Luận văn Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

Nội dung text: Luận văn Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum

1. Lời cảm ơn LỜI CẢM ƠN Em chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Vũ Tuân, thầy đã hướng dẫn em suốt quá trình thực hiện đề tài này. Trong quá trình làm việc cùng với thầy, em đã học hỏi được nhiều điều bổ ích, không chỉ là những kiến thức chuyên môn mà còn cả những kinh nghiệm khi làm việc. Khi em gặp khó khăn trong quá trình thực hiện đề tài, thầy đã kịp thời hướng dẫn, chỉ bảo tận tình. Em gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lưu Thị Ngọc Anh, những lời truyền đạt của cô thật sự bổ ích cho em trong quá trình em làm luận văn tại trường. Em gửi lời cảm ơn đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt, cô đã giúp đỡ chúng em về mặt hóa chất phục vụ cho việc thực hiện đề tài. Em cảm ơn cô Thùy Dương - bộ môn Công nghệ Sinh học của trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ em về nguồn vi sinh vật sử dụng trong đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện tốt nhất về mọi mặt giúp chúng em thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp. Tôi cũng muốn bày tỏ sự cảm ơn đến tất cả các bạn bè của tôi, họ đã giúp đỡ, đặc biệt là cho tôi thấy được sự gắn bó, sự chia sẻ, sự cảm thông cũng như là những giây phút thư giãn trong khi làm việc. Tôi xin cảm ơn với tất cả lòng chân thành. Tp. HCM, ngày 07 tháng 01 năm 2008 Phan Anh Tuấn i
2. Tóm tắt luận văn TÓM TẮT LUẬN VĂN Acetobacter xylinum (A. xylinum) là một vi khuẩn Gram âm, có thể sản xuất một loại polysaccharide ngoại bào được gọi là cellulose vi khuẩn. Cellulose vi khuẩn có khả năng được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm và các lĩnh vực khác. Để ứng dụng cellulose vi khuẩn một cách rộng rãi, đòi hỏi có nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào và ổn định. Gần đây, ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao thực phẩm đã được phát hiện và ứng dụng thực tế. Với mục đích sản xuất cellulose vi khuẩn phục vụ mục đích màng bao thực phẩm, với đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện tĩnh, chúng tôi thực hiện khảo sát các yếu tố sau: - Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên môi trường Hestrin- Schramm (HS). - Cải thiện hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Để khảo sát sự sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện tĩnh trên môi trường HS ở các điều kiện khác nhau nhằm rút ra điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho chủng A. xylinum có sẵn. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với quá trình tạo cellulose của vi khuẩn A. xylinum được tiến hành và thấy rằng, trong khoảng pH từ 4,0 đến pH 5,5, hiệu suất tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum này là thích hợp nhất, lượng cellulose đạt được có thể ~5,2 gl-1. Bên cạnh đó, tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon bằng cách thay đổi nguồn carbon trong thành phần môi trường nuôi cấy, chọn được nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng A. xylinum sinh tổng hợp cellulose là mannitol. Lượng cellulose đạt được ~7,4 gl -1. Để chọn ra nguồn nitơ tốt nhất cho sự tổng hợp cellulose, một thí nghiệm được thực hiện với nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ được thay đổi, kết quả cho thấy cao nấm men cho kết quả tạo cellulose tốt nhất. Lượng cellulose đạt được ~8 gl -1 g. Khi khảo sát ảnh hưởng đồng thời của mannitol và cao nấm men lên quá trình tổng hợp cellulose của A. xylinum, hàm lượng cellulose thu được có thể đạt được ~8,5 gl -1 khi thành phần môi trường HS được điều chỉnh với hàm lượng mannitol 15,5 gl-1 và hàm lượng cao nấm men là 6,5 gl-1, pH môi trường được chỉnh xung quanh giá trị 5,0. Với kết quả thu được trong các thí nghiệm, môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum có tại Phòng Thí nghiệm Sinh học trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh với mục đích thu nhận cellulose nên bao gồm các thành phần sau: 15,5 gl -1 mannitol; 6,5 gl-1 cao -1 -1 nấm men; 5,0 gl Na2HPO4; 1,115 gl acid citric; pH được điều chỉnh về 5,0 là thích hợp cho ii
3. Tóm tắt luận văn quá trình nuôi cấy. Các kết quả quả thí nghiệm này cung cấp những thông tin hữu ích cho sự phát triển khả năng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp. iii
4. Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC VIẾT TẮT viii CHƯƠNG 1:MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 CELLULOSE VI KHUẨN VÀ VI SINH VẬT TỔNG HỢP CELLULOSE 3 2.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 3 2.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 3 2.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose 6 2.2 SINH TỔNG HỢP CELLULOSE TỪ VI KHUẨN A. XYLINUM 10 2.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum 10 2.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 11 2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose 13 2.3ỨNG DỤNG CỦA CELLULOSE VI KHUẨN 24 2.3.1 Thực phẩm 24 2.3.2 Y học 25 2.3.3 Các ngành công nghiệp khác 25 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 28 3.1 NGUYÊN LIỆU 28 3.1.1 Chủng vi sinh vật 28 3.1.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 28 3.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 29 3.2.1 Khảo sát quá trình nhân giống. 29 3.2.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose 30 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum 30 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum 31 3.2.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum 31 3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH. 33 3.3.1 Số lượng vi khuẩn 33 iv
5. Mục lục 3.3.2 Hiệu suất cellulose 33 3.3.3 Phân tích thống kê 34 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35 4.1 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG VI KHUẨN A. XYLINUM 35 4.2 KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP CELLULOSE 36 4.3 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA PH LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM 38 4.4 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NGUỒN CARBON VÀ NITƠ LÊN HIỆU SUẤT SINH TỔNG HỢP CELLULOSE CỦA VI KHUẨN A. XYLINUM 40 4.4.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon 40 4.4.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 43 4.5 TỐI ƯU HOÁ NỒNG ĐỘ NGUỒN CARBON VÀ NITƠ. 45 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 5.1 KẾT LUẬN 49 5.2ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC 55 v
6. Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn 4 Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) 6 Hình 2.3: SEM của A. xylinum 8 Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum 11 Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn 12 Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum 13 Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và có khuấy đảo 15 Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo 16 Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum 35 Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 36 Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum 39 Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi 42 Hình 4.5: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn nitơ thay đổi 44 vi
7. Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose 7 Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC 16 Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC của A. xylinum IFO 13693 17 Bảng 2.4: Aûnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của 23 Bảng 2.5: Các ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của cellulose vi khuẩn 26 Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ 33 Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 34 Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu 47 Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát 47 vii
8. Danh mục viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT - Ag-BC: agitated bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo) - A. xylinum: Acetobacter xylinum - A. xylinus: Acetobacter xylinus - ATP: adenosine triphosohate - BASYC®: bacterial synthesised cellulose - Cel-: non-producing mutants – chủng vi khuẩn đột biến không tổng hợp cellulose. - cfu: cololy-forming units – khuẩn lạc - CS: cellulose synthase - CSL: corn steep liquor - DAP: diamon phosphate - DP: degree of polymerization - FK: Fructosekinase - FBP: Fructose-1,6-biphosphate phosphatase - Fru-bi-P: Fructose-1,6-bi-phosphate - Fru-6-P: Fructose-6-phosphate - GK: Glocosekinase - G6PDH: Fructose-1-phosphate kinase - Glc-6-P: Glucose-6-phosphate - Glc-1-P: Glucose-1-phosphate - HS: Hestrin-Schramm - HR/MAS 1H NMR: high resolution/magic angle spinning hidrogen-1 nuclear magnetic resonance. - PGI: Phosphoglucoisomerase viii
9. Danh mục viết tắt - PGM: Phosphoglucomutase - PTS: Phosphatransferase - PGA: Phosphogluconic acid - S/V: surface/volume ratio - tỉ lệ diện tích/thể tích - SEM: Scanning electronic microscopy - St-BC: Static bacterial cellulose (cellulose vi khuẩn thu nhận được dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh) - SA: Sulfate amon - UGP: UDP-glucose pyrophosphorylase - UDPG: Uridine diphosephoglucose - YPM: Yeast extract Peptone Mannitol - YE: Yeast extract – cao nấm men ix
10. Chương 1. Mở đầu Chương 1: MỞ ĐẦU Cellulose là một hợp chất hóa học thường được biết đến với vai trò là bộ khung xương quan trọng trong cơ thể thực vật. Không những cellulose được tổng hợp bởi thực vật, mà cellulose còn được tổng hợp nên bởi vi sinh vật, với tên gọi là cellulose vi khuẩn. Một trong những loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose rất tốt đó là A. xylinum. Cellulose vi khuẩn ngày càng được quan tâm nhiều hơn bởi khả năng ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành khoa học: công nghiệp thực phẩm, y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, âm thanh, xử lý nước thải, bảo vệ môi trường Gần đây, khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn không ngừng được nghiên cứu, cải tiến bởi các nhà khoa học trên thế giới (Otomo et al., 2000). Trong công nghệ đồ uống và thực phẩm, cellulose vi khuẩn đã được ứng dụng làm nhiều sản phẩm như: nước trái cây, thực phẩm chức năng Đặc biệt, một ứng dụng của cellulose vi khuẩn mới được phát hiện gần đây là khả năng ứng dụng làm màng bao thực phẩm chống vi sinh vật rất hiệu quả (Yoshinaga et al., 1997; Okiyama et al., 1993). Việc ứng dụng cellulose vi khuẩn vào sản xuất công nghiệp nói chung và làm màng bao thực phẩm nói riêng đòi hỏi phải có được các nguồn nguyên liệu cellulose vi khuẩn dồi dào, ổn định, và phù hợp với tính chất của các ứng dụng. Nhiều kết quả nghiên cứu đã cho thấy khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo thì hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum sẽ cao hơn khi nuôi cấy tĩnh. Tuy nhiên, với mục đích sử dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong công nghệ thực phẩm, yêu cầu cellulose thu được phải ở dạng màng. Với mục đích đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản xuất cellulose vi khuẩn từ Acetobacter xylinum” dưới điều kiện nuôi cấy tĩnh với mong muốn thu được các kết quả hữu ích cho các nghiên cứu trong tương lai. Trong nội dung thực hiện, chúng tôi tập trung khảo sát các yếu tố sau: - Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS. - Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum trên môi trường HS. - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. 1
