Sinh học - Thành phần cấu tạo của DNA - Các bazơ

75 trang vanle 6510

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Sinh học - Thành phần cấu tạo của DNA - Các bazơ", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

sinh_hoc_thanh_phan_cau_tao_cua_dna_cac_bazo.pdf

Nội dung text: Sinh học - Thành phần cấu tạo của DNA - Các bazơ

Kiến thức ôn tập  Cấu trúc phân tử DNA  Cấu trúc gen và hệ gen
Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ Purines Pyrimidines
Nucleoside [structure of deoxyadenosine] Nucleotide
Cách gọi tên Nucleoside Nucleotide Base +deoxyribose +phosphate Purines adenine adenosine guanine guanosine Pyrimidines thymine thymidine cytosine cytidine +ribose uracil uridine
ii). Structure of the Structure of the DNA DNA double helix polynucleotide chain 5’ 3’ • polynucleotide chain • 3’,5’-phosphodiester bond
A-T base pair Hydrogen bonding of the bases G-C base pair Chargaff’s rule: The content of A equals the content of T, and the content of G equals the content of C in double-stranded DNA from any species
HỆ GEN & GEN :CẤU TRÚC, TỔ CHỨC
DNA của hệ gen được “đóng gói” trong NST  Lượng DNA có trong mỗi tế bào người có thể dài 5.8 feet (2 m) nếu được kéo duỗi dài ra  Để có thể nằm gọn trong các tế bào nhỏ bé, mỗi NST được đóng gói ở nhiều cấp khác nhau.  Các DNA được đóng gói lại đươc gọi là thể nhiễm sắc (chromatin) Courtesy of Helmut Schiessel,
Hình. Thành phần các hệ gen của eukaryotes, prokaryotes, và viruses.
Cấu trúc hệ gen ở Eukaryote
Tổ chức hệ gen của người Hệ gen người 3000 Mb Gen và trình tự Trình tự ADN liên quan đến gen giữa các gen 900 Mb 2100Mb ADN mã hóa ADN không Trình tự lặp lại ADN lặp lại 90 Mb mã hóa duy nhất và 420 Mb 810Mb có bản sao thấp 1680 Mb Intron, Pseudo- Các đoạn ADN lặp lại ADN lặp lại leader, gen gen liền kề phân bố trailer rải rác ADN Micro- satellite satellite LTRs SINEs mini- ADN satellite Strachan & Read,1996 LINEs transposon
Học thuyết trung tâm:The Central Dogma DNA RNA Protein Function Replication Translation Work Transcription
Phân loại Gene intergenic region non-coding coding genes genes Chromosome (simplified) Messenger RNA Structural RNA Proteins transfer ribosomal other RNA RNA RNA Structural proteins Enzymes
Cấu trúc gen ở sinh vật prokaryote • Trong bộ gen của prokaryote các gen có cấu trúc tương đối đồng nhất, phần lớn các gen mang mã di truyền, nhiều gen cùng hướng trao đổi chất tập hợp thành các operon • Operon gồm nhiều cistron có chung vùng điều khiển và vùng kết thúc, mỗi cistron tương đương với một gen mã hoá protein ở sinh vật bậc cao • Trong một operon, quá trình phiên mã khởi đầu từ cistron thứ nhất đến cistron cuối cùng, không có quá trình gắn mũ và gắn đuôi polyA, phiên mã đồng thời với dịch mã. Hiện tượng các gen cùng hướng trao đổi chất hợp thành các operon, tương đối phổ biến ở vi khuẩn, giúp cho vi khuẩn thích ứng nhanh với điều kiện môi trường.
