Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ sargassum mcclurei in vitro và ứng dụng để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu

91 trang vanle 2320

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ sargassum mcclurei in vitro và ứng dụng để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

nghien_cuu_kha_nang_chong_oxy_hoa_cua_dich_chiet_rong_mo_sar.pdf

Nội dung text: Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ sargassum mcclurei in vitro và ứng dụng để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  PHẠM THỊ MỸ HIỀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM MCCLUREI IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ HẠN CHẾ SỰ OXY HÓA LIPID TRÊN THỊT CÁ THU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN Nha Trang, tháng 06 năm 2014
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  PHẠM THỊ MỸ HIỀN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT RONG MƠ SARGASSUM MCCLUREI IN VITRO VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ HẠN CHẾ SỰ OXY HÓA LIPID TRÊN THỊT CÁ THU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ CHẾ BIẾN THỦY SẢN GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN TS. NGUYỄN THẾ HÂN Nha Trang, tháng 06 năm 2014
i LỜI CẢM ƠN Trong gần ba tháng nghiên cứu tại phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Nha Trang, em đã hoàn thành được đề tài tốt nghiệp của mình. Để đạt được kết quả hôm nay, bên cạnh sự nỗ lực của bản thân là sự giúp đỡ tận tình từ gia đình, thầy cô và bạn bè. Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn đến ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, các quý thầy cô trong khoa Công nghệ Thực phẩm đã tận tình, tạo điều kiện tốt nhất cho em hoàn thành đề tài này. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới thầy TS. Nguyễn Thế Hân, người trực tiếp hướng dẫn em trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Để hoàn thành đề tài tốt nghiệp của mình, em đã nhận được sự giúp đỡ, động viên rất lớn từ gia đình. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ, anh, chị và những người thân trong gia đình. Cuối cùng, cảm ơn tất cả những người bạn đã giúp đỡ em trong thời gian thực hiện đề tài. Khánh Hòa, ngày 10 tháng 06 năm 2014 Sinh viên thực hiện Phạm Thị Mỹ Hiền
ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH v LỜI MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 4 1.1. Giới thiệu về rong mơ Sargassum mcclurei 4 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái 4 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh thái 5 1.1.3. Thành phần hóa học của rong mơ 6 1.1.4. Ứng dụng của rong mơ 7 1.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của rong biển 7 1.2.1. Nghiên cứu trong nước 7 1.2.2. Nghiên cứu ngoài nước 8 1.3. Các phương pháp chiết 11 1.3.1. Cơ sở của quá trình tách chiết 11 1.3.2. Các phương pháp tách chiết bằng dung môi 11 1.3.2.1. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation) 11 1.3.2.2. Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration) 11 1.3.2.3. Tách chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu 12 1.3.2.4. Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước 12 1.3.3. Một số phương pháp tách chiết khác 12 1.3.3.1. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) 12 1.3.3.2. Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm 12 1.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 13 1.3.4.1. Dung môi chiết 13 1.3.4.2. Nhiệt độ chiết 13 1.3.4.3. Thời gian chiết xuất 14 1.4. Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 14
iii 1.4.1. Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) 14 1.4.2. Phương pháp khử gốc tự do DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals) 15 1.4.3. Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity) 15 1.4.4. Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential) 16 1.4.5. Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power) 17 1.4.6. Lipid assay 17 1.4.7. Phương pháp FTC (ferric thiocyanat ) 18 1.4.8. Tổng năng lực khử (reducing power) 18 1.5. Giới thiệu về cá thu Scomberomorus commerson 18 1.5.1. Đặc điểm sinh học và phân bố 19 1.5.2. Thành phần hóa học và dinh dưỡng 20 1.5.3. Hư hỏng thường gặp của thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh 20 1.6. Quá trình oxy hóa lipid và lipid trên cá thu 21 1.6.1. Khái quát chung về lipid ở cá thu 21 1.6.2. Cơ chế của quá trình oxy hóa lipid 21 1.6.3. Tác hại của quá trình oxy hóa lipid 23 1.6.4. Các chất chống oxy hóa 24 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 29 2.1.1. Nguyên liệu rong mơ S. mcclurei 29 2.1.2. Nguyên liệu cá thu S. commerson 29 2.1.3. Hóa chất và thuốc thử 29 2.2. Phương pháp nghiên cứu 30 2.2.1. Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát 30 2.2.2. Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô 32 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 33 2.2.3.1. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết 33 2.2.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 34 2.2.3.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết 35
iv 2.2.3.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết 36 2.2.3.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm 38 2.2.4. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh 39 2.3. Phương pháp phân tích 41 2.3.1. Xác định hàm ẩm 41 2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số 41 2.3.3. Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 41 2.3.4. Xác định tổng năng lực khử 42 2.3.5. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei trên thịt cá thu bảo quản lạnh 42 2.4. Phương pháp xử lý số liệu 43 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 44 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết 44 3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết 47 3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết 51 3.1.4. Ảnh hưởng của số lần chiết 54 3.1.5. Ảnh hưởng của sóng siêu âm 56 3.1.6. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH) 59 3.2. Khả năng hạn chế sự oxy hóa lipid trên cơ thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh của dịch chiết rong mơ S. mcclurei 61 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 4.1. Kết luận 63 4.2. Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 PHỤ LỤC
v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của cá thu 4 20
vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Rong mơ Sargassum mcclurei 4 Hình 1.2. Phản ứng giữa gốc tự do DPPH và một chất chống oxy hóa 15 Hình 1.3. Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 16 Hình 1.4. Cá thu Scomberomorus commerson 19 Hình 1.5. Quá trình tự oxy hóa của lipid không no 23 Hình 1.6. Vô hoạt hóa gốc tự do bởi flavonoid (Nicole, 2001; Marfak, 2003) 10 26 Hình 1.7. Cơ chế tạo phức giữa các flavonoid và các ion kim loại (Men+) (Nicole, 2001; Marfak, 2003) 10 27 Hình 1.8. Các vùng cấu trúc đảm bảo khả năng chống oxy hóa của polyphenol (Amic và cộng sự, 2003) 10 27 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 30 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô 32 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 33 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 34 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 35 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 36 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 38
vii Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm ứng dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh ở t=4C 40 Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 45 Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 46 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 47 Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 49 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng năng lực khử 50 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 51 Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 52 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 53 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiêt đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 54 Hình 3.10. Ảnh hưởng của số lần chiêt đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 55
viii Hình 3.11. Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 56 Hình 3.12. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 57 Hình 3.13. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tổng năng lực khử 58 Hình 3.14. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng khử gốc tự do DPPH 59 Hinh 3.15. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và tổng năng lực khử 60 Hinh 3.16. Mối tương quan giữa hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH 61 Hình 3.17. Sự thay đổi chỉ số TBARS của thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh (t=4C) (Chữ cái trên điểm khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa 62
1 LỜI MỞ ĐẦU Rong biển hay tảo biển có tên khoa học là marine-algae, marine plant hay seaweed. Rong biển phân bố hầu hết ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng nước sâu và vùng biển cạn. Hàng năm, các Đại dương cung cấp cho trái đất trên 200 tỷ tấn rong. Trong tự nhiên, rong biển có vai trò quan trọng đối với sự sống của các sinh vật biển khác. Rong biển cũng được xem như nguồn thực phẩm tương lai của con người. Với tiềm năng đó, rong biển ngày càng được con người khai thác, nuôi trồng và sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Ở Việt Nam trong gần 1000 loài rong biển được tìm thấy, trong số đó ngành rong nâu (Phacophyta) chiếm 143 loài. Cơ sở dữ liệu Species 2000 phiên bản 2006 liệt kê chi rong mơ Sargassum thuộc ngành rong nâu Phacophyta, có tới 691 loài 54. Hiện nay, theo thống kê ở Việt Nam có khoảng 78 loài, nhiều loài có giá trị kinh tế cao như S. oligocystum, S. polycystum (rong mơ nhiều phao), và S. mcclurei. Các loài rong mơ được phân bố chủ yếu ở vùng biển miền Trung bộ trong đó có Khánh Hòa, sản lượng khoảng 4.000 tấn rong khô mỗi năm 13. Tuy nhiên, việc nuôi rong biển vẫn chưa được chú trọng và chưa tương xứng với tiềm năng thế mạnh của Việt Nam. Hiện nay, rong mơ là một trong những đối tượng nghiên cứu được quan tâm nhiều. Nhiều nghiên cứu cho thấy trong thành phần rong nâu chứa các chất có hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng nấm, chống đông tụ và chống bức xạ UV-B, làm lành vết thương và tái tạo cấu trúc tế bào 2. Vì vậy, rong nâu là nguồn nguyên liệu tiềm năng sử dụng trong các lĩnh vực y dược và thực phẩm. Một số nghiên cứu ở Việt Nam mới bước đầu tập trung vào các hoạt tính kháng nấm, kháng u, kháng khuẩn của một số hợp chất như carbohydrate và phenolic từ rong nâu (Nguyễn Duy Nhứt, (2008); Bùi Minh Lý, (2009); Trần Thị Thanh vân, (2009)) 2. Trong khi đó, nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của rong mơ và ứng dụng dịch chiết từ rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid thịt cá vẫn
2 chưa được nghiên cứu một cách đầy đủ. Ngoài ra, nghiên cứu ở Việt Nam chưa nghiên cứu điều kiện chiết thích hợp cho hoạt tính chống oxy hóa cao mà chỉ dừng lại chiết trong một điều kiện. Do đó, đề tài này sẽ nghiên cứu các điều kiện chiết thích hợp để thu được hoạt tính chống oxy hóa cao. Hiện nay, thủy sản là mặt hàng chiếm tỷ trọng lớn trong cơ cấu xuất khẩu của Việt Nam trong đó cá là mặt hàng chủ lực xếp thứ hai sau tôm. Trong thịt cá, lipid chiếm tỷ lệ cao và là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho con người. Cá là nguyên liệu thực phẩm dễ bị hư hỏng. Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến sự giảm chất lượng của cá sau thu hoạch là do quá trình oxy hóa lipid gây nên. Oxy hóa lipid làm giảm giá trị cảm quan và dinh dưỡng đối với sản phẩm thủy sản. Để khắc phục được vấn đề trên, trong công nghiệp chế biến và bảo quản thực phẩm, con người đã sử dụng rộng rãi các chất chống oxy hóa tổng hợp như Butylated hydroxytoluene (BHT), Butylated hydroxynisole (BHA), tocopherol tổng hợp, Tertbutyl hydroquinone (TBHQ), dodecyl gallate, propyl gallate, ascorby palmitate. Mặc dù các chất này mang lại hiệu quả cao tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất chống oxy hóa tổng hợp có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe con người. Ngày nay, với cuộc sống con người ngày càng được nâng cao thì vấn đề về an toàn sức khỏe luôn được quan tâm hàng đầu, vì vậy thị yếu của người tiêu dùng là mua những loại thực phẩm không chứa các hợp chất tổng hợp. Hiện nay, các nhà khoa học đang tập trung nghiên cứu về các chất chống oxy hóa tự nhiên thay thế cho các chất chống oxy hóa tổng hợp. Do đó việc nghiên cứu về các chất chống oxy hóa vừa có chi phí thấp vừa không gây độc cho sức khỏe con người được nhiều người quan tâm và dịch chiết rong mơ có thể là một giải pháp có thể đáp ứng được vấn đề này. Xuất phát từ những thực tế đó, đề tài “Nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ Sargassum mcclurei in vitro và ứng dụng để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu” được thực hiện nhằm xác định điều kiện chiết phù hợp để thu được dịch chiết giàu chất chống oxy hóa từ rong mơ S. mcclurei và tiềm
3 năng sử dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid của thịt cá. Kết quả thu được là cơ sở dữ liệu về điều kiện chiết thích hợp để thu được dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao từ rong mơ. Kết quả của đề tài cũng là cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn các ứng dụng của dịch chiết rong mơ trong thực phẩm và dược phẩm. Từ đó thúc đẩy ngành nuôi trồng rong mơ, tạo thêm nhiều việc làm cho người dân và kinh kế của đất nước. Khi rong có hoạt tính chống oxy hóa chứng tỏ khi sử dụng rong như một thức ăn sẽ rất tốt cho sức khỏe con người. Điều này chứng minh tiềm năng chữa bệnh của rong biển. Đồng thời, việc nghiên cứu ứng dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid của thịt cá thu bảo quản lạnh sẽ là cơ sở để sản xuất các chất bảo quản tự nhiên cho thủy sản đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng khi sử dụng các sản phẩm đảm bảo an toàn sức khỏe vì được bảo quản bằng hợp chất tự nhiên không gây hại cho sức khỏe con người. Đề tài gồm các nội dung chính như sau: Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết (loại dung môi, nhiệt độ, thời gian) đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S.mcclurei; Nghiên cứu ảnh hưởng của số lần chiết và phương pháp chiết bằng sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S.mcclurei; Thử nghiệm khả năng hạn chế sự oxy hóa lipid trên cơ thịt cá thu bảo quản lạnh của dịch chiết rong mơ S.mcclurei.
4 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1. Giới thiệu về rong mơ Sargassum mcclurei 1.1.1. Phân loại và đặc điểm hình thái Ngành: Phacophyta Lớp: Phaeophyceae Bộ: Fucales Họ: Sargassaceae Chi: Sargassum Loài: Sargassum mcclurei Hình 1.1. Rong mơ Sargassum mcclurei Rong mơ S.mcclurei thuộc ngành rong nâu (Phacophyta). Rong nâu có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm 7. Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng.