11. Chương 1. Mở đầu - Khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. - Tối ưu hoá thành phần môi trường lên men thu nhận cellulose vi khuẩn nhằm nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum. Với kết quả thu được, phần nào sẽ cung cấp những thông tin hữu ích cho các nghiên cứu tiếp theo, đầy đủ hơn để có thể ứng dụng sản xuất cellulose vi khuẩn trên quy mô công nghiệp. 2
12. Chương 2. Tổng quan tài liệu Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose vi khuẩn và vi sinh vật tổng hợp cellulose 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu sự sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn. Sự tổng hợp lớp màng cellulose ngoại bào của vi khuẩn A. xylinum lần đầu tiên được báo cáo bởi Brown et al. (1986). Theo đó, khi nghiên cứu về vi khuẩn acetic, Brown đã phát hiện và quan sát thấy một khối rắn mà theo ông lúc đó khối rắn này không nằm trong các kết quả nghiên cứu ông dự định trước. Khối rắn này khó bị phân hủy và giống với mô động vật. Hợp chất đó sau này được xác định là cellulose và vi khuẩn tổng hợp ra nó là Bacterium xylinum (Brown et al., 1986). Đến nửa thế kỷ XX các nhà khoa học mới thực sự nghiên cứu nhiều về cellulose vi khuẩn. Đầu tiên, Hestrin et al. (1954) đã nghiên cứu về khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. Ông đã chứng minh rằng vi khuẩn này có thể sử dụng đường để tổng hợp cellulose. Sau đó, Next và Colvin (1957) chứng minh rằng cellulose được A. xylinum tổng hợp trong môi trường có đường và ATP. Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cấu trúc của cellulose vi khuẩn ngày càng được hiểu khá rõ, đó là các chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Saxena (1990) đã giải thích cơ chế tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng việc giải trình tự đoạn gen tổng hợp cellulose. Ông đã tách chiết được đoạn polypeptide liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose tinh khiết dài 83kDa. Từ đó đến nay đã có nhiều công trình nghiên cứu giúp hiểu rõ thêm cấu trúc, cơ chế tổng hợp, ứng dụng của cellulose vi khuẩn. 1.1.2 Cellulose vi khuẩn và tính chất của cellulose vi khuẩn 1.1.2.1 Cellulose vi khuẩn Cellulose vi khuẩn là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Những chuỗi glucan được vi khuẩn tổng hợp nối lại với nhau thành thớ sợi thứ cấp, có bề rộng 1,5 nm. Đây là những thớ sợi tự nhiên mảnh nhất khi so sánh với sợi cellulose sơ cấp trong tượng tầng ở một vài loài thực vật. Các thớ sợi thứ cấp kết lại thành những vi sợi, những vi sợi tạo thành bó sợi, những bó sợi tạo thành dải. Dải có chiều dày 3 – 4 nm, và chiều dài 130 – 177 nm (Yamanaka et al., 2000). Các dải siêu mịn của cellulose vi 3
13. Chương 2. Tổng quan tài liệu khuẩn có chiều dài từ 1 µm đến 9 µm tạo thành cấu trúc mắt lưới dày đặc, được ổn định nhờ các liên kết hydro, đó là lớp màng film (Bielecki et al., 2001) Hình 2.1: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn (Yamanaka et al., 2000) 1.1.2.2 Mức độ polymer hoá (Degree of polymerization - DP) Cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật tương tự nhau về mặt hóa học, cellulose bao gồm các liên kết β-1,4-glucan, nhưng mức độ polymer hoá khác nhau. DP của cellulose thực vật khoảng 13000 – 14000, và của cellulose vi khuẩn khoảng 2000 – 6000. Tuy nhiên, trong một số trường hợp DP của cellulose vi khuẩn có thể đạt 16000 đến 20000 phân tử glucose (Watanabe et al., 1998). Đường kính của bacterial cellulose chỉ vào khoảng 1/100 đường kính của cellulose thực vật (Bielecki et al., 2001) (hình 2.2). 1.1.2.3 Cấu trúc kết tinh của cellulose vi khuẩn. Ngày nay nhờ vào các kỹ thuật công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của cellulose vi khuẩn. Chẳng hạn như kỹ thuật nhiễu xạ tia X giúp xác định được kích thước và phân biệt cấu trúc cellulose vi khuẩn. Những kỹ thuật khác như phổ hồng ngoại, phổ Raman, và phổ cộng hưởng từ hạt nhân giúp xác định các dạng kết tinh của cellulose (Bielecki et al., 2001). Như các cellulose tự nhiên khác, cellulose vi khuẩn được tạo thành bởi hai loại cấu trúc tinh thể riêng biệt, cellulose I α và Iβ. Trong vi sợi cellulose đều có sự tham gia của hai 4
14. Chương 2. Tổng quan tài liệu loại cấu trúc tinh thể này (Yamamoto & Horii, 1993). Trong khi hầu hết tinh thể I β tinh khiết thu được từ cellulose thực vật thì vẫn chưa có cách nào thu nhận được các tinh thể I α tinh khiết từ nguồn này. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp từ vi khuẩn A. xylinum chứa nhiều tinh thể Iα hơn cellulose thực vật, hàm lượng loại tinh thể này có thể lên đến hơn 60%. Tỉ lệ này có thể dao động trong khoảng 64% đến 71% tuỳ vào chủng vi sinh vật và nhiệt độ môi trường (Yamamoto & Horii, 1994). Ngược lại I β chủ yếu có trong thành phần cellulose hình thành nên thành tế bào của một số loài thực vật bậc cao như cotton và gai. Ở đó, cellulose I α chỉ chiếm khoảng 20%. Nhìn chung, cấu trúc tinh thể được coi như là một yếu tố quan trọng trong việc xác định các tính chất của cellulose mặc dù cho đến bây giờ vẫn có rất ít các nghiên cứu về sự tương quan giữa cấu trúc tinh thể và những đặc tính riêng biệt của cellulose được thực hiện. 1.1.2.4 Tính chất của cellulose vi khuẩn (El-Saied et al., 2004; Bielecki et al., 2001) - Cellulose vi khuẩn là cellulose rất trong suốt, cấu trúc mạng tinh thể mịn, thành phần tỉ lệ Iα cao. - Kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao, đặc biệt là cellulose I. - Khả năng giữ nước và hấp thụ nước cực tốt, tính xốp chọn lọc. - Có độ tinh sạch cao so với các loại cellulose khác, không chứa ligin và hemicellulose. - Có thể bị phân hủy hoàn toàn bởi một số vi sinh vật, là nguồn tài nguyên có thể phục hồi. - Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt. - Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt: tinh thể cellulose vi khuẩn có độ bền cao, ứng suất dài lớn, trọng lượng nhẹ, tính bền rất cao. - Lớp màng cellulose được tổng hợp một cách trực tiếp, vì vậy việc sản xuất một số sản phẩm từ cellulose vi khuẩn không cần qua bước trung gian. Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được cellulose dưới dạng màng mỏng hoặc dưới dạng các sợi chỉ cực nhỏ. 5
15. Chương 2. Tổng quan tài liệu - Có thể kiểm soát được đặc điểm lý học của cellulose theo mong muốn bằng cách tác động vào quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử cellulose. Hình 2.2: Cellulose vi khuẩn (a) và cellulose thực vật (b) (Bielecki et al., 2001) 1.1.3 Vi sinh vật tổng hợp cellulose. Cellulose vi khuẩn được nhiều loài vi sinh vật tổng hợp trong đó chủng A. xylinum được biết đến nhiều nhất, đây cũng là loài vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose hiệu quả nhất và được tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Cấu trúc của cellulose được tổng hợp bởi các vi sinh vật khác nhau là khác nhau. Sau đây là bảng tổng quan về các loài vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose. Bảng 2.1 Các vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulose (Jonas et al., 1998) Vi sinh vật Cấu trúc cellulose Vai trò sinh học Acetobacter Lớp màng ngoại bào Để giữ vi khuẩn trong môi trường Dải cellulose hiếu khí Achromobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Aerobacter Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Agrobacterium Sợi ngắn Tham gia vào mô thực vật Alcaligenes Sợi cellulose Sự kết bông trong nước thải Pseudomonas Các sợi không tách biệt Sự kết bông trong nước thải Rhizobium Sợi ngắn Tham gia vào hầu hết thực vật Sarcina Cellulose dị hình Không rõ 6
16. Chương 2. Tổng quan tài liệu Zoogloea Chưa xác định rõ cấu trúc Sự kết bông trong nước thải Trong đó, Acetobacter được sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất trong việc sản xuất cellulose. Đặc biệt là A. xylinum vì những đặc điểm ưu việt của nó như: năng suất tạo cellulose cao, cấu trúc cellulose phù hợp cho các mục đích sử dụng 1.1.3.1 Phân loại A. xylinum A. xylinum là một vi khuẩn acetic thuộc họ Acetobacteraceae, họ này bao gồm các giống sau: Acetobacter, Acidomonas, Asaia, Gluconacetobacter, Gluconobacter và Kozakia. Các loài vi khuẩn này trước đây được gọi với các tên gọi Acetobacter xylinus hay Acetobacter xylinum, sau đó được xếp lại vào giống Gluconacetobacter với tên gọi Gluconacetobacter xylynus. A. xylinum có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau như từ nước quả (Kahlon & Vyas, 1971), hay từ một số loài thực vật như lá của cây cọ (Faparusi et al., 1974), từ giấm (Passmore & Carr, 1975), từ thạch dừa (Bernado et al., 1998), từ nấm Kombucha và trà (Hermann et al., 1928). 1.1.3.2 Đặc điểm hình thái của A. xylinum. A. xylinum có dạng hình que, thẳng hay hơi cong, có thể di động hay không di động, không sinh bào tử. Là vi khuẩn Gram âm, chúng có thể đứng riêng rẽ hay xếp thành chuỗi. Nếu A. xylinum phát triển trên môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chúng biến đổi thành dạng có hình thái đặc biệt như: dạng tế bào phình to, kéo dài, phân nhánh hoặc không phân nhánh và dần dần sẽ gây thoái hóa giống làm giảm hoạt tính một cách đáng kể. Khuẩn lạc của A. xylinum có kích thước nhỏ, bề mặt nhầy và trơn, phần giữa khuẩn lạc lồi lên, dày hơn và sẫm màu hơn các phần xung quanh, rìa mép khuẩn lạc nhẵn. 7
17. Chương 2. Tổng quan tài liệu Hình 2.3: SEM của A. xylinum (Forge & Preston, 1977) 1.1.3.3 Đặc điểm sinh lý của A. xylinum (Jonas et al., 1998) Oxy hóa ethanol thành acid acetic, CO2, H2O. Phản ứng catalase dương tính: tạo bọt khí trong dung dịch lên men. Không tăng trưởng trên môi trường Hoyer. Chuyển hóa glucose thành acid gluconic. Chuyển hóa glycerol thành dihydroxyaceton. Không sinh sắc tố nâu. Tổng hợp cellulose. 1.1.3.4 Đặc điểm sinh trưởng của A. xylinum Lớp màng cellulose tạo ra gây trở ngại đến khả năng biến dưỡng, vận chuyển chất dinh dưỡng và oxi đến tế bào. Tuy nhiên lớp màng này có thể giữ nước nên giúp vi khuẩn có thể phân hủy chất dinh dưỡng để sử dụng và giúp tế bào chống lại tia UV. A. xylinum có thể sử dụng nhiều nguồn cacbon khác nhau và tùy thuộc vào chủng vi khuẩn mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chẳng hạn chủng A. xylinum BPR 2001 sử dụng fructose tốt nhất (Matsuoka et al., 1993) trong khi chủng A. xylinum IFO 13693 sử dụng glucose hiệu quả hơn (Masaoka et al., 1993) A. xylinum có thể chuyển hóa glucose thành 8
18. Chương 2. Tổng quan tài liệu acid gluconic, điều này là nguyên nhân làm cho pH của môi trường nuôi cấy giảm từ 1 đến 2 đơn vị trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển từ 25 0C đến 300C và pH từ 5,4 đến 6,3. Theo Hestrin (1947) thì pH tối ưu để A. xylinum phát triển là 5,5 và không phát triển ở nhiệt độ 370C ngay cả trong môi trường dinh dưỡng tối ưu. Theo Maccormide et al. (1996) cho rằng A. xylinum có thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 đến 8, nhiệt độ từ 12 0C đến 350C và có thể phát triển trong môi trường có nồng độ ethanol lên tới 10%. Khi nuôi cấy trên môi trường thạch, lúc còn non khuẩn lạc mọc riêng lẻ, khuẩn lạc nhầy và trong suốt, xuất hiện sau 3 đến 5 ngày. Khi già tế bào mọc dính thành cụm, và chúng mọc theo đường cấy giống. A. xylinum có khả năng chịu được pH thấp, vì thế người ta thường bổ sung thêm acid acetic hay acid citric vào môi trường nuôi cấy để hạn chế sự nhiễm khuẩn lạ và tăng hiệu suất tổng hợp cellulose. 1.1.3.5 Vai trò của cellulose vi khuẩn đối với A. xylinum. Màng cellulose được sản xuất bởi A. xylinum đóng nhiều vai trò cho sự phát triển và tồn tại của vi sinh vật trong tự nhiên. Cung cấp chất dinh dưỡng cho vi khuẩn trong điều kiện thiếu thức ăn (Bielecki et al., 2001). Sự tổng hợp và tiết cellulose bởi A. xylinum giúp tế bào lơ lửng và tới được bề mặt giàu khí oxy vì đây là vi khuẩn hiếu khí. Do đó chỉ những tế bào gần ranh giới lỏng khí của môi trường mới sản xuất cellulose (Krystynowicz et al., 2002; Watanabe et al., 1998) Màng cellulose xúc tiến sự hình thành tập đoàn của A. xylinum trên cơ chất và bảo vệ vi khuẩn trước những đối thủ cạnh tranh sử dụng cùng cơ chất. Vì độ nhớt và đặc tính ưa nước của lớp cellulose nên khả năng chống chịu với những thay đổi bất lợi (thay đổi pH, sự có mặt của chất độc và vi sinh vật gây bệnh ) trong môi trường sống tăng lên. Sợi cellulose giúp chống ảnh hưởng gây chết của tia UV. 23% vi khuẩn acetic được bao bọc bởi màng cellulose có thể sống sót hơn 1 giờ khi bị chiếu tia UV (Bielecki et al., 2001). 9