Cấu trúc tổng quát gen mã hoá protein ở Eukaryote
Kích thước và số lượng gen  Kích thƣớc trung bình của gen:  Vikhuẩn: 1100bp  Nấm men: 1200 bp  Giun: 5000 bp  Ngƣời: 27000 bp  Thực vật: 2-4000 bp  Khoảng cách trung bình giữa các gen  Vi khuẩn: 118bp  Nấm men: 700 bp  Ngƣời: overlap (trùng lấp) đến 1 Mb  Kích thƣớc exon  Trung bình 125 bp  Một số exon đặc biệt mã hoá protein: 1300-1400bp  Kích thƣớc intron  Rất biến động. Ở ngƣời có thể > 5kb
Sự biến động về kích thước, số lượng gen  Gen có độ biến động rất lớn về kích thước và số lượng  Độ lớn của gen được quyết định chủ yếu bởi độ dài của các đoạn intron  Động vật có vú: 1-100kb  Dystrophin là gen lớn nhất đã biết: 2500 kb
Các gen có độ lớn < 10 kb ở người Percentages describe exon content to the length of the gene
Các gen có độ lớn < 100 kb ở người
Các gen có độ lớn > 100 kb ở người
So sánh các gen mã hoá có cùng chức năng ở sinh vật
Sự tƣơng đồng của gen (orthologous genes) giữa ngƣời và các nhóm sinh vật khác
Chƣơng II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phƣơng pháp lai phân tử (phƣơng pháp tạo mẫu dò, lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phƣơng pháp PCR  Các kỹ thuật xác đinh tính đa hình DNA (dựa trên PCR, dựa trên RELP)  Kỹ thuật tạo thƣ viện hệ gen và cDNA
Enzym giới hạn (restriction enzymes-RE)  Kh¸i niÖm:lµ c¸c enzyme cã khả năng nhận dạng và c¾t AND chØ ë những vÞ trÝ ®Æc hiÖu nhÊt ®Þnh. EcoRI 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ Hind III 5’ AAGCTT 3’ 3’ TTCGAA 5’
Lịch sử phát hiện  1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của một số bacteriophages.  1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thống enzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA của phage, đồng thời có khả năngtự biến đổi DNA của bản thân để tránh bị phá huỷ  1970, Haminton Smith at Johns Hopkins University, Phát hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của tế bào chủ để tự bảo vệ.
Ph©n lo¹i c¸c RE  Lo¹i I: C¾t t¹i ®iÓm c¸ch vÞ trÝ giíi h¹n khoảng 1000-5000 nucleotit  Lo¹i II: c¾t ngay t¹i vÞ trÝ giíi h¹n.  Lo¹i III: c¾t ë vÞ trÝ c¸ch vÞ trÝ giíi h¹n ®ã khoảng 20 nucleotide.
C¸ch gäi tªn c¸c enzym giíi h¹n kiÓu II – EcoRI E = Escherichia Tên genus co = coli Tên species R = strain RY12 Tên strain or serotype I = chữ số la mã = Thứ tự tìm ra enzyme – HinDIII Haemophilus influenza serotype d 3rd enzyme
Đặc điểm của trình tự nhận biết: palindromes: (Đọc ngược đọc xuôi đều giống nhau) Mçi enzyme c¾t giíi h¹n RE cã AAGCTT kh¶ n¨ng nhËn biÕt c¸c tr×nh tù Hind III ®Æc hiÖu cã tõ 4-8 cÆp TTCGAA nucleotide trªn chuçi AND. ë vÞ trÝ nµy c¸c cÆp base cã cÊu tróc CTCGAG ®èi xøng ®Æc biÖt, ®äc xu«i vµ Pst 1 ng•îc theo chiÒu 5' ®Õn 3' ®Òu GAGCTC gièng nhau gäi lµ cÊu tróc GGATCC palindron Bam H1 CCTAGG Cigar? Toss it in a can, it is so tragic. Boston, O do not sob. Do not start at rats to nod. Desserts, I stressed! Are poets a waste? Opera! Reign at Tangier. Anne, I vote more cars race Rome to Vienna. And E.T. saw waste DNA.
Tần xuất cắt của RE  NÕu giả thiÕt trình tù s¾p xÕp cña c¸c lo¹i base lµ ngÉu nhiªn thì x¸c suÊt ®Ó mét ®o¹n trình tù ®•îc nhËn biÕt sÏ lµ 4n ( n lµ chiÒu dµi (bp) cña chuçi ®•îc nhËn biÕt). Sè nucleotit cña ®o¹n x¸c suÊt x¶y ra sù kiÖn nhËn biÕt (n) ph©n c¾t bëi RE 4 1/ 44= 1/256 5 1/ 45= 1/ 1024 6 1/ 46= 1/ 4096 8 1/ 48= 1/ 65.536 n 1/ 4n
Các kiểu cắt: Tạo đầu so le và đầu bằng 5’ overhangs 3’ overhangs blunt ends
Mét sè lo¹i enzym giíi h¹n Enzym Vi khuÈn cã enzym Vïng nhËn biÕt EcoRI Escherichia coli GA-A-T-T - C C - T-T-A-AG EcoRV Escherichia coli G-A-TA-T-C C-T-AT-A-G TagI Thermus aquaticus TC-G-A A-G-CT HbaI Haemophilus baemoliticus GC-G-C C-G-CG DdeI Desulfovibrio desulfuricans CT-N-A-G G-A-N-TC MboII Moraxella bovis GA-A-G-A-(N)8  C-T-T- C-T-(N)7  Pst I Providencia stuarti C -T -G-C-AG GA-C- G-T- C
