Sinh học - Chương II:. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại dung dịch

Nội dung text: Sinh học - Chương II:. Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại dung dịch

1. Chương II. Cỏc kỹ thuật nền của CNSH hiện đại dd  Chức năng và ứng dụng của cỏc enzyme giới hạn  Giới thiệu cỏc vector nhõn dũng và kỹ thuật nhõn dũng gen  Phương phỏp PCR  Cỏc phương phỏp lai phõn tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xỏc định trỡnh tự DNA  Kỹ thuật tạo thư viện DNA
2. Khỏi niệm thư viện DNA •Thư viện DNA, giống như thư viện truyền thống được sử dụng để thu thập và lưu trữ thụng tin •Trong thư viện DNA thống tin được dự trữ là cỏc phõn tử DNA Th• viện DNA là tập hợp ngẫu nhiên các đoạn ADN (có tính đại diện đặc thù cho hệ gen của một sinh vật) đ•ợc chèn vào các vector nhân dòng
3. Có hai loại th• viện mẫu chính đó là: 1. Th• viện genom (Genomic library): chứa toàn bộ các đoạn DNA có trong nhân của một tổ chức hay cơ thể. Genomic library có thể đ•ợc nhân dòng bằng plasmid hoặc genome của thực khuẩn thể. 2. Th• viện cDNA (cDNA library): chứa các đoạn cDNA có tính đại diện đặc thù cho toàn bộ mARN của một mô. Th• viện cDNA đ•ợc tạo ra bằng cách tổng hợp nên cDNA từ mRNA.
4. Các b•ớc trong tạo th• viện mẫu đã nhân dòng 1. Tạo các đoạn ADN ngẫu nhiên từ hệ gen hay cDNA 2. Chèn các đoạn ADN vào vectơ nhân dòng thích hợp. 3. Nhân các đoạn ADN tạo ra trong hệ thống tế bào chủ (chứa vectơ nhân dòng t•ơng ứng) 4. Chọn lọc các dòng có chứa vectơ mang đoạn ADN mục tiêu.
5. Thiết kế thư viện mẫu cho đọc trỡnh tự.
6.  Mỗi một đoạn ADN cài trong một vectơ biến nạp trong 1 tế bào vi khuẩn Sách (Book)  Tập hợp tất các các dòng vi khuẩn Th• viện
7. Tạo đoạn ADN có kích th•ớc phù hợp cho nhân dòng Kích th•ớc của đoạn ADN tùy thuộc vào mục đích sử dụng th• viện Để lập bản đồ, xác định các gen hay tách dòng gen từ hệ gen có kích th•ớc lớn cần các đoạn ADN lớn và sử dụng các vectơ nh• phage, cosmid, BAC hay YAC Để xác định trình tự, lập bản đồ chi tiết cần các đoạn ADN có kích th•ớc nhỏ, sử dụng vectơ nhân dòng là plasmid Các đoạn ADN phải có tính ngẫu nhiên để đảm bảo tính đại diện cho hệ gen.
8. Tạo đoạn ADN có kích th•ớc phù hợp cho nhân dòng  Làm gãy nhiễm sắc thể  Cắt bằng RE  Ở genom người dựng RE có vùng nhận biết gồm 8 Nu (Not1, SfiI) sẽ tạo được đoạn cắt cú chiều dài lớn  Thụng thường dựng RE có vùng nhận biết gồm 4 Nu AluI, HaeIII  cắt không hoàn toàn (partial digest) bằng cỏch sử dụng phối hợp nhiều RE
9. Bảng. Khả năng chốn đoạn ADN ngoại lai của một số vectơ nhõn dũng Khả năng chứa đoạn Stt Vectơ ADN(kb) Plasmit <10kb 1. Bacteriophage 9-20kb 2. Cosmit 33-47kb 3. BAC 100-300kb 4. YAC 100-1000kb 5.
