Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật

Nội dung text: Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật

1. PHƯƠNG PHÁP QUẢN LÝ MẪU BỆNH THỰC VẬT
2. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật “Mọi tài liệu ghi chép nếu không thể được kiểm tra lại thì cũng chỉ là những mảnh giấy vụn mà thôi” R.W.G. Dennis, theo British Ascomycetes (1968), J. Cramer, Lehre, Germany. ii
3. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật LỜI CẢM ƠN Chúng tôi xin chuyển lời cảm ơn sâu sắc tới TS. John Alcorn, người đã hiệu đính cuốn sách này. Xin cảm ơn Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia (AusAID) đã cung cấp nguồn kinh phí quý báu cho việc ra đời và xuất bản cuốn sách. Xin giành lời cảm ơn đặc biệt cho ông Eli Szandala, Văn phòng các chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp, Bộ Nông nghiệp, Thủy sản và Lâm nghiệp Australia đã điều hành chương trình xuất bản cuốn sách này. Cuốn sách này mô tả nhiều phương pháp đã được thảo luận bởi các thành viên tham gia trong hội thảo tổ chức tại Chiang Mai, Thái Lan ngày 20 tháng 11 năm 2004. Chúng tôi xin cảm ơn TS. Srisuk Poonpolgul (Bangkok, Thái Lan), bà Srisurang Likhitekaraj (Bangkok, Thái Lan), TS. Pornpimon Athipunyakom (Bangkok, Thái Lan), ông Woothisak Butranu (Bangkok, Thái Lan), TS. Kartini Kramadibrata (Bogor, Indonesia), TS. Lee Su See (Kepong, Malaysia), TS. Hien Thuy Phan (Hà Nội, Việt Nam) và ông Eli Szandala (Canberra, Australia) vì những đóng góp quý báu cho sự thành công của cuốn sách này. Các tác giả chính TS. Roger Shivas và TS. Dean Beasley, Bảo tàng bệnh cây, Sở Nông nghiệp và Thủy sản Queensland, Australia. Các tác giả tham gia TS. John Thomas và TS. Andrew Geering, Khoa virus học, Sở Nông nghiệp và Thủy sản Queensland, Australia. TS. Ian Riley, Chuyên gia tuyến trùng học, Trường Đại học Adelaide, Bang Nam Australia, Australia. © Commonwealth, Australia 2005 Cuốn cẩm nang ‘Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật’ được đảm bảo quyền tác giả. Tuy nhiên, bạn có thể tải xuống, in và sao chép cho việc sử dụng riêng, không vì mục đích thương mại hoặc sử dụng trong phạm vi cơ quan của mình. Ngoài mục đích sử dụng được phép trong phạm vi quy định của Luật bản quyền năm 1968, tất cả các quyền tác giả khác đều được đảm bảo. ISBN 0-9751686-9-X iii
4. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật BẢNG CHỮ VIẾT TẮT AMV Virus khảm lá linh lăng ACIAR Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc tế Australia ASEAN Hiệp hội các Quốc gia Đông Nam Á ASEANET Hội thiết lập và điều hành mạng lưới khu vực Đông Nam Á AusAID Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia BO Bảo tàng Bogoriense BRIP Bảo tàng bệnh cây Queensland DAFF Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản DAR Bảo tàng bệnh cây New South Wales DNA Deoxyribonucleic Acid ELISA Kỹ thuật miễn dịch liên kết men FAO Tổ chức lương thực của Liên Hợp Quốc GA Glycerol Agar GBIF Phương tiện thông tin đa dạng sinh học toàn cầu GPS Hệ thống định vị toàn cầu KBA King’s B Agar ICTV Ủy ban Quốc tế về phân loại virus IJSB Tạp chí Quốc tế về phân loại học vi khuẩn IJSEM Tạp chí Quốc tế về tiến hóa và phân loại vi sinh vật học IMI CABI Bioscience, UK Centre IPPC Công ước Quốc tế về bảo vệ thực vật ISPM Tiêu chuẩn Quốc tế về kiểm dich động thực vật LNYV Virus đốm vàng hoại sinh rau diếp MEA Malt Extract Agar MTA Văn bản thỏa thuận chuyển giao mẫu NA Nutrient Agar NSW New South Wales OCPPO Văn phòng chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp PCR Phản ứng trùng hợp chuỗi PDA Khoai tây - đường – Agar PEMV Virus khảm biến dạng đậu PRA Đánh giá nguy cơ dịch hại PRSV Virus đốm vòng đu đủ QDPIF Sở Nông nghiệp và Thủy sản Queensland RIRDC Tổ chức nghiên cứu và phát triển nông thôn RNA Ribonucleic Acid SEM Kính hiển vi điện tử quét SPA Sucrose Peptone Agar SPS Kiểm dịch động thực vật SCBV Virus hình que hại mía SWG Cân trọng lượng tiêu chuẩn TMV Virus khảm lá thuốc lá TSWV Virus đốm héo cà chua TWA Môi trường agar - nước máy UV Tia cực tím VIDE Cơ sở dữ liệu trao đổi thông tin giám định virus WFCC Hiệp hội lưu giữ mẫu vi sinh vật Thế giới WTO Tổ chức thương mại Thế giới iv
5. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật LỜI TỰA Cuốn cẩm nang về quản lý mẫu bệnh thực vật này được Bộ Nông nghiệp, Thủy sản và Lâm nghiệp Australia tài trợ thực hiện. Cuốn sách được ra đời với mục đích cung cấp tài liệu tham khảo cho các nước trong khu vực nhằm xây dựng danh mục dịch hại từ tiêu bản các mẫu bệnh thu được, đáp ứng nhu cầu của thương mại Quốc tế đối với hàng hóa nông nghiệp. Sự thành lập tổ chức thương mại Thế giới (WTO) năm 1995 là tiền đề cho sự ra đời của một kỷ nguyên mới trong tự do thương mại. Hiệp định WTO về việc áp dụng các biện pháp kiểm dịch động thực vật (Hiệp định SPS) đã thúc đẩy sự phát triển của thương mại hóa nông sản, tuy vậy mục tiêu này đã bị lãng quên ở một số nước đang phát triển. Ở nhiều nước trên thế giới, bộ sưu tập sâu và bệnh hại rất nghèo nàn dẫn đến những hạn chế trong việc mô tả tình trạng lành mạnh của nền nông nghiệp cũng như lâm nghiệp nước đó. Đó cũng là nguyên nhân khiến nhiều tổ chức bảo vệ thực vật Quốc gia không thể thực hiện công tác phân tích nguy cơ dịch hại một cách đầy đủ và tin cậy. Tình trạng này còn tiếp diễn sẽ là một bất lợi lớn cho các nước đang phát triển ở khu vực trong việc đàm phán để mở rộng thị trường cho hàng nông sản. Theo điều khoản 9 của hiệp định SPS, các nước phát triển đã chấp thuận trợ giúp về chuyên môn cho các nước đang phát triển thành viên để phát triển kỹ năng có liên quan đến hiệp định SPS và đáp ứng các điều kiện mà Hiệp định SPS đề ra. Australia đã đóng góp trách nhiệm của mình bằng nhiều cách khác nhau thông qua các chương trình trợ giúp song phương trong khu vực, với nguồn vốn tài trợ của Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia (AusAID). Các hoạt động trợ giúp được tiến hành trên nhiều lĩnh vực, trong đó có việc xây dựng danh mục các dịch hại trên cơ sở mẫu tiêu bản. Văn phòng các chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp thuộc Bộ Nông nghiệp, Lâm nghiệp và Thủy sản Australia đã đảm nhận công việc này, đối tượng nhận được sự giúp đỡ trong chương trình là các nước ở khu vực Đông Nam Á. Chương trình chú trọng đến việc xây dựng năng lực của các nhà khoa học ở năm lĩnh vực cơ bản sau: ¾ Điều tra dịch hại thực vật ¾ Chẩn đoán ¾ Bảo quản mẫu ¾ Phụ trách và quản lý bộ sưu tập mẫu ¾ Quản lý dữ liệu Cuốn cẩm nang này đã tóm tắt lại những phương pháp và kỹ thuật thường được sử dụng trong tất cả các vấn đề về bệnh cây, bao gồm cả thông tin về những bệnh hại có tầm quan trọng về kinh tế, các phương pháp thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng, phương pháp nuôi cấy trên môi trường nhân tạo, phương pháp phân lập, bảo quản mẫu cũng như các thông tin, các mẹo nhỏ trong việc quản lý tiêu bản mẫu bệnh và mẫu vi sinh vật hại. Để đáp ứng nhu cầu sử dụng rộng rãi, cuốn cẩm nang này đã được dịch sang tiếng Việt, tiếng Thái và tiếng Bahasa. Lois Ransom Chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp Bộ Nông nghiệp, Thủy sản và Lâm nghiệp Australia. 1
6. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN III BẢNG CHỮ VIẾT TẮT IV LỜI TỰA 1 MỤC LỤC 2 DANH MỤC HÌNH 5 DANH MỤC BẢNG 5 1 MỞ ĐẦU U 6 1.1 Những trách nhiệm mang tính toàn cầu 6 1.2 Tình trạng lưu giữ mẫu sinh học ở các nước ASEAN 8 1.3 TẦm quan trọng của việc lưu giữ hồ sơ tiêu bản 8 1.4 Xây dựng và phát triển công tác lưu giữ mẫu bệnh cây ở các nước ASEAN 9 2 LƯU GIỮ MẪU BỆNH HẠI THỰC VẬT 10 2.1 Bảo tàng mẫu 10 2.2 Bộ sưu tập vi sinh vật 10 2.3 Xây dựng bộ mẫu bệnh cây 11 2.4 Danh mục dịch hại 12 3 XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP MẪU BỆNH 15 3.1 Nguồn mẫu 15 3.2 Thu thập mẫu bệnh ngoài đồng ruộng 15 3.3 Thu thập và xử lý mẫu bệnh 17 3.3.1 Đối với lá, thân và quả 18 3.3.2 Đối với rễ và đất 19 3.3.3 Đối với nấm lớn 20 3.4 Cách ghi phiếu điều tra mẫu bệnh 21 3.5 Điều tra và lấy mẫu 22 4 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MẪU BỆNH 24 4.1 Nhuộm màu nấm và vi khuẩn 24 4.2 Kính hiển vi quang học 26 4.3 Chụp ảnh mẫu 27 4.3.1 Cách quản lý và đặt tên file ảnh 27 5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP NẤM, VI KHUẨN VÀ TUYẾN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM 29 2
7. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 5.1 Phân lập nấm 30 5.1.1 Buồng giữ ẩm 31 5.1.2 Phương pháp pha loãng 32 5.1.3 Phát triển và sản sinh bào tử 32 5.2 Phân lập vi khuẩn 34 5.3 Phân lập tuyến trùng 35 5.3.1 Mẫu đất 36 5.3.2 Mẫu cây bệnh 38 5.3.3 Bảo quản và làm tiêu bản 39 5.4 Môi trường nuôi cấy 40 6 CÁCH BẢO QUẢN VÀ LƯU GIỮ MẪU BỆNH 44 6.1 Tiêu bản mẫu bệnh 44 6.1.1 Tiêu bản khô 44 6.1.2 Tiêu bản chuẩn 46 6.1.3 Mẫu vi sinh vật khô 47 6.1.4 Tiêu bản lam 47 6.1.5 Đóng gói và vận chuyển tiêu bản 48 6.2 Mẫu vi sinh vật đã phân lập 48 6.2.1 Nuôi cấy trên môi trường agar 49 6.2.2 Bảo quản bằng dầu khoáng 49 6.2.3 Bảo quản trong nước vô trùng 50 6.2.4 Bảo quản đông khô 50 6.2.5 Bảo quản trong đất 50 6.2.6 Bảo quản bằng silica gel 50 6.2.7 Bảo quản trên giấy thấm 51 6.2.8 Bảo quản lạnh sâu 51 6.2.9 Bảo quản bằng nitơ lỏng 51 7 GIÁM ĐỊNH VI SINH VẬT GÂY HẠI 52 7.1 Nấm 52 7.1.1 Nấm gây bệnh trên rễ 53 7.1.2 Nấm gây bệnh trên thân 53 7.1.3 Nấm gây bệnh trên lá 54 7.1.4 Nấm gây bệnh trên quả và hạt 56 7.1.5 Nấm gỉ sắt 56 7.1.6 Nấm than đen 58 3
8. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 7.2 Vi khuẩn 59 7.3 Phytoplasma 61 7.4 Virus và viroid 61 7.4.1 Các loài virus và thông tin lưu giữ 62 7.4.2 Triệu chứng bệnh virus thực vật 63 7.5 Tuyến trùng 66 7.5.1 Những yêu cầu về giám định 67 7.5.2 Nhận dạng tuyến trùng ký sinh thực vật 67 7.5.3 Giám định đến loài 68 7.6 Các kỹ thuật phân loại 69 7.6.1 Kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy - SEM) 69 7.6.2 Kỹ thuật hóa sinh và phân tử 69 7.6.3 Huyết thanh (miễn dịch) 69 7.6.4 Kỹ thuật nucleic axit 70 8 QUẢN LÝ HỒ SƠ MẪU BỆNH 71 8.1 Hệ thống cơ sở dữ liệu (Database) 71 9 QUẢN LÝ BỘ SƯU TẬP MẪUU 73 9.1 Điều kiện phòng mẫu 73 9.2 Phòng trừ bộ cánh cứng hại tiêu bản mẫu 73 9.3 Phòng trừ nhện hại mẫu vi sinh vật 74 9.4 Cho mượn mẫu 75 9.5 Bảo đảm an toàn cho mẫu bệnh 76 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO CHỌN LỌC 78 4
9. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật DANH MỤC HÌNH Hình 1 Trang thiết bị cần thiết cho việc xây dựng một phòng tiêu bản và mẫu vi sinh vật 11 Hình 2 Nguồn thông tin giúp cho việc xây dựng danh mục dịch hại xếp theo thứ tự tin cậy 12 Hình 3 Ví dụ về danh mục dịch hại trên cây đu đủ 12 Hình 4 Thông tin cần thiết cho một hồ sơ dịch hại, được xây dựng dựa trên ISPM 8 14 Hình 5 Dụng cụ thường dùng để lấy mẫu bệnh 17 Hình 6 Lọ làm khô mẫu nghi ngờ nhiễm virus. 19 Hình 7 Ví dụ một nhãn lấy mẫu được sử dụng tại phòng lưu giữ mẫu bệnh BRIP 22 Hình 8 Mặt cắt nghiêng của buồng để mẫu nấm phân lập có ‘ánh sáng đen’ 33 Hình 9 Cách vạch phân lập vi khuẩn trên mặt agar. 35 Hình 10 Khay Whitehead dùng để tách tuyến trùng từ đất và cây 37 Hình 11 Dùng phễu Baermann để tách tuyến trùng từ đất và cây bệnh 37 Hình 12 Tách tuyến trùng từ mô bệnh bằng phương pháp phun sương 39 Hình 13 Ví dụ một nhãn dán trên gói tiêu bản sử dụng tại phòng tiêu bản BRIP 45 Hình 14 Các gói tiêu bản ở Bảo tàng mẫu bệnh Ustilaginales Vánky (HUV) và Bảo tàng bệnh cây của QDPI&F (BRIP) 48 Hình 15 Triệu chứng bệnh virus (từ trái qua phải): vòng biến mầu, đốm vòng và khảm lá 65 Hình 16 Hình thái mặt trước của một số nhóm tuyến trùng 68 Hình 17 Môđun Catalogue của KE EMu database 71 Hình 18 Địa chỉ Internet và trang chủ của hai database phân loại tin cậy 72 Hình 19 Vết bò của nhện trong các giọt nước đọng trên nắp đĩa Petri 75 DANH MỤC BẢNG Bảng 1 Một số triệu chứng bệnh thường gặp 16 5
10. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 1 MỞ ĐẦU Tầm quan trọng của việc lưu giữ tiêu bản sinh vật, bao gồm cả các mẫu thực vật bị bệnh và các vi sinh vật gây bệnh đã được nói đến trong hàng loạt bài báo trên các tạp chí khoa học. Trong một bài có nhan đề Trách nhiệm tương hỗ của phân loại nấm học và bệnh cây, Walker (1975) đã trích dẫn ít nhất 18 tài liệu tham khảo và chính tác giả trong đó đã nhấn mạnh tầm quan trọng của phân loại học trong sinh học ứng dụng cũng như tầm quan trọng của công tác phân loại nấm, bao gồm nấm học nói chung và bệnh cây nói riêng. Những bài báo này có ảnh hưởng tới việc trợ giúp phát triển các bảo tàng bệnh hại và phân loại học hay không? Câu trả lời có lẽ là “không”, lấy dẫn chứng từ thực tế ở Australia, hầu hết các bảo tàng mẫu bệnh ở Australia đều do các cơ quan của Chính quyền các bang tài trợ. Nguyên nhân tại sao chính phủ lại lưỡng lự trong việc đầu tư vào các bảo tàng (phòng) tiêu bản sinh học trong khi chúng là nền tảng cho những nghiên cứu về phân loại còn đang là vấn đề gây tranh cãi. Có lẽ vấn đề là ở chỗ những nhà phân loại học đã không chú ý đến nhu cầu của những người có khả năng sử dụng chúng nhiều nhà phân loại học thường không nghĩ đến nhu cầu và công việc của các nhà sinh học ứng dụng trong đó có các nhà bệnh cây, thậm chí một số còn có xu hướng tách mình ra khỏi những lĩnh vực nghiên cứu và thực hành sinh học rộng lớn hơn (Walker, 1975). Cùng với sự ra đời của Tổ chức thương mại thế giới năm 1995 và những điều luật của tổ chức này áp dụng cho hàng hóa nông nghiệp, tình trạng sức khỏe cây trồng đã trở thành một vấn đề chính trị thương mại lớn. Chịu áp lực từ nhiều thành phần khác nhau, các Quốc gia đang phải sử dụng các điều khoản của Hiệp định kiểm dịch động thực vật (Hiệp định SPS)1 để tối đa hóa lợi thế cạnh tranh – hay nói cách khác là để thúc đẩy mở cửa những thị trường trước đây đã bị đóng lại do những nghi ngờ về vấn đề kiểm dịch và loại trừ việc nhập khẩu những hàng hóa có nguy cơ ảnh hưởng xấu tới các ngành sản xuất nông nghiệp trong nước. Dựa trên những cơ sở khoa học và đánh giá nguy cơ dịch hại, Hiệp định SPS đưa ra điều kiện để bảo vệ các ngành sản xuất nông nghiệp trước sự xâm nhập của dịch hại2 từ ngoài vào, đồng thời tạo điều kiện cho sự phát triển của thương mại hóa nông sản. Hiệp định SPS cho phép các thành viên quản lý thương mại đối với hàng hóa nông nghiệp dựa trên tình trạng sức khỏe cây trồng và an toàn thực phẩm. Tuy nhiên các giới hạn đề ra phải rõ ràng và phải có bằng chứng kỹ thuật. 1.1 NHỮNG TRÁCH NHIỆM MANG TÍNH TOÀN CẦU Công ước Quốc tế về bảo vệ thực vật (IPPC) và Hiệp định SPS quy định: các nước xuất khẩu phải có trách nhiệm cung cấp cho các nước nhập khẩu một danh mục dịch hại có khả năng đi theo hàng xuất khẩu. Cụ thể như sau: ¾ IPPC quy định các nước có hàng hóa xuất khẩu phải cung cấp các thông số kỹ thuật và sinh học hợp lệ cần thiết cho việc đánh giá nguy cơ dịch hại để 1 Biện pháp kiểm dịch động thực vật (trong hiệp định SPS) là các tiêu chuẩn và quy định của một Quốc gia về các vấn đề như: sự lẫn tạp vi sinh vật, độc tố, kim loại nặng, tàn dư thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm, sinh vật hại, cỏ dại. 2 Định nghĩa ‘dịch hại’ được sử dụng để chỉ các động vật chân đốt, vi sinh vật và tuyến trùng gây hại cho thực vật và sản phẩm thực vật. 6
11. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật tạo điều kiện cho việc xác định những thông tin cụ thể về tình trạng dịch hại của một sản phẩm chuẩn bị xuất khẩu.3 4 ¾ Điều khoản 6.3 trong Hiệp định SPS ghi rõ ‘Nếu các thành viên có hàng hóa xuất khẩu tuyên bố rằng những khu vực trong lãnh thổ của họ là những khu vực không có hoặc ít sâu bệnh thì sẽ phải đưa ra các bằng chứng cần thiết để chứng minh một cách khách quan cho các thành viên nhập khẩu rằng khu vực đó không có hoặc ít sâu bệnh. Để thực hiện được điều này, các thành viên xuất khẩu sẽ phải tạo điều kiện cho các thành viên nhập khẩu thanh tra, kiểm tra hay thực hiện các thủ tục liên quan nếu họ yêu cầu’. ¾ Phụ lục B, mục 3(b) trong Hiệp định SPS ghi rõ ‘mỗi thành viên đều phải bảo đảm rằng mọi thắc mắc hợp lý mà các thành viên đối tác đưa ra đều phải được trả lời thỏa đáng và phải cung cấp cho đối tác các tài liệu liên quan đến: (b) các biện pháp phòng trừ, giám sát, xử lý sản xuất và kiểm dịch; khả năng kháng thuốc của dịch hại và các thủ tục được áp dụng trong lãnh thổ đó’. Để đáp ứng các quy định trên, để có thể thực hiện công tác đánh giá nguy cơ dịch hại và đưa ra các điều lệ về kiểm dịch thực vật với mục đích ngăn ngừa sự xâm nhập và lây lan của vi sinh vật gây hại, các nước cần phải duy trì công tác lưu trữ hồ sơ dịch hại. Theo Tiêu chuẩn Quốc tế về biện pháp kiểm dịch động thực vật (ISPM) số 85, ‘việc cung cấp hồ sơ dịch hại tin cậy và việc xác định tình trạng dịch hại là không thể thiếu trong hàng loạt các hoạt động được đề cập trong IPPC cũng như các nguyên tắc được đề cập trong ISPM số 1: Nguyên tắc kiểm dịch thực vật trong thương mại Quốc tế’. ISPM 8 ghi rõ: ‘Tất cả các nước đều có thể sử dụng các thông tin về tình trạng dịch hại cho các mục đích sau: ¾ Các mục đích đánh giá nguy cơ dịch hại; ¾ Lập kế hoạch cho các chương trình quản lý dịch hại trong phạm vi một quốc gia, trong khu vực hay trong phạm vi Quốc tế; ¾ Xây dựng các danh mục dịch hại của Quốc gia; ¾ Xây dựng và duy trì các khu vực sạch sâu bệnh’. Để phát huy hết quyền lợi trong tự do thương mại của WTO, các nước cần phải tuân thủ mọi điều kiện trong Hiệp định SPS do IPPC và WTO đề ra. Nếu như dịch vụ kiểm dịch thực vật nhằm mục đích đánh giá nguy cơ lây lan dịch hại trong hàng hóa thương mại thì việc xây dựng cơ sở hạ tầng tốt, làm nền tảng cho công tác bảo vệ thực vật là vô cùng cần thiết. 3 Công ước Bảo vệ thực vật Quốc tế, 1997: Điều VII: Hợp tác Quốc tế: 1. “Các tổ chức tham gia hợp đồng phải hợp tác chặt chẽ trong phạm vi có thể để thực hiện mục tiêu của Công ước, đặc biệt là c) hợp tác trong phạm vi có thể để cung cấp các thông tin kỹ thuật và sinh học cần thiết cho việc đánh giá nguy cơ dịch hại.” 4 ISPM 11, Đánh giá nguy cơ dịch hại đối với dịch hại kiểm dịch, 1.2 Thông tin: “Việc cung cấp thông tin chính thức liên quan đến tình trạng dịch hại là quy định bắt buộc theo IPPC (Điều VIII.1c) mà các đối tác phải thực hiện (Điều VIII.2).” 5 ISPM 8, Xác định tình trạng dịch hại trong một khu vực, IPPC, FAO, Tháng 11, 1998. 7
12. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 1.2 TÌNH TRẠNG LƯU GIỮ MẪU SINH HỌC Ở CÁC NƯỚC ASEAN Năm 2001-2002, Tổ chức hỗ trợ phát triển Quốc tế Australia (AusAID) đã tài trợ cho công việc bước đầu của chương trình với mục đích đánh giá lại tình trạng lưu giữ sinh vật hại và mẫu tiêu bản bệnh cây ở các nước trong khối ASEAN. Công việc này bắt nguồn từ một quyết định được thông qua tại cuộc họp lần thứ hai của Ủy ban điều hành Hội thiết lập và điều hành mạng lưới khu vực ASEAN (ASEANET6 LOOP) tổ chức năm 2000. Các đại biểu tại cuộc họp đã tán thành ý kiến về việc xây dựng báo cáo về các bảo tàng (phòng) lưu giữ sinh vật ở các nước thành viên. Tác giả của các bản báo cáo về tình trạng lưu giữ tiêu bản dịch hại ở các nước ASEAN đều nhận xét rằng trong phạm vi dù lớn hay nhỏ, không một nước nào trong khu vực có khả năng mô tả đầy đủ về tình trạng sức khỏe nền nông nghiệp của mình. Vấn đề là ở chỗ, trong phạm vi lớn hơn, số lượng tiêu bản bệnh cây trong các phòng mẫu bệnh trong khu vực quá nhỏ. Số lượng tiêu bản côn trùng trong các phòng lưu giữ tiêu bản lớn hơn nhiều so với số lượng tiêu bản bệnh cây. Các nhà côn trùng học nhìn chung cũng thông thạo với công việc bảo quản tiêu bản và quản lý mẫu hơn là các nhà bệnh cây. 1.3 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC LƯU GIỮ HỒ SƠ TIÊU BẢN Các nguồn thông tin về sự tồn tại của một sinh vật hại rất nhiều và sẵn có với độ tin cậy khác nhau. Tuy nhiên, trong phạm vi thương mại Quốc tế, hồ sơ lưu trữ dựa trên các tiêu bản được xác nhận trong các phòng mẫu đạt tiêu chuẩn là nguồn thông tin đáng tin cậy nhất về tình trạng sức khỏe thực vật của một nước. Hồ sơ dịch hại bao gồm mẫu tiêu bản và dữ liệu đi kèm tiêu bản gồm có: địa điểm lấy mẫu, ngày lấy mẫu, người lấy mẫu, ký chủ và đặc tính của vi sinh vật hại. Các phòng mẫu bệnh hoạt động tốt bao giờ cũng có rất nhiều mẫu khác nhau của cùng một loài từ các ký chủ khác nhau, từ các khu vực địa lý và sản xuất nông nghiệp khác nhau. Các mẫu tiêu bản có thể được kiểm tra lại để xác định lại kết quả giám định hoặc để có được các thông tin chính xác hơn về điều kiện lấy mẫu và về phân bố của bệnh. Mặt khác, các báo cáo được xuất bản (công bố) mà không có mẫu tiêu bản bệnh làm chứng đều không có giá trị và còn là một cản trở cho thương mại nông nghiệp. Các báo cáo không đúng sự thật sẽ có thể gây khó khăn, tốn thời gian và tiền của để bác bỏ yêu cầu của đối tác thương mại sau này. Tiêu bản và các mẫu vật khác trong phòng mẫu sinh học là vũ khí đắc lực trong việc trợ giúp tiếp cận thị trường và để giải thích cho việc thực hiện các biện pháp ngăn ngừa sự xâm nhập của sinh vật hại từ ngoài vào. 6 ASEANET là Hội thiết lập và điều hành mạng lưới BioNET Quốc tế trong khu vực Đông Nam Á, đây là một tổ chức hoạt động dựa trên sự hợp tác trong khu vực để tăng cường sự tự lực trong phân loại học sinh vật. 8
13. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 1.4 XÂY DỰNG VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG TÁC LƯU GIỮ MẪU BỆNH CÂY Ở CÁC NƯỚC ASEAN Nếu các nhà khoa học và những người công tác trong lĩnh vực bệnh cây hiểu được sự cần thiết phải gửi mẫu bệnh vào các phòng thí nghiệm được chỉ định thì việc xây dựng các phòng mẫu bệnh ở các nước Đông Nam Á sẽ dễ dàng hơn. Chính phủ Australia đã ưu tiên trợ giúp tổ chức các hội thảo nhỏ bao gồm các nhà bảo vệ thực vật để giải thích tầm quan trọng của việc lưu giữ mẫu sinh học trong mối liên quan với thương mại và vai trò của các nhà bảo vệ thực vật trong việc phát triển công tác này. Thêm vào đó, các chương trình đào tạo dành cho những người làm công tác bệnh cây cũng được tổ chức để bảo đảm rằng họ biết cách bảo quản mẫu và vận chuyển mẫu tới các phòng lưu giữ được chỉ định. Cuốn cẩm nang này chứa đựng những thông tin cần thiết để giúp cho tất cả những người làm công tác bệnh cây thực hiện trách nhiệm của họ trong việc xây dựng và phát triển bảo tàng Quốc gia về mẫu bệnh cây và mẫu vi sinh vật hại, cũng như cung cấp các tài liệu cần thiết cho những người quản lý bảo tàng. 9
14. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 2 LƯU GIỮ MẪU BỆNH HẠI THỰC VẬT 2.1 BẢO TÀNG MẪU Bảo tàng mẫu là nơi lưu giữ các mẫu tiêu bản sinh học đã chết, khô, được ép hoặc các mẫu thực vật và nấm đã được xử lý bảo quản dài hạn, tất cả các mẫu tiêu bản đều phải có thông tin đi kèm. Đa số bảo tàng mẫu sinh vật chỉ dành một phần nhỏ để lưu trữ tiêu bản nấm và bệnh cây trong khi chỉ một số ít bảo tàng mẫu chuyên lưu trữ nấm và bệnh cây. Thực tế các bảo tàng bệnh cây đều có chức năng như hai bảo tàng, đó là lưu trữ tiêu bản thực vật bị bệnh và lưu trữ vi sinh vật gây bệnh như nấm, vi khuẩn, virus, viroid, tuyến trùng, phytoplasma và vi sinh vật có dạng vi khuẩn ký sinh nội bào. Bảo tàng nấm và các thông tin được lưu trữ trong bảo tàng là đối tượng sử dụng của các nhà phân loại học, các nhà nấm học, các nhà bệnh cây, các nhà khoa học về bảo vệ thực vật, các cán bộ kiểm dịch, các nhà sưu tầm sinh vật và những người hoạch định chính sách trong rất nhiều lĩnh vực bao gồm cả việc duy trì an ninh sinh học và đa dạng sinh học. Tất cả các bảo tàng được chính thức công nhận trên thế giới đều có tên viết tắt, ví dụ Bảo tàng Bogoriense (BO) và bảo tàng CABI Bioscience, Trung tâm UK (IMI). Mỗi tiêu bản trong một bộ sưu tầm đều được đánh số thứ tự, đứng trước các số thứ tự là tên viết tắt của bảo tàng. Nếu biết số truy nhập của một tiêu bản ta có thể tìm ra nơi lưu giữ tiêu bản đó với sự trợ giúp của cuốn ‘Danh mục tra cứu các bảo tàng’ (Index Herbariorum). Cuốn sách chứa đựng thông tin về hơn 3.000 bảo tàng trên thế giới và hơn 9.000 nhân viên làm công tác lưu giữ trong các bảo tàng này. Danh mục tra cứu này có thể được truy cập qua mạng internet qua địa chỉ [ ] và các thông tin có thể được tìm kiếm từ các thông số như: tên cơ quan, tổ chức, tên viết tắt, tên nhân viên, chuyên ngành nghiên cứu. Cuốn danh mục tra cứu Index Herbariorum là kết quả của một dự án hợp tác giữa Hiệp hội phân loại thực vật Quốc tế và Vườn thực vật New York. 2.2 BỘ SƯU TẬP VI SINH VẬT Bộ sưu tập vi sinh vật sẽ lưu giữ các mẫu nấm và vi khuẩn còn sống ở trạng thái ổn định cho đến khi được sử dụng ở những lần sau. Có nhiều cách bảo quản mẫu vi sinh vật khác nhau từ cách liên tục cấy truyền cho tới những phương pháp làm giảm hoặc gián đoạn quá trình trao đổi chất. Hiệp hội lưu giữ mẫu vi sinh vật thế giới (WFCC) [www.wfcc.info] đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc lựa chọn, duy trì, mức độ chính xác và sự phân bố của các mẫu vi sinh vật cũng như mẫu tế bào sinh vật. Mục đích của liên đoàn là thúc đẩy và hỗ trợ việc xây dựng các bộ sưu tầm mẫu vi sinh vật và các dịch vụ có liên quan, là cầu nối thiết lập mạng thông tin giữa các trung tâm lưu giữ và những người sử dụng để bảo đảm sự tồn tại lâu dài của các trung tâm này. WFCC đã xây dựng một hệ thống dữ liệu mẫu vi sinh vật với phạm vi toàn cầu. Hệ thống cơ sở dữ liệu này được duy trì tại Viện di truyền Quốc gia ở Nhật Bản và lưu trữ thông tin của gần như 500 bộ sưu tập từ 62 nước khác nhau. Các thông tin được lưu giữ bao gồm tên các tổ chức, cách quản lý, dịch vụ và những dẫn liệu khoa học của các bộ sưu tập. Hệ thống cơ sở dữ liệu này đã hình thành một nguồn thông tin quan trọng cho tất cả 10
15. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật các hoạt động liên quan đến vi sinh vật và cũng đóng vai trò trung tâm cho các hoạt động về dữ liệu của các thành viên WFCC. 2.3 XÂY DỰNG BỘ MẪU BỆNH CÂY Các tiêu bản được lưu giữ trong bảo tàng mẫu và các bộ sưu tập vi sinh vật là hoàn toàn khác nhau. Bảo tàng mẫu lưu giữ các tiêu bản chết trong khi bộ sưu tập mẫu vi sinh vật lưu giữ các vi sinh vật còn sống. Các nhà bệnh cây cần phải làm việc với cả hai loại mẫu (mẫu cây đã chết và mẫu vi sinh vật còn sống). Thông thường mỗi bảo tàng bệnh cây đều có lưu giữ một bộ sưu tập vi sinh vật. Ở một số nơi, hai nhóm khác nhau hoạt động trong cùng một tổ chức hoặc thậm chí hai tổ chức khác nhau trong cùng một Quốc gia đảm trách hai bộ sưu tập riêng rẽ. Giải pháp lý tưởng nhất là ở bất cứ vùng nào hay một Quốc gia nào cũng nên có mối quan hệ chặt chẽ giữa bảo tàng mẫu bệnh và bộ sưu tập mẫu vi sinh vật gây bệnh. Những trang thiết bị cơ bản cần thiết cho một phòng mẫu tiêu bản và mẫu vi sinh vật hại được đưa ra ở Hình 1. Các trang thiết bị văn phòng có thể được dùng chung cho cả hai ví dụ như chương trình quản lý dữ liệu tiêu bản. Phòng mẫu tiêu bản — Phòng chống côn trùng chuyên dụng — Máy điều hòa không khí (20-23°C) — Máy hút ẩm (40-60%) — Giá, tủ giữ mẫu (kim loại) — Chuông báo cháy Thiết bị quản lý — Máy tính, máy in, máy quét ảnh — Phần mềm cơ sở dữ liệu — Kính hiển vi — Kính lúp soi nổi — Kính hiển vi điện tử quét — Máy ảnh kỹ thuật số (gắn được vào kính hiển vi) — Gói mẫu, nhãn, bản chú thích (giấy không có axit) — Thư viện điện tử, điện thoại, hộp thư — Tủ chứa đồ Phòng mẫu vi sinh vật — Buồng cấy vô trùng — Nồi hấp — Tủ lạnh — Tủ đá (lạnh sâu) — Tuýp giữ mẫu — Máy làm lạnh khô/Tủ chứa nitơ lỏng — Giá để Hình 1 Trang thiết bị cần thiết cho việc xây dựng một phòng tiêu bản và mẫu vi sinh vật 11
16. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 2.4 DANH MỤC DỊCH HẠI Danh mục dịch hại là tập hợp các sinh vật gây hại trên một ký chủ cụ thể tại một nước hoặc một khu vực nhất định. Ngoài những thông tin liên quan đến tình trạng sức khỏe cây nông nghiệp, cây lâm nghiệp, nguồn gốc (bản xứ hay du nhập), danh mục dịch hại có tầm quan trọng đặc biệt, nhất là đối với các nước đang tìm kiếm thị trường nước ngoài để xuất khẩu hàng hóa. Những danh mục dịch hại đáng tin cậy nhất là những danh mục đã được xác định và có mẫu tiêu bản đi kèm, những danh mục dịch hại được xây dựng trên cơ sở các báo cáo, tài liệu được xuất bản mà không có tiêu bản đi kèm được coi là không có độ tin cậy cao. Mức độ tin cậy còn phụ thuộc vào kỹ năng của người lấy mẫu và người giám định, phương pháp giám đinh và danh tiếng của tạp chí đăng tải. Những bài mà tác giả là các nhà phân loại học và được xuất bản trên các tạp chí chuyên ngành thế giới chắc chắn sẽ đáng tin cậy hơn các bài không được đăng trên các tạp chí chuyên ngành (Hình 2). Nguồn thông tin sắp xếp theo độ tin cậy 1. Bộ sưu tập dịch hại thuộc Bộ Nông nghiệp, các trường, viện nghiên cứu. 2. Tài liệu tham khảo chủ yếu: các tạp chí khoa học, các bài báo công bố các công trình nghiên cứu, sách, báo cáo kiểm dịch, báo cáo từ các cơ quan về sức khỏe thực vật và kiểm dịch thực vật. 3. Tài liệu tham khảo thứ yếu: trích yếu bảo vệ thực vật của CABI. 4. Tài liệu liên quan khác: cẩm nang, tài liệu hội thảo, đánh giá nguy cơ dịch hại. 5. Các nguồn thông tin: thảo luận với các chuyên gia trong và ngoài nước, các bài báo phổ thông, thông tin qua mạng (internet). Hình 2 Nguồn thông tin giúp cho việc xây dựng danh mục dịch hại xếp theo thứ tự tin cậy Các thông tin được đưa vào danh mục dịch hại phụ thuộc vào nhu cầu của người sử dụng. Những thông tin gì là cần thiết? Mục đích sử dụng thông tin? Hình 3 là ví dụ về một danh mục dịch hại bao gồm tên đầy đủ của các vi sinh vật gây bệnh trên 1 ký chủ và tên thường gọi của bệnh. CARICACEAE Carica papaya L. (đu đủ) Alternaria tenuis Nees – Đốm vỏ quả. Ascochyta caricae Pat. – Đốm đen. Botryosphaeria rhodina (Berk. & M.A. Curt.) Arx – Thối quả. Colletotrichum acutatum J.H. Simmonds – Thán thư trên quả. Corynespora cassiicola (Berk. & M.A. Curt.) C.T. Wei – Đốm lá. Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk – Đốm quả chín. Macrophomina phaseolina (Tassi.) Goid. – Thắt ngang thân. Phytophthora cinnamomi Rands – Thối rễ. Sclerotium rolfsii Sacc. – Chết rạp cây con. Thanatephorus cucumeris (A.B. Frank) Donk – Chết rạp cây con. Verticillium dahliae Kleb. – Chết héo. Hình 3 Ví dụ về danh mục dịch hại trên cây đu đủ 12
17. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Danh mục dịch hại được xây dựng từ các công tác: ¾ Quan sát; ¾ Lấy mẫu; ¾ Bảo quản mẫu trong điều kiện phù hợp; ¾ Điều tra có kế hoạch tất cả các nông sản và các khu vực có liên quan; ¾ Hợp tác với các tổ chức khác; ¾ Việc lưu giữ các bộ sưu tập phải đáp ứng các tiêu chuẩn Quốc tế về kiểm dịch thực vật (tiêu chuẩn 8) (ISPM 8). Từ xưa đến nay, việc xây dựng danh mục dịch hại thường gặp nhiều khó khăn do việc tiếp cận thông tin từ các phòng tiêu bản rải rác ở các cơ quan, tổ chức khác nhau trong đó có: ¾ Các Bộ Nông, Lâm nghiệp trực thuộc Quốc gia; ¾ Các bảo tàng lịch sử tự nhiên; ¾ Các viện nghiên cứu nông nghiệp chuyên ngành; ¾ Các nhà khoa học làm công tác nghiên cứu và các viện hàn lâm. Các thông tin lưu trữ trong các phòng tiêu bản bệnh cây có tầm quan trọng đặc biệt. Vì vậy, việc xây dựng hệ thống cơ sở dữ liệu điện tử để người sử dụng có thể truy cập dễ dàng là việc làm hết sức cần thiết. Hệ thống công nghệ thông tin hiện nay lại sẵn có, tạo điều kiện cho việc tìm tiêu bản và thông tin lưu trữ một cách nhanh chóng và thuận lợi. Chi phí cho phần mềm thấp, tuy nhiên chi phí cho việc nạp thông tin và dữ liệu lại tốn kém hơn. Việc nạp cơ sở dữ liệu là vấn đề khá phổ cập trong giai đoạn đầu của việc xây dựng hệ thống cơ sở dữ liệu, vì vậy các cơ quan làm công việc này đòi hỏi phải làm việc liên tục và cập nhật thông tin thường xuyên. Một vấn đề đáng lưu tâm nữa là số luợng và chất lượng của các thông tin cơ bản. Ở đa số các nơi, công việc giám định, phân loại chiếm phần lớn bao gồm việc kiểm tra lại các kết quả giám định và ghi chép trước đây cũng như giám định các mẫu gửi đến mà chưa được phân loại. Các nước cần phải thiết lập một hệ thống tiêu chuẩn dữ liệu tối thiểu cho các hồ sơ dịch hại để đáp ứng các tiêu chuẩn Quốc tế do IPPC (ISPM 8) đề ra. ISPM 8 liệt kê các thông tin cơ bản cần thiết để xây dựng một hồ sơ dịch hại (Hình 4). Hồ sơ dịch hại bao gồm những gì? 1. Tên khoa học của dịch hại (chi, loài, dưới loài) 2. Trạng thái hoặc giai đoạn của vòng đời 3. Nhóm phân loại 4. Phương pháp phân loại (bao gồm cả tên người phân loại) 5. Ngày lấy mẫu (bao gồm cả tên người lấy mẫu) 6. Thông tin chi tiết về nơi lấy mẫu a. Địa điểm (thành phố & bang, huyện, tỉnh) b. Nước c. Thông tin về GPS (kinh độ & vĩ độ) 7. Tên khoa học của ký chủ (chi, loài, dưới loài) 13
18. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 8. Tình trạng bị hại của ký chủ 9. Tình trạng phổ biến của bệnh 10. Tài liệu tham khảo Hình 4 Thông tin cần thiết cho một hồ sơ dịch hại, được xây dựng dựa trên ISPM 8 Hầu hết các nước không có trung tâm lớn lưu giữ các thông tin về tình trạng sức khỏe cây trồng bởi vì các phòng lưu giữ mẫu và hồ sơ dịch hại thường phân bố rải rác ở rất nhiều các cơ quan khác nhau. Điều này ảnh hưởng tới sự nhất quán của thông tin lưu giữ và chất lượng thông tin lưu giữ vì mỗi nơi có sự ưu tiên khác nhau đối với đối tượng lưu giữ. Cùng với sự phát triển gần đây về công nghệ thông tin, chúng ta có thể khắc phục được tình trạng tồn tại này. Công nghệ lưu trữ cơ sở dữ liệu bằng hệ thống máy tính tạo điều kiện cho các hệ thống quản lý dữ liệu ở các địa điểm xa nhau có thể nối kết được với nhau, vì vậy mà tất cả các điểm đều có thể truy cập được hệ thống mạng cơ sở dữ liệu. Có thể nói rằng sự phát triển của công nghệ đã giúp cho việc xây dựng một hệ thống cơ sở dữ liệu duy nhất ở cấp Quốc gia hoặc cấp khu vực, thông qua hệ thống này thông tin có thể được cập nhật thường xuyên ở cấp cơ sở. Hồ sơ bệnh hại được tiếp cận thông qua một trang chủ trên hệ thống internet và một số thông tin chỉ những người liên quan mới có thể truy cập được (thông qua mã khóa bảo vệ). Thông qua hệ thống này, người sử dụng có thể cung cấp các thông tin liên quan đến danh mục loài, phân bố và ký chủ. Một hệ thống cơ sở dữ liệu có khả năng thu thập và tổng hợp dữ liệu về sức khỏe cây trồng từ rất nhiều tổ chức khác nhau với điều kiện là: ¾ Các cơ quan làm công tác lưu giữ mẫu sinh vật hại phải lưu giữ hồ sơ mẫu bệnh trong các hệ thống cơ sở dữ liệu điện tử kết nối với mạng internet.; ¾ Có khả năng phát triển và điều chỉnh các 'gateway' (cổng) hoặc 'broker' chuyên dụng mà các phần mềm cần để kết nối với các nguồn thông tin cơ sở dữ liệu khác nhau; ¾ Các cơ quan phải sẵn lòng chia sẻ thông tin và cam kết duy trì phòng lưu giữ của họ như một thành viên của hệ thống mạng dữ liệu (bao gồm cả việc đáp ứng các tiêu chuẩn Quốc tế). 14
19. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 3 XÂY DỰNG BỘ SƯU TẬP MẪU BỆNH 3.1 NGUỒN MẪU Nguồn tiêu bản chủ yếu trong các phòng mẫu bệnh cây được cung cấp bởi các nhà bảo vệ thực vật làm việc tại các phòng thí nghiệm chẩn đoán bệnh hại thuộc các viện và các cơ quan nghiên cứu trực thuộc Bộ. Các mẫu bệnh, sau khi được thu thập từ các cuộc điều tra ngoài đồng, thường được đưa đến các phòng thí nghiệm giám định. Tại đây, các nhà khoa học sẽ xem xét có nên lưu lại những mẫu bệnh này hay không. Bất cứ mẫu bệnh nào đại diện cho 1 vi sinh vật lần đầu tiên được phát hiện tại một địa điểm mới hay trên một ký chủ mới đều phải được gửi đến một trong các phòng lưu giữ mẫu bệnh có uy tín. Đa số phòng lưu giữ mẫu bệnh đều có đội ngũ nhân viên có thể xác định được các nhóm vi sinh vật hại khác nhau. Cán bộ và sinh viên tại các trường đại học và các cơ quan nghiên cứu cũng là những người thường cung cấp mẫu cho các phòng lưu giữ mẫu bệnh cây. Hơn nữa, tất cả các công trình nghiên cứu khi được xuất bản trên các tạp chí, sách đều phải liệt kê ít nhất tên một phòng lưu giữ mẫu bệnh nơi họ gửi mẫu đến. Những mẫu tiêu bản này được sử dụng để kiểm tra và nhận dạng các vi sinh vật hại thu thập từ các cuộc điều tra và các công trình nghiên cứu về sinh thái, dịch hại, di truyền tiến hóa, hình thái, phân tử. Ngoài ra, số lượng mẫu cũng được tăng thêm khi được cấy truyền và làm khô để trao đổi giữa các phòng lưu giữ mẫu. Việc tặng, biếu, mua bán mẫu cũng là một hình thức làm tăng số lượng mẫu trong một phòng lưu giữ mẫu. Sự chuyển nhượng sở hữu giữa các phòng lưu giữ mẫu do không đủ khả năng duy trì cũng là một việc đáng khích lệ để bảo vệ các bộ sưu tập mẫu bệnh có giá trị. 3.2 THU THẬP MẪU BỆNH NGOÀI ĐỒNG RUỘNG Hầu hết các mẫu tiêu bản trong một phòng lưu giữ vi sinh vật hại đều được thu thập từ đồng ruộng hoặc môi trường ngoài tự nhiên. Các cây bệnh đều được xác định nhờ các triệu chứng và dấu hiệu đặc trưng. Triệu chứng là những thay đổi bên ngoài của cây hoặc các bộ phận của cây bị nhiễm bệnh mà mắt thường có thể nhìn thấy được (Bảng 1). Triệu chứng xuất hiện do thực vật bị suy giảm khả năng quang hợp, sinh sản, hút nước hoặc trao đổi chất. Triệu chứng Mô tả Thán thư Vết hoại sinh màu đen do Colletotrichum gây ra Muội đen Các tản nấm ký sinh đen và dày đặc(Meliolales), thường xuất hiện trên bề mặt lá cây nhiệt đới. Chết lụi Mô bệnh bị chết, lan rộng rất nhanh. Loét Vết hoại sinh, thường lõm xuống trên thân gỗ, cành hoặc rễ. Chết rạp cây con Cây con bị gãy và thối ở điểm tiếp giáp với mặt đất trước hoặc ngay 15
20. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Triệu chứng Mô tả sau khi nảy mầm do nấm Pythium hoặc Rhizoctonia gây ra. Khô cành Rụng lá, chết cành thậm chí chết toàn bộ cây Sương mai Phấn màu hơi trắng xuất hiện trên bề mặt lá và thân cây do sự xuất hiện của bọc bào tử và bào tử động của các loài thuộc bộ Peronosporales. Biến dạng lá, hoa Hiện tượng mô cây chủ sinh trưởng nhanh và không bình thường, kéo dài từ gân, đặc biệt là trên lá và hoa Biến dạng chồi Chồi bị phân ly thành từng bó chồi nhỏ cong hoặc xoăn. Nốt sưng Hiện tượng sưng lên hoặc tạo thành u không bình thường Chảy gôm Chảy nhựa từ mô ký chủ. Vết đốm Các vết thương hoặc mô bệnh xác định. Khảm Sự biến đổi màu sắc từng khoảng xanh đậm, nhạt trên lá. Đây là triệu chứng của rất nhiều bệnh do virus gây ra. Hóa lá Hoa biến tính thành dạng cấu trúc giống như lá. Phấn trắng Hiện tượng các sợi nấm, cành bào tử phân sinh và bào tử phân sinh xuất hiện trên bề mặt cây có dạng bột màu trắng, nấm phấn trắng thuộc bộ Erysiphales. Mụn sùi Các bọc mọng nước, khi vỡ giải phóng ra nấm. Nốt sưng Các nốt sưng xuất hiện ở rễ do những loài tuyến trùng nhất định (Meloidogyne) gây nên. Thối Mô thực vật bị mềm và phân rã do enzyme của vi sinh vật hại sản sinh ra (có thể cứng, mềm, khô, ướt, đen hoặc trắng). Gỉ sắt Các khối bào tử do nấm gỉ sắt thuộc bộ Uredinales sản sinh ra. Sẹo Khu vực bị bệnh sần sùi, thô ráp, giống như có một lớp vỏ cứng. Vết bỏng Mô trông giống như bị giội nước nóng. Thủng lá Triệu chứng bệnh trên lá, các mô giữa vết bệnh rơi rụng tạo thành những lỗ hổng trên lá cây. Các khối bào tử trên lá, trên thân và hoa do nấm than đen Than đen (Ustilaginomycetes) gây ra. Mốc đen Các đám mầu đen trên lá và thân của nấm hoại sinh bề mặt (thường là Capnodiales) sống nhờ các chất tiết ra từ côn trùng (thường là rệp). Lục hóa Các bộ phận của cây bị biến đổi thành màu xanh, đặc biệt là hoa. Héo Hiện tượng cây mất tính trương, các bộ phận của cây rũ xuống. Chổi rồng Sự phân ly mạnh của chồi và mầm rất gần nhau hoặc tại cùng một điểm. Bảng 1 Một số triệu chứng bệnh thường gặp 16
21. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Dấu hiệu của bệnh là sự có mặt của các vi sinh vật dưới các dạng khác nhau, ví dụ như dạng quả thể mà mắt thường có thể nhìn thấy được. Một số dấu hiệu thường thấy của bệnh như sau: • Đĩa cành, cành bào tử phân sinh, quả cành: các cấu trúc nấm nhỏ dạng quả thể sản sinh ra bào tử. • Đảm: dạng quả thể của nấm đảm (nấm rỗ hoặc nấm mũ); • Thể sợi nấm: khối sợi nấm; • Dịch tiết: dịch lỏng và dính tiết ra từ vết thương hoặc các lỗ tự nhiên (khí khổng, bì khổng); • Sợi nấm dạng rễ: các sợi nấm tập hợp bó lại giống như sợi dây (thường có màu tối). 3.3 THU THẬP VÀ XỬ LÝ MẪU BỆNH Việc lựa chọn mẫu bệnh cho dù với mục đích giám định hay nghiên cứu về phân loại học đều phải hết sức cẩn thận. Thời điểm thu mẫu cây bệnh thích hợp nhất là ở giai đoạn đầu hoặc giữa của bệnh, khi vi sinh vật hại vẫn đang ở trạng thái hoạt động. Những mẫu bệnh bị nhiễm quá nặng thường không sử dụng được vì ở giai đoạn này vi sinh vật hại có thể không hoạt động nữa, thay vào đó là các vi sinh vật hoại sinh xâm nhập vào các các mô bệnh đã chết hoại. Vì vậy, phân lập vi sinh vật hại từ các mẫu bệnh ở giai đoạn này thường rất khó. Việc lựa chọn vị trí lấy mẫu trên cây bệnh cũng rất quan trọng. Người thu thập mẫu bệnh cần phải có kiến thức cơ bản về triệu chứng bệnh và nguyên nhân gây bệnh để bảo đảm rằng mẫu lấy được có vi sinh vật hại. Trong một số trường hợp, triệu chứng có thể xuất hiện ở vị trí này của cây nhưng vi sinh vật hại thì có thể được tìm thấy ở vị trí khác. Ví dụ như bệnh héo: triệu chứng thường xuất hiện đầu tiên trên lá trong khi vi sinh vật gây bệnh lại ký sinh trong hệ thống mạch dẫn của rễ và thân. Một danh mục các dụng cụ cần thiết cho điều tra thu thập mẫu bệnh được trình bày ở hình 5. Dụng cụ Kéo cắt cây Cặp ép mẫu Giấy báo Nhãn Kính lúp cầm tay Bay, xẻng nhỏ Túi giấy Túi nilon Kéo Bút dạ Phong bì Bút chì GPS Cưa tay Dao Thùng đá Bản đồ Tài liệu tham khảo Hình 5 Dụng cụ thường dùng để lấy mẫu bệnh Một số nguyên tắc cần tuân theo khi thu thập và xử lý mẫu bệnh: • Nhận dạng cây ký chủ. Nếu chưa xác định được tên cây ký chủ thì phải lấy mẫu cây khỏe, đặc biệt là hoa và quả. Người lấy mẫu phải bảo đảm rằng mẫu cây khỏe lấy về chính là cây ký chủ. Điều này đặc biệt quan trọng khi lấy mẫu bệnh than đen và một số bệnh phá hủy hoa của một số loài trong họ Hòa 17
22. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật thảo vì những bệnh này thường phát triển trên những tập đoàn ký chủ khác nhau. • Sử dụng túi giấy để lấy giữ mẫu bệnh. Không bao giờ sử dụng túi nilon để giữ mẫu tươi vì mẫu vẫn có thể hô hấp, làm ẩm túi tạo điều kiện cho vi sinh vật hoại sinh xâm nhập và phát triển nhanh, phá hủy các mô thực vật. Túi nilon chỉ có thể được sử dụng để giữ các mẫu ướt trong thời gian ngắn. • Đóng, gói mẫu cẩn thận để tránh va đập và hơi nước ngưng tụ. Bề mặt ẩm sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoại sinh phát triển, khiến cho mẫu bệnh không thể sử dụng được. • Sử dụng bút chì để viết nhãn (mực sẽ không thích hợp vì có thể bị nhòe khi ẩm ướt). • Xin các giấy phép cần thiết để thu thập và vận chuyển mẫu bệnh. Ở một số khu vực việc lấy mẫu sinh vật có thể bị hạn chế, ví dụ như ở các vườn Quốc gia hoặc ở các khu vực do tư nhân quản lý. Việc vận chuyển mẫu từ nước này sang nước khác có thể phải cần đến giấy phép xuất nhập khẩu và giấy phép kiểm dịch. 3.3.1 Đối với lá, thân và quả Nên lấy mẫu lá có bề mặt khô ráo, nếu trong điều kiện mưa ẩm, bề mặt lá ướt thì có thể dùng giấy báo thấm khô trước khi kẹp mẫu giữa các lớp giấy báo hoặc các loại giấy thấm nước khác (không nên sử dụng giấy ăn vì khi ướt giấy ăn có thể tan rã ra và khó tách chúng ra khỏi mẫu lá). Khi ép và làm khô mẫu lá, cần chú ý rải lá ra sao cho không trùng lên nhau. Nếu lá dày và mọng nước, cần thay giấy báo hàng ngày cho đến khi lá khô hẳn. Khi lấy mẫu thân cây bị bệnh cần lấy ở vị trí bao gồm cả mô khỏe và mô bệnh. Gói cẩn thận mỗi thân bệnh vào một tờ báo vì chúng rất dễ bị xây sát hoặc gãy khi được gói thành một bó chung. Khi lấy mẫu quả mọng nước, thịt quả nhiều cần chọn những mẫu mới xuất hiện triệu chứng hoặc triệu chứng đang ở giai đoạn giữa của sự phát triển. Các vi sinh vật gây thối thứ yếu và hoại sinh thường xâm nhập quả ở giai đoạn cuối của sự phát triển bệnh, gây cản trở cho việc giám định vi sinh vật gây bệnh. Gói mỗi quả bệnh vào một tờ giấy báo riêng rẽ. Không dùng túi nilon để gói mẫu quả. Bệnh gỉ sắt và nấm than đen Khi lấy mẫu nấm gỉ sắt cần kiểm tra cả 2 mặt lá để tìm bào tử đông mầu nâu đen và bào tử hạ màu vàng da cam. Nấm than đen thường phá hủy các bộ phận hoa của các loài trong họ Hòa thảo. Xác định đúng tên ký chủ là điều kiện cần thiết để giúp cho việc giám định nấm than đen, tuy nhiên việc xác định tên ký chủ đôi khi gặp khó khăn nếu hệ hoa bị phá hủy. Cần chú ý gói mẫu bệnh bằng giấy báo cẩn thận để bào tử nấm gỉ sắt và nấm than đen không bị rơi ra ngoài. Bệnh vi khuẩn Mô bệnh vi khuẩn thường bị phân rã rất nhanh, vì vậy khó thu thập và vận chuyển mẫu bệnh tới phòng thí nghiệm ở xa. Đặt mẫu bệnh vào túi giấy và dùng giấy báo ẩm 18
23. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật bọc lại để tránh cho mẫu khỏi bị khô. Nên giữ mẫu ở nơi mát mẻ, tránh ánh nắng mặt trời. Đối với mẫu đốm lá và tàn lụi do vi khuẩn, nên dùng giấy báo ép lại cho khô để lưu giữ. Nhiều vi khuẩn gây bệnh có thể sống sót hàng tháng, thậm chí hàng năm trong các mẫu khô ở nhiệt độ phòng. Bệnh virus Mẫu bệnh cây nghi ngờ nhiễm virus sau khi thu thập nên bảo quản tạm thời trong các lọ làm khô (Hình 6). Lọ làm khô có thể được làm bằng cách lấy một lọ nhựa, đổ tinh thể Clorua Canxi (CaCl2) khan vào đến 1/3 lọ, dùng bông phủ lên ngăn cách giữa các tinh thể Clorua Canxi và mẫu bệnh. Cách bảo quản mẫu này tốt nhất ở nhiệt độ 0–4oC, tuy nhiên cũng có thể áp dụng ở nhiệt độ môi trường. Dùng kéo hoặc lưỡi dao để cắt lá. Nếu lá bị bụi bẩn hoặc côn trùng bám vào, có thể dùng nước hoặc cồn lau sạch trước khi cắt. Cắt lá thành từng mẩu nhỏ 3 - 5 mm, nên lấy ở gần phần giữa của phiến lá, sau đó đặt 5 - 10 mẩu lá vào một lọ làm khô. Lưỡi kéo hoặc dao phải được khử trùng bằng cồn hoặc dung dịch sodium hypochlorite (NaOCl) 10% giữa các mẫu khác nhau để tránh bị tạp. Ngoài cách xử lý mẫu như trên, có thể giữ mẫu bệnh virus trong túi nilon cùng với một ít giấy ẩm và giữ trong thùng đá cho đến khi đưa đến phòng thí nghiệm. Bằng cách này, lá cây vẫn tươi, giữ được sức trương cần thiết. nắp vặn bằng nhựa mẩu lá (3-5 mm) bông Tinh thể canxi clorua Hình 6 Lọ làm khô mẫu nghi ngờ nhiễm virus. 3.3.2 Đối với rễ và đất Thông thường các mô rễ hay các cấu trúc vi sinh vật hại ở vùng rễ thường rất mỏng manh. Không nên nhổ cây vì có thể làm đứt rễ, không lấy được phần rễ hay vi sinh vật hại, gây khó khăn cho việc giám định. 19
24. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Lắc nhẹ để loại bỏ phần đất bám vào rễ, nếu có thể nên rửa rễ nhẹ nhàng (trong trường hợp định kiểm tra tuyến trùng thì không nên rửa). Trong đất có rất nhiều vi sinh vật hoại sinh xâm nhập vào các phần rễ đã chết hoặc đang chết, cản trở việc phân lập vi sinh vật gây bệnh. Khi loại bỏ đất khỏi rễ, không dùng bàn chải hoặc các vật dụng tương tự vì có thể làm mất các phần rễ quan trọng cho việc giám định. Bọc rễ trong giấy báo để vận chuyển đến phòng thí nghiệm. Nên lấy mẫu đất đủ dùng cho việc phân tích rõ hơn về bệnh sau này. Tuy nhiên, hạn chế chủ yếu của việc lấy mẫu đất là chúng có thể khá nặng và cồng kềnh trong trường hợp điều tra lấy mẫu ở nhiều điểm. Khi xem xét có nên lấy mẫu đất hay không cũng nên tính đến thời gian và không gian cần thiết cho việc xử lý mẫu đất sau khi đem về. Các vi sinh vật hại trong đất thường không phân bố đồng đều mà có xu hướng tập hợp thành từng nhóm trong điều kiện thích hợp hoặc xung quanh điểm xâm nhiễm trên cây ký chủ. Cách tốt nhất là nên lấy ngẫu nhiên một số mẫu đất. Kinh nghiệm cho thấy rằng mẫu thu thập được càng nhiều thì việc đánh giá tổng quan về bệnh càng chính xác. Số lượng mẫu đất lấy ở từng điểm điều tra có thể khác nhau phụ thuộc vào điều kiện thực tế. Cách làm thông thường là ghi lại số lượng mẫu lấy, sau đó trộn lẫn vào nhau một cách kỹ lưỡng rồi từ đó lấy mẫu đại diện. Nếu lấy mẫu bệnh tuyến trùng, cần cẩn thận để khỏi va đập làm trầy xước tuyến trùng nằm trong đất. Không nên lấy mẫu đất quá ướt hoặc quá khô. Đất lấy mẫu nên ở độ sâu ít nhất 5-10cm so với mặt đất vì đây là vùng rễ cây nên vi sinh vật hại tập trung nhiều nhất. Nếu triệu chứng bệnh tập trung thành từng đám trên khoảnh ruộng thì nên lấy 2 mẫu đất riêng rẽ trên đám ruộng bị nhiễm nặng và đám ruộng không thể hiện triệu chứng để có thể so sánh. Mỗi mẫu đất nên lấy khoảng 250-300 g. Nếu có thể nên lấy mẫu đất có chứa cả rễ cây, rễ có thể để lẫn trong đất hoặc để riêng. Đối với cây thân thảo, lấy khoảng 25-100 g rễ là đủ tùy thuộc vào loại cây, ví dụ đối với rau có thể lấy ít rễ (khoảng 25 g) trong khi đối với các loại cây có rễ to như chuối thì nên lấy nhiều hơn (khoảng 100 g). Đối với cây thân gỗ có thể phải đào sâu tới 30 cm gần gốc cây hoặc đào đến khi nhìn thấy đường ranh giới giữa mô khỏe và mô bệnh. Mẫu đất nên giữ trong túi nilon và đặt nhãn giấy hoặc nhựa vào bên trong túi (ghi nhãn bằng bút chì nếu dùng nhãn giấy). Nên để mẫu nơi mát mẻ, tránh ánh nắng mặt trời. Giữ mẫu cẩn thận, gửi mẫu phân tích hoặc xử lý mẫu càng sớm càng tốt. Nếu điều kiện không thể gửi mẫu đi hoặc xử lý mẫu ngay thì nên bảo quản mẫu trong tủ lạnh tại 4 - 8 °C trong vài ngày mà không sợ mẫu bị hỏng. 3.3.3 Đối với nấm lớn Nấm lớn, đặc biệt là các loài thuộc bộ Agaricales rất dễ tìm khi điều tra nhưng lại là một trong những nhóm khó vận chuyển đến phòng thí nghiệm nhất. Vì vậy, nên chú ý lấy một số mẫu ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của nấm. Không nên lấy mẫu nấm bằng cách nhổ lên, tránh làm gẫy thân nấm khi lấy mẫu. Dùng dụng cụ đào 20
25. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật nấm để không làm hỏng phần gốc. Nên dùng giấy báo bọc từng cá thể riêng rẽ và đặt cẩn thận trong các hộp đựng sao cho nấm không bị nát. Mẫu nấm lớn cần phải được làm khô càng nhanh càng tốt. Tùy từng trường hợp cụ thể có thể áp dụng một trong các cách sau: ¾ Sấy trong tủ sấy có quạt thông gió (45°C, qua đêm); ¾ Dùng máy sấy quả bằng điện; ¾ Dùng các nguồn năng lượng khác như: than củi, bếp ga, đèn dầu, dưới ánh nắng mặt trời. Việc lấy dấu vết bào tử, đặc biệt là mầu của chúng, có thể trợ giúp rất nhiều cho việc giám định, nhất là đối với các loài nấm lớn có bản mũ nấm (vách tia). Cách lấy dấu vết bào tử như sau: cắt lấy phần mũ nấm và đặt lên một tấm bìa màu trắng trong 15 phút đến một vài giờ (chú ý để mặt có bản mũ nấm ở dưới). Đặt một chiếc hộp không (đáy lên trên) sao cho luồng không khí bên ngoài không ảnh hưởng đến các dấu vết bào tử. Nếu nấm có bào tử mầu trắng thì nên sử dụng bìa mầu đen. Mầu của bào tử cũng có thể được xác định từ các dấu vết bào tử, và ngược lại, nhờ có mầu bào tử, dấu vết bào tử cũng hiện lên rõ hơn trên nền bìa. 3.4 CÁCH GHI PHIẾU ĐIỀU TRA MẪU BỆNH Những mẫu bệnh dù tốt đến mấy nhưng không ghi phiếu điều tra đầy đủ thì cũng coi như không có giá trị. Các thông số cần thiết phải ghi lại trên nhãn đi kèm mẫu bệnh bao gồm: ¾ Tên cây ký chủ và bộ phận cây bị nhiễm bệnh; ¾ Địa điểm chính xác nơi lấy mẫu, xã, thị xã/thị trấn, huyện, tỉnh, quốc gia (kinh độ/vĩ độ và độ cao nếu biết). Máy định vị vệ tinh (GPS) là phương tiện tốt nhất để xác định tọa độ. GPS có thể tìm kiếm các vệ tinh quay quanh quỹ đạo trái đất. Với 3 vệ tinh, GPS có thể tính toán chính xác kinh độ và vĩ độ. Với 4 vệ tinh, GPS có thể tính được độ cao so với mặt biển. GPS xác định được tọa độ, vì vậy giúp cho việc xây dựng bản đồ phân bố của vi sinh vật hại; ¾ Ngày lấy mẫu; ¾ Tên người lấy mẫu, đánh số mẫu; ¾ Triệu chứng bệnh và mức độ bệnh (ví dụ số cây bị nhiễm bệnh). Tất cả các mẫu bệnh chuyển đến phòng mẫu đều phải ghi nhãn đầy đủ (Hình 7). Tên và địa chỉ liên lạc của người đưa mẫu cũng phải ghi lại. Giải thích lý do tại sao đưa mẫu đến, ví dụ với mục đích giám định hoặc lưu giữ. 21
26. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Hình 7 Ví dụ một nhãn lấy mẫu được sử dụng tại phòng lưu giữ mẫu bệnh BRIP 3.5 ĐIỀU TRA VÀ LẤY MẪU Mục đích của các cuộc điều tra là xác định loại bệnh và mức độ gây hại của bệnh đến cây chủ. Điều tra bệnh cần thiết cho việc: ¾ Xác định phạm vi phân bố và tình trạng dịch hại trong một khu vực. Trước khi tham gia cung cấp hàng hóa cho các thị trường và xuất khẩu, những khu vực này phải được xác định xem có bệnh hại thuộc đối tượng kiểm dịch hay không; ¾ Xác định các bệnh quan trọng và hướng dẫn cách quản lý dịch hại để giúp cho định hướng công tác bảo vệ thực vật; ¾ Phát hiện các bệnh ngoại lai và các bệnh mới xuất hiện; ¾ Đánh giá thiệt hại do bệnh và xác định tình trạng sức khỏe cây trồng; ¾ Hiểu biết về đa dạng dịch hại; ¾ Xác định ký chủ chính; ¾ Đánh giá hiệu quả của các biện pháp phòng trừ; ¾ Xây dựng báo cáo về tình trạng dịch hại hiện tại và đối chiếu với thiệt hại về kinh tế; ¾ Phát hiện thiên địch tự nhiên. Có hai dạng điều tra: điều tra định tính và điều tra điều tra định lượng. Điều tra định tính chỉ cần xác định xem một bệnh hại nào đó có xuất hiện hay không. Điều tra định 22
27. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật lượng xác định cả tỷ lệ bệnh và chỉ số bệnh liên quan đến mức độ thiệt hại cho cây ký chủ. Điều tra phải chọn điểm đại diện cho khu vực và đủ lớn để bảo đảm mức độ chính xác. Phụ thuộc vào mục đích điều tra để chuẩn bị thiết bị, dụng cụ cũng như kỹ năng điều tra. Lượng thông tin thu thập và mức độ chính xác cũng phụ thuộc vào phạm vi điều tra. Quy cách lấy mẫu cũng nên đơn giản, mang tính đại diện và bảo đảm độ tin cậy. Dựa vào các cuộc khảo sát sơ bộ trước khi tiến hành điều tra có thể giúp cho việc ước lượng trước số lượng mẫu lấy và ước tính mức độ bệnh hại với các số lượng mẫu lấy khác nhau. Từ việc so sánh các kết quả thu được trong các lần khảo sát, có thể lựa chọn số lượng mẫu lấy tối thiểu mà vẫn cho kết quả tin cậy về mức độ nhiễm bệnh. Một điều quan trọng nên lưu ý là dù áp dụng phương pháp điều tra nào cũng nên tính đến sự phân bố của bệnh. Cây bị bệnh có thể phân bố rải rác, đồng đều hoặc thành từng cụm. Lấy mẫu theo phương pháp ngẫu nhiên thường cho kết quả tốt bởi vì rất nhiều bệnh phân bố thành từng cụm. Trong một số trường hợp, có thể phải điều tra với quy mô lớn hơn và hệ thống hơn. Đối với các cuộc điều tra cụ thể, cần phải thu thập thêm thông tin để lên kế hoạch điều tra đạt hiệu quả cao nhất. Các yếu tố cần tính đến là thời gian tiến hành điều tra, giai đoạn sinh trưởng nào của cây trồng là thích hợp nhất cho việc thể hiện triệu chứng bệnh. Để biết thêm thông tin về cách tiến hành điều tra trong khu vực Châu Á Thái Bình Dương, có thể liên lạc với TS. Teresa McMaugh7 tại Văn phòng chuyên viên bảo vệ thực vật cao cấp (OCPPO), Bộ Nông nghiệp, Thủy sản và Lâm nghiệp Australia (DAFF). 7 TS. McMaugh đang điều hành việc xuất bản một cuốn cẩm nang về điều tra dịch hại ở Châu Á Thái Bình Dương (Guidelines for Plant Pest Surveillance in Asia and the Pacific), do Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Quốc tế Australia (ACIAR) và Tổ chức nghiên cứu và phát triển nông thôn (RIRDC) tài trợ. 23
28. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 4 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA MẪU BỆNH Việc giám định mẫu phải bắt đầu từ các đặc tính vĩ mô mà mắt thường có thể nhìn thấy được và kiểm tra dưới kính lúp soi nổi. Bước tiếp theo là dùng lam kính và kiểm tra cấu trúc của vi sinh vật hại dưới kính hiển vi quang học. Nếu người giám định chưa biết vi sinh vật này thì nên đo kích thước, vẽ hình và chụp ảnh vi sinh vật nếu có thể. Nên lưu giữ những ghi chép, hình vẽ và ảnh ban đầu cùng với tiêu bản bệnh. 4.1 NHUỘM MÀU NẤM VÀ VI KHUẨN Hầu hết nấm và vi khuẩn có thể quan sát được dưới kính hiển vi bằng cách đặt lên lam kính, nhỏ một giọt nước và dùng lamen phủ lên. Có thể sử dụng axit lactic làm môi trường cố định nấm. Việc nhuộm màu thường áp dụng đối với các cấu trúc nấm không màu sắc. Hai hóa chất nhuộm màu thường dùng cho nấm là thuốc nhuộm bông xanh (cotton blue) và lacto-fuchsin. Cotton blue (hay trypan blue) Cotton blue (trypan blue) 0,1 g Axit lactic 25 ml Glycerol 50 ml Nước cất 25 ml Lacto-fuchsin Acid-fuchsin 0,1 g Axit lactic 100 ml Việc quan sát vi khuẩn trong mô cây bệnh thường rất khó. Có thể dùng dung dịch Toluidine blue O 0,1% để nhuộm màu vi khuẩn. Cắt một mẩu nhỏ mẫu bệnh phần giữa mô khỏe và mô bệnh, đặt lên một lam kính và nhỏ một giọt chất nhuộm màu. Đặt lamen lên trên và quan sát với độ phóng đại 400 lần. Vi khuẩn (nếu có) thường di chuyển xung quanh phần mô cắt ở mép ngoài mẫu bệnh. Vi khuẩn được nhuộm thường có màu xanh nước biển đậm, mô cây màu nhạt hơn và hơi pha màu xanh lá cây. Toluidine blue O Toluidine blue O 0,05 g Nước cất 50 ml Vi khuẩn được phân làm hai nhóm chính: Nhóm có khả năng duy trì phức hợp của thuốc nhuộm crystal violet và iốt mà không bị hòa tan trong cồn ethanol (Gram dương) và nhóm không thể duy trì phức hợp này (Gram dương). Nhuộm màu Gram giúp cho việc giám định các đặc tính ban đầu của nhiều vi khuẩn gây bệnh cây. Hóa chất và phương pháp nhuộm màu Gram như sau: 24
29. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Hòa tan 2 g thuốc nhuộm crystal violet trong 20 ml cồn ethanol 95%. Hòa tan 0,8 g amonium oxalat trong 80 ml nước cất. Đổ lẫn hai dung dịch vào nhau. Dung dịch crystal violet Crystal violet 2 g Cồn ethanol 95% 20 ml Ammonium oxalate 0,8 g Nước cất 80 ml Nghiền tinh thể iốt và muối kali iodide (KI) và hòa tan trong nước cất, đựng vào một bình kín, khuấy đều khoảng vài giờ đến khi hòa tan hoàn toàn. Dung dịch Lugol iốt Iốt 1 g KI 2 g Nước cất 300 ml Pha dung dịch nhuộm màu safranin ban đầu bằng cách hòa tan 2,5 g safranin O trong 100 ml cồn ethanol 95%. Pha loãng 1:10 dung dịch này bằng nước cất trước khi sử dụng. Dung dịch nhuộm màu Safranin Safranin O 2,5 g 95% ethanol 20 g Chuẩn bị dung dịch chứa các tế bào vi khuẩn từ một khuẩn lạc đang phát triển (sau khi cấy khoảng 24-48 giờ) và nước cất. Dùng que cấy vi khuẩn quệt một vệt nhỏ (khoảng 1 cm2) dung dịch lên một lam kính sạch. Để khô trong không khí sau đó cố định mẫu bằng cách đưa đi đưa lại lam kính (mặt có vi khuẩn lên trên) vài lần qua ngọn lửa đèn cồn. Không được làm cho lam kính quá nóng. Bằng cách cố định này, vi khuẩn sẽ dính chặt vào bề mặt lam kính trong quá trình nhuộm màu. Ngâm lam kính vào crystal violet trong 1 giờ sau đó dùng vòi nước rửa nhẹ nhàng đến khi không thấy dung dịch màu bị rửa trôi nữa. Ngâm lam kính vào dung dịch Lugol trong một phút. Dùng vòi nước rửa nhẹ và thấm khô. Dội nhẹ nhàng ethanol 95% lên lamen trong vài giây (không quá 39 giây) để rửa hết hóa chất nhuộm rồi thấm khô. Khử nhuộm màu bằng cách ngâm lam kính trong safranin trong 20 giây. Rửa sạch bằng nước sau đó thấm khô. Quan sát mẫu lam dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần sau khi đã nhỏ 1 giọt dầu dùng cho vật kính dầu. Vi khuẩn Gram dương có màu tím xanh trong khi vi khuẩn Gram âm có màu hồng đỏ. Để xác định mức độ tin cậy của phản ứng Gram, có thể dùng hydroxit kali (KOH) để kiểm tra lại. Dùng que cấy (nên dùng que tre hoặc gỗ) lấy một lượng nhỏ vi khuẩn từ 25
30. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật khuẩn lạc đang phát triển và trộn đều với một giọt dung dịch KOH 3% trên một lam kính. Nhấc đầu que cấy lên cách bề mặt của lam kính khoảng vài centimet. Nếu dịch vi khuẩn dạng nhớt dính, tạo thành sợi khoảng 5 - 20 mm thì vi khuẩn đó thuộc nhóm Gram âm. Nếu dịch vi khuẩn giống như nước, không nhớt dính thì vi khuẩn đó thuộc nhóm Gram dương. Các sợi nhớt do vi khuẩn Gram âm tạo ra là do các tế bào bị phá hủy giải phóng ADN có dạng sền sệt trong nước. Ngược lại, lớp vỏ tế bào của vi khuẩn Gram dương lại có khả năng chống chịu với KOH nên không bị phá hủy và không giải phóng ra ADN. Phương pháp thử này chỉ nên áp dụng trong trường hợp vẫn nghi ngờ kết quả của phương pháp nhuộm màu. 4.2 KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC Kính lúp soi nổi chỉ có ích trong trường hợp quan sát mẫu bệnh ban đầu. Kính hiển vi có độ phóng đại lên tới 1000 lần rất cần thiết cho việc quan sát hình thái của vi khuẩn và nấm. Để giám định nấm, dùng que cấy hoặc dao đầu nhọn lấy một phần nhỏ mô có bào tử và đặt vào một giọt dung dịch nhuộm màu, thường sử dụng lacto-fuchsin (0,1 g axit fuchsin và 100 ml axit lactic), hoặc dung dịch cố định mẫu như axit lactic (100 ml axit lactic, 200 ml glycerol và 100 ml nước cất). Dùng kính lúp soi nổi sẽ giúp cho việc lấy bào tử dễ dàng hơn. Nếu mẫu cần quan sát hơi lớn thì có thể dùng lamen ép nhẹ cho mẫu phẳng ra. Có thể loại bỏ bọt khí bằng cách đưa đi đưa lại lam kính qua lửa (tránh không để muội than bám vào mặt dưới của lam kính). Nếu đốt lam kính quá nóng sẽ làm nổ hoặc nứt lamen. Phương pháp dán băng dính rất có hiệu quả đối với việc định hướng bào tử khô (cả chuỗi bào tử và hình dạng bào tử). Cắt một mẩu băng dính và dùng panh giữ băng dính sát vào bề mặt tản nấm (hoặc bề mặt lá). Sau đó đặt miếng băng dính lên một lam kính (mặt dính lên trên) có nhỏ sẵn một giọt dung dịch nhuộm màu hoặc dung dịch cố định mẫu. Dùng lamen phủ lên trên và quan sát dưới kính hiển vi. Một số nấm có bào tử dạng chuỗi rất mỏng manh, dễ dàng rời ra dưới tác động của những luồng không khí rất nhẹ. Có thể khắc phục tình trạng này bằng cách dùng lam kính cấy nấm như sau: Đặt một que thủy tinh đã gập lại lên một tờ giấy lọc thấm nước để dưới đáy một đĩa Petri. Cắt một mẩu agar khoảng 1 cm2 đặt lên một lam kính đã tiệt trùng rồi đặt lam kính này lên trên que thủy tinh. Cấy nấm vào bốn cạnh của miếng agar rồi đặt lamen lên trên. Sau vài ngày có thể quan sát hình thái nấm trên lam kính bằng kính hiển vi. Áp dụng phương pháp này có thể quan sát được cấu trúc của nấm nguyên vẹn khi đang phát triển. Sau đó, tách miếng agar ra khỏi lamen và lam kính, đặt lamen lên một lam kính mới và ngược lại tạo thành 2 mẫu để quan sát. Đối với một số vi sinh vật, mối quan hệ về không gian giữa cấu trúc quả thể và mô ký chủ hay vị trí của cành bào tử phân sinh trong quả thể là những đặc tính phân loại quan trọng. Cắt mẫu thành lát mỏng có thể quan sát được các đặc tính này dưới kính hiển vi. Đặt mẫu dưới kính lúp soi nổi, dùng dao hoặc máy cắt vi phẫu để cắt mẫu thành lát mỏng. Đối với các mẫu tươi hoặc để trong tủ đá nên dùng máy cắt vi phẫu lạnh. Máy cắt vi phẫu lạnh được gắn một tấm nhỏ để đặt mẫu bệnh lên, mẫu có thể được làm lạnh ngay trên mặt tấm bằng nhiệt điện hoặc bằng chất lỏng làm lạnh ở nhiệt độ thấp. 26
31. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Đối với vi khuẩn, thường rất khó quan sát ngay tại mẫu bệnh. Có thể sử dụng Toluidine Blue O để phát hiện vi khuẩn. Cũng có thể áp dụng phương pháp nhuộm màu Gram để phân biệt giữa hai nhóm vi khuẩn khác nhau về mặt hóa học, Gram dương và Gram âm (tế bào vi khuẩn Gram dương có mầu tím đậm trong khi tế bào vi khuẩn Gram âm có màu đỏ). Có thể tham khảo thêm về phương pháp này ở chương 7, Giám định vi sinh vật gây hại. Để duy trì tốt chất lượng của kính hiển vi quang học đòi hỏi phải có bảo dưỡng. Nên bảo dưỡng kính hiển vi định kỳ 6 đến 12 tháng một lần. Trong môi trường nhiệt đới ẩm, nấm có thể mọc lan vào vật kính và bề mặt các bộ phận quang, ảnh hưởng đến chất lượng kính hiển vi, bề mặt các bộ phận này có thể bị hỏng hoàn toàn nếu không kiểm tra. Trong điều kiện khí hậu nhiệt đới nên bảo quản tất cả các kính hiển vi trong phòng có điều hòa và máy hút ẩm. Bảo quản kính hiển vi trong phòng có điều hòa mà không có máy hút ẩm thì không giảm được độ ẩm cần thiết để ngăn ngừa sự phát triển của nấm trên mặt kính. Nếu không có máy hút ẩm chuyên dụng thì có thể bảo quản kính trong tủ có hút ẩm hoặc cất vào hộp bảo quản kính nếu không sử dụng. Hộp bảo quản kính được làm bằng gỗ hoặc nhựa, đủ to để có thể chứa kính hiển vi và một bóng đèn điện 25 W. Bóng đèn có chức năng như một máy hút ẩm do tỏa nhiệt đủ nóng để làm bốc hơi nước trong hộp và giữ hộp luôn khô ráo. Cả hệ thống máy ảnh cũng nên bảo quản trong hộp như vậy. 4.3 CHỤP ẢNH MẪU Nếu có thể nên chụp ảnh mẫu bệnh (dùng máy ảnh thường hoặc kỹ thuật số) khi lấy mẫu trên ruộng điều tra. Chụp ảnh trên ruộng tại thời điểm điều tra cung cấp những tư liệu ảnh về triệu chứng bệnh trong tự nhiên. Nên chụp nhiều ảnh, sau đó chọn lựa những ảnh tốt nhất và lưu vào một cuốn nhật ký có chú thích thông tin về mẫu bệnh để tránh lẫn lộn giữa ảnh này với mẫu bệnh khác xử lý tại phòng thí nghiệm. Chụp ảnh mẫu tại phòng thí nghiệm cho phép loại bỏ được những ảnh hưởng của điều kiện môi trường đến hình ảnh. Khi chụp ảnh tại phòng thí nghiệm có thể phải dùng đến ánh sáng đèn mặc dù ánh sáng đèn thường tạo thành bóng khi chụp ảnh. Khi chụp ảnh mẫu nên dùng màu xám nhạt làm nền cho ảnh, màu đen và màu trắng có thể làm cho mẫu bệnh trong ảnh sáng quá hoặc tối quá. Hình ảnh kỹ thuật số về triệu chứng bệnh có ưu điểm là có thể được gửi đến các đồng nghiệp một cách dễ dàng và không bị hỏng do nấm mốc hoặc giảm chất lượng do thời gian (đặc biệt là trong điều kiện khí hậu nhiệt đới) như phim ảnh. Ngoài việc sử dụng máy ảnh kỹ thuật số, hình ảnh kỹ thuật số còn có thể được tạo ra bằng cách dùng máy quét ảnh hoặc phim dương bản, thậm chí có thể quét trực tiếp mẫu bệnh. 4.3.1 Cách quản lý và đặt tên file ảnh Máy ảnh kỹ thuật số tự động đặt tên cho các file ảnh, (ví dụ IMG_001.jpg, DSCF0001.jpg). Những tên này không có ý nghĩa gì khi chúng ta muốn tìm ảnh trên máy tính. Dùng các phần mềm quản lý hình ảnh (bên dưới) có thể khắc phục được 27
32. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật nhược điểm này nhờ tính năng đổi tên file ảnh. Nên sử dụng các tên có tính mô tả (ví dụ ‘thán thư xoài.jpg’). Nếu số lượng ảnh nhiều, nên đánh số file ảnh để sắp xếp các ảnh thành catalog. Nên bắt đầu bằng số có chữ số không ở trước, ví dụ 001 thay cho 1 vì phần mềm máy tính khi xếp thứ tự thường để 100 trước 99. Nếu hình ảnh minh họa triệu chứng bệnh từ một mẫu tiêu bản trong phòng mẫu thì nên dùng tên truy cập tiêu bản để đặt tên file ảnh. Không nên lưu giữ quá nhiều file trong một thư mục. Nếu có quá nhiều file thì sẽ mất nhiều thời gian để tìm kiếm hình ảnh mong muốn. Tạo các thư mục nhỏ sắp xếp theo vi sinh vật, ký chủ, địa điểm lấy mẫu hoặc thời gian lấy mẫu. Một trong những cách tốt nhất để quản lý các hình ảnh là sử dụng các phần mềm quản lý ảnh chuyên dụng. Các chương trình này cho phép sắp xếp các hình ảnh, mô tả chi tiết, hiển thị lần lượt các hình ảnh một cách tự động, chọn các ảnh mong muốn và đưa lên mạng internet cùng một lúc. Có rất nhiều phần mềm quản lý ảnh có thể sử dụng để: ¾ Đưa hình ảnh từ máy ảnh vào máy tính; ¾ Hiển thị hình ảnh; ¾ Catalog hóa các hình ảnh; ¾ Chỉnh sửa hình ảnh; ¾ Đưa các hình ảnh lên mạng internet. Một số chương trình phần mềm quản lý ảnh đang lưu hành hiện nay: Ablaze Image Manager, ThumbsPlus, Cumulus, Epson’s File Factor, Piccolo, PhotoWallet, Polybytes Polyview, Thumber, PIE, ACDSee (PC và Mac), PicaView32, Image Fox, Graphic Workshop, Professional, GraphicConverter, Power Browser, IrfanView32, Photopage, Quisknailer, Compupic, Image Viewer, Photo Recall, Photo Explorer, EXIFRead, VuePrint, ImageAXS, iView Multimedia, Compupic Pro, Sony PictureGear, FlipAlbum, PictureWorks MediaCenter, JASC Media Center, Pictureshow, Qpict Media Organizer và DigiPicộng sự 28
33. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật 5 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP NẤM, VI KHUẨN VÀ TUYẾN TRÙNG TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM Mẫu bệnh sau khi đem về phòng thí nghiệm được phân thành các nhóm chính. Nhóm ưu tiên bao gồm các mẫu bệnh phân hủy nhanh chóng, ví dụ nấm lớn có thịt dày hoặc các mẫu bệnh mà vi sinh vật hại phải được phân lập từ mô cây. Nhóm khác bao gồm các mẫu bệnh có thể để thêm một thời gian mà không ảnh hưởng gì, ví dụ gỉ sắt, than đen. Các mẫu thuộc nhóm này có thể để khô bằng cách ép báo, sau đó để vào tủ đá -20°C trong 7 ngày, có thể giám định sau. Mẫu virus hại thực vật có thể được bảo quản tạm thời trong các lọ làm khô như đã mô tả ở phần 3.3.1. Virus thực vật sẽ không được đề cập thêm trong chương này vì chúng không được phân lập và làm sạch (tách virus ra khỏi các bộ phận cấu thành tế bào) bằng các phương pháp thông thường trong quy trình giám định. Nấm và vi khuẩn thường phải được phân lập và nuôi cấy trước khi có thể giám định. Các vi sinh vật có khả năng phát triển hoại sinh (vi sinh vật ký sinh không bắt buộc hoặc hoại sinh) có thể được nuôi cấy trên môi trường nhân tạo mặc dù không phải loài nào cũng được nuôi cấy dễ dàng. Phân lập nấm từ mô cây bệnh bằng cách cấy những mẩu nhỏ mô bệnh lên môi trường nhân tạo thích hợp, ví dụ môi trường agar - nước cất (water agar) được để trong các đĩa Petri đã khử trùng. Nếu vi sinh vật xuất hiện trên bề mặt mẫu bệnh, dùng que cấy lấy bào tử trực tiếp từ cấu trúc quả thể và cấy lên bề mặt môi trường. Nhiều loài nấm hoại sinh và vi khuẩn thường phát triển thứ sinh trên mô cây bị bệnh. Vì vậy, phải hết sức cẩn thận tránh phân lập các vi sinh vật thứ sinh bằng các phương pháp khử trừng. Tiệt trùng bề mặt các mô cây bệnh có thể giúp loại trừ các vi sinh vật hoại sinh thường phát triển trên bề mặt mô bệnh. Lấy bông hoặc giấy ăn sạch nhúng cồn ethanol 70% lau phần mô bệnh dùng để cấy sau đó để khô. Tốt nhất nên sử dụng các mẩu kính hoặc các bề mặt cứng, nhẵn để cắt mẫu cây bệnh. Tiệt trùng panh và dao bằng cách nhúng chúng vào cồn ethanol 95% và hơ qua ngọn lửa đèn cồn. Không cần phải giữ dụng cụ quá lâu trên ngọn lửa vì lửa có thể làm hỏng chúng. Cồn rất dễ cháy vì vậy phải hết sức cẩn thận không để dụng cụ vừa hơ lửa quá gần lọ hoặc cốc chứa cồn. Tiệt trùng que cấy bằng cách hơ cho nóng đỏ trên lửa đèn cồn. Để que cấy nguội trước khi sử dụng. Khử trùng bề mặt giúp loại bỏ vi sinh vật hoại sinh và tạo điều kiện cho vi sinh vật gây bệnh phát triển tự do, không bị cản trở khi mẫu bệnh được cấy lên môi trường nhân tạo. Nhúng hoặc lau bề mặt vết bệnh bằng cồn ethanol (70%) có thể khử trùng hầu hết các bề mặt mà không cần rửa lại cho hết cồn vì cồn có thể bay hơi, nếu cần có thể hơ nhanh qua lửa đèn cồn. Natri hypochlorite cũng thường được sử dụng khá phổ biến làm dung dịch khử trùng. Thuốc tẩy trên thị trường thường chứa 10-14% Clo. Có thể pha loãng 10 % (dung dịch pha loãng chứa 1-1,4% Clo) và ngâm mẫu khoảng 1-5 phút. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh vì qua thời gian dung dịch sẽ giảm hiệu lực. Thay dung dịch Natri 29
34. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật hypochlorite 2-3 tuần / lần. Dung dịch hypochlorite có nhược điểm là có mùi hắc, nếu bị dây ra quần áo thường để lại vết và làm hỏng quần áo. Lựa chọn cách phân lập vi khuẩn và nấm nên dựa vào đặc tính của ký chủ và vi sinh vật hại. 5.1 PHÂN LẬP NẤM Các bước phân lập nấm bệnh từ mô cây bệnh như sau: 1. Rửa mẫu bệnh dưới nước máy để loại bỏ đất và bụi bẩn; 2. Nếu có nhiều vi sinh vật hoại sinh trên bề mặt vết bệnh nên rửa mẫu bằng cồn ethanol 70%. Đối với mẫu cây thân gỗ nên áp dụng cách khử trùng này; 3. Cắt mô vết bệnh thành mẩu nhỏ tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe; 4. Nhúng mô bệnh vào dung dịch natri hypochlorite 1% trong cồn ethanol 10% khoảng 1 – 5 phút (có thể thay đổi nồng độ phụ thuộc vào tính chất mô cây, ví dụ một số lá cây có bề mặt rất xốp, có thể hấp thụ dung dịch khử trùng đủ làm chết vi sinh vật hại); 5. Lấy mẫu ra khỏi dung dịch khử trùng bề mặt và rửa lại bằng nước cất, sau đó làm khô mẫu bằng cách đặt mẫu lên giấy lọc đã tiệt trùng (nếu có thể nên để trong tủ cấy có hệ thống thổi lọc không khí). Cắt mẫu bệnh thành từng miếng cấy nhỏ khoảng 2 x 2 mm sau đó đặt lên môi trường agar - nước cất hoặc môi trường khoai tây - đường - agar. Việc để mẫu khô trước khi cấy có tác dụng hạn chế sự phát triển của vi khuẩn lẫn tạp. Khi đặt miếng cấy lên môi trường agar cần mở và đóng nắp hộp Petri cẩn thận và nhanh để tránh vi sinh vật lẫn tạp từ không khí xung quanh; 6. Sau khi cấy xong, đặt ngược đĩa Petri để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường cấy. Hầu hết các nấm bệnh thực vật đều phát triển tốt ở 25°C; 7. Để đạt được mẫu nấm thuần, không lẫn tạp có thể dùng phương pháp cấy đơn bào tử hoặc cấy đỉnh sợi nấm từ các tản nấm mọc lên từ lần phân lập đầu tiên. Phương pháp cấy đơn bào tử như sau: Chuẩn bị dung dịch bào tử trong một ống nghiệm chứa nước cất đã tiệt trùng rồi đổ dung dịch bào tử lên đĩa Petri chứa môi trường agar - nước cất (hoặc môi trường khác phù hợp) sao cho dung dịch phủ kín đĩa. Để đĩa Petri chứa dung dịch bào tử trong bóng tối ở nhiệt độ phòng khoảng 24 giờ. Đặt đĩa bào tử dưới kính lúp soi nổi, dùng que cấy cắt từng bào tử đã nảy mầm và cấy lên môi trường thích hợp; 8. Có thể thay đổi ít nhiều phương pháp trên dựa vào kinh nghiệm hoặc tuân theo tài liệu tham khảo. Phân lập từ lá Chọn lá có vết bệnh còn trẻ vì nấm thường đang phát triển mạnh ở các mô lá này. Cẩn thận dùng kéo hoặc dao cắt mẫu lá thành từng mẩu nhỏ tại phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Khử trùng bề mặt bằng cách ngâm trong dung dịch natri hypochlorite 10% khoảng 1 – 3 phút rồi rửa qua bằng nước vô trùng. Dùng panh đã khử trùng đặt miếng cấy lên môi trường agar. 30
35. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Phân lập từ thân Trong trường hợp vết bệnh sâu hoặc nằm phía trong bó mạch của cây bệnh, có thể cắt miếng cấy ở các mô bên trong để tránh phải khử trùng bề mặt. Dùng dao (hoặc dụng cụ có thể cắt thân gỗ) đã tiệt trùng qua lửa đèn cồn để chẻ dọc thân bệnh theo chiều từ phần khỏe đến phần bệnh. Dùng dao vô trùng cẩn thận cắt miếng cấy (3-5 mm) tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe, chọn mô bệnh còn mới. Dùng panh vô trùng gắp miếng cấy đặt lên đĩa Petri chứa môi trường agar - nước cất (hoặc môi trường khác thích hợp). Đối với các thân cây nhỏ, vết bệnh chủ yếu bị giới hạn bởi phần mô phía ngoài hoặc trong trường hợp không thể cắt miếng cấy ở phần mô bệnh phía trong thì có thể dùng dao vô trùng cắt miếng cấy ở phần tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh, sau đó khử trùng bề mặt (1-3 phút trong natri hypochlorite), rửa lại bằng nước vô trùng và cấy lên bề mặt môi trường. Phân lập từ rễ Rửa hết phần đất bám ở bộ phận rễ, sau đó đặt rễ vào một chậu thủy tinh nhỏ hoặc đĩa Petri thủy tinh với mực nước khoảng 2-3 cm sao cho dễ dàng nhìn thấy phần rễ bệnh. Dùng panh hoặc dao xé rễ thành từng mẩu nhỏ. Dùng dao hoặc kéo vô trùng cắt mẩu rễ cấy (dài khoảng 5 mm) tại điểm tiếp giáp giữa mô khỏe và mô bệnh. Có thể khử trùng qua bề mặt miếng cấy, tuy vậy đối với rễ vì rất mỏng manh nên cần rửa lại kỹ bằng nước vô trùng như sau: Đặt các mẩu rễ vào rây có lỗ nhỏ rồi để dưới vòi nước sạch chảy liên tục trong 30 đến 90 phút. Dùng dao hoặc panh vô trùng đặt các miếng cấy lên đĩa Petri có chứa môi trường agar - nước cất (hoặc môi trường khác phù hợp), chú ý ấn nhẹ cho miếng cấy tiếp xúc sâu vào bề mặt môi trường. 5.1.1 Buồng giữ ẩm Đôi khi triệu chứng bệnh thể hiện rất rõ nhưng phân lập vi sinh vật gây bệnh lại không đơn giản chút nào. Trong trường hợp khó phân lập vi sinh vật hại có thể để mẫu trong môi trường ẩm, chờ sự xuất hiện của các dạng quả thể và hình thành bào tử. Tuy nhiên, trong điều kiện để ẩm, vi sinh vật hoại sinh cũng rất dễ xuất hiện trên bề mặt mô bệnh. Lau nhẹ bằng cồn công nghiệp hoặc natri hypochlorite 10% có thể giúp hạn chế sự phát triển của vi sinh vật hoại sinh nhưng lại có thể phá hủy cấu trúc vi sinh vật hại trên bề mặt vết bệnh. Để khắc phục tình trạng này có thể rửa mẫu bệnh bằng nước vô trùng rồi làm khô trước khi để ẩm. Hộp để ẩm nên giữ ở nhiệt độ dưới 25°C và tốt nhất là nên để nơi sáng, ví dụ trên bàn thí nghiệm, nhưng không nên để trực tiếp dưới ánh nắng mặt trời, nên giữ ở nhiệt độ không đổi để tránh hơi nước ngưng tụ. Mẫu cần được kiểm tra hàng ngày dưới kính lúp soi nổi với độ phóng đại thấp để quan sát sự xuất hiện của bào tử. Các cấu trúc bào tử có thể được lấy ra bằng que cấy vô trùng để kiểm tra dưới kính hiển vi có độ phóng đại lớn hơn hoặc cấy lên môi trường agar. Đối với các mẫu bệnh nhỏ như lá hoặc cành nhỏ có thể dùng đĩa Petri bằng thủy tinh hoặc nhựa. Các mẫu bệnh lớn hơn có thể để ẩm trong các hộp nhựa và các mẫu quá lớn có thể để ẩm trong các túi nilon lớn. 31
36. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Hộp hoặc túi dùng để ẩm phải được khử trùng. Nếu không thể cho vào nồi hấp được thì phải lau sạch bằng cồn 70% rồi để khô. Túi nilon phải mới chưa sử dụng lần nào. Đặt giấy lọc (đã được hấp khử trùng) vào đĩa Petri hoặc hộp làm ẩm rồi dùng nước cất vô trùng thấm ướt giấy lọc. Khăn giấy dùng trong phòng thí nghiệm có thể được sử dụng bằng cách thấm ướt rồi để vào trong túi nilon hoặc hộp nhựa lớn. Mẫu bệnh phải được để phía trên giấy thấm nước bằng cách đặt một lưới nhựa vào hoặc bất cứ vật gì (nhúng trong cồn 70% và hơ qua ngọn lửa đèn cồn) để kê cao mẫu bệnh trong hộp, tránh tiếp xúc trực tiếp với giấy thấm. 5.1.2 Phương pháp pha loãng Nấm có thể được phân lập từ đất và bề mặt các bộ phận cây như lá, hoa bằng cách rửa và sử dụng phương pháp pha loãng lần lượt để phân lập được các tản nấm trên môi trường thích hợp, ví dụ như môi trường agar - nước máy (tap water agar) (TWA). Không nên sử dụng các môi trường giàu dinh dưỡng vì chúng sẽ kích thích sự phát triển của cơ quan sinh dưỡng thay vì việc hình thành bào tử. Có thể sử dụng kháng sinh như streptomycin sunfat trộn lẫn vào môi trường agar để hạn chế sự phát triển của vi khuẩn. Phương pháp pha loãng lần lượt được thực hiện như sau: Nghiền nhỏ hoặc rây mịn đất hoặc các mẩu nhỏ cây bệnh, trộn thật kỹ rồi lấy một lượng nhỏ đổ vào lọ McCartney (dung tích 20 ml) chứa 10 ml nước vô trùng. Dùng pipet vô trùng để lấy 1 ml dung dịch rồi đổ vào lọ McCartney khác chứa 9 ml nước vô trùng. Dùng pipet vô trùng khác để lấy 1 ml dung dịch vừa được pha loãng rồi đổ vào lọ McCartney thứ ba chứa 9 ml nước vô trùng. Cứ tiếp tục pha loãng lần lượt như vậy đến khi dung dịch đạt đến nồng độ mong muốn. Lấy một lượng nhỏ dung dịch pha loãng cuối cùng đổ vào bề mặt môi trường trong đĩa Petri và dùng que thủy tinh dàn đều sao cho dung dịch bao phủ hết bề mặt môi trường. Sau một thời gian các tản nấm bắt đầu xuất hiện, cần cấy truyền ngay lên môi trường phù hợp trước khi chúng mọc chồng lên nhau. Đôi khi chỉ có một lượng rất nhỏ nấm hình thành bào tử, ví dụ: Nấm túi hoặc nấm dạng quả cành. Trong trường hợp này cách tốt nhất là áp dụng phương pháp sau: nhỏ một giọt nước vô trùng vào một lam kính vô trùng rồi gắp một quả thể nấm đặt vào giọt nước, đợi đến khi bào tử được giải phóng khỏi quả thể. Có thể điều chỉnh mật độ bào tử dưới kính hiển vi. Dùng que cấy đưa dịch bào tử vào thành từng vệt trên môi trường TWA. Sau 24 giờ cấy đơn bào tử từ TWA lên môi trường thích hợp. 5.1.3 Phát triển và sản sinh bào tử Đối với hầu hết nấm bệnh, sản sinh bào tử là hình thức sinh sản chủ yếu, bào tử sau khi sinh ra sẽ được phát tán trong môi trường sống của chúng. Sự sản sinh bào tử phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường nuôi cấy. Hầu hết loài nấm có thể phát triển tốt ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Sự sản sinh bào tử là yếu tố rất cần thiết cho việc giám định và tạo nguồn nấm để lây bệnh nhân tạo. Điều kiện môi trường nhân tạo như: tủ định ôn tối và các môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng thường không có lợi cho việc sản sinh bào tử ở hầu hết nấm bệnh. Nên sử dụng lá ký chủ (đã tiệt trùng), ví dụ: cọng rơm của lúa mì, lá ngô, lá cẩm 32
37. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật chướng đặt vào môi trường nghèo dinh dưỡng như TWA để kích thích sự sản sinh bào tử. Có thể kích thích sự sản sinh bào tử ở nhiều loài nấm bằng cách đặt dưới ‘ánh sáng đen’ (cực tím yếu). Mặc dù ‘ánh sáng đen’ có thể ảnh hưởng đến màu sắc tản nấm, hình thái đại thể của tản nấm, thậm chí hình thái bào tử, những biến đổi này không ảnh hưởng đến việc giám định. Gắn bóng đèn ‘ánh sáng đen’ vào phía trên giá để đĩa cấy để kích thích sự sản sinh bào tử ở các loài nấm mà việc hình thành bào tử đòi hỏi môi trường ánh sáng này (Hình 8). ‘ánh sáng đen’ Hộp đèn huỳnh quang Lỗ thông hơi, khoảng 50 Hộp đèn huỳnh mm đường kính quang dày 100 mm 450 mm 350 mm Thiết bị điều Mẫu nấm phân lập chỉnh thời gian 500 mm Hình 8 Mặt cắt nghiêng của buồng để mẫu nấm phân lập có ‘ánh sáng đen’ Những điểm cần chú ý khi sử dụng ‘ánh sáng đen’ để kích thích sự hình thành bào tử:. ¾ Bóng đèn huỳnh quang có ‘ánh sáng đen’ sẵn có trên thị trường với các loại 20 W, 40 W và 80 W và chiều dài khác nhau. Bóng đèn huỳnh quang với ánh sáng trắng thường phát ra một lượng tia sáng cực tím yếu, vì vậy nếu không có đèn ‘ánh sáng đen’ có thể dùng đèn huỳnh quang với ánh sáng trắng thay thế. Có thể sử dụng kết hợp các loại bóng khác nhau (ví dụ: một bóng ánh sáng đen ở giữa hai bóng ánh sáng trắng). Không nên sử dụng đèn có cường độ chiếu sáng lớn; ¾ Dùng thiết bị điều chỉnh thời gian để chỉnh ánh sáng liên tục sao cho cứ tiếp theo 12 giờ UV lại có 12 giờ bóng tối; ¾ Một số loài nấm đòi hỏi một khoảng thời gian trong bóng tối để bắt đầu sự hình thành bào tử, vì vậy buồng để mẫu nấm phân lập nên được che sáng. 33
38. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật ¾ Sau khi cấy 1 đến 4 ngày, bắt đầu sử dụng ánh sáng đen cho đến khi nấm ngừng phát triển. Không bao giờ để mẫu nấm phân lập tiếp xúc với ánh sáng đen ngay sau khi cấy vào môi trường; ¾ Đối với một số loài nấm, ánh sáng cực tím yếu sẽ không có hiệu lực đối với sự hình thành bào tử nếu để ở nhiệt độ cao; ¾ ‘Ánh sáng đen’ có thể truyền hiệu quả qua đĩa Petri nhựa và các đĩa không màu. Vì vậy nên dùng đĩa nhựa để cấy nấm khi định để mẫu nấm phân lập ở ánh sáng này. 5.2 PHÂN LẬP VI KHUẨN Nếu bệnh do vi khuẩn gây ra, một lượng lớn các tế bào vi khuẩn thường dễ dàng được tìm thấy khi vết bệnh trên lá hoặc trong các bó mạch bị vỡ. Phương pháp phát hiện và phân lập vi khuẩn từ mô cây bệnh như sau: 1. Rửa phần cây bị bệnh dưới vòi nước chảy để loại bỏ đất, bụi và các sinh vật lẫn tạp. Nếu mẫu bệnh ban đầu được giữ gìn cẩn thận, không bị cọ xát nhiều thì không cần thiết phải khử trùng bề mặt. Nói chung, càng hạn chế khử trùng bề mặt càng tốt, nhất là đối với các mẫu bệnh khô hoặc gần khô. Các chất có tác dụng khử trùng thường xâm nhập rất nhanh và dễ dàng diệt vi khuẩn. Nếu cần thiết phải khử trùng, chỉ nên nhúng mẫu bệnh thật nhanh vào dung dịch natri hypochlorite 10%, sau đó rửa lại bằng nước vô trùng. Nếu mẫu bệnh dày ví dụ như nụ, quả, cành hoặc nốt sưng thì có thể nhúng qua cồn etanol 70% và hơ qua lửa đèn cồn trước khi phân lập. 2. Cắt vết bệnh thành từng mẩu nhỏ ở phần giữa mô bệnh và mô khỏe, sau đó đặt mẫu lên lam kính tiệt trùng đã nhỏ sẵn một giọt nước vô trùng. Đối với những mô bệnh dày hơn nên dùng que cấy hoặc dao cấy xé nhỏ ra sau khi đặt vào giọt nước vô trùng. Dùng lamen vô trùng đặt lên trên miếng mẫu bệnh và kiểm tra ngay dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Có thể hạ thấp tụ quang hoặc đóng phin lọc bàn di mẫu kính hiển vi để nhìn tế bào vi khuẩn rõ hơn. Nếu vết bệnh do vi khuẩn gây nên ta có thể nhìn thấy một đám vi khuẩn chuyển động từ vết cắt. Cần chú ý để không nhầm lẫn vi khuẩn với các thành phần khác như: nhựa cây, hạt tinh bột, plastid. Khi nhìn thấy dịch vi khuẩn chuyển động ra ngoài từ vết cắt, có thể bỏ lamen ra và dùng que cấy vi khuẩn với đầu que cấy hình vòng tròn cấy dịch vi khuẩn lên môi trường agar thích hợp. Trong một số trường hợp có thể phải ngâm mô bệnh trong nước vô trùng khoảng vài giờ để đảm bảo đủ lượng vi khuẩn chuyển động ra ngoài thành dịch, sau đó mới cấy lên môi trường. 3. Cấy vi khuẩn bằng cách dùng que cấy vi khuẩn chứa dịch vi khuẩn vạch từng vạch lên bề mặt agar. Có thể vạch que cấy theo nhiều cách: Cách 1: tạo thành hình zích zắc trên một góc phần tư của đĩa cấy, bắt đầu từ mép đĩa. Các góc phần tư khác vạch thành các đường thẳng song song, một đầu trùng lên vạch của góc phần tư trước (Hình 9). Que cấy phải được khử trùng trước mỗi lần vạch lên mặt agar. Cách 2: vạch lên toàn bộ bề mặt agar từ trên xuống dưới, từ trái sang phải để phân lập được từng khuẩn lạc riêng biệt. 4. Dựa vào dự đoán nguyên nhân gây bệnh mà lựa chọn môi trường thích hợp. Môi trường phải được để khô trước khi cấy bằng cách đặt ngược nắp đĩa cấy 34
39. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật và để nghiêng trong 24 giờ ở buồng vô trùng hoặc mở nắp trong tủ cấy vô trùng trong 30 phút. Cẩn thận để tránh không cho không khí tạp lẫn vào môi trường. 5. Đĩa phân lập nên đặt ngược để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường. Hầu hết các vi khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 25-28oC. 6. Có thể thay đổi một số thao tác trên theo kinh nghiệm hoặc tuân theo các bài báo. 2 3 1 4 Hình 9 Cách vạch phân lập vi khuẩn trên mặt agar: 1. Vạch phân lập ban đầu từ dịch bào tử. 2. Dùng que cấy sau khi khử trùng vạch thành các vạch thẳng thứ nhất nối với vạch phân lập ban đầu. 3. Các vạch thẳng thứ hai. 4. Các vạch thẳng thứ ba, khuẩn lạc được tạo thành riêng rẽ trên các vạch này. Sau khi phân lập, đặt đĩa cấy ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm và kiểm tra hàng ngày trong 4-5 ngày, hoặc 10-14 ngày đối với các vi khuẩn phát triển chậm. Dựa vào triệu chứng có thể dự đoán vi khuẩn gây bệnh và cấy truyền, kể cả trong trường hợp nhiều vi khuẩn khác nhau cùng xuất hiện trên một đĩa phân lập. Nếu chọn lựa mẫu bệnh và mẫu cấy tốt thì thông thường chỉ phân lập ra một loại vi khuẩn gây bệnh. Nếu từ hai loại vi khuẩn được phát hiện trên mẫu phân lập thì chú ý ghi chép lại mức độ phổ biến của từng loại. Không tính đến các vi khuẩn hoại sinh phổ biến, nên cấy truyền để kiểm tra các vi khuẩn xuất hiện nhiều, đặc biệt là ở các địa điểm khác nhau. Chỉ nên cấy truyền các khuẩn lạc riêng rẽ, tốt nhất lên cùng loại môi trường để trong ống nghiệm. Có thể áp dụng phương pháp phân lập tương tự như đối với nấm. Cấy trực tiếp mô bệnh lên bề mặt môi trường, vi khuẩn sẽ phát triển xung quanh miếng cấy. Nếu vi khuẩn hoại sinh có mặt trong mẫu cấy, chúng thường lấn át vi khuẩn gây bệnh đặc biệt là đối với các vi khuẩn gây bệnh phát triển chậm. Vì vậy, chỉ áp dụng phương pháp này trong trường hợp phương pháp cấy dịch vi khuẩn không phù hợp. 5.3 PHÂN LẬP TUYẾN TRÙNG Tuyến trùng (giun tròn không phân đốt) là một nhóm động vật đa dạng, nhỏ, mắt thường không nhìn thấy được. Chúng phân bố ở hầu hết mọi nơi có nước tự do, thậm chí cả những nơi rất ít nước. Tuyến trùng tổng hợp chất dinh dưỡng từ nhiều nguồn khác nhau, nhiều loài có khả năng ký sinh chuyên tính cao. Đại đa số thực vật và 35
40. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật động vật là ký chủ của ít nhất một loài tuyến trùng ký sinh. Vì vậy mà rất nhiều tuyến trùng ký sinh là dịch hại quan trọng đối với kinh tế. Ngược lại, các loài tuyến trùng sử dụng vi khuẩn và nấm làm thức ăn (hay còn gọi là tuyến trùng sống tự do) lại có chức năng quan trọng về mặt sinh thái. Ví dụ, tuyến trùng sống tự do đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ dinh dưỡng của hệ sinh thái đất. Tuyến trùng ký sinh thực vật được phân làm hai nhóm chính: (1) nhóm di chuyển và lấy thức ăn trên bề mặt hoặc giữa các rễ cây (tuyến trùng ký sinh di chuyển) và (2) nhóm không di chuyển, kích thích cây chủ sản xuất ra các cấu trúc bảo vệ và dự trữ dinh dưỡng nuôi tuyến trùng (tuyến trùng ký sinh tại chỗ). Các loài tuyến trùng di chuyển thường có khả năng ký sinh trên nhiều ký chủ khác nhau và gây thiệt hại về kinh tế khi mật độ tuyến trùng cao trừ một số ít giống. Các loài tuyến trùng ký sinh tại chỗ có khả năng ký sinh chuyên tính cao và tác động đến ký chủ ở mức độ phân tử, tác động rất lớn đến năng suất cây trồng nhưng thường gây hại trên ít đối tượng hơn là đối với các loài tuyến trùng di chuyển. Để giám định tuyến trùng ký sinh thực vật, nên tách tuyến trùng ra khỏi đất hoặc mẫu bệnh và bảo quản cẩn thận. 5.3.1 Mẫu đất Đối với mục đích giám định và lưu giữ mẫu, nên lấy mẫu bệnh ở vùng rễ cây có biểu hiện triệu chứng. Nếu điều tra một khoảnh bị nhiễm bệnh trên một ruộng thì nên lấy mẫu ở khu vực ranh giới giữa khoảnh bị bệnh và khoảnh không bị bệnh, vì ở khu vực này tuyến trùng gây bệnh cây có thể tập trung với mật độ cao nhất. Ngoài ra, cũng nên lấy mẫu ở khu vực không bị bệnh để so sánh. Chiều sâu của điểm lấy mẫu và số lượng mẫu lấy ban đầu cũng quan trọng nhưng chúng tôi sẽ không đề cập sâu về vấn đề đó trong phần này. Tốt nhất nên lấy mẫu đất ẩm bởi vì một số tuyến trùng ngủ nghỉ trong đất khô thường bị thương do đứt gãy. Đặt mẫu đất trong túi nilon và giữ ở nơi mát mẻ trong quá trình chuyên chở, xử lý mẫu càng sớm càng tốt. Một số tuyến trùng có thể được giữ trong tủ lạnh nhưng không phải là tất cả các loài đều có thể áp dụng cách này. Đối với đất nhẹ, bở, có thể dùng rây (kích thước lỗ rây 10mm) để loại bỏ các mảnh rác sau đó trộn kỹ. Phương pháp này không phải lúc nào cũng áp dụng được với đất nặng. Phương pháp tách tuyến trùng ra khỏi mẫu bệnh có thể dựa vào sự di chuyển của tuyến trùng (chủ động) hoặc dựa vào kích thước và mật độ tuyến trùng (thụ động). Phương pháp chủ động đơn giản nhất là dùng khay Whitehead hoặc phễu Baermann để tách tuyến trùng đang hoạt động. Mặc dù đơn giản, quá trình này có thể kéo dài 2- 4 ngày và mẫu thu được có thể rất ít, do tuyến trùng lớn di chuyển chậm. Phương pháp thụ động được tiến hành bằng cách lọc, gạn và tách với nhiều cách kết hợp khác nhau. Trong phần này, chúng tôi tập trung mô tả phương pháp rây ướt và các phương pháp ly tâm khác nhau. Phương pháp rây ướt có thể dùng để phân lập bào nang của các loài Heteroderid. Tách tuyến trùng bằng khay Bỏ đất vào một khay có lót một miếng lưới thô và một lớp vải hoặc giấy thấm, dàn đều đất rồi đổ nước vào sao cho chỉ vừa thấm ướt đất (Hình 10). Sau 1 - 4 ngày, 36
41. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật tuyến trùng đang hoạt động sẽ di chuyển xuống dưới, xuyên qua miếng vải vào trong nước dưới đáy khay. Lượng đất sử dụng phụ thuộc vào kích thước của khay; khay loại lớn (450 x 300 mm) có thể chứa một lớp 200g đất mỏng. Lớp đất càng mỏng càng có tác dụng tăng hiệu quả tách tuyến trùng và giảm thời gian tách. Đất Vải Lưới Nước Khay Hình 10 Khay Whitehead dùng để tách tuyến trùng từ đất và cây Trước khi thu thập tuyến trùng, cẩn thận nhấc phần lưới đỡ lên để hạn chế đất rơi vào phần nước phía dưới. Chuyển phần nước vào một cốc đong và để như vậy vài giờ cho tuyến trùng lắng xuống. Sau đó, tốt nhất nên dùng pipet lấy bớt nước ra chỉ giữ lại khoảng 5-20 ml, cẩn thận để không làm xáo trộn tuyến trùng đã lắng xuống ở dưới. Có thể thay thế phương pháp này bằng cách trút nước có chứa tuyến trùng ra một rây lọc với kích thước lỗ rây 20 - 38 μm. Tuy nhiên, dùng loại rây với lỗ rây càng nhỏ thì càng đắt và khó mua. Tuyến trùng có thể lọt qua rây nhưng có thể khắc phục bằng cách bắt và lọc lại vài lần. Phễu Baermann Đặt đất vào phễu có lót lưới ở dưới và giấy thấm hoặc một miếng vải để trên, cổ phễu được gắn ống cao su Đất có kẹp. Đổ nước vào miệng phễu Vải vừa đủ để thấm ướt đất (Hình 11). Lưới Phương pháp này chỉ tiến hành được với một lượng nhỏ đất nhưng có ưu điểm là tuyến trùng tập trung ở phần ống cao su phía trên kẹp và Nước có thể mở kẹp để lấy khoảng 5 đến 10 ml nước chứa tuyến trùng vào ống nghiệm. Ống cao su Kẹp Hình 11 Dùng phễu Baermann để tách tuyến trùng từ đất và cây bệnh. 37
42. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Phương pháp lọc ướt và ly tâm Đổ đất vào chậu rồi đặt dưới vòi nước chảy, hòa khoảng 4 lít dung dịch đất - nước, tránh không để nước chảy tràn. Khoảng 10 giây sau, các phần tử đất lớn hơn chìm xuống đáy chậu. Phần nước còn lại được lọc qua rây (kích thước lỗ rây 38 μm) xuống một chậu khác. Tuyến trùng bị mắc lại ở lỗ rây sẽ được thu hồi bằng cách ly tâm với một lượng nước rất nhỏ. Tuyến trùng lọt qua rây được thu hồi bằng cách rây lại (có thể rây lại đến 3 lần). Để tăng lượng tuyến trùng thu được, nên lặp lại toàn bộ quá trình từ khâu hòa đất vào nước thêm 2 lần nữa. Tuyến trùng được thu hồi bằng cách ly tâm, cẩn thận rút phần nước phía trên ống nghiệm, chỉ để lại một lượng nước nhỏ chứa tuyến trùng. Sau đó hòa tuyến trùng thu được vào nước đường đặc (450 g/lít) rồi ly tâm lại. Loại bỏ các hợp chất hữu cơ nổi lên trên ống, nước đường cùng với tuyến trùng được rửa qua rây để thu hồi tuyến trùng. Có thể rây lại 2 lần để tận dụng tuyến trùng lọt qua lỗ rây. Không nên để tuyến trùng quá lâu trong dung dịch đường đặc vì đường có thể kết tinh gây hại đến tuyến trùng. Có thể thay thế dung dịch đường bằng các dung dịch đặc như NaCl, MgSO4 hoặc keo silica (Ludox, DuPont de Nemours). Phương pháp tách tuyến trùng bào nang Hòa tan đất bằng 4 lít nước xả từ vòi, tránh chảy tràn. Để phần đất lắng xuống sau 10 giây, phần nước được lọc qua rây thô (710 μm) đặt trên một rây 250 μm. Đất được rửa lại và lọc qua rây 2 lần nữa. Các chất hữu cơ đọng lại trên rây lỗ nhỏ được thu và để vào phễu Buchner có lót giấy lọc. Kiểm tra bào nang dưới kính lúp soi nổi. Nếu dùng phễu tam giác và hòa tan các hợp chất hữu cơ bằng cồn ethanol 70% thì bào nang sẽ nằm lại thành một vòng ở phía vành ngoài của giấy lọc. 5.3.2 Mẫu cây bệnh Tuyến trùng có thể được tìm thấy trong rễ, thân, lá và hạt của cây, vì vậy phương pháp tách cũng khác nhau tùy từng loại mẫu và các loài tuyến trùng khác nhau. Cách tốt nhất để tách tuyến trùng nội ký sinh di chuyển là dùng thiết bị phun sương, ngoài ra có thể dùng khay Whitehead hoặc phễu Baermann như đã mô tả ở trên. Đối với tuyến trùng không di chuyển có thể dùng dao cắt mô bệnh để lấy tuyến trùng ra hoặc bảo quản in situ. Có thể tách trứng của một số tuyến trùng cố định bằng cách rửa trong thuốc tẩy và lọc qua rây. Tuy nhiên chúng tôi không mô tả phương pháp này ở đây vì trứng tuyến trùng không có ý nghĩa nhiều về mặt phân loại. Tuyến trùng con di chuyển và tuyến trùng đực hình giun được tách bằng phương pháp phun sương. Phương pháp tách tuyến trùng bằng phun sương Đặt mẫu bệnh (cắt thành từng mẩu dài 10mm) vào phễu có lót lưới và một mảnh vải phía trên. Để phễu có chứa mẫu bệnh vào buồng phun sương, cứ khoảng 10 phút thì phun sương một lần (Hình 12). Nước thấm qua phễu được hứng vào 1 ống nghiệm với lượng chảy đủ chậm để tuyến trùng lắng xuống đáy ống và được lấy ra sau 2- 4 ngày. Giảm lượng nước trong ống bằng pipet (Dùng pipet để hút bớt nước trong ống nghiệm). Phun sương bảo đảm cho nước được oxy hóa tốt và loại bỏ những độc tố do các mô cây bệnh hoại sinh sản sinh ra, vì thế mà tuyến trùng được giữ ở điều kiện tốt nhất. Có thể áp dụng phương pháp khay Whitehead và phễu Baermann nhưng các phương pháp này có nhiều hạn chế khi áp dụng với mẫu cây bệnh hơn là với mẫu đất. 38
43. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Phun sương (định kỳ) Rễ Vải Lưới Ống nghiệm Nước Hình 12 Tách tuyến trùng từ mô bệnh bằng phương pháp phun sương Cắt mẫu Đặt mẫu vào một đĩa Petri. Dùng dao cấy nhọn đầu hoặc que cấy xé mẫu mô bị bệnh tuyến trùng thành từng phần nhỏ dưới kính lúp soi nổi. Tốt nhất nên dùng kết hợp ánh sáng truyền và ánh sáng tới. Có thể quan sát tuyến trùng đã tách ra từ mô bệnh bằng ánh sáng gián tiếp phía dưới kính. Để mẫu trên đĩa Petri như vậy một thời gian có thể tạo điều kiện cho một số tuyến trùng di chuyển ra ngoài mô bệnh. Ánh sáng tới sẽ có ích cho việc quan sát giai đoạn sưng của tuyến trùng cố định như bào nang (Heterodera spp.), nốt sưng (Meloidogyne spp.) u lá và hạt (Anguina spp.). Có thể quan sát tuyến trùng nội ký sinh bằng cách làm sạch mô bệnh bằng thuốc tẩy, sau đó nhuộm màu bằng nhiều cách khác nhau. Phương pháp này có thể có ích cho mục đích giám định những mẫu bệnh sau khi xử lý không phù hợp để bảo quản lâu dài. 5.3.3 Bảo quản và làm tiêu bản Xử lý nhiệt Trước khi cố định mẫu tuyến trùng bằng chất bảo quản phải giết chúng để giữ nguyên vẹn cấu trúc. Ngâm tuyến trùng trong nước hoặc chất cố định ở 60oC, sau đó làm lạnh thật nhanh bằng nước lạnh hoặc chất cố định. Nếu không có bể cách thủy để duy trì nhiệt độ ở 60oC, có thể đổ nước sôi vào dung dịch chứa tuyến trùng với lượng nước sôi bằng lượng nước chứa tuyến trùng để tạo ra nhiệt độ vừa đủ giết tuyến 39
44. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật trùng. Ngoài ra, có thể đặt dung dịch chứa tuyến trùng (mực nước nông) vào tủ sấy ở nhiệt độ 55 – 60oC, kiểm tra một phút/lần cho đến khi tuyến trùng bị chết. Cần lưu ý trong quá trình xử lý nhiệt không được luộc hoặc để nhiệt độ quá cao vì sẽ phá hủy cấu trúc bên trong của tuyến trùng. Cố định mẫu Phương pháp cố định tuyến trùng đơn giản nhất là dùng formaldehyde. Nhỏ dung dịch formaldehyde đậm đặc vào dung dịch chứa tuyến trùng sao cho nồng độ formaldehyde cuối cùng là 2 – 5%. Mẫu được ngâm trong formaldehyde ít nhất 12 giờ, lý tưởng nhất là 2 tuần trước khi tiến hành các bước tiếp theo. Có thể bảo quản mẫu lâu dài trong dung dịch formaldehyde. Các chất cố định khác thường được sử dụng bao gồm TAF (3% formaldehyde, 0,2 % triethanolamine trong nước cất) và FA4:1 (4% formaldehyde, 0,1% axit axetic trong nước cất). Tuy vậy, các hóa chất này không phù hợp với bảo quản lâu dài. Không sử dụng cồn ethanol để cố định mẫu cho mục đích nghiên cứu về hình thái, nhưng có thể sử dụng cồn ethanol để bảo quản cho mục đích nghiên cứu về sinh học phân tử sau này. Làm tiêu bản Để làm tiêu bản với mục đích bảo quản lâu dài, mẫu tuyến trùng được ngâm trong glycerol và để bay hơi chậm. Cho một lượng nhỏ dung dịch glycerol 2 - 5 % (vài ml) vào một đĩa thủy tinh nông, sau đó đặt tuyến trùng vào. Cho đĩa vào tủ sấy ở 40oC hoặc bình hút ẩm. Để làm chậm lại quá trình bay hơi nước không nên đóng kín nắp đĩa. Quan sát dưới kính lúp soi nổi để gắp từng mẫu tuyến trùng vào một lam kính hiển vi. Sử dụng que cấy nhọn đầu có dính keo dán lông mi để gắp tuyến trùng. Kéo tuyến trùng dần dần về phía bề mặt có thể quan sát được và nhấc ra khỏi bề mặt bằng cách di chuyển que cấy. Quá trình gắp tuyến trùng ra được tiến hành từ đĩa nông nhưng nhiều khi phải thường xuyên thay đổi cự ly ống kính để tìm tuyến trùng. Muốn thành thạo thao tác này cần phải thực hành nhiều. Gắp một vài đến 10 tuyến trùng ở các giai đoạn đại diện vào một giọt glycerol khan đặt trên một lam kính. Dùng que cấy đặt cố định mẫu ở chính giữa lam kính. Để giữ cho mẫu tuyến trùng khỏi bị nghiền nát, dùng vụn thủy tinh, lamen vỡ (Số 0) hoặc sáp đặt xung quanh mẫu tuyến trùng. Nhẹ nhàng đặt lamen (tốt nhất nên dùng loại tròn) lên trên giọt glycerol khan, không để glycerol tràn ra mép ngoài lamen. Nếu dùng sáp cạo râu hoặc vòng sáp (nấu chảy ra rồi để nguội) thì phải đặt lam kính lên bếp điện để làm sáp chảy ra. Sau đó hàn lamen lại. Trước đây glycin thường được dùng để hàn lamen nhưng hiện nay glycin không sẵn có trên thị trường vì vậy có thể thay bằng nhựa epoxy hai phần (ví dụ: 5 min. Araldite) hoặc DePeX (có ở nhiều công ty khác nhau). Mặc dù một số nơi có thể sử dụng thuốc đánh móng tay chân nhưng cách này thường không bền trong điều kiện khí hậu nóng. 5.4 MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Hầu hết các môi trường nuôi cấy thường được làm từ các hóa chất cơ bản hoặc thậm chí có thể mua sẵn từ thị trường. Các môi trường bán sẵn trên thị trường có chất lượng đồng đều hơn môi trường tự chuẩn bị từ các thành phần cơ bản. 40
45. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Hạn chế sự phát triển của vi khuẩn bằng cách cho thêm một lượng kháng sinh vào môi trường. Hầu hết các loại kháng sinh đều dễ bị biến tính ở điều kiện nhiệt độ cao, chỉ bỏ kháng sinh vào môi trường sau khi hấp khử trùng (trước khi agar kịp đông lại). Penicillin (50 đơn vị / ml), streptomycin (50 đơn vị / ml) và tetracycline (30 đơn vị / ml) có thể sử dụng riêng hoặc kết hợp. Chloramphenicol (50 mg / l) có thể hấp khử trùng (cho thẳng vào môi trường trước khi hấp). Lượng agar cho vào các môi trường (giới thiệu ở phần dưới) có thể khác nhau tùy thuộc vào nhãn hiệu agar và cơ sở sản xuất. Lượng agar dùng để nấu môi trường phải bảo đảm đủ cứng để có thể cấy vi khuẩn bằng phương pháp vạch que cấy lên môi trường. Nếu phát hiện trong nước máy có chứa chất bẩn hoặc độc tố thì nên sử dụng nước cất thay thế. Môi trường khoai tây - đường - agar (PDA): Đây là môi trường tốt cho sự phân lập và phát triển của nấm. Rửa sạch khoai tây (không gọt vỏ). Cắt khoai tây thành từng miếng nhỏ và luộc trong khoảng 1 giờ, sau đó lọc khoai tây và nước luộc bằng rây (hoặc vải màn) rồi vứt bỏ phần bã đi. Có thể dùng máy xay sinh tố để xay nát hỗn hợp. Hòa tan đường dextrose (glucose) và agar vào 1 lít nước máy cùng với nước lọc khoai tây. Hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Môi trường PDA Khoai tây 200 g Dextrose (glucose) 20 g Agar 20 g Nước máy 1 lit Công thức này có thể được thay đổi một chút bằng cách dùng các loại rau và ngũ cốc khác thay thế khoai tây. Có thể giảm ¼ hoặc ½ lượng khoai tây và lượng đường tùy thuộc yêu cầu sử dụng. Môi trường agar - nước máy (TWA): Đây là môi trường phổ biến để phân lập rất nhiều loài nấm. Có thể tiệt trùng cọng lúa hoặc hạt ngũ cốc rồi đặt lên môi trường để kích thích nấm sản sinh bào tử. Trộn agar trong nước và hấp ở 121°C trong 20 phút. Môi trường TWA Agar 20 g 41
46. Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Nước máy 1 lit Môi trường nước quả V-8 - agar (V-8J): Đây là môi trường tốt cho sự phát triển của nấm, đặc biệt là Phytophthora. Lọc qua nước V-8 trước khi sử dụng. Trộn các thành phần vào nhau và hấp khử trùng ở 121°C trong 20 phút. Nếu không có nước V-8 có thể thay thế bằng nước sinh tố cà chua, cà rốt, cần tây lớn Môi trường V-8J Nước V-8 đã lọc 200 ml CaCO3 3 g Agar 20 g Nước cất 800 ml Môi trường King B - agar (KBA): Đây là môi trường tốt để phân lập vi khuẩn hại nói chung và đặc biệt là pseudomonads huỳnh quang và Erwinia spp. Điều chỉnh pH đến 7,2 và hấp khử trùng ở 121°C trong 25 phút. Môi trường KBA Proteose peptone 20 g Glycerol 10 g K2HPO4 (khan) 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Agar 15 g Nước cất 1 lit Môi trường Nutrient agar (NA): Là môi trường thường được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn. Điều chỉnh pH đến 7,4 và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút. Môi trường NA Chất chiết nấm men 3 g Peptone 5 g NaCl 5 g Agar 15 g Nước cất 1 lit Môi trường Sucrose peptone agar (SPA): Là môi trường thích hợp cho sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn, có thể sử dụng để phân lập vi khuẩn hại. Điều chỉnh pH 7,2 – 7,4 và hấp khử trùng ở 121°C trong 15 phút. 42