Hóa học - Một số phương pháp tủa protein

Nội dung text: Hóa học - Một số phương pháp tủa protein

1. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN I. Phương pháp tủa bằng các tác nhân gây tủa là dung môi hữu cơ (Ethanol 80%, Aceton) Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol ) ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan của những phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió. II. Phương pháp tủa bằng muối Người ta có thể dùng muối (NH 4)2SO4, NaCl để tủa protein vì các muối này vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu), vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng. Phần thí nghiệm 1. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Hóa chất Pipet 5ml, 10ml Nguyên liệu thơm (dứa) Becher 50ml, 100ml, 250ml Etanol 96% Bình tia Muối (NH4)2SO4 Máy ly tâm 2. Thực hành Cân khoảng 80g đến 100g thơm, giã nát vắt lấy nước rồi ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút rồi đong xem thể tích của nước thơm là bao nhiêu, ghi nhận thể tích V. Sau đó chia đôi thể tích V nước thơm vùa thu được thành hai phần bằng nhau rồi tiến hành tủa protein bắng hai tác nhân tủa khác nhau: Ethanol 80% và muối (NH4)2SO4 1
2. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Quy trình kết tủa enzym Bromelin bằng cồn 80% Chồi ngọn, vỏ quả Làm sạch Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Bã Ly tâm 6000 v/p, trong 15 phút Bã cồn 80%, làm Dịch trong lạnh 40C Tủa cồn 4oC / 2 giờ Ly tâm 6000 v/p, trong 20 phút Bỏ dịch Thu tủa trong Sấy khô Bromelin Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn) 2
3. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Quy trình thu nhận enzym Bromelin bằng muối (NH4)2SO4 Chồi ngọn, vỏ quả Làm sạch Nghiền ép, xay nhuyễn Lọc Bã Ly tâm 6000 v/p, 15 – 20phút Bã Ammonium Dịch trong sulfate 70% bão hòa Hỗn hợp dịch dứa, để ở nhiệt độ phòng 30 phút Ly tâm 6000 v/p, trong 15 phút Thu tủa Bỏ dịch trong Sấy khô Bromelin Lưu ý: Để có muối(NH4)2SO4 bão hòa 70% ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối trong 100ml nước thơm. 3. Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu. 3
4. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH III. Phương pháp tủa protein bằng điểm đẳng điện. 1. Nguyên tắc Giá trị pH mà tại đó phân tử protein trung hòa điện gọi là điểm đẳng điện của protein (pI), ở giá trị pH = pI phân tử protein trung hòa điện sẽ không chuyển dịch trong điện trường, phân tử protein sẽ kém bền nhất dễ kết tủa. Người ta lợi dụng tính chất này để kết tủa protein. 2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Hóa chất Máy khuất từ Dung dịch NaOH 20% Máy ly tâm Dung dịch HCl 10% Cân phân tích Ete Bercher 100ml, 250ml Etanol Pipet 5ml, 10ml Giấy pH 3. Thực hành Tách chiết protein cá: Cân 100g cá đã xay nhuyễn trong một bercher rồi cho 4 lần nước. (1 cá : 4 nước, g/l) Khuấy đều rồi cho từ từ NaOH 20% vừa cho vừa khuấy cho đến pH 11 thử bằng giấy pH, khuấy khoảng 45 phút rồi ly tâm, giữ lại dịch chiết trong một bercher 250ml, bã còn lại thêm nước chiết tiếp lần hai rồi ly tâm lấy dịch bỏ bã. Dịch thu được cho vào bercher 250ml gộp chung với phần dịch chiết bên trên. Cho từ từ HCl 100% vào dịch chiết vừa cho vừa khuấy đến pH thích hợp là 6 sẽ thấy kết tủa, ly tâm 4000 vòng/phút trong 30 phút, rồi bỏ dịch thu tủa protein, rửa tủa với ete : ethanol với tỷ lệ 2:1, tủa protein sạch khi rửa tủa vài lần với ete : ethanol. Cân lượng tủa protein thu được (mg tủa) để tính ra hiệu suất protein có trong 100g cá. 4
5. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ENZYM BROMELIN (Xác định hoạt tính enzym Bromelin bằng phương pháp Anson cải tiến) 1. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thủy phân protein casein bằng enzym Bromelin có trong dịch nghiên cứu, tiếp đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của Tyrosin để tính lượng sản phẩm do enzym xúc tác tạo nên. 2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Hóa chất Ống nghiệm Dung dịch Casein 1% Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Dung dịch TCA 5% Máy quang phổ Dung dịch NaOH 0,5N Becher 50ml, 250ml, 500ml Thuốc thử Folin Bình tia Dung dịch HCl 0,2N Dung dịch Tyrosin chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2N 3. Chuẩn bị đường chuẩn Tyrosin Các bước dựng đường chuẩn Tyrosin Dung dịch hóa chất Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Lượng Tyrosin tương ứng (µM) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 10 10 10 10 10 10 Thuốc thử Folin (ml) 3 3 3 3 3 3 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (µM) và ΔOD (ΔOD = ODTN – ODTK). 5
6. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH 4. Phương pháp tiến hành Lấy 6 ống nghiệm sạch, khô, tiến hành làm 3 ống thử thật, 3 ống thử không Các bước chuẩn bị mẫu enzym để đo hoạt tính Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thử thật Thử không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 1 Lắc đều và giữ ở 35,5oC trong 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0 Để yên 30 phút, lọc lấy dịch trong Lấy 2 ống nghiệm mới khác, cho vào ống thứ nhất 5ml dịch lọc của ống thử thật và cho vào ống thứ hai 5ml dịch lọc cùa ống thử không. Tiếp tục thêm vào mỗi ống 10ml NaOH 0,5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ΔOD = ODTT – ODTK, sau đó dựa vào đồ thị chuẩn suy ra được số µM Tyrosin. 5. Tính kết quả Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzym tối thiểu trong điều kiện thí nghiệm (35,50C: pH 7,6 ) thủy phân Casein trong 1 phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm tương ứng với 1µM Tyrosin trong đường chuẩn. M Tyro sin*V * L Hđ Protease = (UI) t * m * v Với: Hđ Protease : hoạt độ enzym protease (UI/g) V : tổng thể tích hỗn hợp trong ống thử thật hoặc ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzym đem đi xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzym µM Tyrosin: lượng µM Tyrosin trong v (ml) suy ra từ đường chuẩn 6
7. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH KHẢO SÁT HOẠT TÍNH INVERTASE I. Nguyên tắc: Invertase là một enzym thủy giải saccharose thành glucose và fructose. Trong bài này ta dùng enzym invertase trích trong men bia để cho thủy giải saccharose, từ đó tính được hoạt tính của enzym này. II. Dụng cụ và thuốc thử Dụng cụ Hóa chất Becher 100ml – 250ml dung dịch saccharose 10% Erlen 250ml dung dịch NaOH N/10 Ống nghiệm 50ml Dung dịch Iod N/10 Pipet 5ml – 10ml Dung dịch H2SO4 N Buret 25ml Hồ tinh bột 1% Phễu lọc Dung dịch Na2S2O3 N/20 III. Cách tiến hành Điều chế dung dịch invertase: cân 0,5g men bia hòa tan trong 50ml nước cất. Khuấy đều trong 5 phút. Để lắng đem lọc lấy dịch lọc. Thực hiện ba ống nghiệm như sau: Số ống 1 2 3 ml dung dịch saccharose 10% 10 10 ml nước cất 10 ml enzym invertase 10 10 ml enzym invertase đã đun sôi 10 Để thủy giải trong 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiếp đó, đem tất cả các ống đun cách thủy trong 2 phút, làm lạnh dưới vòi nước. Hút 5 ml của hỗn hợp cho vào một erlen 250ml và định phân đường glucose như sau: cho thêm vào bình 10ml dung dịch Iod N/10 và 15 ml dung dịch NaOH N/10. Thời gian nhỏ NaOH phải kéo dài khoảng 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong bóng tối 15 -20 phút. Lấy ra thêm vào 2ml dung dịch H2SO4 N. Định phân lượng iod thêm còn thừa bằng dung dịch Na2S2O3 N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng để làm chất chỉ thị màu). 7
8. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH IV. Kết quả Hoạt tính của invertase được biểu thị bằng số mol saccharose thủy giải bởi lượng enzym invertase có trong 1g men bia trong 1 phút ở nhiệt độ phòng thí nghiệm. Gọi V1 và V2 là số ml Na2S2O3 N/20 dùng định phân ống số 1 và số 2. Có nhận xét gì về kết quả định phân trong ống số 3? Hoạt tính invertase được tính theo công thức sau: (V V )* A* B 1 2 mol / g / phút 103 20 2 a b*t *m a: thể tích lấy ra trong mỗi ống để định đường glucose (ml) A: thể tích tổng cộng trong mỗi ống (ml) b: thể tích dung dịch enzym cho vào mỗi ống (ml) B: tổng thể tích dung dịch enzym có được từ mg – men (ml) t: thời gian thủy giải tính bằng phút. 8
9. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM ALPHA – AMYLASE (THEO PHƯƠNG PHÁP SMITH & ROE) I. Nguyên tắc: Hoạt tính α - amylase biểu thị khả năng của enzym amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột đến dextrin trong 1 phút ở 50 0C và được thể hiện bằng số đơn vị của enzym trong 1g mẫu. Khi phản ứng thủy phân tinh bột xảy ra, lượng tinh bột còn lại chưa được thủy phân hủy sẽ tạo phản ứng màu với iod và được so màu bằng máy so màu quang học ở bước sóng 620 nm. II. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Hóa chất Bình định mức 50ml, 100ml, 250ml Cồn 960 Bếp ổn nhiệt Dung dịch tinh bột 1% trong đệm pH 5,6 Pipet 1ml, 2ml, 3ml, 5ml, 10ml Dung dịch HCl 1N Becher 50ml, 100ml, 250ml Dung dịch NaCl 3% Máy quang phổ Thuốc thử Lugol III. Thực hành 1. Ly trích Amylase Amylase là 1 tạp chất protein không tan trong rượu mạnh. Cân 10g lúa nảy mầm cho vào cối với 30ml nước cất, giã nát lúa dưới nước. Để yên trong 15 phút, đem lọc. Lấy tất cả nước qua lọc, thêm 4 lần thể tích cồn 960. Khuấy đều, ta sẽ thấy amylase và các protein khác tủa dưới dạng nùi lớn. Để lắng, ly tâm lấy tủa. Hòa tan tủa trong 20ml nước cất. Ta có dung dịch amylase khá tinh sạch. Đặc biệt dung dịch này không có chất đường khử (thử 1ml dung dịch thuốc thử Fehling, đun cách thủy 3 phút, ta không có kết tủa đỏ xuất hiện) 9
10. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH 2. Khảo sát hoạt tính α-amylase Lấy sáu ống nghiệm chia thành 2 lô, mỗi lô 3 ống nghiệm gồm thử thật và thử không để lấy trung bình. Tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Ống thử thật (t) Ống thử không (o) Nước cất (ml) 0 1 Dịch chiết α - amylase 1 0 Dung dịch đệm (ml) 1 1 Dung dịch tinh bột 1% (ml) 1 1 Dung dịch NaCl 3% (ml) 0,5 0,5 Dung dịch HCl 1N (ml) 0 1 Đem ủ ở 500C trong 30 phút Dung dịch HCl 1N (ml) 1 0 Nước cất (ml) 5,5 5,5 Thuốc thử Lugol (ml) 0,5 0,5 Lắc đều hỗn hợp trong ống nghiệm rồi mang đi so màu ở bước sóng 620nm IV. Kết quả: (OD OD ) *C * L Hđ A= 0 t (UI ) OD 0 *t Với OD0: mật độ quang của ống thử không ODt: mật độ quang của ống thử thật C: lượng tinh bột ban đầu tham gia phản ứng (mg) T: thời gian phản ứng (phút) L: hệ số pha loãng mẫu enzym. 10
11. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH XÁC ĐỊNH ĐẠM TỔNG SỐ THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I. Vô cơ hóa: Nguyên tắc: Sự vô cơ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù nằm dưới dạng nào (hữu cơ, vô cơ, protein) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfat (NH 4)2SO4 bằng cách đun sôi với H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. H2SO4 đậm đặc Chất đạm (NH ) SO Xúc tác, t0 4 2 4 Thực hành: hút chính xác 1ml nếu là nguyên liệu lỏng hay cân chính xác 1g nếu là nguyên liệu khô đã nghiền nhuyễn để cho đồng nhất, cho vào một bình cổ cao có dung tích từ 60ml đến 100ml (bình kjeldahl). Thêm vào đó 5ml H 2SO4 đậm đặc và khoảng 0,5g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh do trời nhạt. Để nguội và pha loãng thành 100ml với nước. Chất xúc tác dùng ở đây là hỗn hợp đã xay nhuyễn của: K 2SO4 và CuSO4 có tỷ lệ theo trọng lượng là 9: 1 Thực hiện 3 sự thử thật (có chất đạm) và 3 sự thử không có chất đạm (thay chất đạm bằng nước cất) II. Phương pháp kjeldahl: Nguyên tắc: Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng Amonium sulfat đem cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac (NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH4OH + Na2SO4 Sau đó lượng amoniac được hơi nước nôi cuốn bằng một dụng cụ máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H 2SO4. Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu. 11
12. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Dụng cụ và hóa chất: Dụng cụ: Hóa chất: - Máy cất đạm Parnas – Wargner - Dung dịch NaOH đậm đặc (10N) - Bình kjeldahl - Dung dịch H2SO4 N/100 - Bếp đun - Dung dịch NaOH N/100 (dung dịch - Bình xịt nước cất này sau khi pha xong dùng ngày thì - Becher 250 ml, 100ml, 50ml đúng nồng độ, nhưng để lâu sẽ bị - Erlen 250ml carbonat hóa nên nồng độ không còn - Bình định mức 100ml, 50ml đúng như ban đầu, vì thế phải xác - Buret 25ml định lại hệ số chỉnh lý x bằng cách - Pipet 1ml, 5ml, 10ml, 20ml. định phân nó với dung dịch acid - ống đong 25ml chuẩn (acid oxalic, acid phtalic ) - Dung dịch đỏ metil 0,5% pha trong rượu etylic. Cách thực hành: Đun sôi bình nước máy Parnas – Wargner. Đặt erlen có chứa 25ml H 2SO4N/100 và vài giọt đỏ metil vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng chìm vào dung dịch. Hút 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng thành 100ml, đem đổ vào máy Parnas – Wargner; thêm vào đó 10ml NaOH đậm đặc ( ghi nhó là khi cho mẫu cũng như NaOH đậm đặc vào máy, phải cho xuống từ từ bằng kẹp Mohr, nếu cho chảy xuống quá nhanh thì dung dịch sẽ bị máy hút ra ngoài). Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi cuốn amoniac sang erlen trong 3 phút, hạ erlen xuống và tiếp tục đun thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào erlen đựng H 2SO4 N/100. Lấy erlen ra và định phân H2SO4 thừa bằng dung dịch NaOH có chuẩn độ là x N/100 cho đều. Khi dung dịch đổi màu (từ màu hồng nhạt sang màu da cam): thực hiện 3 sự thử thuật và 3 sự thử không để lấy trị số trung bình. Cách tính: Nếu nguyên liệu là chất lỏng, thông thường lượng đạm được tính bằng số gam đạm trong 1 lít, nếu nguyên liệu là chất rắn, thì trước hết phải tính độ ẩm, sau đó lượng đạm đươc tính bằng phần trăm (số gam đạm có trong 100g nguyên chất liệu) theo độ khô tuyệt đối) Giả sử nguyên liệu là chất lỏng. Lấy 1ml nguyên liệu đem vô cơ hóa và pha loãng thành 100ml, sau đó hút 10ml đem chưng cất bằng máy Parnas – Wargner. Gọi V0 là thể tích dung dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử không). Gọi Vt thể tích dụng dịch NaOH x N/100 (trị số trung bình của 3 lần thử thật). 12
13. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Vậy: V V0 Vt là lượng NaOH tương đương với lượng amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng. 1mol amoniac tương đương với 1mol NaOH. Do đó số mol amoniac phóng thích bởi 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là: Vx(1/100) C mol Vx10 5 mol M 1000 Số gam đạm có trong 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng là: 14. V.x.10 5 g Số gam đạm có trong 1000gl dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng hay trong 1ml nguyên liệu 14. Vx.10 5.100 14. Vx10 4 g 10 Số gam đạm có trong 1 lít nguyên liệu: 14. V.x.10 4.1000g / lít 1,4. V.xg / lít 13
14. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH CHẤT ĐƯỜNG I. Phản ứng màu tổng quát (phản ứng Molish) Tất cả các chất đường đều cho màu tím đối với dung dịch α – Naphthol trong H 2SO4 đậm đặc. Đổ trong ống nghiệm 1 ml dung dịch đường 1% và 2 giọt dung dịch α – Naphthol 15% trong rượu. Lắc đều, nghiêng ống và cho H 2SO4 đậm đặc từ từ theo thành ống. Có sự tạo thành một lớp màu tím hiện ra ở mặt ngăn cách 2 chất lỏng. II. Phân biệt giữa monosaccharid và disaccharid (phản ứng Barfoed) Khả năng khử của những monosaccharid có thể lớn hơn nhiều khả năng khử của disaccharid cho nên, thay vì sử khử ở môi trường base, sự khử ở môi trường acid yếu có thể giúp ta phân biệt được monosaccharid và disaccharid. Trong ống nghiệm đựng 2ml thuốc thử Barfoed, ta thêm vào 1ml dung dịch đường muốn khảo sát. Ta thực hiện đồng thời ba sự thử chứng với các dung dịch glucose 1% , lactose 1% và nước cất. Đun sôi cách thủy trong 5 phút. Làm lạnh, quan sát ống có trầm hiện đỏ. Đun tiếp tục 8 phút, quan sát ống có trầm hiện đỏ. Giải thích hiện tượng. III. Phản ứng với thuốc khử Fehling Thuốc khử này là dung dịch CuSO4 với dung dịch soude đậm đặc và tartrat kép natrium và kalium. Tác dụng của dung dịch soude đậm đặc lên CuSO 4 cho hydroxyd đồng (CuO, H2O) tan trong dung dịch nhờ sự hiện diện của tartrat. Trong một ống nghiệm, đổ 1ml thuốc thử Fehling và 1ml dung dịch glucose. Đun sôi cách thủy trong 5 phút có trầm hiện đỏ gạch Cu 2O nhờ sự khử đồng nhị thành đồng nhất bởi glucose. 14
15. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH KHẢO SÁT LIPID I. Khảo sát tính hòa tan của lipid 1. Nguyên tắc: Lipid không hòa tan trong nước do có sức căng bề mặt rất cao. Nếu dùng lực cơ học tác động vào hỗn hợp lipid nước thì chúng phân tán thành từng hạt nhỏ, nhưng ngưng tác dụng chúng lại phân thành 2 lớp: lipid ở trên và nước ở dưới. Nếu ta thêm vào hỗn hợp các chất muối kiềm, xà phòng, mật sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của các hạt lipid do đó việc trở lại hai lớp khó hơn và dung dịch lúc này sẽ có màu trắng đục như sữa (nhũ tương), lipid ở dưới dạng các hạt nhỏ liti các micell đấy là hiện tượng nhũ hóa mỡ. Nếu thay nước bằng các dung môi hữu cơ: acetone, ether, chloroform, benzen thì lipid sẽ hòa tan vào các dung môi nói trên. 2. Hóa chất Dầu thực vật hay mỡ động vật Dung môi hữu cơ: alcohol, acetone, bezen 3. Cách làm Cho vào ba ống nghiệm: Ống 1: 2ml alcohol Ống 2: 2ml acetone Ống 3: 2ml benzen Nhỏ thêm vào mỗi ống 1 giọt dầu hoặc mỡ, lắc nhẹ, quan sát sự hòa tan của lipid trong ba dung môi hữu cơ. II. Khảo sát một số chỉ số đặc trưng của chất béo 1. Chỉ số acid: Là số mg KOH dùng trung hòa các acid béo tự do trong 1g chất béo. Nguyên tắc Dùng KOH 0,1N trong rượu để trung hòa các chất béo tự do trong 1g nguyên liệu, chất chỉ thị màu là phenolphtalein. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Hóa chất Erlen 100ml KOH 0,1N Pipet 10ml Ether ethylic Becher 100ml Phenolphtalein 0,5% trong alcohol Bình tia Dầu để khảo sát 15
16. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH Cách làm Cân 1g (1ml) chất béo cho vào erlen, thêm 10ml ether ethylic, lắc đều cho tan chất béo. Cho 1 giọt phenolphtalein và chuẩn độ bằng KOH 0.1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây. Tính toán kết quả: Chỉ số acid = 5.61 * V/m 5,61 là số mg KOH tương ứng 1ml KOH 0.1N V là số ml KOH m là trọng lượng lipid đã cân (gram) 2. Chỉ số savon Là số mg KOH cần thiết để savon hóa các ester chứa trong 1g chất béo. Nguyên tắc: Cho nguyên liệu kết hợp với 1 lượng thừa KOH để savon hóa chất béo. Định lượng KOH thừa bằng HCl giúp suy ra chỉ số savon. Dụng cụ và hóa chất: Dụng cụ Hóa chất Erlen KOH 0.5N trong rượu Pipet 10ml HCl 0.5N Becher 100ml Ethanol tuyệt đối Bộ chưng cất hoàn lưu Phenolphtalein 0,5% trong alcohol Chất béo để khảo sát Cách làm: Cân chính xác 500mg chất béo cho vào erlen, thêm 10ml KOH 0.5N. Đun sôi hoàn lưu 45’, định phân KOH bằng HCl 0.5N với chất chỉ thị màu là phenolphtalein. Thực hiện một bình đối chứng thay 500mg chất béo bằng 500mg nước. Tính toán kết quả: Chỉ số savon = 28.05 * (V0 – V1)/m 28.05 là số mg KOH tương ứng 1ml HCl 0.5N V0 là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình đối chứng V1 là thể tích dung dịch HCl 0.5N của bình thí nghiệm m là trọng lượng chất béo đã cân (gram) 16
17. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C (Phương pháp định lượng vitamin C bằng IOD) 1. Nguyên tắc Để xác định nhanh chóng hàm lượng vitamin C trong nguyên liệu khi có chất màu người ta thường dùng phương pháp chuẩn độ iod. Tất cả acid ascorbic bị oxi hóa bởi iod. Phần iod thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột. Điều đó nói lên là phản ứng đã kết thúc. 2. Dụng cụ và hóa chất Dụng cụ Hóa chất - Erlen 100ml - Dung dịch HCl 5% - Pipet 5ml, 10ml - Dung dịch Na2S2O3 0,01N - Buret - Dung dịch tinh bột 1% - Bình định mức 50ml - Dung dịch iod 0,01N - Becher - Cối chày sứ - Phễu thủy tinh 3. Cách thực hành a. Chuẩn bị mẫu vật: Cân N (g) mẫu vật và nghiền nhanh chóng trong cối sứ với 5ml HCl 5%. Vitamin C rất dễ bị oxi hóa trong không khí nhất là khi có sự hiện diện của các ion kim loại (Fe, Cu). Vì vậy trong khi chuẩn bị mẫu phải cắt hoặc nghiền bằng dao không rỉ và làm nhanh. Dịch chiết thu được cho vào bình định mức 50ml và thêm nước cất (rửa cối chày và bã vài lần bằng nước cất rồi đổ vào bình), khuấy đều rồi lọc. b. Định phân: - Định chuẩn lại dung dịch iod N/100 với dung dịch Na2S2O3 0,01N để tính hệ số hiệu chỉnh T của dung dịch iod. - Chuẩn bị hai erlen. Hút vào mỗi bình 20ml dịch chiết có chứa vitamin C, 5 -10 giọt dung dịch hồ tinh bột 1% và chuẩn độ ngay bằng dung dịch iod 0,01N đến khi có màu xanh 17
18. KHOA CN SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH 4. Kết quả Số mg vitamin C trong 1g mẫu vật được tính như sau: 0,00088.a.T.V.100 x% v.N a: thể tích (ml) dung dịch iod 0,01N dùng khi chuẩn độ. T: hệ số hiệu chỉnh dung dịch iod 0,01N với dung dịch Na2S2O3 0,01N V: thể tích chung của dịch chiết (50ml) v: thể tích dịch chiết lấy để chuẩn độ (20ml) N: trọng lượng mẫu phân tích 0,00088: số gram vitamin C tương ứng với 1ml dung dịch iod 0,01N 18