10. Trong một th• viện sẽ chứa bao nhiêu dòng ? Theo lý thuyết:  Số dòng tối thiểu cần thiết để tạo th• viện(n) = độ lớn của hệ gen (b) độ lớn TB của đoạn ADN (a)
11. Ví dụ: thiết kế th• viện hệ gen của ng•ời, dùng các vector khác nhau: Kích th•ớc genome : 3 x 109 bp  Plasmid = Take inserts of 0.2 - 20 kb (kb = kilobase = 1000 bases) > Average insert size of 1000 bases = 3 x 106 clones required to cover one human genome (haploid human)  Lambda Phage = Inserts of 9-23 kb > Average insert of 17,000 bases = 1.8 x 105 clones required to cover one human genome  Cosmid = Take inserts of 35-50 kb > Average insert of 50,000 bases = 60,000 clones required to cover one human genome  BAC (bacterial artificial chromosome) =Take inserts of ~500 kb > Average insert of 500 kb= 6,000 clones required to cover one human genome  YAC (yeast artificial chromosomes) = Take inserts of 200 kb - 1 Mb (Mb = 1 x 106 bases) or greater > Average insert of 1 Mb = 3,000 clones required to cover one human genome
12. Trên thực tế, số dòng sẽ lớn hơn bởi quá trỡnh cắt và ghép vào vector là ngẫu nhiên.  Một số dòng sẽ có mặt hơn một lần trong th• viện do hiện t•ợng lặp đoạn  Một số trỡnh tự nào đó sẽ bị mất nếu chỉ sử dụng số dòng tối thiểu.  Clarke and Carbon (1976) đề nghị công thức tính mới nhằm tính xác suất để một đoạn ADN đ•ợc nhân dòng trong một th• viện mẫu. N = ln(1-P) ln(1-a/b)  Trong đó: P: xác xuất nhân dòng một đoạn DNA bất kỳ; a: kích th•ớc đoạn DNA cần nhân (bp), b : độ lớn hệ gen (bp)
13. Cõu hỏi  Cần bao nhiờu dũng để 99 % một đoạn trỡnh tự cú mặt trong thư viện gen của người sử dụng cosmid vector?
14. The Central Dogma exon DNA Double-stranded intron Precursor AAAAAAAAAAn RNA mRNA AAAAAAAAAAn Single-stranded Reverse transcription Protein AAAAAAAAAAn double-stranded cDNA
15. cDNA A cDNA or complementary DNA, is a DNA copy of an RNA, usually mRNA cDNA mRNA Double stranded Single stranded Stable unstable Easy to manipulate More difficult to manipulate Need to be transcribed into Can be directly used to make RNA to make a protein a protein
16. Kỹ thuật tạo thư viện cDNA Khỏi niệm:  Bộ gen của sinh vật eukaryote thường rất lớn, tuy nhiờn số lượng gen mó hoỏ chỉ chiếm phần nhỏ trong tế bào  Trong cỏc gen mó hoỏ protein, chỉ cú một số gen nhất định hoạt động và biểu hiện ở cỏc mụ nhất định tuỳ thuộc vào cỏc giai đoạn sinh trưởng phỏt triển của cơ thể  Chiết tỏch mRNA của tế bào, mụ ở từng thời điểm nhất định sẽ thu được cỏc loại mRNA khỏcnhau ứng với số gen đạng hoạt động trong tế bào. Sử dụng kỹ thuật phiờn mó ngược từ mRNA tạo nờn cỏc c DNA tương ứng, mỗi cDNA được gắn vào vector nhõn dũng, tạo nờn cỏc dũng cDNA khỏc nhau
17.  Tập hợp tất cả cỏc mRNA thu được từ một loại tế bào, ở cỏc giai đoạn phỏt triển khỏc nhau tạo nờn tập hợp cDNA được tỏch dũng gọi là ngõn hàng cDNA của tế bào  Tổng hợp cỏc ngõn hàng cDNA của từng loại tế bào và mụ của một sơ quan ngõn hàng cDNA của cơ quan đú
18. Sơ đồ tổng hợp cDNA
19. Phương phỏp 1: Tạo cDNA bằng phiờn mó ngược cú phõn huỷ hoàn toàn mRNA khuụn Cỏc bước tiến hành 1. Chiết tỏch ARN tổng số  do cỏc mARN đều chứa ở đầu cuối 3” một chuỗi cỏc gốc A (polyA) nờn cú thể dựng cỏc tổ hợp oligonucleotid chỉ chứa deoxythimidin (oligodT)  Gắn cỏc oligodT vớimàng xelluloza và đặt trong cỏc phễu chiết.  Chiết tỏch toàn bộ ARN rồi cho cỏc ARN này chảy qua phễu cú gắn xelluloza-oligo (dT)  Cỏc mARN sẽ bị giữ lại do hỡnh thành liờn kết bổ sung A-T  Dựng dung dịch muối NaCl để tẩy cỏc rARN và t ARN ra khỏi phễu.  Dựng dung dịch đệm Tris EDTA cho chảy qua phễu, cỏc mARN được giải phúng do liờn kết A-T bị phõn giải.