5 Rong mơ S.mcclurei dài 1-2 m, có khi dài đến 4 m hay hơn khi mọc ở sâu. Đĩa bám rộng khoảng 1cm, thường mọc liên lết 2-3 đĩa bám chung. Đĩa bám có xẻ thùy nhưng không sâu. Trục chính hình trụ ngắn hơn 1 cm. Nhánh chính nhiều, 3-5, hình trụ, không gai to 1,5-2 mm, các nhánh bên mọc cánh 3-7 cm, dài 20 cm. Lá hơi dày và dai chắc, có hình bầu dục kéo dài, dài 1-3 cm, mép có răng cưa nhọn, đôi khi lá dày lên, mép có hai hàng răng hay có mâm nhỏ khi chúng mọc nơi sóng mạnh. Gân giữa không rõ, ổ lông rãi rác, cuống lá ngắn. Phao nhiều, hình xoan hay hơi kéo dài, to 2-5 mm, thường nằm trong một lá nhỏ hình dạng rất biến thiên. Khi rong còn non hay ở phần gốc, phao có cánh bao quanh hình dạng giống như lá. Ở các nhánh thụ cánh thụ cánh này nhỏ hơn hay có khi là mũi dài ở cuối phao 6, 7. Rong là cây khác gốc, cây đực và cái riêng, đế cái hình ba cạnh, có gai mọc thành chùm 2-3 không chia nhánh, dài khoảng 1 cm, noãn cầu đường kính 200 , đế đực hình trụ có u, không gai, dài 1-1,5 cm. Ở các nhánh thụ phao rất nhiều, trà trộn với các chùm đế 7. 1.1.2. Phân bố và đặc điểm sinh thái Rong mơ S. mcclurei là loài rất phổ biến ven biển từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu, làm thành các bãi rong quan trọng, mật độ và sinh lượng cao (có nơi trên 12 kg rong tươi/m2). S. mcclurei thích nghi rộng với các dạng vật bám và điều kiện môi trường khác nhau 6, 7. Chúng có thể mọc lên cao đến vùng triều thấp hay xuống sâu đến 4-5 m hay hơn tùy điều kiện môi trường và vật bám, nhưng thường bị giới hạn bởi dải san hô và hoa đá mềm ở độ sâu 2-4 m. Chúng có thể mọc trên vách đá dốc đứng hay bãi san hô chết bằng phẳng. Ở nơi sóng mạnh, lá dày, cứng, mép có hai hàng răng cưa hay chót lá dày lên thành mâm nhỏ, ở nơi sóng yếu lá mỏng, mép không có bìa đôi. Hai dạng này được gặp phổ biến ven biển, thậm chí ở hai nơi rất gần nhưng có điều kiện sống khác nhau 7 . Mùa sinh sinh trưởng của rong mơ S. mcclurei cũng như với hầu hết các loài Sargassum khác kéo dài từ tháng 11 đến tháng 6 7, 13. Chúng tăng trưởng rất mạnh từ tháng 2 đến tháng 3, có kích thước tối đa vào tháng 3, 4 và hình thành các
6 cơ quan sinh sản, sau đó sẽ bị sóng nhổ tấp vào bờ và tàn lụi. Nhưng có nơi mùa vụ trễ hơn kéo dài đến tháng 7, 8 7, 13. Rong mơ hấp thu chất dinh dưỡng, làm sạch nước, là một mắc xích quan trọng trong mối quan hệ hữu cơ và sự tương tác giữa các thành tố trong hệ sinh thái rạn san hô. Như vậy, rong mơ đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa, cân bằng hệ sinh thái ven biển. Đặc biệt các bãi rong mơ chính là nơi cư ngụ, ươm nuôi ấu trùng, sinh trưởng và sinh sản của rất nhiều loài thủy hải sản như cá chuồn, cá dìa và mực 7. 1.1.3. Thành phần hóa học của rong mơ Hàm lượng protein trong rong mơ ở vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05- 21,11% so với trọng lượng rong khô. Lượng protein này không chỉ phụ thuộc vào thành phần loài mà còn phụ thuộc vào quá trình phát triển của cá thể, điều kiện sống của rong, cách phơi sấy, bảo quản rong nguyên. Rong mơ chứa 17 loại acid amin trong đó có mặt tất cả các acid amin thiết yếu. Vì vậy protein của rong mơ có tính dinh dưỡng cao hơn so với các protein của các cây trồng trên cạn (Trần Thị Luyến và cộng sự, 2004) 13. Hàm lượng lipid chỉ chiếm một phần nhỏ so với các chất hữu cơ khác trong rong. Rong mơ có tới 28 loại acid béo chủ yếu là acid palmitic, aicd oleic, acid linoleic với hàm lượng khoảng 0,2-0,6% so với trọng lượng khô (Trần Thị Luyến và cộng sự, 2004) 13. Thành phần quan trọng nhất trong rong mơ là acid alginic, hàm lượng của nó chiếm khoảng 19-44% so với trọng lượng rong khô (Nguyễn Hữu Đại, 1996) 6. So với các loài rong nâu trên thế giới, rong mơ Việt Nam có hàm lượng acid alginic khá cao là điều kiện cần thiết để rong mơ trở thành nguồn nguyên liệu có giá trị trong công nghiệp sản xuất alginate. Mannitol cũng là một hợp chất quan trọng còn chưa được nghiên cứu nhiều, hàm lượng mannitol trong một số loài rong mơ chiếm khoảng 5,98-17,68% so với trọng lượng khô (Chapman và cộng sự, 1980) 25. Các chất khoáng có mặt trong rong với tỷ lệ tùy vào từng loài, nơi phân bố và giai đoạn phát triển. Ngoài các nguyên tố phổ biến như K, Na,Ca và Mg, rong
7 mơ Việt Nam cũng có khả năng tích tụ nguyên tố stronti khá cao, chiếm khoảng 10- 3-10-2% so với trọng lượng khô. Hàm lượng iod khoảng 0,05-0,25% so với trọng lượng khô (Nguyễn Hữu Đại, 1996) 6. Ngoài ra còn có chất diệp lục và một số loại vitamin khác. 1.1.4. Ứng dụng của rong mơ Một số thành phần của rong mơ được sử dụng rộng rãi trong các ngành y dược, công nghiệp, nông nghiệp và thực phẩm 7, 13. Chính vì những ứng dụng quan trọng của chúng mà rong mơ ngày càng được nhiều nhà khoa học quan tâm, nghiên cứu. Trong y học, rong mơ là nguyên liệu chính sản xuất keo alginat dùng để bao viên thuốc, đã được nghiên cứu làm huyết thanh nhân tạo, làm chỉ khâu vết mổ, chất sát trùng, thuốc cầm máu. Rong mơ có chứa nhiều iod nên có thể ngừa và trị bệnh bướu cổ. Ngoài ra, dân gian còn sử dụng rong mơ để chữa ho, thủy thũng và một số bệnh ngoài da. Gần đây, alginat còn được sử dụng làm chất mang để cố định tế bào. Trong công nghiệp, alginat trong rong mơ được sử dụng trong lĩnh vực hồ vải sợi. Trong nông nghiệp, rong mơ có thể dùng làm phân bón, một số thành phần của rong mơ được sử dụng để pha chế thuốc trừ sâu, thay thế phèn chua. Trong ngành chế biến thực phẩm, keo alginate được sử dụng rộng rãi trong ngành sản xuất bánh kẹo 7, 13. 1.2. Tổng quan về tình hình nghiên cứu khả năng chống oxy hóa của rong biển 1.2.1. Nghiên cứu trong nước Đặng Xuân Cường và cộng sự (2013) đã nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 5 loài rong mơ thu hoạch ở tỉnh Khánh Hòa gồm có S. angustifolium, S. aemulum, S. assimile, S. feldmanii và S. ilicifolium. Kết quả nghiên cứu này cho thấy hàm lượng phlorotannin/polyphenol và khả năng chống oxy hóa ở rong S. angustifolium là cao chất 2. Huỳnh Trường Giang và cộng sự (2013) đã nghiên cứu xác định được thành phần hóa học, hoạt tính chống oxy hóa của hỗn hợp polysaccharide trích ly từ rong mơ S. microcystum. Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng polysaccharide trích ly từ rong mơ S. microsystum có khả năng chống oxy hóa mạnh. Tác giả đề nghị rằng
8 polysaccharide từ rong mơ có thể nghiên cứu ứng dụng trong nuôi trồng thủy sản để tăng cường miễn dịch cho tôm cá nuôi 8. 1.2.2. Nghiên cứu ngoài nước Demirel và cộng sự (2009) đã nghiên cứu xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của một số loài rong nâu ở vùng biển Aegean bao gồm: C. sinuosa, D. dichotoma, D. dichotoma var. implexa, P. fascia và S. lomentaria 30. Trong nghiên cứu này, tác giả đã dùng một số loại dung môi khác nhau bao gồm methanol, dichloromethane và hexane để chiết. Kết quả cho thấy, hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa không những phụ thuộc vào loài rong mà còn phụ thuộc vào dung môi chiết. Thoudam và cộng sự (2011) cũng nghiên cứu sử dụng các dung môi khác nhau để tách chiết một số chất có hoạt tính sinh học từ rong mơ S. muticum, bao gồm alkaloids, anthraquinones, carbohydrates, flavonoids, glycosides, saponins, steroids, phenols, terpenoids và tannins 59. Ngoài ra, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết thu được từ loài rong này cũng được xác định. Kết quả cho thấy, methanol là dung môi cho hiệu quả chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học là tốt nhất. Dịch chiết rong mơ thu được bằng dung môi methanol cũng cho khả năng khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực chống oxy hóa là cao nhất. Hàm lượng polyphenol tổng số và hoạt tính chống oxy hóa của hai loài rong nâu T. conoides và T. ornata ở vùng biển Ấn Độ, được Chakraborty và cộng sự nghiên cứu vào năm 2013 23. Các phương pháp đánh giá khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm khả năng bắt gốc tự do DPPH, 2, 2'-azino-bis-3 ethylbenzothiozoline-6-sulfonic acid diammonium salt + (ABTS) và H2O2/HO, khóa ion Fe (2 ) và tổng năng lực khử. Kết quả cho thấy khả năng chống oxy hóa của rong T. conoides cao hơn đáng kể so với rong T. ornata. Từ kết quả đạt được tác giả kết luận rằng dịch chiết của rong hai loài rong nâu này có thể sử dụng như thành phần của thực phẩm chức năng, giúp tăng cường sức khỏe cho con người.
9 Kelman và cộng sự cũng đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các loài tảo biển ở Hawaii vào năm 2012 41. Nghiên cứu này đã xác định được hoạt tính chống oxy hóa tổng của các chất chiết xuất từ hữu cơ của 37 mẫu tảo bao gồm 30 loài của tảo Hawaii từ 27 giống khác nhau. Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính chống oxy hóa của các loài tảo phụ thuộc theo loài. Budhiyanti và cộng sự (2012) đã nghiên cứu xác định hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết rong nâu Sargassum species được thu tại bờ biển của đảo Java ở Indonesia 22. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng hoạt tính chống oxy hóa của Sargassum chịu ảnh hưởng bởi quá trình chiết, nơi thu hoạch, mùa vụ và loài. Các chất chống oxy hóa tiềm năng từ các loại rong biển kunakeshwar dọc theo bờ biển phía tây Maharashtra, được Megha và cộng sự nghiên cứu vào năm 2013 48. Trong nghiên cứu này, hoạt tính chống oxy hóa của các loài rong biển ăn được gồm có tảo biển (Chaetomorpha media và Enteromorpha intestinalis), rong nâu (Padina tetrastromatica và Dictyota dichotoma) và rong đỏ (Gracilaria corticata và Gelidiella acerosa) đã được xác định sử dụng dung môi chiết là methanol và ethanol. Kết quả nghiên cứu này đã cho thấy Enteromorpha intestinalis với dung môi chiết là methanol và Dictyota dichotoma được chiết trong ethanol có hoạt tính chống oxy hóa tổng giảm mạnh hơn so với các loài rong khác. Năm 2013, Sathya và cộng sự đã nghiên cứu xác định hiệu quả chống oxy hóa và khả năng khử gốc tự do DPPH của hợp chất phlorotannin trong thành phần của rong nâu Cystoseira trinodis thu được ở bờ biển Mandapam 53. Rong nâu Cystoseira trinodis được chiết trong dung môi F5 cho hàm lượng polypheol và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với các dung môi còn lại là DCM, EtoAc (Ethy acetate), F1, F2, F3, F4, F6 và F7. Năm 2013, Indu và Seenivasan đã nghiên cứu xác định hoạt tính chống oxy hóa của một số loài rong ở vùng biển đông nam Ấn Độ gồm có: Chaetomorpha linum, Grateloupia lithophila và Sargassum wightii 37. Kết quả nghiên cứu cho thấy rong S. wightii có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với hai loại rong còn lại. Hoạt tính chống oxy hóa (xác định bởi khả năng khử gốc tự do DPPH) cao nhất khi
10 S. wightii được chiết trong dung môi ethanol. Rong được chiết trong dung môi ethanol có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với khi chiết trong aceton. Foon và cộng sự (2013) cũng nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các loài rong thu được tại bờ biển đông ở Malaysia gồm có: Eucheuma cottonii và Padina sp. 34. Nghiên cứu này đã sử dụng hai phương pháp chiết là chiết thường và chiết soxhlet và dung môi chiết được sử dụng là methanol với khả năng hòa tan trung bình. Kết quả nghiên cứu cho thấy khả năng khử gốc tự do DPPH, hoạt tính khử sắt và hàm lượng polyphenol có mối tương quan cao trong dịch chiết rong biển. Hoạt tính chống oxy hóa, hàm lượng polyphenol tổng số và hàm lượng flavonoid của một số rong lục gồm có: Ulva clathrata, Ulva linza, Ulva flexuosa và Ulva intestinalis thu hái tại vùng bờ biển phía bắc ở Iran, được Farasat và cộng sự nghiên cứu xác định vào năm 2013 33. Kết quả nghiên cứu đã cho thấy rằng các loài rong này có hoạt tính chống oxy hóa đáng kể có thể được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y tế, mỹ phẩm và công nghiệp thực phẩm. Năm 2013, Veeraperumal và công sự cũng nghiên cứu thành công hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết rong nâu Sargassum plagiophyllum 60. Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số các dung môi chiết được sử dụng trong nghiên cứu thì dung môi aceton cho hoạt tính chống oxy hóa cao hơn so với các dung môi còn lại (acidic, alkaline và nước). Như vậy, trong hầu hết các nghiên cứu tách chiết hoạt tính sinh học từ rong nâu nói riêng và rong biển nói chung, người ta thường sử dụng các loại dung môi môi có độc tính cao như methanol và dichloromethane, có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe cho người sử dụng. Ngoài ra, sản phẩm của quá trình tách chiết trước khi sử dụng đòi hỏi một quá trình nghiêm ngặt để loại bỏ các dung môi độc tính này (Esther và cộng sự, 2003) 32. Do đó, việc sử dụng dung môi thân thiện với môi trường hơn cần được nghiên cứu.