Enzym Vi khuÈn cã enzym Vïng nhËn biÕt MstII Microcoleus stuarti c-c  t-n-a-g-g g-g-a-n-t c-c NotI Nocardia G-C  G-G-C-C-G-C otitidiscaviarum C-G-C-C-G  G-C-G Bam HI Bacillus GG-A-T-C - C amyloliquefaciens C - C-T-A-GG Hae III Haemophilus aegyptius G-GC-C C-CG-G HhaI Haemophilus G-G-CC haemolyticus CC -G-G
Ứng dụng của RE  Tạo DNA tái tổ hợp  Lập bản đồ giới hạn
Tạo DNA tái tổ hợp  ADN tái tổ hợp là các ADN được tạo thành từ ít nhất hai đoạn ADN có nguồn gốc khác nhau thông qua vi thao tác của con người
NÕu nh• 2 (hay nhiÒu) ADN ®Òu ®•îc c¾t bëi cïng mét lo¹i enzyme th× c¸c ®Çu c¾t cña c¸c ®o¹n ADN ®•îc t¹o ra hoµn toµn khíp nhau (t•¬ng øng theo qui t¾c bæ sung) gäi lµ c¸c ®Çu dÝnh vµ chóng rÊt dÔ dµng g¾n l¹i víi nhau khi cã mÆt enzym ligase. Tõ ®©y xuÊt hiÖn kh¶ n¨ng ch¾p nèi c¸c ADN cã nguån gèc kh¸c nhau ®Ó t¹o nªn ADN t¸i tæ hîp
BẢN ĐỒ GIỚI HẠN  Là bản đồ thể hiện loại enzym giới hạn, số lượng và kích thước các đoạn DNA bị cắt bằng enzym giới hạn.  Một phân tử khi sử dụng các loại enzym khác nhau có thể cho nhiều đoạn cắt khác nhau hình thành nên các bản đồ giới hạn khác nhau.  Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự khác nhau giữa các cá thể trong loài.
PHƢƠNG PHÁP LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN  Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR tạo ra một lượng DNA cần thiết.  Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý enzym giới hạn các mẫu trong điều kiện thích hợp.  Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang DNA chuẩn, tính toán kết quả và lập bản đồ.
VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN Sö dông enzym 1 ®Ó c¾t ®o¹n ADN nghiªn cøu (kÝch th•íc 17kb). KÕt quả cho 3 ®o¹n ADN (6kb, 3kb, 8kb). §iÒu nµy chøng tá enzym 1 cã 2 vÞ trÝ c¾t trªn ®o¹n ADN nh•ng ch•a râ ®o¹n 3kb n»m ë giữa hay ë cuèi sîi. Khi c¾t sîi ADN nghiªn cøu b»ng enzym 2, kÕt quả cho 2 ®o¹n c¾t (7kb, 10kb) chøng tá enzym nµy chØ cã mét ®iÓm c¾t trªn sîi 17kb. Khi c¾t b»ng tæ hîp hai enzym 1 vµ 2 cho thÊy cã sù xuÊt hiÖn l¹i ®o¹n 6kb vµ 8kb, hai ®o¹n nµy lµ sản phÈm cña sù ho¹t ®éng cña enzym 1. Nh• vËy ®o¹n 3kb sÏ bÞ c¾t bëi enzym 2 (vì kÕt quả c¾t phèi hîp cho 4 ®o¹n (6kb, 8kb, 2kb, 1 kb). Tõ ®©y suy ra ®o¹n 3kb phải n»m ë giữa sîi.
Chƣơng II. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen  Các phƣơng pháp lai phân tử (phƣơng pháp tạo mẫu dò, lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xác định trình tự DNA  Phƣơng pháp PCR  Các kỹ thuật xác đinh tính đa hình DNA (dựa trên PCR, dựa trên RELP)  Kỹ thuật tạo thƣ viện hệ gen và cDNA
Nhân dòng AND (DNA CLONING)  DNA cloning là kỹ thuật dùng để tái sản xuất các đoạn DNA .  Hai cách: ▪ sử dụng tế bào chủ ▪ dùng PCR  Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn DNA mục tiêu vào trogn tế bào chủ
Vector nhân dòng  Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn AND/gen đã được tách dòng  Trong thực tế, một đoạn ADN lạ không thể duy trì và nhân bản trong tế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn ADN đơn độc.  Do enzym ADN polymerase làm nhiệm vụ tái bản ADN không thể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào trên ADN mà chỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là “điểm tái bản” (origins of replication) Các đoạn ADN (các gen) muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vào một vectơ (cloning vectors). Vectơ nhân dòng thực chất là một phân tử ADN có gốc tái bản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn.