20. 2. Tổng hợp cDNA  Dựng cỏc mARN làm khuụn với sự cú mặt của enzym sao chộp ngược (inverse transcriptase) cựng với cỏc nguyờn liệu (dNTP) để tổng hợp nờn ADN bổ sung hay cADN sợi đơn cú cấu trỳc kẹp túc.  Dựng enzyme Rnase H (hoặc alkali) phõn huỷ hoàn toàn sợi khuụn mRNA  Bổ sung DNA polymerase và cỏc nucleotid tự do để tổng hơp sợ cDNA thứ 2 (phần múc cong trở thành primer cho DNA polymerase)  Sử lý với S1 nuclease để cắt bỏ đoạn cú cấu trỳc kẹp túc thu được phõn tử cDNA cú cấu trỳc xoắn kộp
21. 3. Nhõn dũng cỏc cDNA  Cỏc cADN được cloning và tập hợp thành thư viện cADN  Ngõn hàng cADN được thiết lập từ gen hoạt động, được phiờn mó thành mARN nờn cú tớnh đặc trưng cao
22. Qui trình tạo th• viện cDNA *see text page 261
23. Phương phỏp 2: Tạo cDNA bằng kỹ thuật RACE  RACE: (rapid amplification of cDNA ends): kỹ thuật nhõn nhanh đầu cuối cDNA  Cỏc bước:  Sau khi tổng hợp được cDNA sợi đơn, thuỷ phõn toàn bộ mRNA bằng Rnase H  Nối thờm đuụi poly C vào đầu 3’ của cDNA nhờ terminal transferase và ATP  Bổ sung mồi oligo dG, dNTP, DNA polymerase và thực hiện nhõn PCR để tổng hợp cDNA thứ 2.
24. Sơ đồ tạo cDNA bằng kỹ thuật RACE
25. cDNA synthesis TTTTTTTTT First strand Nick translation cDNA library
26. So sỏnh thư viện cDNA library và thư viện genom  1) Thư viện cDNA chỉ chứa trỡnh tự được phiờn mó ở mRNA, chứ khụng phải toàn bộ gene. Thư viện genom thường chứa trỡnh tự của toàn bộ gen. 2) Thư viện cDNA cú thờ khụng chứa toàn bộ gene của cơ thể. Thư viện genom cần chứa tất cả cỏc gen của cơ thể 3) Nếu gen được biểu hiện mạnh ở một mụ, thư viện cDNA cú thể chứa nhiều bản sao của gen đú. Cỏc gen khụng biểu hiện hoặc biểu hiện ở mức thấp cú thể khụng cú mặt trong thư viện cDNA. Thư viện genom thường chứa tất cả cỏc dũng của gen nếu như gen đú xuất hiện nhiều trong hệ gen sinh vật.
27. ứng dụng th• viện mẫu đã nhân dòng  Cung cấp các trỡnh tự cho phân tích, khuyêch đại, nhân dòng và thể hiện gen  Thiết kế các mẫu dò, mồi khi đã biết trỡnh tự để cung cấp cho các nghiên cứu, chuẩn đoán tiếp theo (lai, blot, PCR, trị liệu gen )  Tổng hợp hoạt chất thông qua điều khiển sự thể hiện của một gen nào đó trong tế bào chủ đặc thù.
28. ứng dụng th• viện cDNA  Xác định trỡnh tự các bazơ và phân tích gen  Thiết kế các mẫu dò cho các gen mục tiêu trên nhiễm sắc thể  nghiên cứu sự thể hiện của gen  Tổng hợp protein nhân tạo