11 1.3. Các phương pháp chiết 1.3.1. Cơ sở của quá trình tách chiết Chiết là phương pháp thu lấy một hay nhiều chất từ hỗn hợp đã tách biệt, cô lập và tinh chế các cấu tử có trong hỗn hợp thành những cấu tử riêng. Quá trình chiết gồm hai giai đoạn, giai đoạn 1: Dung môi thấm ướt lên bề mặt nguyên liệu, sau đó thấm sâu vào bên trong do quá trình thẩm thấu tạo ra dung dịch chứa các hoạt chất. Sau đó dung môi tiếp tục hòa tan các chất trên bề mặt bằng cách đẩy các bọt khí chiếm đầy trong các khe vách trống của tế bào. Giai đoạn 2: giai đoạn tiếp tục hòa tan các hợp chất trong các ống mao dẫn của nguyên liệu nhờ vào dung môi đã thấm sâu vào các lớp bên trong 9, 38. 1.3.2. Các phương pháp tách chiết bằng dung môi Tách chiết bằng dung môi là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất tan trong một pha lỏng vào trong một pha lỏng khác không hòa tan với nó, nhằm chuyển một lượng nhỏ chất nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác, nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu. Bên cạnh đó việc chiết thành cao dịch thô là vô cùng quan trọng vì khi đó giữ lại được hoạt chất tốt hơn và dễ dàng cho những công đoạn sau 9. 1.3.2.1. Chiết bằng phương pháp ngấm kiệt (Percolation) Phương pháp ngấm kiệt là một trong những phương pháp trích ly được sử dụng phổ biến nhất không đòi hỏi nhiều thao tác cũng như thời gian 9. Đây là quá trình chiết liên tục, dung môi đã bão hòa hoạt chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi mới. Tuy vậy, ta không thực hiện liên tục mà mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 12 giờ, cho dung môi bão hòa chảy ra rồi thay thế bằng dung môi mới và tiếp tục quá trình trích ly. 1.3.2.2. Chiết bằng phương pháp ngâm dầm (Maceration) Phương pháp ngâm dầm không hiệu quả gì hơn so với phương pháp ngấm kiệt. Ngâm nguyên liệu vào trong bình chứa thủy tinh có nắp đậy. Rót dung môi phủ lớp mẫu, để ở điều kiện nhiệt độ theo yêu cầu, dung môi sẽ thấm vào nguyên liệu và hòa tan các chất tự nhiên. Sau một thời gian dung môi trong bình được đổ ra và rót dung môi mới vào 9.
12 1.3.2.3. Tách chiết bằng phương pháp chiết hồi lưu Chiết hồi lưu là một trong những phương pháp chiết truyền thống. Sự đun hồi lưu là sự chuyển chất trở lại môi trường phản ứng thông qua hệ thống ngưng tụ, cơ sở của phương pháp này là sự tách các chất có nhiệt độ sôi khác nhau ra khỏi hỗn hợp của chúng 9. Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng một lượng ít dung môi mà vẫn có thể chiết kiệt được hoạt chất. Sự chiết suất tự động liên tục nên nhanh chóng. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là không chiết xuất được một lượng lớn mẫu nên chỉ thích hợp cho việc nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. 1.3.2.4. Chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước Đây là phương pháp đặc biệt để trích ly tinh dầu và những hợp chất dễ bay hơi có trong nguyên liệu. Dụng cụ gồm một bình cầu lớn để cung cấp hơi nước, hơi nước sẽ được dẫn sục vào bình chứa có mẫu, hơi nước xuyên thấm qua màng tế bào nguyên liệu và lôi theo những cấu tử dễ bay hơi, hơi nước tiếp tục bay hơi và ngưng tụ bởi một ống sinh hàn, ta thu được hợp chất tinh dầu. Dùng ete dầu hỏa hoặc ether ethylic để trích ly tinh dầu ra khỏi hỗn hợp trên hoặc để yên một thời gian trong bình sẽ có sự phân tách giữa hai pha tinh dầu và nước 9. 1.3.3. Một số phương pháp tách chiết khác 1.3.3.1. Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (Supercritical fluid extraction) Chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn (SFE) được xem như là một phương pháp chiết hữu hiệu để thay thế các phương pháp thông thường sử dụng dung môi hữu cơ (King và cộng sự, 2002) 42 . Phương pháp SFE xảy ra nhanh chóng, tự động, có chọn lọc, không gây cháy nổ và tránh việc sử dụng một số lượng lớn các dung môi độc hại 46. Siêu chất lỏng dễ dàng tách các chất cần thiết do dung môi thay đổi thuộc tính nhanh chóng chỉ với các biến đổi áp lực nhẹ 38. Chất lỏng siêu tới hạn (SCFs) đang ngày càng thay thế dung môi hữu cơ như n-hexane, dichloromethane, chloroform và những dung môi khác thường sử dụng trong chiết công nghiệp, lọc, vì quy định và sức ép môi trường về các hợp chất hữu cơ và khí thải. 1.3.3.2. Phương pháp chiết sử dụng sóng siêu âm Đây là kỹ thuật chiết thay thế rẻ tiền, đơn giản và hiệu quả. Sóng siêu âm thường được sử dụng để cải thiện việc chiết lipid, protein và các hợp chất phenolic từ
13 thực vật, quá trình chiết các hợp chất phenol từ Folium eucommiae có sử dụng sóng siêu âm thu được hiệu quả cao hơn so với khi chiết bằng cách gia nhiệt hoặc bổ sung enzyme hỗ trợ chiết tách (Bar, 1987) 16. Sóng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, do đó giúp cho sự xâm nhập của dung môi vào bên trong tế bào dễ dàng hơn. Ngoài ra siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh dung môi làm tăng diện tích tiếp xúc của dung môi và cải thiện đáng kể hiệu suất chiết 38. 1.3.3.3. Phương pháp chiết sử dụng năng lượng lò vi sóng Đây là một mảng lớn chưa được khai thác, mặc dù bằng cách sử dụng lò vi sóng để làm trung gian trong quá trình chiết có thể duy trì các điều kiện nhẹ và đạt được hiệu quả vượt trội khi chiết (Delazar và cộng sự, 2012) 29. Dưới tác dụng của lò vi sóng nước trong thực vật bị nóng lên nhanh chóng, áp suất bên trong tăng đột ngột làm các mô chứa dịch chiết vỡ ra, dịch chiết thoát ra ngoài, lôi cuốn theo hơi nước sang hệ ngưng tụ. Hiệu suất có thể bằng hoặc cao hơn những phương pháp khác nhưng thời gian chiết rất ngắn. Dịch chiết thu được có mùi tự nhiên. Sản phẩm phân hủy trong dịch chiết tự nhiên giảm đi, tiết kiệm thời gian, năng lượng, chi phí. Tuy nhiên chỉ áp dụng được cho các nguyên liệu có tuyến dịch chiết nằm ngay sát bề mặt lá. Năng lượng chiếu xạ lớn sẽ làm cho một số cấu phần trong dịch chiết phân hủy 38. 1.3.4. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết 1.3.4.1. Dung môi chiết Qua nhiều nghiên cứu cho rằng với mỗi dung môi khác nhau thì khả năng tách chiết không giống nhau 1, 9. Một số yếu tố của dung môi có ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất là độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt 1. Độ phân cực của dung môi: dung môi kém phân cực thì dễ hòa tan những chất không phân cực, dung môi càng phân cực mạnh càng dễ hòa tan các chất phân cực. Độ nhớt và sức căng bề mặt: độ nhớt càng thấp hoặc sức căng bề mặt càng nhỏ thì dung môi càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần thiết. Độ nhớt cao sẽ cản trở quá trình khuếch tán của chất chiết làm giảm hiệu quả chiết. 1.3.4.2. Nhiệt độ chiết Theo công thức tính hệ số khuếch tán của Eintein, khi nhiệt độ tăng thì hệ số khuếch tán tăng, do đó theo định luật Fick, lượng chất khuếch tán cũng tăng lên
14 56. Hơn nữa, khi nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất 1. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng sẽ gây bất lợi cho quá trình chiết xuất trong các trường hợp sau: Đối với hợp chất kém bền nhiệt độ cao: nhiệt độ tăng cao sẽ gây phá hủy một số hoạt chất như vitamine, glycoside, alkaloid. Đối với tạp: khi nhiệt dộ tăng, không chỉ độ tan của chất tăng, mà độ tăng của tạp cũng tăng theo, khi đó dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp. Nhất là đối với một số tạp như gôm, chất nhầy khi nhiệt độ tăng sẽ bị trương nở, tinh bột bị hồ hóa, độ nhớt của dịch chiết sẽ bị tăng, gây khó khăn cho quá trình chiết xuất, tinh chế. Đối với dung môi dễ bay có nhiệt độ sôi thấp: khi tăng nhiệt độ thì dung môi dễ bị hao hụt, khi đó thiết bị phải kín và phải có bộ phận hồi lưu dung môi. Đối với một số chất đặc biệt có quá trình hòa tan tỏa nhiệt: khi nhiệt độ tăng, độ tan của chúng lại giảm. Do đó để tăng độ tan thì cần phải làm giảm nhiệt độ. Từ những phân tích trên thấy tùy từng trường hợp cụ thể mà lựa chọn nhiệt độ chiết sao cho phù hợp (tùy thuộc vào các yếu tố như nguyên liệu chiết, dung môi, phương pháp chiết). 1.3.4.3. Thời gian chiết xuất Khi bắt đầu chiết, các chất có khối lượng phân tử nhỏ thường là hoạt chất sẽ được hòa tan và khuếch tán vào dung môi trước, sau đó mới đến các chất có phân tử lượng lớn (thường là tạp, nhựa, keo) 1. Do đó nếu thời gian chiết ngắn sẽ không chiết hết hoạt chất trong dược liệu; nếu thời gian chiết quá dài, dịch chiết sẽ lẫn nhiều tạp, gây bất lợi cho quá trình tinh chế và bảo quản. Tóm lại, cần lựa chọn thời gian chiết, thành phần dược liệu dung môi, phương pháp chiết phù hợp. 1.4. Các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 1.4.1. Phương pháp TEAC (Trolox equivalent antioxidant capacity) TEAC là phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa so sánh với khả năng chống oxy hóa của Trolox (Demirel và cộng sự, 2009) 30. Cation ABTS+ [2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] là một gốc tự do bền. Đây là một chất phát quang màu xanh, được đặc trưng ở độ hấp thu 734 nm. Khi cho chất chống oxy hóa vào dung dịch chứa ABTS+, các chất chống oxy hóa sẽ khử ion này thành ABTS. Đo độ giảm độ hấp thu của dung dịch ở bước sóng 734 nm để xác định hoạt tính của chất chống oxy hóa trong sự so sánh
15 với chất chuẩn Trolox [6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong môi trường kali persulfate, gốc ABTS+ có thể bền 2 ngày ở nhiệt độ phòng trong tối 51. 1.4.2. Phương pháp khử gốc tự do DPPH (Scavenging ability towards DPPH radicals) Phương pháp bắt gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) được phát minh bởi Blois (1958) 19. DPPH là một gốc tự do bền, có màu tía và có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 517 nm. Khi có mặt chất chống oxy hóa, nó sẽ bị khử thành 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine (DPPH-H), có màu vàng (hình 1.2). Đo độ giảm độ hấp thu ở bước sóng 517 nm để xác định khả năng khử gốc DPPH của chất chống oxy hóa. Hình 1.2. Phản ứng giữa gốc tự do DPPH và một chất chống oxy hóa 1.4.3. Phương pháp ORAC (oxygen radical absorbance capacity) Phương pháp ORAC xác định khả năng hấp thụ gốc tự do chứa oxy hoạt động 49. Phương pháp này đo mức độ phân hủy do bị oxy hóa của fluorescein khi có sự hiện diện của gốc peroxy. Phản ứng trong điều kiện này được so sánh với
16 phản ứng trong sự hiện diện của chất chuẩn Trolox (hay vitamin E) và trong hiện diện của mẫu chứa chất chống oxy hóa cần xác định hoạt tính. Khi fluorescein bị oxy hóa, cường độ phát huỳnh quang sẽ giảm đi. Tiến hành đo độ giảm cường độ phát quang này liên tục trong 35 phút sau khi thêm chất oxy hóa vào. Khi có mặt chất chống oxy hóa, sự phân rã fluorescein sẽ chậm hơn. Xây dựng đường cong biểu diễn sự phụ thuộc độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian và vùng dưới đường cong dùng để tính toán. Kết quả tính toán là mmol Trolox/g mẫu. Ưu điểm của phương pháp ORAC là xác định được có hoặc không có sự trễ pha trong mẫu chứa các chất chống oxy hóa. Đây là một điều rất thuận lợi khi đo các mẫu thực phẩm chứa cả những hợp chất chống oxy hóa có tốc độ phản ứng khác nhau nhiều. Hình 1.3. Đồ thị mô tả độ giảm phát huỳnh quang theo thời gian 1.4.4. Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential) Khả năng chống oxy hóa bằng cách bẫy các gốc tự do (TRAP) là một trong những phương pháp đầu tiên sử dụng để xác định tổng công suất chống oxy hóa của huyết tương hoặc huyết thanh (Wayner và cộng sự, 1985) 61. Phương pháp TRAP sử dụng gốc peroxyl được tạo thành từ 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vào môi trường plasma, các chất khử sẽ
17 bị oxy hóa. Quá trình oxy hóa này được đo đạt thông qua hàm lượng oxy tiêu thụ bằng một điện cực. Khi có mặt chất chống oxy hóa trong môi trường plasma, quá trình oxy hóa sẽ xảy ra chậm hơn. Giá trị TRAP của mẫu thí nghiệm được tính toán dựa vào độ dài pha lag của mẫu so với độ dài pha lag của mẫu trắng và độ dài pha lag của chất chuẩn là dung dịch Trolox. Kết quả tính toán là mmol Trolox/kg mẫu rắn hoặc mmol Trolox/l mẫu lỏng. 1.4.5. Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power) Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức Fe3+-TPTZ [2,4,6- tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (màu tía) thành phức Fe2+-TPTZ (màu xanh) trong môi trường acid 49, 57. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 593 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene) (Strain và Benzie, 1996) 57. Khi cho phức Fe3+-TPTZ vào môi trường chứa chất chống oxy hóa, các chất chống oxy hóa sẽ nhường điện tử cho phức này và sinh ra Fe2+-TPTZ. Kết quả tính toán là mmol Fe2+/ g chất khô. Do đó, khi kết quả tính toán ra lớn thì chúng ta có thể suy đoán rằng trong môi trường phản ứng đó, số lượng các phân tử có thể nhường điện tử là cao. Tuy nhiên, điều này không hoàn toàn đúng vì một phân tử chất chống oxy hóa có thể khử nhiều phức Fe3+-TPTZ cùng lúc. Đây là một hạn chế của phương pháp FRAP. 1.4.6. Lipid assay Phương pháp này đánh giá sự khác biệt trong tốc độ oxy hóa acid linoleic bởi gốc ABAP trong mối quan hệ với chất chuẩn là tocopherol 49. Trước và trong suốt quá trình xảy ra phản ứng, nhiệt độ của hỗn hợp {[70 µl của linoleic acid (2,3 mmol/l)]; 100 ml đệm phosphate 0,05 M (Natri phosphate hòa tan trong nước; 2.88 g SDS; pH 7.4)} được điều chỉnh và duy trì ở 40oC. Lấy 2 µl của dung dịch này cho vào 0,01 ml ABAP (0,04 M). Sau 2-5 phút phản ứng, lấy 0,02 ml dịch chiết cho vào hỗn hợp này. Đo độ hấp thu của hỗn hợp ở 236 nm. Xây dựng đường chuẩn là tocopherol.