19. Chương 2. Tổng quan tài liệu 1.2 Sinh tổng hợp cellulose từ vi khuẩn A. xylinum 1.2.1 Quá trình sinh tổng hợp cellulose ở A. xylinum Theo Ross et al. (1991), con đường sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn từ glucose thành các sợi kết tinh đòi hỏi phải có sự tổng hợp uridine diphosphoglucose (UDP-Glucose), sau đó là một phản ứng tổng hợp cellulose và cuối cùng là sự tập hợp lại thành sợi cellulose nhỏ để hình thành nên các dải tinh thể cellulose. UDP-Glucose là một nucleotide tiền thân của sự tổng hợp cellulose trong A. xylinum. Như sơ đồ duới đây, quá trình sinh tổng hợp UDP-Glucose từ glucose là một quá trình trải qua 3 bước có sự tham gia của 3 loại enzyme. Những bước này là sự phosphoryl hoá của glucose bởi xúc tác của enzyme glucokinase thành glucose-6-phosphate, sự izomer hoá của glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate bởi phosphoglucomutase, và sự tổng hợp UDP-Glucose bởi UDP-Glucose pyrophosphorylase. UDP-Glucose pyrophosphorylase đóng vai trò then chốt trong sự sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trong khi các chủng A. xylinum đột biến không có khả năng tổng hợp cellulose bị thiếu enzyme này (Valla & Kjosbakken, 1981). Hình 2.4: Con đường tổng hợp cellulose trong A. xylinum (Canon & Anderson, 1991) 1.2.2 Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn Quá trình sinh tổng hợp cellulose từ A. xylinum trên được chia thành hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hóa và giai đoạn kết tinh. 1.2.2.1 Giai đoạn polymer hóa Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hóa chuyển glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Sau đó enzyme phosphoglucomutase (PGM) tiếp tục chuyển hóa glucose-6-phosphate thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) thông qua phản ứng isomer hóa. Glucose-1-phosphate được enzyme UDP-Glucose pyrophospholyase chuyển hóa 10
20. Chương 2. Tổng quan tài liệu thành UDP-Glucose. Cuối cùng, UDP-Glucose được polymer hóa thành cellulose và cellulose được tiết ra môi trường ngoại bào nhờ một phức hợp protein màng là cellulose synthase (Iguchi et al., 2000). Một số vi khuẩn có khả năng sử dụng đường fructose hiệu quả hơn sẽ tạo cellulose theo con đường sau: lúc này hệ thống enzyme phosphotransferase sẽ chuyển fructose thành fructose–1-phosphate. Sau đó fructose-1-phosphate sẽ được chuyển hóa thành fructose-1,6- biphosphate nhờ enzyme fructose–1-phosphatekinase. Sau đó, enzyme phosphoglucose isomerase có hoạt tính cao, sẽ giúp chuyển hóa fructose-6-phosphate thành glucose-6- phosphate. Tiếp theo glucose-6-phosphate lại tham gia vào quá trình chuyển hóa tương tự như trên để tạo ra cellulose (Iguchi et al., 2000). Hình 2.5: Cơ chế sinh tổng hợp cellulose vi khuẩn (Iguchi et al., 2000) 1.2.2.2 Giai đoạn kết tinh Các chuỗi glucan được nối với nhau nhờ liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết hợp với nhau tạo thành lớp chuỗi glucan nhờ lực liên kết yếu Van Der Waals. Lớp chuỗi glucan này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đó chúng kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các vi sợi, sau đó các vi sợi tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành các bó sợi và được phun ra ngoài môi trường thông qua các lỗ trên bề mặt của vi khuẩn (hình 2.6). Ảnh chụp 11
21. Chương 2. Tổng quan tài liệu kính hiển vi điện tử bề mặt tế bào cho thấy có khoảng 50 – 80 lỗ sắp xếp thành hàng dọc chiều dài của tế bào (Ross et al., 1991). Các lỗ này chính là các vị trí sinh tổng hợp cellulose trên bề mặt tế bào. Đây là những lỗ có đường kính khoảng 3,5 nm sắp xếp song song theo đường thẳng dọc trục vi khuẩn. Mỗi lỗ bao phủ một tiểu phần 10 nm chứa enzym tổng hợp cellulose. Mỗi tiểu phần 10 nm tạo ra các chuỗi glucan hình thành vi sợi 1.5 nm. 12
22. Chương 2. Tổng quan tài liệu Hình 2.6: Sự giải phóng cellulose ra môi trường ngoài từ A. xylinum (Iguchi et al., 2000) 1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp cellulose. 1.2.3.1 Kiểu nuôi cấy Có 2 kiểu nuôi cấy thường được sử dụng để sản xuất cellulose vi khuẩn, đó là nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo. a) Nuôi cấy tĩnh Đối với nuôi cấy tĩnh, người ta sử dụng những khay nhựa đã chuẩn bị môi trường và tiến hành nuôi cấy chủng A. xylinum ở điều kiện tĩnh. Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, những thớ sợi thứ cấp liên tục được lộ ra từ lỗ sắp xếp thẳng hàng trên bề mặt của tế bào vi khuẩn, kết thành những vi sợi, lắng sâu xuống môi trường sinh trưởng, sau đó dải cellulose chồng chập và xoắn với nhau tạo thành tấm cellulose trên bề mặt canh trường dinh dưỡng, ngay mặt phân cách pha lỏng khí giàu oxy. Dù vẫn được sử dụng để sản xuất cellulose nhưng nuôi cấy tĩnh cho sản lượng thấp và mang tính thủ công. Do đó, để sản xuất công nghiệp, cần thiết để thiết lập hệ thống sản xuất hàng loạt sử dụng kĩ thuật nuôi cấy hiệu quả hơn (Edwards, 1995). b) Nuôi cấy có khuấy đảo 13
23. Chương 2. Tổng quan tài liệu Tiến hành nuôi cấy trong thiết bị lên men chứa dung dịch môi trường, có cánh khuấy, thổi khí oxy hoặc lắc. Vi khuẩn phân bố đều trong toàn dung dịch và phát triển theo chiều sâu của môi trường. Cellulose được tạo ra có dạng viên hình cầu, elip Đây là kĩ thuật nuôi cấy mong đợi sẽ đem lại hiệu quả tạo cellulose cao, có thể ứng dụng trong sản xuất cellulose vi khuẩn thương mại nhưng hiện nay cellulose vi khuẩn chỉ mới được sản xuất với sản lượng thấp. Sản xuất cellulose từ A. xylinum bằng phương pháp nuôi cấy có khuấy đảo gặp phải một số trở ngại, trở ngại lớn nhất cho đến nay là tính không ổn định khi nuôi cấy. Tính không ổn định được thể hiện bởi sự mất khả năng sản xuất cellulose và thay thế dần tế bào sản xuất cellulose bằng chủng đột biến không có khả năng sản xuất cellulose (Hai-Peng et al., 2002; Chao et al., 1997). Từ việc quan sát thấy rằng cellulose tổng hợp nhanh khi tế bào A. xylinum được gắn vào những phần tĩnh trong bình lên men như điện cực, cánh khuấy, màng ngăn, Vandamme et al. (1998) đã giới thiệu “điểm dính đa chức năng” trong bình nuôi cấy bằng cách cung cấp vào môi trường những phần tử nhỏ không tan như diatonit, silicagel, cát biển, những hạt thủy tinh nhỏ, đất mùn, cellulose thực vật được giã nhỏ Nồng độ phần tử nhỏ đưa vào được tối ưu tuỳ theo mức độ khuấy, cũng như mức độ lắc của khay (Yoshinaga et al., 1997). Sự lựa chọn kỹ thuật nuôi cấy phụ thuộc vào mục đích thương mại của polymer sinh học, hơn nữa cấu trúc cellulose và đặc tính cơ lý của nó bị ảnh hưởng rất lớn của phương pháp nuôi cấy (Hai-Peng et al., 2002). Trong điều kiện nuôi cấy bề mặt, màng cellulose dày được tạo thành trên bề mặt môi trường nuôi cấy. Trong khi dưới điều kiện nuôi cấy chìm, cellulose lại được sản xuất dưới dạng huyền phù thớ sợi, những khối không đều, dạng viên kết hay dạng cầu kích thước từ 10 µm đến 1000 µm. 14
24. Chương 2. Tổng quan tài liệu Hình 2.7: Cellulose được tạo thành trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (trái) và có khuấy đảo (phải) (El-Saied et al., 2004) Hình 2.8 thể hiện sự khác biệt về cấu trúc của cellulose khi nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy có khuấy đảo. Những phần tử hình cầu mịn của cellulose trong nuôi cấy chìm (Agitated bacterial cellulose – Ag-BC) có cấu trúc mắt lưới tương tự cấu trúc mắt lưới của màng mỏng cellulose thu được khi nuôi cấy bề mặt (Static bacterial cellulose – St-BC). Tuy nhiên có vài sự khác biệt về hình thái trong những sợi nhỏ và trong cấu trúc này giữa St-BC và Ag-BC. Sợi cellulose của St-BC duỗi thẳng trong khi sợi cellulose Ag-BC cong và rối, làm cấu trúc mắt lưới dày hơn so với cấu trúc St-BC. Bên cạnh đó, chiều rộng sợi Ag-BC mỏng hơn so với St- BC, mặc dù rất khó xác định chính xác kích thước của mỗi sợi. Hình thái này có được có thể do dòng chảy rối loạn và áp lực do dịch chuyển không ngừng của môi trường khi nuôi cấy dưới điều kiện có khuấy đảo. Những thay đổi về hình thái học có liên quan đến những thay đổi trong cấu trúc vi mô như trọng lượng phân tử, độ kết tinh, thành phần I α, bảng 2.2 cho thấy rõ điều này. 15
25. Chương 2. Tổng quan tài liệu Hình 2.8: Cấu trúc trong điều kiện nuôi cấy tĩnh (a) và nuôi cấy có khuấy đảo (b) (Watanabe et al., 1998) Bảng 2.2: Đặc tính cấu trúc St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998) Đặc tính cấu truùc Ag-BC St-BC Chỉ số kết tinh a 63 71 Kích thước tinh thể b 6.9 7.4 Sự kết tinh c (%) 72 80 c Cellulose Iα (%) 61 73 Ñoä polymer hoaù 10900 14400 a. Xaùc ñònh baèng phöông phaùp chuïp nhieãu xaï tia X. b. Öôùc löôïng baèng phöông phaùp chuïp nhieãu xaï tia X kích thöôùc cuûa maët phaúng tinh theå hoïc. c. Xaùc ñònh baèng CP/MAS 13C NMR. Do nhöõng khaùc bieät veà caáu truùc maø St-BC vaø Ag-BC coù nhöõng tính chaát coù lieân quan tôùi nhöõng öùng duïng thöông maïi cuõng khaùc nhau nhö trình baøy ôû baûng 2.3. Bảng 2.3: Tính chất St-BC và Ag-BC (Watanabe et al., 1998) 16
26. Chương 2. Tổng quan tài liệu Đặc trưng Ag-BC St-BC Young module cuûa maøng (GPa) 28,3 33,3 Khaû naêng giöõ nöôùc (g nöôùc/g 170 45 cellulose) Chức năng giúp duy trì lọc (%) 43 38 Chỉ số ổn định nhũ tương (%) 83 60 Khả năng giữ nước của cellulose vi khuẩn là khối lượng nước được giữ lại trên một đơn vị khối lượng của sợi cellulose, lượng nước này được giữ trên bề mặt và trong những phần tử tạo nên sợi cellulose. Giá trị của chức năng duy trì lọc được định nghĩa là lượng phân tử CaCO 3 bị giữ trên tờ giấy cellulose. Phân tử nhỏ hơn và phân tán hơn của Ag-BC bị phân hủy có hiệu quả hơn phân tử của St-BC trong việc giữ lại các hột nhỏ vì phân tử của Ag-BC bị phân hủy có bề mặt hiệu dụng rộng hơn suốt quá trình lọc trong sản xuất giấy. Trong trường hợp của chất ổn định nhũ tương, phân tử Ag-BC bao phủ bề mặt của những giọt dầu rộng hơn và nhũ tương chứa trong Ag-BC ổn định hơn. Do đó, Ag-BC thể hiện nhiều đặc tính phù hợp hơn cho những ứng dụng công nghiệp hơn St-BC (Watanabe et al., 1998). 1.2.3.2 Ảnh hưởng của thiết bị đến năng suất tạo thành cellulose vi khuẩn Phương pháp sản xuất cellulose vi khuẩn truyền thống là nuôi cấy tĩnh, nhưng phương pháp này đòi hỏi phải có diện tích lên men lớn và thời gian lên men dài. Do đó một số phương pháp khác được khảo sát để thay thế cho phương pháp nuôi cấy tĩnh. Thùng lên men khuấy trộn được dùng rộng rãi trong sản xuất cellulose vi khuẩn, nuôi cấy liên tục có bổ sung ethanol làm tăng tốc độ tổng hợp cellulose gấp 2 lần so với nuôi cấy mẻ. Hơn nữa trong điều kiện nuôi cấy có khuấy đảo, dễ dàng kiểm soát các yếu tố môi trường. Tuy nhiên, khó khăn của quá trình nuôi cấy lắc là cellulose sinh ra tích lũy trong môi trường làm cho môi trường có độ nhớt cao dẫn đến khó kiểm soát quá trình khuấy trộn và sục khí. Các viên huyền phù cellulose có độ giữ nước cao, nhanh chóng choáng hết thể tích môi trường, gây khó khăn cho vi sinh vật phát triển tạo cellulose (Klemm et al., 2001; Yoshinaga et al., 1997). 17