Loại vectors Chromosome-based Plasmid-based Virus-based YAC Phage-based MAC BAC Hybrid Eukaryotic virus- based (phagemid, cosmid etc)
Plasmids Plasmid lµ c¸c ph©n tö ADN vßng cã cÊu tróc chuçi xo¾n kÐp vµ cã thÓ tù nh©n bản. Chóng cã mÆt trong vi khuÈn vµ n»m ngoµi còng nh• ®éc lËp víi nhiÔm s¾c thÓ cña vi khuÈn
Nhãm Plasmit pBR  C¸c plasmit pBR ®•îc xem lµ c¸c vect¬ nh©n dßng thÕ hÖ 1. C¸c plasmit nµy ®•îc F. Boyer vµ ®ång nghiÖp thiÕt kÕ.
Cấu trúc vector pBR322 4363bp “p" = plasmid "BR" lµ tªn cña hai nhµ khoa häc F. Bolivar vµ R.Rodrigues "332" lµ sè thø tù.
Nhãm Plasmit pUC  Đ©y lµ nhãm c¸c plasmit ®•îc ph¸t triÓn tõ nhãm plasmit pBR322.  PhÇn chøa gen kh¸ng tetracyline (khoảng 40 % ADN) ®•îc c¾t bá cßn phÇn gen kh¸ng ampicillin vµ gèc t¸i bản cña pBR322 ®•îc giữ l¹i.  Ngoµi ra, c¸c vÞ trÝ nh©n dßng hay vÞ trÝ g¾n c¸c ®o¹n ADN ngo¹i lai (còng lµ c¸c vÞ trÝ c¾t cña c¸c enzym giíi h¹n) cña pUC ®•îc ph©n bè tËp trung vµo mét vÞ trÝ gäi lµ vÞ trÝ ®a nh©n dßng (multiple cloning site-MCS).
Nhãm Plasmit pUC  Đ©y lµ nhãm c¸c plasmit ®•îc ph¸t triÓn tõ nhãm plasmit pBR322.  PhÇn chøa gen kh¸ng tetracyline (khoảng 40 % ADN) ®•îc c¾t bá cßn phÇn gen kh¸ng ampicillin vµ gèc t¸i bản cña pBR322 ®•îc giữ l¹i.  Ngoµi ra, c¸c vÞ trÝ nh©n dßng hay vÞ trÝ g¾n c¸c ®o¹n ADN ngo¹i lai (còng lµ c¸c vÞ trÝ c¾t cña c¸c enzym giíi h¹n) cña pUC ®•îc ph©n bè tËp trung vµo mét vÞ trÝ gäi lµ vÞ trÝ ®a nh©n dßng (multiple cloning site-MCS).
Bảng. Khả năng chèn đoạn ADN ngo¹i lai của một số vectơ nhân dòng Khả năng chứa đoạn Stt ơ Vect ADN(kb) Plasmit <10kb 1. Bacteriophage 9-20kb 2. Cosmit 33-47kb 3. BAC 100-300kb 4. YAC 100-1000kb 5.
Tiªu chuÈn cña mét vector nh©n dßng  Chỉ có một địa điểm nhận biết cho một enzym hạn chế nào đó.  Nếu nhƣ số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này. Một vectơ nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu nhƣ nó có thể đƣợc cắt nhờ nhiều loại enzym giới hạn và tất nhiên ứng với mỗi loại enzym cũng chỉ có một địa điểm nhận biết.  Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc  thí dụ nhƣ tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo mầu. Điều này cần thiết để có thể chọn lọc đƣợc các tế bào đã đƣợc chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu của chúng.  Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế bào chủ mới.  Trong một số trƣờng hợp một plasmit có thể đƣợc sử dụng làm vectơ nhân dòng cho hai tế bào chủ không có liên quan với nhau nhƣ E.coli và Bacillus subtilis. Các vectơ hai chức năng này phải có số điểm tái bản lớn hơn 1.