18 1.4.7. Phương pháp FTC (ferric thiocyanat ) Mục đích của phương pháp này là khảo sát khả năng làm giảm sự peroxide hóa lipid của chất kháng oxy hóa 49. Thông thường, các gốc oxy tự do sẽ peroxide hóa lipid, tạo thành peroxide. Peroxide sẽ oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, phức của Fe3+ với SCN- có giá trị hấp thu tối đa tại 500 nm. Giá trị hấp thu cao đồng nghĩa với sự peroxide hóa lipid cao trong suốt quá trình ủ dung dịch. Mẫu dung dịch có chứa chất kháng oxy hóa sẽ cho giá trị độ hấp thu thấp hơn mẫu trắng không có chất kháng oxy hóa. 1.4.8. Tổng năng lực khử (reducing power) Nguyên tắc xác định hoạt tính chống oxy hóa của phương pháp này là dựa trên khả năng của các chất chống oxy hoá trong việc khử phức K3Fe(CN)6 thành phức K4Fe(CN)6, phức này tác dụng với FeCl3 thành KFe[Fe(CN)6] (xanh Pruss) 49. Khi đó, độ tăng cường độ màu xanh tỷ lệ với hàm lượng chất chống oxy hóa có trong nguyên liệu. Mức độ tăng cường độ màu này được đo ở bước sóng 690 nm trong sự so sánh với chất chuẩn là dung dịch acid ascorbic. 1.5. Giới thiệu về cá thu Scomberomorus commerson Tên khoa học: Scomberomorus commerson Tên tiếng Anh: Narrow barred Spanish Mackerel Tên tiếng Việt: Cá thu vạch Cá thu vạch thường được gọi ngắn gọn là cá thu-là một loài cá thuộc: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Scombridae Chi: Scomberomorus Loài: Scomberomorus commerson
19 Hình 1.4. Cá thu Scomberomorus commerson 1.5.1. Đặc điểm sinh học và phân bố Cá thu có thân thuôn dài, mình dẹt hai bên. Gồm 5 loài thuộc hai giống khác nhau, trong đó loài thường thấy là cá thu vạch, cá thu chấm và cá thu Nhật, cá thu vạch có sản lượng cao sau đó là cá thu chấm. Gồm hai họ cá thu là họ cá thu ngừ và họ cá thu rắn, trong đó cá thu vạch thuộc họ cá thu ngừ 4, 14. Đặc điểm hình thái: Thân hình thoi rất dài, dẹt hai bên. Phần trên kéo dài đến ria dưới mắt hoặc gần sau mắt. Răng trên và hàm rất nhọn và chắc. Có hai vây lưng, vây lưng thứ nhất có 14-17 gai cứng và vây lưng thứ hai có 14-19 tia mềm, sau đó là 8-10 vây phụ, vây hậu môn bắt đầu từ dưới điểm giữa của vây thứ hai và có 14- 18 tia, sau đó 8-10 vây phụ. Đường bên gấp khúc xuống phía dưới ngay sau góc vây lưng thứ hai. Lưng màu xám hoặc xanh thẫm, hai bên thân trắng bạc có ánh nâu, có nhiều vạch thẳng đứng (20-65 vạch) 4. Phân bố: Ấn Độ Dương-Tây Thái Bình Dương, Đông Phi và Ấn Độ, Xrilanca, Oxtraylia, Indonexia, Malaixia, Philippin, Thái Lan, Nhật Bản, Trung Quốc, Việt Nam: Vịnh Bắc Bộ, Miền Trung, Đông và Tây Nam Bộ 4, 14. Mùa vụ: Ở Việt Nam, cá thu vạch được khai thác hầu như quanh năm, chính vụ Bắc vào các tháng từ tháng 4 đến tháng 7, chính vụ Nam vào các tháng từ tháng 9 đến tháng 4. Vùng khai thác ở Vịnh bắc Bộ, Trung, Đông và Tây nam Bộ. Ngư cụ đánh bắt bằng lưới 4, 14. Cá thu vạch sinh sản theo mùa và tập trung ở vùng khơi nơi có dòng nước ấm, gần các rạn san hô hay đá ngầm. Khi còn nhỏ chúng sống thành đàn cùng loài,
20 nhưng khi lớn lên có thể sống lẫn với các loài cá khác cùng họ. Cá thu vạch trưởng thành sau 2 năm, chiều dài trung bình thường là 80 cm, nặng 5 kg. Có cá thể dài tới 240 cm và nặng 70 kg. Cá thu vạch là loài cá săn mồi,chủ yếu là cá nhỏ 14. 1.5.2. Thành phần hóa học và dinh dưỡng Thành phần hóa học của thịt cá thu gồm có nước, protein, lipid, gluxit, khoáng chất và vitamin 4, 12. Thành phần hóa học phụ thuộc giống loài, độ thành thục sinh lý, ngư trường, mùa vụ khai thác. Thành phần hóa học ảnh hưởng rất lớn đến giá trị cảm quan và giá trị dinh dưỡng của sản phẩm 4. Bảng 1.1. Thành phần hóa học cơ bản của cá thu 4 Thành phần Nước Protein Lipid Gluxit Khoáng Cá thu 75,2% 23,3% 12,2% <0,5% 2,5% 1.5.3. Hư hỏng thường gặp của thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh Đặc tính của động vật thủy sản là dễ ươn hỏng, biến chất. Nguyên liệu thủy sản sau khi chết xảy ra các biến đổi làm giảm chất lượng, giảm giá trị của nguyên liệu. Do đó, nguyên liệu thủy sản sau khi thu hoạch cần phải được bảo quản nhanh chóng để kéo dài thời gian sử dụng. Tuy nhiên, thời gian bảo quản cũng có hạn, đặc biệt là bảo quản lạnh chỉ giữ tươi nguyên liệu được trong thời gian ngắn. Bảo quản lạnh cá thu sẽ làm giảm sự phát triển của vi sinh vật, enzyme gây hư hỏng thịt cá. Mặc dù bảo quản ở nhiệt độ thấp nhưng các biến đổi về cảm quan, hóa lý và vi sinh vẫn xảy ra ở tốc độ thấp. Đây chính là nguyên nhân gây hư hỏng ở động vật thủy sản trong quá trình bảo quản lạnh mà cá thu có hàm lượng lipid cao (12,2%) 4, trong đó hàm lượng acid béo chưa bão hòa cao gấp ba lần hàm lượng acid béo bão hòa. Các acid béo tập trung chủ yếu ở phần da, phần cơ thịt màu sáng, phần đầu, bụng và gan. Vì vậy thịt cá thu rất dễ hư hỏng, nhanh bị phân hủy, nhất là trong môi trường nhiệt đới nóng ẩm. Trong quá trình bảo quản lạnh đông các axit béo tự do được sinh ra từ photpholipid và triglyxerit, có ảnh hưởng xấu đến chất lượng của cá. Axit béo tự do gây ra mùi vị xấu, ảnh hưởng đến cấu trúc và khả năng giữ nước của protein cơ thịt.
21 1.6. Quá trình oxy hóa lipid và lipid trên cá thu 1.6.1. Khái quát chung về lipid ở cá thu Lipid là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào động vật và thực vật. Lipid là hợp chất rất cần thiết và có chức năng quan trọng trong cơ thể sống mà chúng tồn tại 3. Lipid là ester của glycerine và acid béo cao phân tử (C1-C36) trong mạch có ít hay nhiều nối đôi liên kết với nhau. Thành phần quan trọng và quyết định đến tính chất của lipid là các aicd béo no hoặc không no và số nối đôi, vị trí nối đôi trong các acid béo không no có ảnh hưởng đến màu sắc mùi vị của lipid, đặc biệt trong phân tử lipid mà các aicd béo không no có nhiều nối đôi thì làm cho quá trình oxy hóa lipid rất dễ xảy ra 3. Lipid trong cá xương như cá thu được chia làm hai nhóm chính: phospholipid và triglycerid. Phospholipid tạo nên cấu trúc của màng tế bào. Triglycerid là lipid dự trữ năng lượng có trong các nơi dự trữ chất béo, thường ở nơi các tế bào mỡ đặc biệt được bao quanh bằng một màng phospholipid và mạng lưới collagen mỏng hơn. Lipid của cá khác với lipid của động vật có vú, chủ yếu do lipid của cá có tới 40% acid mạch dài (14-22 nguyên tử carbon) và mức độ không no cao. Phần trăm acid béo không no với 4, 5 hoặc 6 nối kép trong lipid cá nước ngọt (khoảng 70%) ít hơn đôi chút so với trong lipid của cá biển (khoảng 88%) (Stansbi và Hall, 1967) 3. Trong dinh dưỡng cho người, các acid béo như acid linoleic và linolenic được coi là quan trọng vì cơ thể không thể tổng hợp được chúng. Trong cá biển, các acid béo này chỉ chiếm khoảng 2% lipid tổng số, một tỷ lệ nhỏ so với nhiều loại dầu thực vật. Tuy nhiên dầu cá có chứa nhiều acid béo không no khác cần thiết để phòng ngừa các bệnh ngoài da, giống như acid linoleic và arachidonic. 1.6.2. Cơ chế của quá trình oxy hóa lipid Quá trình oxy hóa là quá trình phản ứng hóa học xảy ra, trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa 3, 10. Trong lipid cá có một lượng lớn acid béo không no đa nối đôi nên chúng rất nhạy cảm với quá trình oxy hóa nhờ cơ chế tự xúc tác (hình 1.5) 3. Quá trình bắt đầu
22 bằng sự giải phóng một nguyên tử hydro từ carbon trung tâm của cấu trúc pentadien là cấu trúc có trong hầu hết các nhánh acyl của acid béo chứa hơn một nối đôi: -CH=CH-CH2-CH=CH- -CH=CH-C•H-CH=CH- + H• Gốc tự do (L•) phản ứng rất nhanh với oxy không khí tạo thành peroxy của gốc tự do (LOO•), peroxy của gốc tự do lại có thể lấy một hydro từ một nhánh acyl khác để hình thành một lipid hydroperoxyt (LOOH) và một gốc lipid tự do mới (L•). Sự lan truyền của phản ứng dây chuyền này sẽ tiếp tục mãi đến khi một gốc tự do được loại ra bằng các phản ứng với gốc tự do khác mà phản ứng của chúng sẽ tạo thành gốc (A•) kém hoạt động hơn nhiều. Phản ứng dây chuyền sẽ tạo thành một lượng tương đối lớn hydroperoxyt. Với xúc tác của các ion kim loại nặng, hydroperoxyt dễ dàng bị bẻ gãy thành các sản phẩm tự oxy hóa thứ cấp với mạch carbon ngắn hơn. Các sản phẩm thứ cấp này phần lớn là các aldehyt, xeton, rượu và một phần nhỏ là các acid carboxylic và các alkan-gây nên những mùi rất khác nhau và trong một số trường hợp còn gây mất màu làm cho sản phẩm có màu hơi vàng 3. Các ion kim loại rất quan trọng trong bước đầu tiên của sự tự oxy hóa lipid- quá trình khởi đầu-trong việc xúc tác hình thành các gốc phản ứng với oxy, chẳng hạn như gốc hydroxyl (OH•). Gốc này lập tức phản ứng với lipid hoặc các phân tử khác tại nơi nó được tạo ra. Hydroperoxyt của acid béo cũng có thể được tạo thành dưới tác động của enzyme lipoxygenaze mà hàm lượng của loại enzyme này lại khác nhau ở các mô cơ cá khác nhau. Các enzyme có hoạt độ khá cao được tìm thấy trong mang và dưới da của nhiều loài cá. Enzyme này không bền và có lẽ chỉ quan trọng đối với sự oxy hóa lipid ở cá tươi 3.