27. Chương 2. Tổng quan tài liệu Một số thiết bị lên men sản xuất cellulose vi khuẩn: a) Ajinomoto Được đặt tên theo tên một công ty, phương pháp này sử dụng môi trường bề mặt nhằm cải thiện sự tổng hợp của cellulose. Các tế bào đầu tiên được nhân giống trong thiết bị có sục khí trước khi được cho vào các khay tĩnh. Sau 3 ngày trong thiết bị suc khí, mật độ tế bào vào khoảng 2x107 (tế bào/ml). Lúc này, dịch lên men được chuyển vào các khay có sục khí. So sánh với quá trình lên men thông thường tạo cellulose thì thiết bị nay fcho năng suất cao hơn 140%. Sản phẩm có khả năng giữ nước thấp và chứa khoảng 10% lượng sucrose ban đầu (Okiyama et al., 1992). b) Weyerhauser Được đặt tên theo tên của một công ty Mỹ phát minh ra, một quá trình được phát triển để sản xuất sợi có kích thước nhỏ, khoảng 1/300 kích thước của bột gỗ. Sử dụng các chất gây đột biến đổi hóa học để thay đổi các mức độ tác động của enzyme, chủng A. xylinum được phân lập để làm giảm lượng chất phụ sinh ra trong quá trình sản xuất, bao gồm gluconic acid với việc điều chỉnh pH thấp hơn. Rõ rằng hơn, chủng vi sinh vật được phân lập để sản xuất cellulose khi khuấy đảo. Trước đây, khuấy đảo một dịch lên men để cung cấp oxy, và sự trao đổi chất, tổng hợ cellulose không ngừng. Tuy nhiên, sản phẩm tạo ra từ phương pháp này là một dịch huyền phù sệt, nhớt, tên thương mại là Cellulon (Black et al., 1990). c) ICI ICI (Imperial Chemical Industry) bao gồm 4 bước và sản xuất một chất sệt giống với hệ thống Weyerhauser. Bước đầu tiên là bước tích lũy. Khi đó vi khuẩn được phép phát triển trong một thiết bị phản ứng có khuấy đảo đến khi nguồn carbon được tiêu thụ hết. Sau đó bổ sung nguồn carbon với tốc độ phù hợp cho sự tổng hợp cellulose. Bước cuối cùng là loại đi các huyền phù từ thiết bị phản ứng và sau đó tách các tế bào vi sinh vật ra khỏi sản phẩm (Serafica et al.,1998). d) Gengiflex®, Biofill® và BASYC® Chủng A. xylinum thích hợp được đưa vào một thiết bị, trong đó tạo điều kiện tối ưu cho chúng phát triển. Các điều kiện tối ưu cho sự sản xuất cellulose sau đó được áp dụng cho dịch lên men. Tất cả các quy trình đều được phát triển trên môi trường cơ bản của Schramm và Hestrin (1954). 18
28. Chương 2. Tổng quan tài liệu Gengiflex® được áp dụng trong công nghiệp nha khoa, cụ thể là được áp dụng để giúp hồi phục lại mô bao quanh răng (Novaes et al., 1997). Biofill®, được sử dụng như là một dải băng, có thể được ứng dụng băng các vết thương trong trường hợp bị phỏng hay bị loét. Biofill® được sử dụng như da nhân tạo cho con người. Mặt hạn chế lớn nhất của sản phẩm là bị giới hạn bởi tính co giãn khi ứng dụng để làm các vết băng tai những vùng có cường độ vận động cao. Ngược lại, ưu điểm của nó là giúp hồi phục nhanh chóng vết thương, và khả năng chống nhiễm trùng tốt. Cellulose trong suốt cho phép kiểm tra, theo dõi vết thương dẽ dàng trong khi Biofill® sẽ tách ra khi vết thương hồi phục. Với việc rút ngắn thời gian và chi phí điều trị, Biofill® được đánh giá rất cao (Fontana et al,. 1990). Một nhóm các nhà hóa học, sinh vật học và giải phẫu học đã phát triển một sản phẩm gọi là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® là một sản phẩm dạng ống dùng thay cho các mạch máu. Các ống có đường kính trong khoảng 1mm và dài 5mm, được sử dụng thay thế cho mạch máu. Công dụng khác của loại sản phẩm này là bề mặt trong của ống BASYC® nhẵn và trơn hơn các vật liệu tổng hợp khác khi sử dụng cùng mục đích (Klemm et al,. 2001). e) Thiết bị thu nhận cellulose liên tục Thường được sử dụng trong phòng thí nghiệm. Sử dụng một dụng cụ có độ sâu không lớn để lượng môi trường cần thiết là tối thiểu, các sợi cellulose được thu bởi một trục quay liên tục với tốc độ 35 mmh -1. Sau một thời gian thu nhận cellulose thì đem cellulose đi xử lý. Ưu điểm lớn nhất của dạng thiết bị này là cellulose có thể được thu nhân liên tục và môi trường mới được bổ sung sau mỗi 12 giờ (Sakairi et al., 1997). f) Thiết bị phản ứng có sục khí tuần hoàn và khuấy đảo Trong môi trường tĩnh, thời gian nhân đôi số lượng tế bào là từ 8 – 10 giờ, trong khi trong điều kiện có lắc đảo, thời gian này là 4 – 6 giờ (Canon và Anderson, 1991). Bằng cách tăng khuấy đảo và cung cấp oxy cho môi trường nuôi cấy, tốc độ sinh trưởng tế bào cũng tăng lên. Do đó, khả năng sản xuất với tỷ lệ lớn là có thể, thiết bị lên men có khuấy đảo và có sục khí được nghiên cứu và mong muốn tạo ra cellulose dạng II. Độ nhớt cao của môi trường và sức cản mạnh là trở ngại của phương pháp. Với phương pháp này thì sợi cellulose tạo ra có cấu trúc không bình thường (Kouda et al., 1997). 19
29. Chương 2. Tổng quan tài liệu 1.2.3.3 Aûnh hưởng của áp suất oxy đến quá trình tổng hợp cellulose vi khuẩn Sự hình thành cellulose diễn ra tại vị trí mặt phân cách giữa không khí và lớp màng cellulose chứ không phải tại mặt phân cách giữa môi trường và cellulose. Do đó oxy là nhân tố quan trọng cho quá trình tổng hợp cellulose (Borzano & Desouza et al., 1995). Watanabe và Yamanaka (1995) phát hiện ra áp suất oxy ảnh hưởng đến cả sự hình thành cellulose cũng như sức sản xuất màng. Cellulose tăng trưởng dưới áp suất oxy thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với cellulose tăng trưởng trong điều kiện áp suất cao hơn. Điều này có thể ảnh hưởng trực tiếp đến tính dai của lớp màng. Hơn nữa, với áp suất oxy là 10% tính sản xuất cellulose cao hơn 25% mà không ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của tế bào. Sự tổng hợp cellulose tại áp suất 10% và 15% cao hơn so với điều kiện áp suất khí quyển. Tuy nhiên, hàm lượng oxy cao trên 50% lại hạn chế khả năng tổng hợp cellulose của vi sinh vật. (Yamanaka & Watanabe et al., 1995). 1.2.3.4 Aûnh hưởng của pH và nhiệt độ đến sản phẩm cellulose vi khuẩn 1. Ảnh hưởng của pH Sự chuyển hóa glucose thành acid gluconic trong quá trình tổng hợp cellulose là nguyên nhân chính của sự giảm pH của môi trường lên men. pH ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của tế bào và sự hình thành cellulose (Hwang, J.W et al., 1999). Các báo cáo trước đây đã đưa ra các kết luận cho thấy pH tối ưu cho sự tổng hợp cellulose từ A. xylinum là trong khoảng 4 – 7. Trong khi đó, trong báo cáo của mình, Fiedler et al. (1989) đưa ra khảng pH tối ưu là 5 - 7. Masaoka et al. (1993) thì thấy rằng khoảng này là 4 - 6. Qua các kết quả nghiên cứu đó cho chúng ta kết luận rằng pH thấp hơn 7 là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose và sự phát triển của tế bào vi sinh vật A. xylinum. A. xylinum đồng thời tổng hợp cả cellulose và cellulase. Cellulase ít được tổng hợp ở pH thấp (pH < 5) và được tổng hợp nhiều hơn ở pH cao. Độ bền cơ học của tấm cellulose nuôi cấy tại pH 4 cao hơn độ bền của tấm cellulose nuôi ở pH 6 (Toda et al., 1997). 2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Sự tổng hợp cellulose phụ thuộc khá nhiều vào nhiệt độ. Nhiệt độ từ 25 - 30 0C là thích hợp cho sự tổng hợp cellulose (Canon & Anderson, 1991). Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng khoảng nhiệt độ từ 25 - 300C. Sự thay đổi nhiệt độ không những chỉ thay đổi hiệu suất tổng hợp cellulose mà còn thay đổi cả cấu trúc của cellulose, đặc biệt là khả năng giữ nước và mức độ polymer hóa. 20
30. Chương 2. Tổng quan tài liệu cellulose được sản xuất ở 30 0C có mức độ polymer hóa thấp hơn và khả năng giữ nước cao hơn so với cellulose được sản xuất ở nhiệt độ thấp hơn (Geyer et al., 1994). Nhiệt độ cao (khoảng 1000C trong 3 giờ) không gây ảnh hưởng cho cấu trúc cellulose nhưng nhiệt độ thấp (-20 0C) sẽ làm tăng tính mềm dẻo của cellulose vi khuẩn (Zou et al., 2006). 1.2.3.5 Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy 1. Ảnh hưởng của nguồn nitơ Môi trường cơ bản cho các nghiên cứu về quá trình tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum là môi trường do Hestrin và Schramm (1954) thiết lập, có nguồn nitơ là dịch chiết nấm men và peptone với tỉ lệ tương ứng là 5:3. Từ khi thành phần môi trường này được đưa ra, nó đã trở thành môi trường cơ bản cho hầu hết các nghiên cứu về sản xuất cellulose vi khuẩn. Nhiều nhóm nghiên cứu khác nhau đã có sự thay đổi thành phần môi trường liên quan đến phần trăm của nitơ từ các nguồn khác nhau như dịch chiết nấm men, CSL (corn steep liquor), peptone, trypton, cao thịt, proteopeptone Tất cả các nguồn nitơ này đều được ứng dụng, trong đó CSL là nguồn nitơ được cho là có hiệu quả nhất, tác động tăng trưởng tế bào và tốc độ tạo cellulose cao so với các nguồn nitơ khác và đây cũng là nguồn nitơ có giá thành tương đối rẻ (Klemm et al., 2001; Jonas et al., 1998; Toda et al., 1997). Một vài amino acid bắt buộc phải có là methionine và glutamate. Masaoka et al. (1993) đã chứng minh methionine có tác dụng quan trọng đến sự tăng trưởng tế bào và tăng hiệu suất tạo cellulose so với môi trường không có amino acid này. Các vitamin pyridoxine, nicotinic acid, p-aminobezoic acid và biotin được xác định là cần thiết cho sự tăng trưởng và tổng hợp cellulose, trong khi pantothanate và riboflavin cho kết quả ngược lại (Yang et al., 1998). 2. Ảnh hưởng của nguồn carbon. Rất nhiều cơ chất được sử dụng làm nguồn carbon cho sự hình thành cellulose bởi vi khuẩn A. xylinum. Các chủng vi khuẩn khác nhau tổng hợp cellulose với những lượng khác nhau đối với các cơ chất khác nhau. Glucose được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A. xylinum IFO 13693 tổng hợp cellulose, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men (Masaoka et al., 1993). Tuy nhiên, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol và arabitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ chất là 21
31. Chương 2. Tổng quan tài liệu glucose (Oikawa et al., 1995). Bên cạnh đó, fructose lại là nguồn cơ chất thích hợp nhất cho A. xylinum BPR2001 tổng hợp cellulose (Matsuoka et al., 1996). Jonas & Farah (1998) đã so sánh lượng cellulose tổng hợp bởi vi khuẩn A. xylinum IFO 13693 khi sử dụng các nguồn carbon khác nhau, glucose được chọn làm nguồn carbon để đối chứng (bảng 2.4). Bảng 2.4: Ảnh hưởng của nguồn carbon lên sự tổng hợp cellulose của A. xylinum IFO 13693 (Jonas & Farah, 1998) Nguồn Carbon Năng suất tổng hợp cellulose (%) Monosaccharides D-Glucose 100 D-Fructose 92 D-Galactose 15 D-Xylose 11 D-Arabinose 14 D-Sorbose 11 Disaccharides Lactose 16 Malnose 7 Sucrose 33 Cellobiose 7-11 Polysaccharides Tinh bột 18 Ethanol 4 Ethylene glycol 1 Propylene glycol 8 Glycerol 93 D-Arabitol 620 D-Mannitol 380 Acid hữu cơ Citrate 20 L-Malate 15 22