Nhân dòng DNA  DNA cloning cho phép chọn lọc và sao chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù của DNA (Hoặc RNA) và sản xuất với một lượng không giới hạn  Là bước đầu tiên trong một loạt các thí nghiệm về kỹ thuật di truyển ▪ Tạo thư viện DNA ▪ PCR ▪ DNA sequencing
C¸c b•íc c¬ b¶n cña nh©n dßng gen 1. T¸ch chiÕt ADN tõ mÉu nghiªn cøu, c¾t ADN b»ng enzym c¾t giíi h¹n ®Ó t¹o ra c¸c ®o¹n ADN lµ nguyªn liÖu cho qu¸ tr×nh nh©n dßng (t¸ch dßng) 2. G¾n c¸c ®o¹n c¾t vµo mét vect¬ nh©n dßng 3. ChuyÓn n¹p c¸c vect¬ nh©n dßng sau ph¶n øng g¾n trªn vµo tÕ bµo sinh vËt chñ ®Ó nh©n b¶n c¸c ®o¹n ADN ®· ®•îc g¾n cïng víi vect¬ 4. Chän läc, tËp hîp c¸c ®o¹n g¾n thµnh tõng dßng riªng h×nh thµnh th• viÖn mÉu ®· nh©n dßng. Tõ ®©y cã thÓ chän läc ra c¸c tr×nh tù cÇn quan t©m.
Bước 1. Cắt mẫu DNA bằng RE
Bước 2. Cắt PLASMID DNA bằng RE
Bước 3. Nối mẫu DNA và PLASMID DNA
Bước 4. Biến nạp  Biến nạp: là quá trình chuyển DNA ngoại sinh vào trong 1 tế bào “transformation”  Có hai phương pháp để biến nạp DNA vào vi khuẩn :  Phương pháp hóa học sử dụng CaCl2 và shock nhiệt để thúc đẩy DNA đi vào trong tế bào  Dùng xung điện (electroporation ): dung xung điện để kích thích quá trình tế bào tiếp nhận DNA
Biến nạp theo phương pháp dùng CaCl2 và sốc nhiệt
Biến nạp bằng xung điện
Các sản phẩm thu được sau biến nạp Plasmid ++ insertinsert Plasmid without insert No plasmid Ampicillin resistantresistant Ampicillin resistant No ampicillin resistance Làm thế nào để phân biệt và chọn lọc đƣợc sản phẩm mong muốn?
Các phương pháp chọn lọc  Chọn lọc dựa vào kháng sinh  Chọn lọc trắng/ xanh  Chọn lọc dựa vào các gen báo cáo khác:Luciferase
Chọn lọc dựa vào kháng sinh Negative selection Insert/No insert Disruption of KAN gene leads to NO RESISTANCE to Kan Basic selection Vector/No vector Origin
Chọn lọc âm tính
Chọn lọc trắng xanh Dựa vào hệ thống lac Operon: điều khiển phản ứng đối với lactose trong tế bào E. coli
 - galactosidaza &  - glucuronidaza  - galactosidaza Lactoza Galactoza + Glucoza  - glucuronidaza -D-glucuronid + H2O AxÝt glucuronic + Glucoza X-Gal Kh«ng mµu X-Gluc 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside 5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-glucuronid   - - glucuronidaza galactosidaza _cleanup1.jpg 5-Brom-4-chlor-indigo Mµu xanh sÉm 5-Brom-4-chlor-indigo
Lac Z gene Gene expression dogma DNA promotor LacZ gene RNA pol. RNA LacZ mRNA Ribosome Protein β-galactosidase X-gal BLUE colonies X-gal WHITE colonies
Lac Z gene promotor LacZ RNA pol. promotor operator LacZ RNA pol. Repressor IPTG IPTG IPTG promotor operator LacZ RNA IPTG pol. IPTG Β-galactosidase X-gal X + galactose Cells which produce ß-galactosidase form BLUE colonies. Cells without ß-galactosidase production form WHITE colonies.
Chọn lọc Insert promotooperato T LacZ r r T pGEM X X X without plasmid X Plasmid without Insert X Plasmid +Insert WHITE colonies BLUE colonies
Bước 5. Nhân nuôi trên môi trường và chọn lọc
Bước 5. Nhân nuôi trên môi trường và chọn lọc  ChØ c¸c vi khuÈn nµo cã chøa plasmid ®· chuyÓn n¹p th× tån t¹i ®•îc trªn m«i tr•êng vµ sinh khuÈn l¹c (v× cã plasmid chuyÓn n¹p th× míi cã gen chÞu kh¸ng sinh ).  Do cÊu tróc cña plasmid, vïng gen chÞu tr¸ch nhiÖm sinh mµu (gen m· ho¸  -galactozidase) sÏ lµ vïng bÞ c¾t ®Ó g¾n ADN ngo¹i vµo, cho nªn c¸c khuÈn l¹c cã mÇu xanh lµ khuÈn l¹c cã chøa plasmid nh•ng kh«ng g¾n ADN ngo¹i lai, cßn khuÈn l¹c cã mÇu tr¾ng chÝnh lµ khuÈn l¹c cã chøa 1 ®o¹n ADN cÇn nh©n dßng ®•îc ghÐp vµo.
Movie on making recombinant DNA