23 Hình 1.5. Quá trình tự oxy hóa của lipid không no 1.6.3. Tác hại của quá trình oxy hóa lipid Oxy hóa lipid là một trong những nguyên nhân chính gây suy giảm chất lượng trong cơ thịt cá. Quá trình oxy hóa lipid xảy ra làm giảm hương vị, mùi, màu sắc, cấu trúc và sinh ra các hợp chất độc hại (Kanner, 1994) 40. Quá trình oxy hóa lipid tạo ra nhiều sản phẩm khác nhau. Sản phẩm cấp một chủ yếu của quá trình oxy hóa chất béo là hợp chất không mùi hydroperoxyde. Tuy nhiên các hợp chất này thường không bền nên dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành các sản phẩm cấp hai mà chủ yếu là malondialdehyde, alkanes, ketones, esters, rượu, acid và các hydrocarbons. Trong đó, các aldehydes được xem là thành phần chính làm cho sản phẩm có mùi ôi thiu. Các sản phẩm cấp hai của quá trình oxy hóa lipid sẽ tiếp tục bị oxy hóa để tạo thành các sản phẩm cấp ba, hoặc liên kết với các thành phần cấu thành nên protein như acid nucleic, acid amine, peptide để tạo thành các phức chất mang mùa nâu sẫm như aldehyde, xeton, rượu và một phần nhỏ là các acid carboxylic và các alkan. Vì vậy, quá trình oxy hóa lipid là một trong những nguyên nhân chính làm giảm chất lượng thực phẩm vì làm giảm giá trị dinh dưỡng và cảm quan của sản phẩm. Khi bị oxy hóa lipid, thực phẩm sẽ thay đổi màu sắc và kết cấu, tạo ra các mùi vị xấu có mùi ôi khét và mất đi các acid béo thiết yếu như: acid oleic, acid
24 linoleic, acid palmitoleic, các vitamine tan trong dầu như A, D, E, carotenoids bị phá hủy làm giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm. Do đó, các thực phẩm bị oxy hóa lipid sẽ tổn thất giá trị dinh dưỡng rất lớn, khó tiêu hóa, có hại cho sức khỏe của người tiêu dùng, đặc biệt là gây thiệt hại về kinh tế cho người sản xuất. 1.6.4. Các chất chống oxy hóa Các chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào của cơ thể (Jovanovic và Simic, 2000; Lachman và cộng sự, 2000; Singh và Rajini, 2004) 10. Dựa trên nguyên tắc hoạt động, các chất chống oxy hóa được phân thành hai loại: các chất chống oxy hóa bậc một và các chất chống oxy hóa bậc hai. Các chất chống oxy bậc một khử hoặc kết hợp với các gốc tự do do đó kìm hãm pha khởi phát hoặc bẻ gãy dây chuyền phản ứng của quá trình oxy hóa. Các chất chống oxy hóa bậc hai kìm hãm sự tạo thành các gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích hoạt sự tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn) (singh và Rajini, 2004; Rollanhd, 2004) 10. Một số chất chống oxy hóa tự nhiên Các hợp chất polyphenol Các hợp chất polyphenol là một trong các nhóm sản phẩm trao đổi chất bậc hai chủ yếu của thực vật , rất đa dạng về cấu trúc và chức năng. Ở thực vật, các hợp chất phenol tạo màu cho thực vật (anthocyanin); bảo vệ thực vật trước tia cực tím, chống lại sự oxy hóa; là hợp chất tín hiệu cho sự cộng sinh giữa thực vật và vi khuẩn nốt sần; bảo vệ thực vật trước sự tấn công của vi sinh vật gây hại (như vi khuẩn gây thối rễ ở khoai tây); là vật liệu góp phần vào độ bền chắc của thực vật và sự thấm của thành tế bào đối với nước và khí (Chirinos và cộng sự, 2007; Al- Saikhan và cộng sự, 1995) 10. Đối với các thực phẩm, các hợp chất phenol là những chất hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyết định hương vị của nhiều loại sản phẩm có nguồn gốc từ thực vật. Chúng ảnh hưởng đến màu sắc và vị của hầu hết các sản phẩm thực phẩm và ở một mức độ nhất định chúng tham gia vào các quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới tạo nên hình thơm đặc biệt cho sản phẩm (Lê Ngọc
25 Tú, 2003) 10. Về mặt y học, việc sử dụng các thực phẩm giàu các hợp chất phenol như trà, rượu vang đỏ được chứng minh là có lợi cho sức khỏe. Tác dụng tốt này có được là do khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất phenol. Vitamine C Vitamine C có khả năng vô hoạt các gốc tự do rất tốt do nó có thể chuyển cho các gốc tự do hai nguên tử hydro của nó và khi đó nó trở thành dehydroascorbic acid (Pincemail và cộng sự, 1998; Pincemail, 2006) 10. Ngoài ra, vitamine C còn có khả năng hoạt động hiệu lực với các chất chống oxy hóa khác trong cơ thể như vitamine E , carotenoid và flavonoid. Khi có sự tiếp xúc giữa vitamine E và gốc tự do peroxide của acid béo, vitamine E chuyển điện tử của nó cho gốc tự do nhưng đồng thời nó trở thành gốc tự do tocopheryl (vitamine E ở dạng oxy hóa). Vitamine C tiến hành khử gốc tocopheryl thành vitamine E nguyên dạng, sẵn sàng vô hoạt các gốc tự do peroxide mới. Các catotenoid và các flavonoid khi vô hoạt các gốc tự do cũng được hoàn nguyên với cơ chế tương tự bởi vitamin C. Điều này góp phần hạn chế sự tự kích hoạt oxy hóa của các gốc vitamine E và flavonoid (Burke và cộng sự, 2001; Jovanvic và Simic, 2000) 10. Các carotenoid Các caorotenoid là các hợp chất màu hữu cơ có trong thực vật và một số sinh vật có khả năng quang hợp. Chúng đem lại màu vàng đến đỏ cho thực vật đồng thời tham gia quá trình quang hợp với vai trò là sắc tố phụ. Đối với con người, các carotenoid là các chất chống oxy hóa quan trọng vì nó có mặt trong rất nhiều loại thực phẩm đồng thời nó có khả năng hoạt động trong môi trường chất béo là nơi rất dễ xảy ra sự oxy háo và gây hậu quả nghiêm trọng (màng tế bào). Khác với vitamine C và polyphenol không được tích lũy trong cơ thể mà bị thải ra ngoài qua con đường nước tiểu (Jovanovic và Simic, 2000; Tapiero và cộng sự, 2002) 10, các carotenoid với đặc điểm hòa tan trong chất béo được tích lũy trong cơ thể, xâm nhập dễ dàng vào các vị trí dễ bị oxy hóa như màng tế bào do đó hiệu quả chống oxy hóa của chúng cao hơn các chất oxy hóa hòa tan trong nước (Huang và cộng sự, 2002; Brown và cộng sự, 2003) 10.
26 Vitamine E Vitamine E tồn tại ở tám dạng trong tự nhiên: bốn dạng tocopherol và tocotrienol. Tính chất hòa tan trong chất béo của vitamine E giúp chúng có khả năng thâm nhập sâu vào các màng sinh học vốn chứa nhiều acid béo không no và ngăn cản chuỗi phản ứng oxy hóa lipid. Các vitamine E sẽ chuyển hydro của nó cho các gốc tự do peroxide. Gốc tocopheryl tạo thành được khử về trạng thái ban đầu nhờ vitamine C (Niki và cộng sự, 1995; Huang và cộng sự, 2002; Pincemail, 2006) 10. 1.6.5. Cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa tự nhiên-polyphenol Các hợp chất phenol rất đa dạng về cấu trúc. Tùy cấu trúc mạch cacbon mà được phân thành phenol đơn giản (C6), acid phenolic, flavonoid (C6-C3-C6), stilbene (C6-C2-C6) và lignine (C6-C2)n (Scalbert và Wiliamson, 2000) 10. Đến lượt mình, cấu trúc của các hợp chất phenol lại quyết định cơ chế hoạt động chống oxy hóa. Các cơ chế chống oxy hóa của các hợp chất phenol như sau: Khử và vô hoạt các gốc tự do nhờ thế oxy hóa khử thấp. Tạo phức với các ion Fe2+ và Cu2+. Kìm hãm hoạt động của các enzyme có khả năng tạo gốc tự do như xanthine oxidase. Các hợp chất flavonoid (Fl-OH) nhờ thế oxy hóa khử thấp có thể khử các gốc tự do như peroxyl, alkoxyle và hydroxyle bằng cách nhường nguyên tử hydro (Jovanovic và Simic, 2000) 10. Fl-OH + R Fl-O + RH (Với R là gốc tự do) Gốc flavonoid tự do (Fl-O) sau đó lại kết hợp với một gốc tự do khác để tạo thành hợp chất bền (Hình 1.6). Hình 1.6. Vô hoạt hóa gốc tự do bởi flavonoid (Nicole, 2001; Marfak, 2003) 10
27 Sắt và đồng là những kim loại đảm nhận những vai trò sinh lý nhất định trong cơ thể như tham gia vận chuyển oxy (hemoglobin), cofactor của nhiều enzyme (Fe đối catalase, Cu đối với superoxyde dismutase). Tuy nhiên các kim loại này có thể tham gia phản ứng Fenton và Haber để tạo nên các gốc tự do (Favier, 2003; Gardes và cộng sự, 2003) 10. Các flavonoid có khả năng tạo phức với các kim loại này và hạn chế tác dụng xấu của chúng (Hình 1.7). 3+ - 2+ Fe + O2 → Fe + O2 2+ + - 3+ 2+ H2O2 + Fe (Cu ) → OH + OH + Fe (Cu ) Phản ứng Fenton - - O2 + H2O2 → OH + OH + O2 Phản ứng Haber-Weiss Hình 1.7. Cơ chế tạo phức giữa các flavonoid và các ion kim loại (Men+) (Nicole, 2001; Marfak, 2003) 10 Hình 1.8. Các vùng cấu trúc đảm bảo khả năng chống oxy hóa của polyphenol (Amic và cộng sự, 2003) 10
28 Khả năng chống oxy hóa của các hợp chất phenol phụ thuộc chặt chẽ vào đặc điểm cấu tạo của chúng. Các bộ phận đảm nhiệm chức năng chống oxy hóa của phenol được giới thiệu ở hình 1.8 (Nicole, 200; Amic và cộng sự, 2003) 10. Đó là: Các nhóm hydroxyl ở dạng ortho của vòng B có khả năng cho điện tử. Liên kết đôi giữa C2 và C3 và nhóm ceton ở C4 đảm bảo việc phân bố điện lại điện tử cho vòng B. Các nhóm hydroxyl ở C3 và C5 cùng với nhóm ceton ở C4 đảm bảo khả năng tạo phức với kim loại.
29 CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu rong mơ S. mcclurei Nguyên liệu sử dụng trong đề tài này là rong mơ (S. mcclurei), được thu mua tại Thành phố Nha Trang (Khánh Hòa). Nguyên liệu rong mơ dạng tươi (10 kg) được rửa sạch tạp chất và muối, sau đó phơi khô dưới ánh nắng mặt trời đến độ ẩm là 16,51%. Rong khô được nghiền nhỏ rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng. 2.1.2. Nguyên liệu cá thu S. commerson Cá thu (S. commerson) nguyên con được mua tại chợ Vĩnh Hải, Thành phố Nha Trang (Khánh Hòa), cá được bảo quản bằng nước đá trong thùng xốp cách nhiệt và vận chuyển về phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nha Trang để tiến hành các xử lý tiếp theo. 2.1.3. Hóa chất và thuốc thử Acid tricloaxetic (TCA) và ethanol được sản xuất tại Trung Quốc; 1,1-Diphenyl- 2-picrylhydrazyl (DPPH), thuốc thử Folin–Ciocalteu, Potassium ferricyanide (K3(Fe[CN]6), Aluminium chloride (AlCl3) và Sodium carbonate (Na2CO3) được mua từ công ty Sigma Ardrich (Hoa Kỳ); Thiobarbituric acid (TBA) và acid gallic mua từ công ty Wako (Nhật Bản). Tất cả hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt hạng phân tích.