32. Chương 2. Tổng quan tài liệu Succinate 12 Những chất khác Glucono-lactate 62 O-methyl-glucose 0.5 1.2.3.6 Tỷ lệ diện tích bề mặt – thể tích (S/V) Bởi vì sự hình thành cellulose diễn ra trên mặt tiếp xúc giữa không khí và môi trường (Masaoka et al.,1993) nên tỉ lệ diện tích bề mặt tiếp xúc và thể tích môi trường là nhân tố có vai trò khá quan trọng trong sự hình thành và tổng hợp cellulose. Tỉ lệ tốt nhất đối với các chủng vi khuẩn khác nhau và điều kiện môi trường đang sử dụng khác nhau là khác nhau. Vandamme et al. (1998) đưa ra kết luận tỉ lệ S/V khoảng 2,2 cm -1 cho kết quả tốt nhất khi khảo sát trên dải tỉ lệ từ 1 đến 3 cm-1. Trong khi đó, lượng cellulose thu được cao nhất khi S/V bằng 0,7 cm-1 khi khảo sát trên dải tỉ lệ từ 0,27 đến 2,13 cm-1 (Krystynowicz et al., 2002). 1.3 Ứng dụng của cellulose vi khuẩn. Mặc dù bản chất hóa học tương tự cellulose thực vật nhưng nhờ sản xuất dễ dàng, đặc tính cơ học cao, tính ổn định dưới hóa chất và nhiệt độ cao, cellulose vi khuẩn là vật liệu được chọn cho nhiều ứng dụng (Watanabe et al., 1998). 1.3.1 Thực phẩm Các loại vi khuẩn gây thối rữa là nguyên nhân làm cho thực phẩm bị hư hỏng và làm giảm thời gian sử dụng của sản phẩm thực phẩm. Vấn đề bảo quản sản phẩm thực phẩm tránh khỏi các vi sinh vật gây hư hỏng được đặc biệt quan tâm. Có nhiều cách để bảo quản sản phẩm, ví dụ như dùng các hoá chất bảo quản chống vi sinh vật là một cách khá phổ biến. Tuy nhiên, với cellulose vi khuẩn, người ta có thể ứng dụng để làm màng bao chống vi sinh vật. Theo đó, chất chống vi sinh vật sẽ được kết hợp với màng, làm các chất bảo quản này tập trung trên màng bao làm thành bức tường bảo vệ thực phẩm, đồng thời giảm lượng hoá chất bảo quản trong thực phẩm, khi sử dụng sản phẩm, màng này có thể được loại bỏ dễ dàng. Ứng dụng làm màng bao bảo quản thực phẩm là một trong những ứng dụng quan trọng của cellulose vi khuẩn trong ngành công nghệ bao bì trong những năm gần đây (Yoshinaga et al., 1997). Một sản phẩm thực phẩm được biết đến khá nhiều mà bản chất là cellulose vi khuẩn đó là thạch dừa (Nata de coco). Nata de coco là một chất màng màu trắng hoặc màu vàng kem được tổng hợp trong quá trình lên men của A. xylinum trên bề mặt của môi trường có đường và acid, ví dụ nhu nước trái cây. Nata de coco được cho rằng có thể làm thực phẩm ăn 23
33. Chương 2. Tổng quan tài liệu kiêng giúp chống lại bệnh ung thư ruột, chứng xơ cứng động mạch, chứng nhồi máu cơ tim và nhiều bệnh khác (El-Saied et al., 2004). Nata de coco đã trở thành món ăn truyền thống của Philippine và rất phổ biến ở nhiều quốc gia khác, trong đó có Việt Nam (Lapuz et al., 1967). 1.3.2 Y học Vì khả năng giữ nước cao nên cellulose vi khuẩn có thể được sử dụng như tấm da nhân tạo tạm thời để chữa phỏng. Hơn nữa, cellulose vi khuẩn còn làm tăng khả năng phát triển tế bào da người. Sản phẩm ứng dụng màng cellulose vi khuẩn trong lĩnh vực y học là làm da tạm thời khá phổ biến như chế phẩm Biofill®. Tại Việt Nam, bộ môn Vi sinh khoa Dược trường Đại học Y dược nghiên cứu sản xuất màng trị phỏng bằng màng cellulose vi khuẩn có tẩm dầu mù u và mang lại hiệu quả cao khi sử dụng cho bệnh nhân. Một nhóm các nhà khoa học, sinh học và giải phẫu học phát triển sản phẩm là BASYC® (Bacterial Synthesised Cellulose). BASYC® là ống sản xuất theo phương pháp tĩnh được sử dụng thay thế mạch máu. Nghiên cứu này bắt nguồn từ cấu trúc mạng sợi siêu mịn, tính chất bền cơ cao và độ trương phồng cao của cellulose vi khuẩn (Klemm et al., 2001). 1.3.3 Các ngành công nghiệp khác Sản xuất cellulose vi khuẩn quy mô lớn của Weyerhaeuser Co. (Tacoma, Washington USA) và Cetus Co. (Emeryville, California, USA) đưa tới sự phát triển của cellulon® với nhiều ứng dụng rộng rãi. Ví dụ bao gồm ứng dụng trong bộ phận khai mỏ, trong ứng dụng nối và phủ để cố định màng và như thành phần thực phẩm để làm chất độn, chất kết cấu hay làm giảm celorie. Ứng dụng của cellulose vi khuẩn làm chất cố định tế bào được Friedleer et al mô tả. Biopolymer Research Co. Ltd, Japan thiết lập mục đích xa hơn của kỹ thuật ứng dụng công nghiệp của polymer sinh học và bây giờ đang tập trung nghiên cứu “Biocellulose”. Tính chất của polymer hiệu dụng có nguồn gốc vi sinh vật cũng đang được xem xét (Watanabe et al., 1998). Cellulose vi khuẩn hiện được mong đợi là vật liệu hóa sinh mới với những ứng dụng thú vị và đang tiếp tục nghiên cứu, phát triển sản xuất hàng loạt. Các lĩnh vực ứng dụng cellulose vi khuẩn được trình bày trong bảng 2.5 Bảng 2.5: Ứùng dụng cellulose vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau 24
34. Chương 2. Tổng quan tài liệu Lĩnh vực Sản phẩm Thực phẩm tráng miệng (Nata de coco, kem, kẹo, snack, khoai tây Thực phẩm chiên ít calorie) Thực phẩm giảm cân Thịt nhân tạo Bao bọc thịt và xúc xích Giảm huyết thanh cholesterol Thuốc rượu Kombucha hay trà Manchurian Màng trị thương, màng trị phỏng Y tế Tác nhân vận chuyển thuốc Da nhân tạo Mạch máu nhân tạo Màng bao sụn Kem thoa da Mỹ phẩm Chất laøm se, chất ổn đñịnh Màng nhân tạo Chất làm dày và tăng cứng cho thuốc đánh bòng móng tay Vật liệu hút vết dầu tràn hay chất độc hại Môi trường Màng siêu lọc làm sạch nguồn nước Vật liệu thu hồi và tái sinh khoáng chất và dầu Dầu mỏ Da nhân tạo Da giầy Lều dùng một lần và đồ dùng cắm trại Thể thao ngoài trời Màng thẩm thấu ngược Tiện ích công cộng Tã giấy dùng một lần có khả năng tái sinh Chăm sóc trẻ em 25
35. Chương 2. Tổng quan tài liệu Màng rung chuyển đổi âm thanh Aâm thanh Chất tăng cứng cho gỗ nhân tạo Công nghiệp gỗ Chất bổ sung làm giấy Thùng chứa chịu lực cao Giấy lưu trữ hồ sơ Công nghiệp Giấy làm tiền tệ giấy Giấy điện tử Máy móc tự Thân xe hơi động và máy Yếu tố cấu trúc cho máy bay bay Màng bao tàu vũ trụ Phòng thí Giá thể nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiệm Lĩnh vực khác Màng composite 26
36. Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp Chương 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 1.4 Nguyên liệu 1.4.1 Chủng vi sinh vật Chủng vi sinh vật được sử dụng để sinh tổng hợp cellulose là chủng của vi khuẩn A. xylinum được cung cấp bởi phòng Thí nghiệm Sinh học, trường Đại học Bách khoa thành phố Hồ Chí Minh. Chủng vi sinh vật được giữ trên thạch nghiêng ở 40C trong môi trường tự nhiên có thành phần chính là nước dừa. 1.4.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Các thí nghiệm đều sử dụng môi trường cơ bản là môi trường Hestrin – Schramm (HS) bao gồm thành phần như sau: glucose 20 gl-1, cao nấm men 5 gl-1, peptone 3 gl-1, -1 -1 -1 Na2HPO4 5 gl , acid citric 1,15 gl , nếu môi trường đặc thì có thêm agar 20 gl , nước cất vừa đủ 1 lít (Schramm et al., 1954). - Môi trường nhân giống được chuẩn vị bằng cách lấy một khuẩn lạc riêng rẽ, cho vào 10 ml môi trường HS trong ống nghiệm đã được tiệt trùng ở 121 0C, 20 phút. Nuôi cấy 3 ngày, sau đó lọc để tách lấy dịch giống đi nhân giống cấp 2. - Môi trường nhân giống cấp 2 cũng có thành phần dinh dưỡng như đối với môi trường nhân giống cấp 1, tuy nhiên được chuẩn bị trong bình erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường HS. Thể tích giống cấp 1 cho vào là 10% (v/v). - Môi trường lên men được chuẩn bị vào các erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường HS và được thanh trùng ở nhiệt độ 100 0C, thời gian 20 phút. Lượng dịch giống sử dụng lên men là 10% (v/v). Kế hoạch thí nghiệm xây dựng như phần thiết kế thí nghiệm sau. 27
37. Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp 1.5 Thiết kế thí nghiệm NỘI DUNG THÍ NGHIỆM Thí nghiệm 1: Khảo sát quá trình phát triển của chủng vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS. Thí nghiệm 2: Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose trên môi trường HS. Thí nghiệm 4: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn carbon đến quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Thí nghiệm 5: Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn nitơ đến quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Thí nghiệm 6: Tối ưu hóa môi trường bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm. 1.5.1 Khảo sát quá trình nhân giống. Chủng A. xylinum từ ống nghiệm thạch nghiêng được bảo quản trong tủ lạnh. Chuẩn bị môi trường HS vào các hộp Petri. Cấy giống vi khuẩn từ ống thạch nghiêng lên các hộp Petri đó nhằm phân lập, đảm bảo nguồn giống đưa vào sử dụng được phát triển từ một khuẩn lạc. Sau khoảng 30 ngày tiến hành phân lập lại một lần nhằm đảm bảo giống có hoạt tính sinh học cao nhất. Sau 2 ngày, các khuẩn lạc đã phát triển trên hộp Petri thành từng khuẩn lạc riêng rẽ. Từ một khuẩn lạc đó, cấy lên các ống nghiệm chứa 10 ml môi trường nhân giống cấp 1, nuôi 28
38. Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp cấy trong tủ ấm tại nhiệt độ 28 0C, thời gian 3 ngày. Sau thời gian 3 ngày, lọc dịch nhân giống trong điều kiện vô trùng để tách các sợi cellulose, thu dịch giống cấp 1 . Sau đó dùng dịch giống đó tiến hành nhân giống cấp 2. Chuẩn bị 90 ml môi trường HS đã tiệt trùng vào erlen 250 ml, cho 10 ml dịch giống cấp 1 vào, lắc đều và để ở nhiệt độ 28 0C, không khuấy đảo. Tiến hành xác định mật độ tế bào ngay sau khi bắt đầu nhân giống cấp 2 và sau mỗi khoảng thời gian 24 giờ. Mục đích của thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng phát triển của chủng A. xylinum hiện có trong điều kiện môi trường hoá học, từ đó chọn thời gian lên men cho các thí nghiệm tiếp theo. 1.5.2 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose. Nuôi cấy thu nhận cellulose từ với chủng vi khuẩn đã được nhân giống cấp 2, xây dựng thí nghiệm như sau: Cho 10ml dịch giống cấp 2 vào erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường HS đã thanh trùng ở nhiệt độ 100 0C, thời gian 20 phút. Sau khi cấy giống, để ở nhiệt độ 28 0C, không lắc đảo. Đến ngày thứ 5 thì bắt đầu thu cellulose, khảo sát khối lượng cellulose thu được tại các ngày thứ 4, thứ 5, thứ 6, thứ 7. Chỉ tiêu theo dõi: - Khối lượng cellulose thu được ở các ngày thứ 4, 5, 6, 7. - pH của môi trường trong thời gian 4, 5, 6, 7 ngày. 1.5.3 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum Nhằm đánh giá tác động của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của chủng A. xylinum hiện tại, chúng tôi tiến hành nuôi cấy thu cellulose tại các giá trị pH ban đầu khác nhau, từ đó rút ra khoảng pH tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp cellulose của chủng vi khuẩn này. Phương pháp thí nghiệm như sau: nuôi cấy A. xylinum trên môi trường cơ bản HS trong erlen 250 ml, tỉ lệ giống cấy là 10%, thay đổi pH ban đầu từ 3 đến 7, nuôi cấy ở nhiệt độ 28 0C. Sau khi kết thúc quá trình lên men, thu nhận cellulose và nhận xét ảnh hưởng của pH lên khả năng tổng hợp cellulose của chủng vi khuẩn A. xylinum. 29
39. Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp 1.5.4 Khảo sát ảnh hưởng độc lập của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum Sau khi đã xác định được thời gian nhân giống cho chủng vi khuẩn A. xylinum, thực hiện khảo sát tác động độc lập của nguồn carbon và nitơ đến hiệu suất sinh tổng hợp cellulose. Đây là thí nghiệm nhằm chọn lựa nguồn carbon và nitơ tốt nhất cho chủng A. xylinum hiện tại. Dịch giống sau khi nhân giống cấp 2 sẽ được lên men trong các môi trường được chuẩn bị với các thành phần như môi trường HS nhưng nguồn carbon và nguồn nitơ được thay đổi, các thành phần khác của môi trường được giữ nguyên. Cụ thể, nguồn carbon được thay đổi giữa các chất sau: mannitol, glucose, fructose, sucrose. Nguồn nitơ được sử dụng gồm: cao nấm men, cao thịt, peptone, tryptone, (NH 4)2HPO4, (NH 4)2SO4. Sau khi thu nhận cellulose, so sánh kết quả, đánh giá hiệu suất của các nguồn cơ chất trên đối với khả năng sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. 1.5.5 Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum Sau khi đã xác định được nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp nhất làm thành phần cho môi trường cho chủng A. xylinum này tổng hợp cellulose, chúng tôi khảo sát ảnh hưởng đồng thời của hai nguồn cơ chất carbon và nitơ lên khả năng tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum. Nguồn carbon thích hợp nhất và nguồn nitơ thích hợp nhất theo kết quả của thí nghiệm trên sẽ được khảo sát tại nhiều hàm lượng khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận cellulose tại các hàm lượng đó, từ các số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy, rút ra hàm lượng nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho A. xylinum tổng hợp cellulose. Sử dụng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi trường lên men. Thiết kế thí nghiệm như bảng 3.1 và 3.2. Bảng 3.1: Bảng thiết kế thí nghiệm tối ưu nguồn carbon và nguồn nitơ TN Biến y y* x1 x2 1 -1 0 30
40. Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp 2 -1 +1 3 0 -1 4 0 +1 5 +1 0 6 +1 +1 7 -1 -1 8 +1 -1 9 0 0 10 0 0 11 0 0 Trong đó, y là hàm lượng cellulose trung bình thực tế thu được trong các thí nghiệm, y* là hàm lượng cellulose thu được theo phương trình hồi quy trong các thí nghiệm, x 1 là yếu tố ảnh hưởng thứ nhất (nguồn carbon), x2 là yếu tố ảnh hưởng thứ hai (nguồn nitơ). Các biến độc lập sẽ được tiến hành thu số liệu ở 3 giá trị nồng độ: mức trên (+) và mức dưới (-) và mức trung bình (0). Đối với nguồn nitơ: - Nếu peptone được sử dụng làm nguồn nitơ thì hàm lượng được cho ở mức 8 gl-1. - Nếu peptone và cao nấm men cùng được sử dụng làm nguồn nitơ thì chọn tổng hàm lượng là 8 gl-1 với tỉ lệ 1:1 Bảng 3.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát Kí hiệu Nguồn carbon Nguồn nitơ -1 -1 x1 (gl ) x2 (gl ) 0 25 8 31
41. Chương 3. Nguyên liệu và phương pháp -1 20 6 +1 30 10 1.6 Các phương pháp phân tích. 1.6.1 Số lượng vi khuẩn Số vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch. Dịch lên men được pha loãng với 0,1% peptone (pH 5). Cho 0,1 ml dịch lên men đã pha loãng lên đĩa chứa môi trường agar HS, nuôi cấy ở 28 0C. Số khuẩn lạc được xác định sau 3 ngày nuôi cấy (Koula et al., 1997). 1.6.2 Hàm lượng cellulose Cellulose ướt thu được từ bình lên men được rửa với nước cất để loại bỏ các thành phần môi trường còn sót lại. Sau đó, khối cellulose ướt được xử lý với dung dịch NaOH 0,5M ở 90oC trong thời gian 1 giờ để loại bỏ hoàn toàn các tế bào vi khuẩn còn sót. Sau đó, khối cellulose được rửa lại bằng nước cất đến khi pH dung dịch nước rửa về trung tính. Sấy cellulose sạch thu được ở 105 0C đến khi khối lượng không đổi. Cân xác định khối lượng của cellulose thu được (Son et al., 2001). 1.6.3 Phân tích thống kê Số liệu nghiên cứu được biểu diễn bằng trung bình kết quả của 3 lần lặp lại với sai số tương đối. Sự khác nhau của các giá trị riêng lẻ được kiểm định bằng t – test bằng phần mềm R cho Windows® với mức ý nghĩa 5% (P < 0,05). 32
42. Chương 4. Kết quả và bàn luận Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 1.7 Khảo sát quá trình nhân giống vi khuẩn A. xylinum Nhân giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy cấp 1 là 10%, trong môi trường cơ bản HS trong bình erlen 250 ml chứa 90 ml môi trường, nhiệt độ nuôi cấy 280C, thời gian 7 ngày. Mật độ tế bào vi khuẩn A. xylinum được xác định ngay từ khi bắt đầu tính thời gian nhân giống. Đồ thị đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn A. xylinum đang sử dụng trong thí nghiệm này thu được như sau. 9 8.8 ) 1 - l 8.6 m u 8.4 f c g 8.2 o l ( o 8 à b ế t 7.8 ộ đ t 7.6 ậ M 7.4 7.2 7 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Thời gian nhân giống (giờ) Hình 4.1: Đường cong sinh trưởng của A. xylinum Thời gian 24 giờ đầu của quá trình nhân giống, dưới đáy erlen bắt đầu xuất hiện những sợi nhỏ, mỏng, lơ lửng, đó là những dải sợi cellulose đầu tiên do A. xylinum tạo ra trong môi trường, sau đó các dải cellulose này sẽ chồng chập, xoắn lại với nhau, bắt đầu tạo thành lớp màng cellulose mỏng, màu trắng đục trên bề mặt môi trường sau ngày thứ ba, thứ tư của quá trình nhân giống. Thời gian tổng hợp cellulose và khả năng tổng hợp cellulose có liên quan đến số lượng tế bào vi khuẩn A. xylinum. Mật độ tế bào ban đầu được xác định ngay khi dịch giống được lắc đều trong bình nhân giống (7,39 ± 0,05 log cfu ml-1) và tại các thời điểm xác định sau mỗi 24 giờ. Mật độ này liên tục tăng lên trong quá trình nhân giống, đạt số lượng 8,73 ± 0,06 (log cfu ml-1) sau 96 giờ phát triển. 33
43. Chương 4. Kết quả và bàn luận Mật độ tế bào tăng nhanh trong 24 giờ đầu của quá trình nuôi cấy, tương ứng với thời gian tế bào đang ở pha thích nghi. Đến giai đoạn pha sinh trưởng thì mật độ tế bào bắt đầu tăng chậm lại, sự tăng chậm lại này diễn ra vào khoảng thời gian từ 24 giờ đến 96 giờ nhân giống. Mật độ tế bào đạt số lượng lớn nhất tại 96 giờ, sau đó giữ ổn định ở pha cân bằng rồi giảm dần khi vào pha suy vong. Từ đường cong sinh trưởng, ta sử dụng dịch giống sau 96h nhân giống để tiến hành lên men thu cellulose là tốt nhất. Vậy, kết quả thí nghiệm cho thấy, trên môi trường hoá học, chủng A. xylinum này cũng có khả năng phát triển tốt như trên môi trường tự nhiên với thành phần chính là nước dừa. 1.8 Khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose. Sau khi xác định được thời gian nhân giống thích hợp, cần xác định thời gian kết thúc quá trình lên men cho các thí nghiệm sao cho phù hợp. Do đó, chúng tôi thực hiện khảo sát quá trình sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum nhằm chọn thời điểm kết thúc quá trình lên men một cách thích hợp nhất. Sử dụng dịch giống cấp 2 với tỉ lệ giống cấy là 10% để nuôi cấy thu nhận cellulose trên môi trường cơ bản HS trong bình erlen 250 ml chứa 100 ml dịch lên men, nhiệt độ nuôi cấy là 280C. Trong quá trình nuôi cấy, khảo sát hàm lượng cellulose được được tổng hợp trong các khoảng thời gian khác nhau, đồng thời xác định pH của dịch lên men. Kết quả thu được cho thấy, trong suốt quá trình lên men, A. xylinum liên tục tổng hợp cellulose, tương ứng với quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Ở ngày đầu tiên, do vừa chuyển từ môi trường nhân giống sang môi trường lên men nên có sự thay đổi đột ngột về môi trường, số lượng tế bào trong môi trường chưa đủ lớn nên sự tạo thành cellulose hầu như chưa có. Sau 2 ngày xuất hiện những sợi cellulose mảnh lơ lửng trong môi trường và trên bề mặt bắt đầu xuất hiện một lớp màng cellulose mỏng, màu trắng. Sang ngày thứ 3 tốc độ tạo cellulose tăng lên đáng kể khi bề mặt bình lên men có một lớp màng cellulose khá dày. Tuy nhiên, lượng cellulose tạo ra sau 3 ngày lên men vẫn rất ít nên chưa thể xác định được khối lượng. Lượng cellulose tăng nhanh từ ngày lên men thứ tư đến ngày thứ sáu. Đây là thời gian vi khuẩn sinh tổng hợp cellulose mạnh nhất sau khi đã thích nghi với môi trường và số lượng tế bào đã đủ lớn. Lượng cellulose thu được tăng lên từ 4,9 ± 0,3 gl-1 lên 7,4 ± 0,3 gl-1. Sang ngày thứ sáu thì tốc độ tăng lên của cellulose được sinh tổng hợp ra đã giảm dần, sự chênh lệch là 0,6 gl -1/ngày thay vì 1,19 gl-1/ngày như sự chênh 34
44. Chương 4. Kết quả và bàn luận lệch giữa ngày thứ tư và ngày thứ năm. Đến ngày thứ bảy thì lượng cellulose thu được hầu như không tăng hơn so với ngày lên men thứ sáu, đạt 7,5 ± 0,4 gl -1. Sự tăng lên này là không đáng kể. (P = 0,21 > 0,05). 9 5 ) 1 - 4.5 l 8 g ( 4 ô 7 h k 3.5 g e 6 n s ờ o 3 l ư u 5 r l t l i e 2.5 ô c 4 m g 2 n H ợ 3 p ư 1.5 l g 2 n 1 ọ r T 1 0.5 0 0 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 Thời gian lên men (giờ) BC pH Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn trọng lượng cellulose thu được và giá trị pH tại các ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7 Mặt khác, trong quá trình lên men, pH của dịch lên men giảm dần từ pH ban đầu là 5 tới pH sau ngày thứ bảy là 3,52. Kết quả cho thấy, song song với sự tổng hợp cellulose, lượng cellulose càng tăng lên thì pH của dịch lên men giảm. Sự giảm pH này có nguyên nhân được xác định rằng trong quá trình sinh trưởng và phát triển, A. xylinum đã sử dụng đường để tạo ra acid gluconic (Tahara et al., 1997). Tuy nhiên, đến ngày thứ 6 thì pH bắt đầu trở nên ổn định, ít thay đổi. Quá trình chuyển hoá đường thành acid gluconic đã giảm. Cũng khảo sát biến động của pH trong quá trình tổng hợp cellulose, trong nghiên cứu của mình, Vandame et al. (1998) thấy rằng, pH dịch lên men giảm rõ rệt vào ngày thứ tư và thứ năm của quá trình lên men, đó cũng là khoảng thời gian cellulose được vi khuẩn tổng hợp mạnh nhất. Khảo sát sự chuyển hoá của đường, Vandame et al. (1998) thấy rằng A. xylinum sử dụng gần 50% lượng glucose trong môi trường chỉ sau ngày lên men thứ hai, và phần lớn lượng glucose này được chuyển hoá thành gluconate và acid gluconic. Bên cạnh đó, Hai-Peng et al. (2002) nghiên cứu trên chủng A. xylinum sucrofermentans BPR2001 cũng cho thấy, sau giai đoạn thích nghi, glucose được chuyển thành acid gluconic rất mạnh và pH dịch lên men giảm rõ rệt. Mặt khác, sự oxy hóa glucose, acid gluconic được tạo ra và giải phóng ra trong môi trường nuôi cấy. 35
45. Chương 4. Kết quả và bàn luận Nếu quá trình này xảy ra mạnh sẽ là nguyên nhân làm cho pH môi trường giảm từ 1 tới 3 đơn vị trong quá trình nuôi cấy, và kiềm chế sự tạo thành cellulose (Krystynowicz et al., 2002). Do đó, khi pH ổn định cũng có thể là dấu hiệu kết thúc quá trình lên men. Kết quả cho thấy, tuy trọng lượng cellulose thu được sau 7 ngày lên men là cao nhất nhưng so với ngày thứ sáu thì sự chênh lệch đó không đáng kể (P > 0,05). Do đó, để rút ngắn thời gian lên men, chọn thời gian kết thúc lên men thống nhất cho các thí nghiệm tiếp theo là sau 6 ngày lên men. 1.9 Khảo sát ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum Tiến hành lên men thu nhận cellulose khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum trên môi trường HS như thí nghiệm trên tại các điểm pH ban đầu khác nhau. Các giá trị pH được khảo sát là 3; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,5 và 7. Khảo sát hàm lượng cellulose thu được, đánh giá ảnh hưởng của pH lên khả năng tạo cellulose của vi khuẩn. Từ đó chọn pH tốt nhất cho môi trường lên men. Kết quả thu được cho thấy, tại các giá trị pH khác nhau lượng cellulose thu được là khác nhau, điều này chứng tỏ pH là một yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose của A. xylinum. Khoảng pH cho chủng A. xylinum trong thí nghiệm này là khoảng từ 4 – 5,5, lượng cellulose thu được ~5,1 gl-1. Lượng cellulose tạo ra tại các giá trị pH khác nhau trong khoảng trên thì sự khác biệt không rõ ràng (P > 0,05). Ngoài khoảng pH trên thì khả năng tổng hợp cellulose của A. xylinum giảm chỉ đạt từ 3,5 gl-1 đến 4,6 gl-1. Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, xem hình 4.3 36
46. Chương 4. Kết quả và bàn luận 6 ) 1 - l g ( n 5 ẩ u h k i 4 v e s o l u 3 l l e c g n 2 ợ ư l g n 1 ọ r T 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 pH Hình 4.3: Ảnh hưởng của pH lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum Song song với quá trình tổng hợp cellulose, A. xylinum còn tổng hợp cả cellulase. Khi cellulase được tạo ra nhiều thì khả năng polymer hóa tạo cellulose của vi khuẩn giảm, lượng cellulose được tạo ra ít hơn. Khi pH cao (pH > 5), lượng cellulase được tạo ra nhiều hơn làm cho cellulose giảm, khi pH thấp (pH < 5) cellulase tạo ra ít, sự tạo thành cellulose tăng lên. Theo nghiên cứu của Tahara et al. (1997) đối với chủng A. xylinum BPR2001, tại pH 4 mức độ polymer hóa của cellulose vào khoảng 14000 – 16000, nhưng với pH 5, DP giảm từ 16800 xuống còn 11000. Độ bền cơ học của cellulose được tổng hợp tại pH 4 cũng cao hơn độ bền cơ của cellulose được sản xuất tại pH 5 (Tahara et al., 1997). Theo nghiên cứu của Hutchen et al. (2006), với chủng vi khuẩn Gluconacetobacter hansenii, nguồn carbon là mannitol thì khi pH đầu là 5,5 lượng cellulose được tạo ra cao hơn đáng kể so với khi pH 6,5. Nhưng cũng trong nghiên cứu này, nếu thay đổi nguồn carbon là glucose thì pH 6,5 lại giúp chủng vi khuẩn này tổng hợp cellulose tốt hơn tại pH 5,5. Mặt khác, trong quá trình tổng hợp cellulose, sự oxy hóa glucose xảy ra cung cấp cho quá trình trao đổi chất các điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm. Các sản phẩm phụ được tạo ra khi glucose bị oxy hóa bởi một số enzyme cũng có thể giải thích tại sao các nguồn carbon khác nhau thì các chủng vi sinh vật khác nhau có hiệu suất sinh tổng hợp cellulose khác nhau tại các giá trị pH khác nhau (Krystynowicz et al., 2002). Như vậy, pH cũng là một yếu tố có thể gây ảnh hưởng đến hiệu suất tổng hợp cellulose của vi khuẩn. Vi khuẩn A. xylinum tổng hợp cellulose tốt hơn ở môi trường có pH thấp hơn 5. 37
