi cấy, vi sinh vật phát triển không đồng đều, cách khắc phục khó do khối lượng lên men lớn
89. 3.4.5. Tổng hợp cellulase • Phương pháp lên men rắn SSF
90. for Your attention