30 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát Rong mơ S. mcclurei tươi Rửa Phơi khô Nghiền rong Bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết (nồng độ dung môi, Chiết nhiệt độ, thời gian, số lần chiết và sóng siêu âm) đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Lọc Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống Dịch chiết oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH) Bảo quản sản phẩm Bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết polyphenol từ dịch chiết rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy rong mơ S. mcclurei hóa lipid trên thịt cá thu bảo quản lạnh Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
31 Giải thích quy trình: Rong mơ tươi được thu mua tại Thành phố Nha Trang (Khánh Hòa). Nguyên liệu rong mơ dạng tươi (10 kg) được rửa sạch tạp chất và muối, sau đó phơi khô dưới ánh nắng mặt trời đến độ ẩm là 16,51%. Rong khô được nghiền nhỏ rồi đem bảo quản trong các túi PA trong điều kiện hút chân không, ở nhiệt độ phòng đến khi sử dụng. Sau đó rong được đem về phòng thí nghiệm của khoa Công nghệ Thực Phẩm, trường Đại học Nha Trang để tiến hành nghiên cứu. Chọn rong khô để nghiên cứu nhằm mục đích: rong khô có hàm ẩm nhỏ góp phần hạn chế sự phát triển của vi sinh vật gây hư hỏng rong, ức chế các quá trình tổng hợp và chuyển hóa trong rong. Bên cạnh đó, rong khô gọn, nhẹ nên được bảo quản dễ dàng, ít chiếm diện tích chứa đựng và thuận lợi trong việc vận chuyển trong quá trình tiến hành nghiên cứu. Đồng thời, khi hàm lượng ẩm trong nguyên liệu giảm, tốc độ trích ly tăng lên vì nước tác dụng với protein và các chất háo nước khác ngăn cản sự dịch chuyển của dung môi thấm sâu vào trong nguyên liệu, làm chậm quá trình khuếch tán. Nghiền rong: Dùng máy nghiền để nghiền nhỏ rong vì rong nhỏ sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc giữa rong với dung môi, góp phần phá vỡ cấu trúc tế bào rong, tạo điều kiện thuận lợi cho các chất hòa tan trong dung môi. Rong sau khi được nghiền nhỏ, một phần nhỏ được đem đi xác định độ ẩm. Chiết: Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa (năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH) đều bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố trong quá trình chiết như nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, số lần chiết và sóng siêu âm. Do đó, tại công đoạn chiết này sẽ tiến hành bố trí các thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố trên để tìm môi trường chiết cho hoạt tính mong muốn cao. Lọc: Mẫu sau khi chiết sẽ được lọc qua giấy lọc để thu dịch có chứa hợp chất cần thiết, loại bỏ những tạp chất không tan như cặn và bã rong. Dịch chiết thu được sẽ được đem đi bố trí các thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa (tổng năng lực khử, khả năng khử gốc tự do DPPH).
32 Sau khi xác định được môi trường chiết thích hợp cho hàm lượng polyphenol và khả năng chống oxy hóa cao thì tiến hành bố trí thí nghiệm áp dụng dịch chiết rong để hạn chế oxy hóa lipid trên thịt cá thu bảo quản lạnh. Phần dịch chiết chưa sử dụng sẽ được bảo quản lạnh. 2.2.2. Thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Sấy đến khối lượng không đổi Làm nguội Cân Tính kết quả Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định độ ẩm của rong mơ khô Sơ đồ bố thí nghiệm xác định độ ẩm được mô tả ở hình 2.2. Sấy cốc đến khối lượng không đổi: Cốc được rửa sạch, úp khô, sấy ở nhiệt độ 105C trong khoảng 1 giờ, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi cân, sau đó sấy tiếp ở nhiệt độ trên, lấy ra làm nguội trong bình hút ẩm rồi đem cân và sấy đến khi nào khối lượng giữa hai lần liên tiếp sai khác không quá 5.10-4 g là được (khối lượng không đổi). Cân chính xác khoảng 5 g rong cho vào cốc đã sấy đến khối lượng không đổi. Đánh tơi mẫu bằng đũa thủy tinh, dàn đều mẫu trên đáy cốc. Chuyển cốc vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 60C trong 2 giờ. Sau đó, nâng nhiệt độ lên 105C, sấy liên tục trong 3 giờ. Chú ý trong quá trình sấy cứ sau 1 giờ đảo mẫu một lần. Lấy mẫu ra để nguội trong bình hút ẩm rồi cân trên cân phân tích, sau đó sấy tiếp đến khối lượng không đổi như trên.
33 Tính kết quả: Công thức xác định hàm ẩm: W=(G1-G2)/(G1-G)*100(%) Trong đó: W: Độ ẩm của nguyên liệu (%) G: Khối lượng cốc sau khi sấy đến khối lượng đổi (g) G1: Khối lượng cốc và mẫu trước khi sấy (g) G2: Khối lượng cốc và mẫu sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g) 2.2.3. Bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ Trong quá trình tiến hành thí nghiệm cần chú ý: Rong tránh tiếp xúc với ánh sáng mặt trời do polyphenol dễ bị phân hủy, thường xuyên kiểm tra nhiệt độ trong quá trình chiết và khi thời gian thực hiện quá dài thì cần thường xuyên kiểm tra các điều kiện còn lại để đảm bảo độ chính xác. 2.2.3.1. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết Ethanol Ethanol Ethanol Ethanol 0% 30% 70% 100% Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Chọn nồng độ dung môi ethanol thích hợp Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
34 Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được mô tả ở hình 2.3. Cân chính xác 2 g nguyên liệu rong khô và cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Rong khô nguyên liệu được chiết bằng dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0; 30; 70 và 100%. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), nhiệt độ chiết là 60C và thời gian chiết là 30 phút, được giữ cố định. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.3.2. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết 30C 45C 60C 75C Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Chọn nhiệt độ chiết thích hợp Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
35 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.4. Cân chính xác 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol ở các nhiệt độ khác nhau bao gồm 30; 45; 60 và 75C, trong cùng khoảng thời gian là 30 phút. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.3.3. Thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết 10 phút 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút Lọc Dịch chiết Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Chọn thời gian chiết thích hợp Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
36 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ được mô tả ở hình 2.5. Cân chính xác khoảng 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol ở các thời gian chiết khác nhau là 30; 60; 90 và 120 phút, tại cùng nhiệt độ là 60C. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số, tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH. 2.2.3.4. Thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Dịch chiết 1 Chiết lần 1 Bã rong Chiết lần 2 Bã rong Dịch chiết 2 Chiết lần 3 Dịch chiết 3 Xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa Chọn số lần chiết thích hợp Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
37 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.6. Cân chính xác khoảng 2 g rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu (NL/DM) là 1/20 (w/v), rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol tại nhiệt độ là 60C trong thời gian 30 phút. Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 1). Phần bã thu được từ chiết lần 1 được tiếp tục chiết trong điều kiện như trên. Hỗn hợp chiết lần hai được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 2). Phần bã thu được từ lần chiết thứ hai tiếp tục thực hiện lần chiết thứ 3 với các điều kiện như trên. Hỗn hợp chiết lần ba được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40 để thu dịch chiết (chiết lần 3). Dịch chiết thu được sau khi lọc từ ba lần chiết được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa.
38 2.2.3.5. Thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm Rong mơ khô (đã nghiền nhỏ) Chiết Không sử dụng Có sử dụng sóng siêu âm sóng siêu âm Lọc Dịch chiết 0,1 ml 0,2 ml 0,3 ml 0,5 ml 0,7 ml 1 ml dịch dịch dịch dịch dịch dịch Xác định Xác định Xác hàm khả năng định lượng khử gốc tổng polyphen tự do năng ol tổng DPPH lực số khử Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ
39 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong được mô tả ở hình 2.7. Cân chính xác 2 g rong rong khô nguyên liệu cho vào bình nón thủy tinh dung tích 50 ml. Trong thí nghiệm này, rong nguyên liệu được chiết bằng 30% ethanol, tại nhiệt độ là 60C trong thời gian 10 phút và bằng hai phương pháp chiết khác nhau (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm). Quá trình chiết được thực hiện trong bể ổn nhiệt (Elma, S300H, Elmasonic, Germany). Sau khi kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc Whatman No.40. Dịch chiết thu được sau khi lọc được bổ sung cùng loại dung môi đến thể tích cuối cùng là 40 ml. Sau đó, dịch chiết được xác định hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa. Từ đó so sánh được sự khác nhau giữa hai phương pháp chiết (chiết tĩnh và chiết có đánh sóng siêu âm). Khi xác định tổng năng lực khử và khả năng khử gốc tự do DPPH, ta dùng dịch chiết với các thể tích lần lượt khác nhau để so sánh ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng chống oxy hóa với các thể tích dịch chiết khác nhau. Cụ thể các thể tích dịch chiết được sử dụng như sau: Xác định tổng năng lực khử: 0,1; 0,2 và 0,3 ml dịch chiết. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH: 0,5 ; 0,7 và 1 ml dịch chiết. 2.2.4. Thí nghiệm sử dụng dịch chiết rong mơ S. mcclurei để hạn chế sự oxy hóa lipid trên thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh Chuẩn bị dịch chiết cô đặc: Cân chính xác 15 g nguyên liệu rong mơ khô cho vào bình nón thủy tinh có dung tích 500 ml. Tiếp theo, 300 ml dung dịch 30% ethanol được thêm vào và tiến hành chiết ở điều kiện chiết thích hợp đã được xác định ở các bước trên (nhiệt độ chiết 60C, thời gian chiết 30 phút) trong bể ổn nhiệt (Elmasonic, Germany). Kết thúc quá trình chiết, hỗn hợp được lọc qua giấy lọc Whatman No. 11. Dịch chiết thu được cô đặc bằng máy cô quay chân không (Buchi-Thụy Sĩ) đến khối lượng không đổi. Sau đó, dịch chiết khô được hòa tan lại vào 40 ml nước cất và sử dụng để bảo quản thịt cá thu. Xử lý nguyên liệu cá thu: Cá thu nguyên liệu còn tươi được mua tại chợ Vĩnh Hải, thành phố Nha Trang, được bảo quản lạnh bằng nước đá trong thùng xốp và vận chuyển về phòng
40 thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang. Trước khi thí nghiệm, cá được rửa sạch để loại bỏ tạp chất, rong rêu và một phần vi sinh vật bám trên bề mặt. Tiếp theo cá được fillet, loại bỏ da, rửa sạch để ráo và xay nhuyễn bằng máy nghiền trục vít. Thịt cá xay nhuyễn được sử dụng để nghiên cứu tác dụng hạn chế sự oxy hóa lipid của dịch chiết rong mơ. Tiến hành thí nghiệm: Cho chính xác 5 ml dịch chiết cô đặc vào 59 g thịt cá xay nhuyễn, trộn đều và bảo quản trong khay nhựa ở 4C. Mẫu đối chứng cũng được chuẩn bị tương tự như trên, ngoại trừ dịch chiết cô đặc được thay bằng nước cất. Sau 0, 1, 3, 5và 7 ngày bảo quản, tiến hành lấy mẫu và đánh giá sự oxy lipid bằng phươngpháp TBARS (hình 2.8). Cá thu Xử lý Xay nhuyễn Trộn thịt cá với dịch chiết cô đặc theo tỷ lệ 10/1 (w/v) Bảo quản lạnh ở 4C trong môi trường không khí lạnh 0 ngày 1 ngày 3 ngày 5 ngày 7 ngày Đánh giá sự oxy hóa lipid theo phương pháp TBARS Hình 2.8. Bố trí thí nghiệm ứng dụng dịch chiết rong mơ để hạn chế sự oxy hóa lipid thịt cá thu trong quá trình bảo quản lạnh ở t=4C
41 2.3. Phương pháp phân tích 2.3.1. Xác định hàm ẩm Hàm ẩm của rong mơ được xác định bằng phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi 11. Phân tích được lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn. 2.3.2. Xác định hàm lượng polyphenol tổng số Hàm lượng polyphenol tổng được xác định theo phương pháp của Singlton và cộng sự (1999) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Lấy 0,1 ml dịch chiết rong trộn với 0,9 ml nước cất trước khi thêm 1 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu (10%) và 2,5 ml Na2CO3 7,5%. Hỗn hợp được lắc đều rồi ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút trước khi đo bước sóng ở 760 nm trên máy quang phổ kế (Spectrophotometry, Carry 50, Varian, Australia). Kết quả được báo cáo bởi mg gallic acid tương đương (GAE)/g chất khô. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn. 2.3.3. Xác định khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá khả năng khử gốc tự do của các mẫu khác nhau (Lee và cộng sự, 2003). Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định dựa theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 0,3 ml trộn với nước cất để đạt thể tích tổng cộng 3 ml. Sau đó thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,2 mM (pha trong ethanol 99,5%), lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. Độ hấp thu quang học được đo ở bước sóng 517 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Khả năng khử gốc tự do DPPH được xác định theo công thức sau: DPPH (%) = 100 × (ACT – ASP)/ACT. Trong đó: ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết; ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu có chứa dịch chiết. Kết quả báo cáo bởi giá trị IC50 là thể tích của dịch chiết khử được 50% gốc tự do DPPH ở điều kiện xác định. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính khử gốc tự do DPPH càng cao. Vì vậy, hoạt tính chống oxy hóa càng mạnh. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo báo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn.