47. Chương 4. Kết quả và bàn luận 1.10 Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của vi khuẩn A. xylinum 1.10.1 Ảnh hưởng của nguồn carbon Để khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên hiệu suất sinh tổng hợp cellulose, A. xylinum được nuôi cấy trên môi trường HS với các nguồn carbon khác nhau: glucose, mannitol, sucrose, fructose. Sau 6 ngày lên men ở nhiệt độ 28 0C, cellulose được thu nhận và xử lý, phân tích hiệu suất. Sau 6 ngày lên men, chiều dày lớp cellulose thu được trong trường hợp môi trường có nguồn carbon là mannitol xấp xỉ bằng chiều cao của lớp dịch môi trường ban đầu. Đây cũng được coi là lượng cellulose lớn nhất thu được trong quá trình lên men so với các nguồn carbon khác (P < 0,05). Khối lượng cellulose đạt được 7,6 ± 0,4 gl -1 (hình 4.4). Mặt khác, cellulose ướt tạo thành có cấu trúc đều, bề mặt nhẵn, khối cellulose chắc, hiệu suất thu cellulose sau khi sấy khô cao. Glucose là nguồn carbon cho kết quả tạo cellulose ở mức trung bình, hiệu suất tổng hợp cellulose khá ổn định, lượng cellulose đạt được ~5,7 ± 0,5 gl -1. Hai nguồn carbon khác là fructose và sucrose không thích hợp với chủng vi khuẩn A. xylinum này nên khả năng sử dụng hai nguồn carbon này kém. Lượng cellulose chỉ đạt khoảng 3,5 gl-1. Bằng việc thay đổi nguồn carbon sử dụng, kết quả cho thấy rằng chủng vi khuẩn này có thể sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau nhưng các nguồn carbon khác nhau có sự thích hợp cho khả năng tạo cellulose của chủng vi khuẩn cũng khác nhau. Mỗi chủng vi sinh vật A. xylinum khác nhau sẽ thích hợp với một nguồn carbon khác nhau, tùy chủng vi sinh vật mà các nguồn carbon sẽ thay đổi để sử dụng cho phù hợp, từ đó tạo ra hiệu suất tổng hợp cellulose cao nhất. Kết quả cho thấy sự sai khác về khả năng sử dụng nguồn cơ chất carbon của chủng vi khuẩn A. xylinum này so với các chủng A. xylinum đã được nghiên cứu. Chẳng hạn, với kết quả này, chủng vi khuẩn A. xylinum sử dụng trong các thí nghiệm này sử dụng nguồn cơ chất carbon thích hợp nhất là mannitol, không giống như kết quả mà Masaoka et al. (1993) đã đạt được, kết quả của ông cho thấy rằng, glucose mới là nguồn carbon thích hợp nhất cho sự tạo thành cellulose của vi khuẩn A. xylinum IFO 13693, lượng cellulose có thể đạt được lên tới 0,6 g/g glucose/ngày sau 2 - 4 ngày lên men. Matsuoka et al. (1996) thấy rằng fructose là nguồn carbon thích hợp nhất cho A. xylinum BPR2001. Fructose cũng được xem là nguồn carbon tốt nhất cho A. xylinum E22 tổng hợp cellulose (Krystynowicz et al., 2002). 38
48. Chương 4. Kết quả và bàn luận Tuy nhiên, kết quả trong nghiên cứu này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Oikawa et al. (1995) với vi khuẩn A. xylinum Ku-1, hàm lượng cellulose được tổng hợp bởi A. xylinum Ku-1 khi sử dụng nguồn cơ chất là mannitol cao hơn 3 lần so với khi sử dụng cơ chất là glucose. Hutchens et al. (2006) với chủng A. xylinum hansenii, kết quả của các ông cũng thấy rằng mannitol là nguồn carbon thích hợp nhất cho các chủng A. xylinum đó tổng hợp cellulose. 9 8 n ẩ 7 u h k i 6 v e s 5 o l ) u 1 - l l l 4 e g ( c g 3 n ợ ư 2 l g n 1 ọ r T 0 Glucose Fructose Sucrose Mannitol Nguồn carbon Hình 4.4: Trọng lượng cellulose thu được khi nguồn carbon thay đổi Trong quá trình tổng hợp cellulose, sự oxy hóa glucose xảy ra cung cấp cho quá trình trao đổi chất các điện tử làm cho phần glucose dùng cho việc tạo thành cellulose giảm, do đó cần giảm thiểu quá trình thất thoát glucose do quá trình oxy hóa này. Có thể giảm sự oxy hóa glucose bằng cách thêm ethanol hay glycerol vào môi trường nuôi cấy như là một nguồn điện tử dồi dào nhằm tăng khả năng sử dụng cơ chất carbon cho mục đích tạo cellulose, từ đó tăng hiệu suất sinh tổng hợp cellulose (Park et al., 2003). Mannitol, một polyol, cung cấp điện tử cho sự trao đổi chất của vi khuẩn và kích thích sự tạo thành cellulose tốt hơn so với glucose, điều này đã được báo cáo trong nghiên cứu của Brown et al. (1986). Khi môi trường được cung cấp nguồn carbon là mannitol, sự acid hóa không xảy ra trong quá trình nuôi cấy, điều này phù hợp với con đường trao đổi chất của vi khuẩn sử dụng mannitol, mannitol được A. xylinum chuyển hóa thành fructose (Matsushita et al., 2003), sau đó oxy hóa tiếp thành 5-keto-d-fructose trước khi hấp thu (Mowshoitz et al., 1973). Với việc hạn chế sự tạo thành acid, glucose ít bị tổn thất, lượng cellulose tạo thành cũng cao hơn. 39
49. Chương 4. Kết quả và bàn luận Khi các yếu tố môi trường khác được giữ cố định, thay đổi nguồn carbon, đối với chủng A. xylinum sử dụng trong nghiên cứu này, mannitol là nguồn carbon thích hợp nhất cho khả năng tạo cellulose của vi khuẩn. 1.10.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ Sau khi chọn được nguồn carbon thích hợp nhất cho chủng A. xylinum hiện có để tổng hợp cellulose, khảo sát tiếp theo nhằm đánh giá ảnh hưởng của nguồn nitơ lên hiệu suất tổng hợp cellulose. Cũng chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon được giữ cố định là manitol và nguồn nitơ được thay đổi: cao nấm men, cao thịt, peptone, (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, nuôi ở 280C, thời gian 6 ngày. Kết quả cho thấy, khi lấy tryptone làm nguồn nitơ thì sự tổng hợp cellulose rất yếu, không đáng kể (0,5 ± 0,1 gl-1). Chứng tỏ đối với chủng vi khuẩn A. xylinum trong thí nghiệm này, nguồn nitơ trên không phù hợp cho chúng sinh tổng hợp cellulose. Hai hợp chất khác được dùng làm nguồn nitơ trong thí nghiệm là (NH4)2SO4 và (NH4)2HPO4, lượng cellulose thu được cao hơn đối với tryptone nhưng hiệu suất tạo cellulose cũng rất thấp, chỉ đạt 2,5 ± 0,6 gl-1 và 2,3 ± 0,6 gl-1. Đối với peptone, trọng lượng cellulose tạo ra ở mức trung bình (4,7 ± 0,3 gl -1), đđiều này cho thấy peptone là nguồn nitơ phù hợp cho chủng A. xylinum này hơn (NH 4)2SO4 và (NH4)2HPO4 (P < 0,05). Khi nguồn nitơ được thay bằng cao nấm men và peptone với tỉ lệ 5:3 hoặc cao thịt thì khả năng tạo cellulose của vi khuẩn tăng lên đáng kể, đạt tương ứng 6,8 ± 0,5 gl -1 và 6,1 ± 0,5 gl-1. Lượng cellulose đạt được cao nhất khi sử dụng nguồn nitơ là cao nấm men (8,1 ± 0,8 gl-1). Điều này cho phép kết luận rằng, đối với chủng vi khuẩn A. xylinum đang khảo sát thì nguồn nitơ tốt nhất trong môi trường lên men để tạo cellulose là cao nấm men. 40
50. Chương 4. Kết quả và bàn luận ) 1 - 10 l g ( 9 n ẩ u 8 h k i 7 v e 6 s o l u 5 l l e c 4 g n 3 ợ ư l 2 g n ọ 1 r T 0 p 4 p 4 E E p e e O y O Y M r P P P S T + 2 H ) 2 4 ) E 4 Y H H N ( Nguồn nitơ N ( Các kí hiệu: YE + Pep – Cao nấm men và peptone YE - Cao nấm men Pep – Peptone Tryp – Tryptone ME – Cao thịt Hình 4.5: Trọng luợng cellulose thu được khi thay đổi nguồn nitơ Nitơ là nguồn dinh dưỡng rất quan trọng đối với A. xylinum. Cũng như đối với nguồn carbon, nguồn nitơ đóng vai trò quyết định đến khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, đặc biệt đối với quá trình chuyển hóa tổng hợp cellulose. Nguồn nitơ hữu cơ tốt hơn cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển. Do đó, nguồn nitơ hữu cơ cũng tốt cho A. xylinum tổng hợp cellulose hơn khi so sánh với nguồn nitơ vô cơ. Với việc thay đổi các nguồn nitơ khác nhau, kết quả cho thấy rằng chủng vi khuẩn A. xylinum nghiên cứu cũng có khả năng sử dụng nhiều nguồn cơ chất nitơ khác nhau. Với những nguồn nitơ tôi tìm được và thử nghiệm trong nghiên cứu này, nấm men là nguồn nitơ thích hợp nhất cho chủng vi khuẩn A. xylinum phát triển và tạo cellulose. Một số nghiên cứu khác cho thấy corn steep liquor (CSL) là nguồn nitơ thích hợp nhất để A. xylinum tạo cellulose. Ví dụ, CSL là nguồn nitơ thích hợp nhất cho chủng A. xylinus BRC5 (Yang et al., 1998), A. xylinus BPR2001 (Matsuoka et al., 1996). Cao nấm men là nguồn nitơ hữu cơ, ngoài thành phần nitơ ra, còn chứa các thành phần dinh dưỡng khác tốt cho vi khuẩn phát triển và hỗ trợ sự tạo thành ATP trong quá trình phát triển của vi khuẩn (Sakairi et al., 1998) 41
51. Chương 4. Kết quả và bàn luận Tóm lại, qua các thí nghiệm trên, nguồn carbon và nguồn nitơ thích hợp nhất cho môi trường nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum để thu nhận cellulose là mannitol và cao nấm men, các thí nghiệm sau đều sử dụng nguồn carbon là mannitol và nguồn nitơ là cao nấm men cho môi trường lên men tổng hợp cellulose. Vấn đề đặt ra là cần phải chọn hàm lượng nguồn carbon và nitơ với hàm lượng như thế nào là tốt nhất cho môi trường lên men. Để giải quyết yêu cầu này, cần tiến hành thí nghiệm tiếp theo, tìm điểm tối ưu của thí nghiệm. 1.11 Tối ưu hoá nồng độ nguồn carbon và nitơ. Nguồn carbon thích hợp nhất là mannitol và nguồn nitơ thích hợp nhất theo kết quả của thí nghiệm trên là cao nấm men được khảo sát với các nồng độ khác nhau, đánh giá hiệu suất thu nhận cellulose tại các hàm lượng đó, từ các số liệu thực nghiệm, xây dựng phương trình hồi quy, rút ra hàm lượng nguồn carbon và nitơ thích hợp nhất cho A. xylinum tổng hợp cellulose. Chuẩn bị môi trường HS, nguồn carbon là mannitol, nguồn nitơ là cao nấm men với nồng độ theo mô hình thí nghiệm tối ưu như bảng 4.1 và 4.2. Sau khi thu được kết quả thí nghiệm, số liệu được xử lý theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm để tìm điểm tối ưu cho thành phần môi trường lên men. Phương trình hồi quy bậc hai biểu diễn sự biến động của các yếu tố ảnh hưởng đến các kết quả thí nghiệm có dạng sau đây: 2 y bo  b j x j  b jl x j xl  b jj x j 1 j k 1 j l k 1 j k Trong đó: y – khối lượng cellulose khô (g) x1 , x2 - các yếu tố ảnh hưởng b - các hệ số của phương trình hồi quy. Bảng 4.1: Bảng kết quả thí nghiệm tối ưu TN Biến y x1 x2 42
52. Chương 4. Kết quả và bàn luận 0,737 1 -1 0 0,793 2 -1 +1 0,801 3 0 -1 0,733 4 0 +1 0,807 5 +1 0 0,817 6 +1 +1 0,807 7 -1 -1 0,713 8 +1 -1 0,811 9 0 0 10 0 0 0,820 11 0 0 0,791 Bảng 4.2: Bảng mã hoá các yếu tố ảnh hưởng cần khảo sát Kí hiệu Nguồn carbon Nguồn nitơ -1 -1 x1 (gl ) x2 (gl ) 0 25 8 -1 20 6 +1 30 10 Trong thí nghiệm này, số lượng các yếu tố cần tối ưu là 2 yếu tố, đó là hàm lượng nguồn carbon (mannitol – x1) và hàm lượng nguồn nitơ (cao nấm men - x 2). Các yếu tố khác được giữ không thay đổi. Sau khi hoàn thành thí nghiệm, các số liệu được xử lý thống kê và xác định các hệ số của phương trình hồi quy. 43
53. Chương 4. Kết quả và bàn luận Các hệ số của phương trình hồi quy trên đã được kiểm tra tính ý nghĩa theo tiêu chuẩn Student với t0.05(2) = 2,12 đã loại đi các hệ số không có ý nghĩa thống kê. Sau khi bỏ đi các hệ số không ý nghĩa, loại đi các hệ số b 1 của biến x1 và b11 của biến 2 x1 , phương trình hồi quy thu được như sau: 2 y 0,83 0,0572x2 0,0522x1x2 0,0572x2 Phương trình hồi quy được kiểm tra sự tương thích với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher (F). Kiểm tra hệ số F với giá trị F0,05(f1, f2). f1, f2 tương ứng là các bậc tự do, f1 = 7; f2 = 2. Sau khi kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với thực nghiệm cho thấy Ftính = 3,7 , F0,05 (7;2)= 4,7. Như vậy phương trình tương thích với thực nghiệm. Chuyển phương trình hồi quy thu được (dạng mã hóa) về dạng phương trình trong hệ trục tự nhiên. Ta được phương trình như sau: 2 y* 0,746 0,021x1 0,115x2 0,0026x1x2 0,0131x2 Tối ưu hóa thực nghiệm được thực hiện bằng phương pháp đường dốc nhất, bắt đầu từ điểm không, là mức cơ sở: x1 = 15 và x2 = 6 Chọn bước chuyển động của yếu tố x 2 là  2 0,5 , suy ra bước chuyển động của yếu tố x1 là 1 0,5 . Sau khi khảo sát các giá trị thực nghiệm tối ưu hóa theo phương trình hồi quy cho thấy -1 -1 tại vị trí x1 = 15,5 gl ; x2 = 6,5 gl cho hiệu suất sinh tổng hợp cellulose là cao nhất, y* = 8,76 gl-1. Đó chính là điểm tối ưu thỏa mãn yêu cầu của thí nghiệm. Để kiểm tra sự sai lệch giữa lý thuyết và thực nghiệm, một thí nghiệm nuôi cấy thu nhận cellulose với thành phần môi trường lên men như điều kiện tối ưu lý thuyết trên. Kết quả cho thấy hiệu suất thu nhận cellulose không đạt được như lý thuyết, tuy nhiên tại điều kiện đó, lượng cellulose thu được cũng cao hơn tại các điều kiện khác. Lượng cellulose đạt được ~8,3 gl-1. Như vậy, kết quả lý thuyết thu được có sự chênh lệch so với thực tế (5,5%), tuy nhiên sự chênh lệch này có thể chấp nhận được. Mannitol là một polyol, nó vừa đóng vai trò là cơ chất cho sự tổng hợp cellulose, vừa là nguồn năng lượng cho sự sản sinh ATP, giúp tế bào tăng trưởng và tăng khả năng tạo thành cellulose (Naritomi et al., 1998). Với nồng độ mannitol 15,5 gl -1, nồng độ cao nấm men 6,5 44
54. Chương 4. Kết quả và bàn luận gl-1, lượng cellulose thu được có thể đạt ~8,7 gl -1. Tuy nhiên, nồng độ của mannitol cao hơn 16 gl-1 và nồng độ cao nấm men cao hơn 6,5 gl -1 lại không làm tăng lượng cellulose tạo thành mà ngược lại, lượng cellulose tạo ra lại có xu hướng giảm khi nồng độ mannitol quá cao. Điều này khá phù hợp với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác, chẳng hạn Masaoka et al. (1993), Oikawa et al. (1995), hay S.A. Hutchens et al. (2006). Điều này có thể giải thích bởi sự ức chế A. xylinum tại nồng độ cơ chất quá cao. Như vậy, qua các thí nghiệm đã thực hiện, lượng cellulose được tổng hợp tốt nhất với môi trường hoá học, lượng cellulose có thể đạt được ~8,3 gl -1 khi A. xylinum được nuôi cấy dưới điều kiện môi trường gồm có 15,5 gl-1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5 gl-1 -1 0 Na2HPO4; 1,15 gl acid citric; tại pH 5 và nhiệt độ 28 C. 45
55. Chương 5. Kết luận và đề nghị Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1.12 Kết luận Như vậy, khi khảo sát quá trình sinh trưởng của chủng vi khuẩn A. xylinum được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Sinh học, giữ giống ở 4 oC trên môi trường có thành phần dinh dưỡng tự nhiên mà thành phần chính có bổ sung nước dừa, cho thấy chủng A. xylinum này có khả năng sinh trưởng tốt trên môi trường hoá học. Kết quả khảo sát cũng cho thấy rằng, chủng A. xylinum này có khả năng sinh tổng hợp cellulose tốt trên môi trường hoá học và hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum bị tác động nhiều bởi các yếu tố điều kiện nuôi cấy và môi trường nuôi cấy, trong đó có pH, nguồn carbon và nguồn nitơ. Có thể nâng cao hiệu suất sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum bằng cách tác động đến các yếu tố ảnh hưởng này. Cụ thể, chọn pH cho môi trường nuôi cấy thích hợp, loại nguồn carbon, loại nguồn nitơ thích hợp nhất đồng thời chọn nồng độ các nguồn carbon và nitơ tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp cellulose của A. xylinum. Ví dụ, có thể điều kiện nuôi cấy được điều chỉnh như sau: 15,5 gl -1 mannitol; 6,5 gl-1 cao nấm men; 5 -1 -1 0 gl Na2HPO4; 1,15 gl acid citric; tại pH 5 và nhiệt độ 28 C. 1.13 Đề nghị Một số yếu tố khác có thể tác động đến khả năng tạo cellulose của A. xylinum chưa được khảo sát trong luận văn này: các nguồn cơ chất khác, các chủng vi sinh vật khác, điều kiện nuôi cấy có bổ sung oxy, khả năng tạo cellulose của các chủng A. xylinum đột biến Vì thế, một số đề nghị nghiên cứu như sau: - Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cơ chất khác nhằm tìm ra các nguồn cơ chất hiệu quả mà rẻ tiền, giảm chi phí sản xuất. - Khảo sát khả năng tạo cellulose của các chủng A. xylinum mới khác để tìm ra nguồn giống vi sinh vật tốt hơn. - Khảo sát tính chất vật lý và hóa học của các sản phẩm cellulose tạo thành dưới các điều kiện nuôi cấy tĩnh nhằm nâng cao các tính chất cần thiết cho việc ứng dụng cellulose vi khuẩn làm màng bao chống vi sinh vật trong thực phẩm. - Nghiên cứu thêm các khả năng ứng dụng cellulose vi khuẩn trong thực phẩm và sinh học: màng bao thực phẩm chống vi sinh vật, cố định vi sinh vật, thực phẩm chức năng 46
56. Chương 5. Kết luận và đề nghị 47
57. Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Bae, S., Sugano, Y. & Shoda, M. (2004) Improvement of becterial cellulose production by addition of agar in a jar fermentor. Journal of Bioscience and Bioengineering. 97: 33-38. Bielecki, S., Krystynowicz, A. Turkiewicz, M. Kalinowska, H (2001) Bacterial cellulose. Institute of Technical Biochemistry, Technical Chemistry of Lódz, Stefanowskiego: 37-46 Brown, R.M., Willison, J.H. & Richarson, C.L (1986) Cellulose biosynthesis in Acetobacter xylinum - Visualization of site of synthesis and direct measurement of in vivo process. Proceeding of the National Academic of Sciences of the United States of America. 73: 4565 - 4569. Chao, Y., Ishida, Sugano, Y. & Shoda, M. (2000) Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum in a 50L internal-loop airlift reactor. Biotechnol Bioeng. 68: 345– 352. Chao, Y.P., Sugano. Y., Kouda, T., Yoshinaga, F., Shoda, M. (1997) Production of Bacterial cellulose by Acetobacter xylinum with an air lift reactor. Biotechnology Techniques. 11: 829-832 El-Saied, H., Basta, A.H., & Gobran, R.H. (2004) Research progress in friendly invironmental technology for the production of cellulose products (bacterial and its application). Polymer-plastic Technology and Engineering. 43: 797-820. DeWulf, P., Joris., & Vandamme, K. (1996) Improved cellulose formation by an Acetobacter xylinum mutant limited In (Keto)Gluconate synthesis. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 67: 376-380. Galas, E., Kristynowicz, A. Tarabasz - Szymanska (1999) Optimization of the production of Bacterial cellulose using multivariable linear regression analysis. Biotechnology. 19: 251- 260. George, J., Ramana, K.V., Sabapathy, S.N., Bawa, A.S. (2005) Physico-mechanical properties of chemically treated bacterial (Acetobacter xylinum) cellulose membrane. Microbiology and Biotechnology. 21: 1323-1327. Gindl, W., Keckes, J. (2004) Tensile properties of cellulose acetate butyrate composites reinforce with bacterial cellulose. Composites science and Technology. 64: 2407-2413. 48
58. Tài liệu tham khảo Hai Peng, C. (2002) Cultivation af Acetobacter xylinum for bacterial cellulose production in a modified airlift reactor. Biotechnol. Appl. Biochem: 25-132. Hestrin, S., & Schramm, M. (1954) Synthesis of cellulose by Acetobacter xylinum 2. Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose. Biochem J. 58: 345–352. Hwang, J.W., Hwang, J.K., Pyun, Y. R., Kim, Y.S. (1999) Effects of pH and dissolved oxygen on cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 in agitated culture. J Ferment Bioeng. 88: 183–188. Iguchi, M., Yamanaka, S., Budhiono, A. (2000) “Bacterial cellulose - a masterpiece of nature's arts,” Journal Of Materials Science 35 (2): 261-270 Jonas, R.F., Luiz (1998) Production and application of microbial cellulose. Polymer Degradation and Stability. 59: 101-106. Klemm D., Udhardt, U., Marsch, S.P (2001) Bacterial cellulose - artificial blood vessels for microsurgery. Progress in Polymer Science. 26: 1561-1603. Klemm, C. (2006) Influence of protective agents for preservation of Gluconacetobacter xylinus on its cellulose production. Cellulose 13: 485 –492. Krystynowicz, A., Czaja, W., Wiktorowska-Jezierska, M., Goncalves-Miskiewicz, M., Turkiewicz and Bielecki, S. (2002) Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. 29: 189 – 195 Lê Văn Việt Mẫn & Lại Mai Hương (2006) Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Masaoka, S. (1993) Production of cellulose from glucose by Acetobacter xylinum. Journal of fermentation and bioengineering. 75: 18-22. Nguyễn Cảnh (2004) Quy hoạch thực nghiệm. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh. Nguyễn Thị Diễm Chi, Hoàng Tuyền Yến Linh và Nguyễn Vũ Thanh (2002) Nghiên cứu nuôi cấy Acetobacter xylinum làm màng sinh học trị phỏng và các tổn thương da. Y học Tp.HCM. 6: 139-141. Nguyễn Thúy Hương (2006) Tuyển chọn và cải thiện các chủng Acetobacter xylinum tạo cellulose vi khuẩn để sản xuất và ứng dụng ở quy mô pilot. Luận án tiến sĩ. 49
59. Tài liệu tham khảo Naritomi, T., Kouda, T., Yano, H., Yoshinaga, F (1998) Effect of ethanol on Bacterial cellulose production from fructose in continous culture. Fermentation and Bioengineer. 85: 598-603. Sakairi, N., Asano, M., Ogawa., Nishi, N., & Tokura, S (1998) A method for direct harvest of bacterial cellulose filaments during continuous cultivation of Acetobacter xylinum. Carbohydrate Polymers. 35: 233–237. Schramm, M., & Hestrin, S. (1954) Factors affecting production of cellulose at the air liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. Journal of Genneral Microbiology. 11: 123 – 129. Son, H.J., Heo, M.S., Kim, Y.G., Lee, S.J. (2001) Optimization of fermentation conditions for the production of Bacterial cellulose by a newly isolated Acetobacter sp.A9 in shaking cultures. Biotechnology and Applied Biochemistry. 33: 1-5. Toda, K., Asukua, T. (1997) Cellulose production by acid acetic-resistant Acetobacter xylinum. Fermentation and Bioengineering. 84: 228-231. Vandamme, E.J., De Baets, S., Vanbaelen, A., Joris, K. & De Wulf, P. (1998) Improved production of bacterial cellulose and its application potential. Polymer Degradation and Stability. 59: 93-99 Watanabe K., T.M., Morinaga Y., Yoshinaga F. (1998) Structure features and properties of Bacterial cellulose produced in agitated culture. Cellulose. 5: 187-200. Yang, L.Z. (2007) Effect of addition of sodium alginate on bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum. J Ind Microbiol Biotechnol. 34: 483–489. Yang, Y.K. (1998) Cellulose production by Acetobacter xylinum BRC5 under agitated condition. Fermentation and Bioengineering. 85: 312-317. Yoshinaga, T.T. (1997) Production of Bacterial cellulose by agitation culture systems. Pure and application chemistry. 69: 2453-2458. Zou, K., Wu, S.C., Wu, W.T. (2006) A hybrid model combining hydrodynamic and biological effects of bacterial cellulose with a pilot scale airlift reactor. Biochemical Engineer 29: 81-90. 50
60. Tài liệu tham khảo 51
61. Phụ lục PHỤ LỤC Các công thức sử dụng để tính toán trong thí nghiệm: Phương trình hồi quy tuyến tính có dạng: 2 y bo bj x j bjl x j xl bjj x j 1 j k 1 j l k 1 j k Trong đó: b là các hệ số Số hệ số của phương trình hồi quy được tính theo công thức: k 1 k 2 m k 1 C 2 k 2 Trong đó, m là số hệ số của phương trình, k là số yếu tố ảnh hưởng Tính toán các hệ số của phương trình: N N N '  x ji yi (x j xl )i yi  x ji yi i 1 i 1 i 1 bj N bjl N bjj N 2 2 ' 2  x ji (x j xl )i (x ji ) i 1 i 1 i 1 Phương sai của các hệ số: s2 s2 s2 s2 th s2 th s th b j N b jl N b jj N 2 2 ' 2  x ji (x j xl )i (x ji ) i 1 i 1 i 1 Kiểm tra tính ý nghía của các hệ số của phương trình hồi quy theo tiêu chuẩn Student, so sánh ttính với ttra sth b j s t j b j k 2 s 2 2 b j Kiểm tra sự tương thích với thực nghiệm của phương trình hồi quy bằng tiêu chuẩn Fisher, so sánh Ftính với Ftra F được tính theo công thức: 2 sdu F 2 sth Trong đó: N N ˆ 2 (yi yi )  si s2 i 1 s2 i 1 du N l th N 52
62. Phụ lục N là số thí nghiệm, l là số hệ số của phương trình hồi quy, s i là các phương sai của các thí nghiệm, y là khối lượng cellulose ở các thí nghiệm. 53