42 2.3.4. Xác định tổng năng lực khử Năng lực khử được xác định theo phương pháp của Oyaizu (1986) với một vài hiệu chỉnh nhỏ. Lấy 1 ml dịch chiết trộn với đệm phosphate pH=6,6 để đạt thể tích cuối cùng 1,5 ml trước khi thêm 0,5 ml K3(Fe[CN] 6) 1%. Hỗn hợp được ủ ở 50C trong 20 phút, sau đó thêm 0,5 ml TCA 10 % và 2 ml nước cất, cuối cùng 0,4 ml AlCl3 0,1% được thêm vào rồi lắc đều. Độ hấp thu quang học được xác định ở bước sóng 700 nm. Độ hấp thu quang học càng cao thì năng lực khử càng mạnh. Kết quả được báo cáo bởi giá trị IC50, là lượng mẫu làm tăng độ hấp thu quang học lên 0,50. Mỗi phân tích được tiến hành lặp lại hai lần, kết quả báo cáo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn. 2.3.5. Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei trên thịt cá thu bảo quản lạnh Khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ S. mcclurei được thử nghiệm trên thịt cá thu bảo quản lạnh bằng cách xác định chỉ số TBARS (các chất phản ứng với acid Thiobarbituric). Phân tích TBARS đã được đề nghị cách đây hơn 40 năm và hiện nay phương pháp này được sử dụng phổ biến để xác định sự oxy hóa lipid. Phương pháp đo Malonaldehyde (MDA) này được hình thành như sản phẩm tách ra của một endoperoxide của các acid béo không bão hòa từ sự oxy hóa lipid. Nó là tiền đề hình thành MDA từ các acid béo. MDA được phản ứng với acid thiobarbituric (TBA) hình thành chất có màu hồng (TBARS) được đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng 532-535nm 49. Các chất phản ứng với TBA được xác định theo phương pháp của Lemon (1957) với một sự hiệu chỉnh nhỏ. Tóm tắt: Khoảng 2 g thịt cá thu đã được xay nhuyễn trộn với 10 ml dung dịch chiết TCA 7,5% và tiến hành chiết trong thời gian 10 phút, sau đó lọc qua giấy lọc Whatman No.40. Phần dịch lọc thu được trộn với dung dịch TBA 0.02 M theo tỷ lệ thể tích bằng nhau để đạt thể tich tổng cộng là 10 ml trong một ống nghiệm và giữ ở nhiệt độ 90C trong 30 phút . Sau đó làm nguội dưới vòi nước chảy đến nhiệt độ phòng trước khi đi xác định độ hấp thu quang học ở bước sóng 532 nm (Spectrophotometer, Carry 50, Varian, Australia). Hàm lượng
43 Malonaldehyde (MAD) được tính toán từ đường cong chuẩn được xây dựng với nồng độ MAD từ 0,01 đến 0,05 M. Kết quả được báo cáo là M MAD/g thịt cá. Mỗi phân tích được thực hiện lặp lại hai lần. Kết quả báo cáo là giá trị trung bình độ lệch chuẩn. 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Các kết quả thí nghiệm được xác định từ trung bình cộng của hai lần thí nghiệm độc lập. Đồ thị được vẽ bằng phần mềm Microsoft Excel 2007. Số liệu được xử lý bằng phần mềm Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) phiên bản 16.0. Giá trị trung bình được phân tích ANOVA theo phép thử Ducan. Giá trị p < 0,05 chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê.
44 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Ảnh hưởng của điều kiện chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ 3.1.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết Đồ thị hình 3.1; 3.2 và 3.3 mô tả ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết (ethanol) đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rong mơ. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ethanol ở các nồng độ khác nhau bao gồm 0, 30, 70 và 100%. Hình 3.1 trình bày kết quả ảnh hưởng của nồng độ của dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số. Kết quả cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol tổng số. Khi tăng nồng độ dung môi ethanol từ 0 đến 30%, hàm lượng polyphenol tổng số lên khoảng 2 lần (p 0,05). Tuy nhiên, khi nồng độ ethanol tăng lên từ 30 đến 100% thì hàm lượng polyphenol giảm dần (p 0,05). Cụ thể, khi sử dụng 30% ethanol để chiết, hàm lượng polyphenol tổng số thu được là 13,13 mg GAE/g rong khô, trong khi sử dụng 70 và 100% ethanol để chiết thì hàm lượng giảm xuống tương ứng là 3,02 và 0,89 mg GAE/g rong khô. Như vậy, 30% ethanol cho hiệu quả thu hàm lượng polyphenol tổng số là cao nhất trong dải nồng độ dung môi nghiên cứu. Dung môi chiết là một thông số quan trọng trong quá trình chiết các hợp chất từ nguyên liệu thực vật và động vật. Từ kết quả của nghiên cứu này chúng tôi thấy rằng nồng độ dung môi chiết (ethanol) có ảnh hưởng lớn đến hàm lượng polyphenol tổng số của dịch chiết rong mơ. Kết quả này tương tự với nhiều nghiên cứu trước đây trên đối tượng rong biển và các loài thực vật trên cạn. Dent và cộng sự (2012) đã xác định khi sử dụng nồng độ dung môi ethanol 30% để chiết sẽ đem lại hiệu quả nhất cho quá trình chiết các hợp chất polyphenol từ lá Salvia officinalis. Chew và cộng sự (2011) nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ ethanol (0-100%) đến hàm lượng polyphenol tổng số của rau má. Kết quả cho thấy nồng độ ethanol có ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng polyphenol của dịch chiết thu được. Nồng độ ethanol ở 40% được xác định là nồng độ cho hàm lượng polyphenol tổng số là cao nhất.
45 Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng khả năng hòa tan polyphenol trong dung môi chiết phụ thuộc vào độ phân cực của dung môi. Methanol là một trong những dung môi phù hợp nhất để tách polyphenol (De và cộng sự, 2005; Galvez và cộng sự, 2005) 28, 36. Tuy nhiên, như đã đề cập ở trên methanol là một dung môi độc tính, có thể ảnh hưởng đến sức khỏe của người sử dụng. Do vậy, ethanol là một dung môi được ưa thích sử dụng để tách các hợp chất polyphenol vì nó có tính chất hóa học tương tự với methanol mà lại ít độc hại (Esther và cộng sự, 2003) 32. Ethanol là dung môi phân cực mạnh nên dễ hòa tan các chất phân cực, ethanol có độ nhớt tương đối cao 1,20 cp sẽ làm cản trở dung môi thấm vào nguyên liệu nhưng lại có sức căng bề mặt khá nhỏ 20,03 dyn/cm nên hòa tan polyphenol dễ dàng. Mặc khác, độ nhớt và sức căng bề mặt của ethanol thấp hơn nước nên khi chiết trong dung môi ethanol thì dung môi này càng dễ thấm vào nguyên liệu, không cản trở quá trình khuếch tán chất cần thiết hơn khi chiết trong nước 1. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng nồng độ ethanol 30% là thích hợp để chiết các hợp chất polyphenol từ rong mơ. Khi tăng nồng độ ethanol lên cao hơn 30% thì hiệu quả chiết giảm xuống rõ rệt. Kết quả này có thể được giải thích như sau: Khi tăng nồng độ ethanol thì độ nhớt của ethanol càng tăng cao nên sẽ làm cản trở dung môi thấm vào nguyên liệu, do đó khả năng hòa tan các hợp chất polyphenol thấp. Hình 3.1. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05)
46 Hình 3.2 trình bày kết ảnh hưởng của nồng độ của dung môi chiết đến tổng năng lực khử của rong mơ. Năng lực khử được đánh giá bằng độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm, độ hấp thụ càng lớn chứng tỏ năng lực khử càng cao. Kết quả cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng rõ ràng đến tổng năng lực khử. Khi nồng độ dung môi tăng từ 0 đến 30% thì năng lực khử tăng từ 0,74 đến 0,91. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng nồng độ dung môi từ 30 đến 100% thì năng lực khử giảm và năng lực khử của dịch chiết thu được bằng dung môi 100% ethanol là thấp nhất chỉ là 0,11 (p 0,05). Như vậy, kết quả này tương tự với sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số. Hình 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH của rong mơ được trình bày ở hình 3.3. Kết quả cũng cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng đáng kể đến khả năng khử gốc tự do DPPH. Cụ thể, dịch chiết thu được khi sử dụng 30% ethanol cho khả năng khử gốc tự do DPPH (94,17%) là cao nhất (p 0,05), tiếp theo là 0% ethanol (58,68%), 70% ethanol (22,92) và 100% ethanol (3,91%).
47 Như vậy, từ kết quả này có thể kết luận rằng, sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa là tương tự nhau. Do đó, các hợp chất polyphenol có thể là thành phần chính đóng góp vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ. Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi ethanol đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 3.1.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết Đồ thị hình 3.4; 3.5 và 3.6 thể hiện ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ. Từ kết quả nghiên cứu ở đồ thị hình 3.4 cho thấy, nhiệt độ chiết có ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol. Kết quả này cũng phừ hợp với kết quả công bố của Dent và cộng sự (2013) khi nghiên cứu trên đối tượng thực vật học (Salvia officinalis), công bố này đã chỉ ra rằng hàm lượng polyphenol tổng số phụ thuộc vào nhiệt độ chiết. Khi tăng nhiệt độ chiết từ 30 đến 60C thì hàm lượng polyphenol tăng từ 3,33 đến 13,13 mg GAE/g rong khô. Khi tiếp tục tăng nhiệt độ lên từ 60 đến 75C thì hàm lượng polyphenol lại giảm từ 13,13 đến 9,62 mg GAE/g rong khô. Từ đồ thị
48 có thể thấy tại nhiệt độ 60C sẽ cho hàm lượng polyphenol cao nhất 13,13 mg GAE/g rong khô. Kết quả nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) khi nghiên cứu trên đối tượng rau má đã lựa chọn nhiệt độ tối ưu là 65C, nghiên cứu của Benmeziane và cộng sự (2014) khi nghiên cứu trên đối tượng nho tươi đã báo cáo nhiệt độ tối ưu để tách chiết polyphenol từ nho là 60C. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được rằng nhiệt độ có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol từ thực vật cũng như rong biển. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xác định được rằng hàm lượng polyphenol trích ly được từ rong mơ tăng dần cùng với nhiệt độ chiết trong khoảng từ 30 đến 60C. Kết quả này có thể được giải thích như sau: khi tăng nhiệt độ sẽ làm tăng cường khả năng hòa tan của chất tan và hệ số khuếch tán (Spigno và cộng sự, 2007). Khi nhiệt độ tăng cũng giúp cho quá trình bẽ gãy màng cellulose, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình giải phỏng phóng các hợp chất polyphenol. Ngoài ra, khi tăng nhiệt độ chiết có thể ức chế hoạt động của một số enzyme gây ra quá trình oxy hóa các hợp chất polyphenol, điều này cũng giúp hàm lượng polyphenol chiết được cao (Brijesh và cộng sự, 2012). Nhiệt độ tăng thì độ nhớt của dung môi giảm, do đó sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chiết xuất, tốc độ phản ứng giữa các thành phần hóa học trong rong với cồn tăng làm tốc độ khếch tán các chất tan trong tế bào rong ra môi trường ngoài, vì vậy tốc độ hòa tan polyphenol sẽ tăng lên đẫn đến hàm lượng polyphenol thu được cao 1. Tuy nhiên, khi tăng nhiệt độ chiết cao thì có thể gây phá hủy các hợp chất polyphenol đặc biệt là những chất không bền với nhiệt độ cao (Chew và cộng sự, 2011). Do đó, khi nhiệt độ tăng cao đến 75C thì hàm lượng polyphenol có xu hướng giảm. Điều đó có thể quan sát thấy rằng khi nhiệt độ cao đến điểm sôi của ethanol là 78,5C thì làm mất dung môi ethanol. Khi đó, nồng độ các chất hữu cơ sẽ tăng cao còn nồng độ dung môi giảm làm giảm phân cực, vì vậy gây bất lợi cho quá trình chiết polyphenol cũng như mang lại hiệu suất chiết các hợp chất polyphenol thấp (Liyana và cộng sự, 2005; Chan và cộng sự, 2009).
49 Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng 60C là nhiệt độ thích hợp để chiết các hợp chất polyphenol từ rong mơ. Kết quả này cũng tương tự với kết quả công bố của Dent và cộng sự (2013) khi xác định 60C là nhiệt độ sẽ đem lại hiệu quả nhất cho quá trình chiết các hợp chất polyphenol từ lá Salvia officinalis L. Hình 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Từ đồ thị hình 3.5 cho thấy tổng năng lực khử của dịch chiết rong mơ tăng giảm theo nhiệt độ khác nhau. Năng lực khử được đánh giá bằng độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm, độ hấp thụ càng lớn chứng tỏ năng lực khử càng cao. Khi nhiệt độ tăng từ 30 đến 60C thì tổng năng lực khử cũng tăng từ 0,71 đến 0,88 và khi nhiệt độ tăng từ 60 đến 75C thì tổng năng lực khử lại giảm xuống từ 0,88 đến 0,76. Như vậy, tương tự với kết quả của hàm lượng polyphenol tổng số, 60C là nhiệt độ chiết cho tổng năng lực khử cao nhất.
50 Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Hình 3.6 cho thấy nhiệt độ chiết cũng ảnh hưởng tới khả năng khử gốc tự do DPPH theo xu hướng tương tự như hàm lượng polyphenol tổng số và tổng năng lực khử. Cụ thể, khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 60C thì khả năng khử gốc tự do DPPH tăng dần từ 57,13 đến 94,17% nhưng khi tiếp tục tăng nhiệt độ từ 60 đến 750C thì khả năng khử gốc tự do DPPH cũng có xu hướng giảm từ 94,17 đến 80,13%. Như vậy, dịch chiết thu được khi chiết ở nhiệt độ 60C có khả năng khử gốc tự do DPPH (94,17%) cao nhất (p 0,05). Điều này có thể được giải thích như sau: Khi nhiệt độ tăng quá cao thì hoạt tính chống oxy hóa giảm vì nhiệt độ tăng cao sẽ là tăng tốc độ phản ứng các thành phần trong rong và đẩy nhanh quá trình trao đổi chất. Do đó, những chất không bền với nhiệt sẽ bị phá hủy hoặc bị kích thích phản ứng làm thay đổi trạng thái ban đầu, vì vậy chúng sẽ cũng sẽ bị mất đi hoạt tính ban đầu. Như vậy, để thu được dịch chiết từ rong mơ có hàm lượng các chất polyphenol cao và khả năng chống oxy hóa mạnh thì nhiệt độ chiết ở 60C là thích hợp. Từ kết quả này có thể kết luận rằng, sự ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa là tương tự nhau. Do đó, các hợp chất polyphenol có thể là thành phần chính đóng góp vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ.
51 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 3.1.3. Ảnh hưởng của thời gian chiết Đồ thị hình 3.7; 3.8 và 3.9 thể hiện ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ. Hình 3.7 cho thấy thời gian chiết ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng số trong dịch chiết rong mơ. Khi tăng thời gian chiết từ 10 đến 30 phút thì hàm lượng polyphenol tăng từ 6,66 đến 13,13 mg GAE/g rong khô nhưng khi tăng thời gian từ 30 đến 120 phút thì hàm lượng polyphenol giảm (từ 13,13 đến 12,43 mg GAE/g rong khô) nhưng không đáng kể. Như vậy, chiết trong thời gian 30 phút là thích hợp để thu các hợp chất polyphenol từ rong mơ. Kết quả này cũng tương tự với kết quả công bố của Dent và cộng sự (2013) khi xác định thời gian chiết 30 phút cho hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol từ lá Salvia officinalis là cao nhất. Thông thường thời gian chiết càng dài thì hiệu quả chiết các hợp chất càng cao. Tuy nhiên, sự ảnh hưởng của thời gian chiết còn phụ thuộc vào đặc tính của nguyên liệu (như kích thước, độ ẩm) và hợp chất cần chiết. Trong nghiên cứu này, 30 phút là khoảng thời gian thích hợp cho quá trình chiết các hợp chất polyphenol
52 từ rong mơ. Khi tiếp tục tăng thời gian chiết, hàm lượng polyphenol tổng số thu được không thay đổi đáng kể. Thời gian chiết dài sẽ tiêu tốn nhiều năng lượng và các chi phí khác. Do đó, thời gian 30 phút được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Kéo dài thời gian chiết mà hàm lượng polyphenol tổng số thu được không tăng mà có chiều hướng giảm có thể được giải thích như sau: Thời gian chiết kéo dài các hợp chất polyphenol có điều kiện tiếp xúc nhiều hơn với oxy, trong điều kiện nhiệt độ cao, có thể bị oxy hóa. Ngoài ra, hiện tượng này còn có thể được giải thích dựa vào định luật Fick thứ 2. Theo đó, trạng thái cân bằng của quá trình khuếch tán sẽ đạt được sau một khoảng thời gian xác định, khi đó nếu tiếp tục tăng thời gian chiết lượng chất chiết thu được sẽ không thay đổi. Hình 3.7. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Hình 3.8 trình bày kết ảnh hưởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử của rong mơ. Năng lực khử được đánh giá bằng độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm, độ hấp thụ càng lớn chứng tỏ năng lực khử càng cao. Kết quả cho thấy nồng độ dung môi ethanol ảnh hưởng rõ ràng đến tổng năng lực khử. Khi tăng thời gian chiết từ 10 đến 30 phút thì năng lực khử tăng từ 0,62 đến 0,71. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian từ 30 đến 120 phút thì năng lực khử cũng tăng nhưng không đáng kể từ
53 0,71 đến 0,73. Qua đó cho thấy rằng, khả năng chống oxy hóa cao khi rong được chiết trong các thời gian từ 30 đến 120 phút. Mặc dù khi tăng thời gian chiết từ 30 đến 120 phút thì hoạt tính chống oxy hóa cũng tăng nhưng mức độ tăng không đáng kể. Phân tích thống kê đã cho thấy rõ điều này. Vì vậy thời gian thích hợp để chiết là 30 phút sẽ tiết kiệm được thời gian chiết và ít tốn kém chi phí. Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian chiết đến tổng năng lực khử (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Hình 3.9 cũng cho thấy thời gian chiết ảnh hưởng đến khả năng khử gốc tự do DPPH. Kết quả này cũng tương tự với kết quả nghiên cứu của Chew và cộng sự (2011) với đối tượng nghiên cứu là rau má. Trong khoảng thời gian từ 10 đến 30 phút thì khả năng khử gốc tự do DPPH tăng từ 79,74 đến 94,17% nhưng khi tăng thời gian từ 30 đến 120 phút thì khả năng khử gốc tự do DPPH giảm từ 94,17 đến 87,73%. Điều này cũng có nghĩa rằng, khi chiết trong thời gian 30 phút thì thu được dịch chiết có khả năng chống oxy hóa cao, thời gian chiết ngắn sẽ tiết kiệm được thời gian chiết và chi phí. Vì vậy, thời gian chiết thích hợp được chọn là 30 phút. Kết quả này được giải thích như sau: Trong quá trình trích ly, ngoài nhiệt độ tác dụng trực tiếp thì còn có yếu tố thời gian. Trong khoảng 30 phút đầu, quá trình
54 khuếch tán vật chất xảy ra nhanh dần và đạt giá trị cực đại tại 30 phút. Sau thời gian này, tốc độ khuếch tán vật chất sẽ tăng chậm hoặc không tăng nữa. Lúc này, nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly. Nếu thời gian kéo dài các chất chống oxi hóa trong dịch chiết phải chịu nhiệt độ càng lâu nên độ bền của nó sẽ giảm xuống. Các thành phần không bền nhiệt sẽ bắt đầu phân hủy sau khi quá trình khuếch tán vật chất đạt đến cân bằng. Qua 3 đồ thị hình 3.7, 3.8 và 3.9 ta thấy có điểm chung đó là, cả 3 đồ thị đều có xu hướng tăng giảm như nhau. Do đó, có thể hợp chất polyphenol là thành phần chính góp phần lớn trong việc chống oxy hóa của dịch chiết từ rong mơ. Để chứng minh cho điều đó ở phần sau chúng tôi sẽ đề cập tới. Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian chiêt đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 3.1.4. Ảnh hưởng của số lần chiết Đồ thị hình 3.10 và 3.11 mô tả ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết rong mơ. Kết quả ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số được trình bày ở hình 3.10. Kết quả cho thấy số lần chiết ảnh hưởng đáng kể đến hàm
55 lượng polyphenol tổng số (p < 0,05). Ở lần chiết đầu tiên, hàm lượng polyphenol tổng số trong rong mơ thu được là 13,13 mg GAE/g rong khô. Giá trị này giảm mạnh ở lần chiết thứ 2 (3,63 mg GAE/g rong khô) và lần chiết thứ 3 (1,35 mg GAE/g rong khô). Kết quả này phù hợp với lý thuyết của quá trình chiết. Ban đầu hàm lượng các hợp chất polyphenol trong rong cao, tạo nồng độ chênh lệch cao giữa bên trong và bên ngoài màng tế bào, quá trình khuếch tán diễn ra nhanh chóng. Theo thời gian chiết, hàm lượng polyphenol trong rong giảm dần, quá trình khuếch tán ra dung môi chiết do đó cũng giảm. Hình 3.10. Ảnh hưởng của số lần chiêt đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH được trình bày trong hình 3.11. Kết quả cho thấy số lần chiết ảnh hưởng đến khả năng khử gốc tự do DPPH. Ở lần chiết thứ nhất, khả năng khử gốc tự do DPPH trong dịch chiết rong mơ thu được là 94,17%. Giá trị này giảm dần ở lần chiết thứ 2 (76,69%) và lần chiết thứ 3 (72,75%). Như vậy, khi chiết lần 1 thu được dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với khi chiết lần 2 và lần 3 (p < 0,05).
56 Như vậy, từ kết quả này có thể kết luận rằng, sự ảnh hưởng của số lần chiết đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa là tương tự nhau. Do đó, các hợp chất polyphenol có thể là thành phần chính đóng góp vào khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ. Hình 3.11. Ảnh hưởng của số lần chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) 3.1.5. Ảnh hưởng của sóng siêu âm Đồ thị hình 3.12; 3.13 và 3.14 trình bày kết quả ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số và khả năng chống oxy hóa của dịch chiết rong mơ. Kết quả nghiên cứu ở đồ thị hình 3.12 cho thấy cho thấy chiết bằng sóng siêu âm cho hiệu quả chiết hàm lượng polyphenol tổng số tăng lên đáng kể so với phương pháp chiết tĩnh. Khi chiết có sử dụng sóng siêu âm thì hàm lượng polyphenol tổng số là 9,62 mg GAE/g rong khô, trong khi đó hàm lượng này ở mẫu không có sử dụng sóng siêu âm là 6,36 mg GAE/g rong khô. Brich và Teh (2013) nghiên cứu sử dụng sóng siêu âm để chiết các hợp chất polyphenol từ cây gai dầu, hạt lanh và hạt cải cũng cho kết quả tương tự như nghiên cứu của chúng tôi. Sóng siêu âm làm tăng hiệu quả chiết các hợp chất polyphenol ở cả ba đối tượng nguyên
57 liệu trên. Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Amegowda và cộng sự (2010) trên đối tượng lá bàng Terminalia catappa. Hàm lượng polyphenol trong dịch chiết sử dụng sóng siêu âm trong 40 phút là 238 mg GAE/g chất khô, giá trị này khi chiết tĩnh là 234,45 mg GAE/g chất khô. Như vậy, sử dụng sóng siêu âm tăng hiệu quả chiết đáng kể các hợp chất polyphenol từ rong mơ. Hiệu quả chiết tăng lên có thể được giải thích như sau: Sóng siêu âm có khả năng phá vỡ màng tế bào của nguyên liệu, tạo điều kiện thuận lợi cho các hợp chất giải phóng ra khỏi tế bào. Ngoài ra, siêu âm còn có tác dụng khuấy trộn mạnh làm tăng sự xâm nhập của dung môi vào bên trong cấu trúc của tế bào (Mason, 1996). Vì vậy, khi chiết bằng phương pháp siêu âm thì các hợp chất polyphenol sẽ được hòa tan vào môi trường nhanh hơn so với chiết không sử dụng sóng siêu âm (Jing và cộng sự, 2008). Hình 3.12. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hàm lượng polyphenol tổng số (Chữ cái trên cột khác nhau chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê p < 0,05) Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tổng năng lực khử được thể hiện trong hình 3.13. Năng lực khử được đánh giá bằng độ hấp thụ ở bước sóng 700 nm, độ hấp thụ càng lớn chứng tỏ năng lực khử càng cao. Kết quả cho thấy khi chiết có sử dụng sóng siêu âm thì năng lực khử cao hơn so với khi chiết không sử dụng sóng siêu âm
58 và năng lực khử tăng dần theo sự tăng của thể tích dịch chiết. Khi tăng thể tích dịch chiết từ 0,5 đến 1 ml thì năng lực khử cũng tăng từ 0,70 đến 0,75 (mẫu chiết có sử dụng sóng siêu âm). Khi chiết không có sóng siêu âm thì năng lực khử thấp hơn, tương tự với mẫu có sử dụng sóng siêu âm thì khi tăng thể tích dịch chiết từ 0,5 đến 1 ml thì năng lực khử tăng từ 0,68 đến 0,73. Như vậy, tương tự với hàm lượng polyphenol tổng số, khi chiết có sử dụng sóng siêu thì thu được dịch chiết có tổng năng lực khử cao. Hình 3.13. Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến tổng năng lực khử Ảnh hưởng của sóng siêu âm đến khả năng khử gốc tự do DPPH được thể hiện trong hình 3.14. Kết quả cho thấy khi chiết có siêu âm thì khả năng khử gốc tự do DPPH cao hơn so với khi chiết không có sóng siêu. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Brich và Teh (2013) với các đối tượng nghiên cứu là cây gai dầu, hạt lanh và hạt cải. Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết cũng tăng dần theo sự tăng của thể tích dịch chiết. Khi tăng thể tích dịch chiết từ 0,1 đến 0,3 ml thì khả năng khử gốc tự do DPPH tăng dần từ 68,36 đến 85,58% (đối với mẫu khi chiết có sử dụng sóng siêu âm). Khi chiết không có sóng siêu âm thì khả năng