Giáo trình Sinh lý thực vật ứng dụng

Nội dung text: Giáo trình Sinh lý thực vật ứng dụng

1. B GIÁO D C VÀ ðÀO T O TR ƯNG ð I H C NƠNG NGHI P I HÀ N I Giáo trình SINH LÝ TH C V T NG D NG PGS.TS V Ũ QUANG SÁNG (ch biên) NGUY N TH NH N, MAI TH TÂN, NGUY N KIM THANH A +GA 3 ð/C
2. LI NĨI ð U Trong quá trình phát tri n c a mình, mơn khoa h c Sinh lý th c v t cĩ hai h ưng nghiên c u chính: - H ưng nghiên c u Sinh lý – Hố sinh: chuyên nghiên c u b n ch t các quá trình s ng xy ra trong c ơ th th c v t, t đĩ tìm ra các bi n pháp điu khi n m t ph n hay tồn b quá trình Sinh lý - Hố sinh theo h ưng cĩ l i cho con ng ưi trong điu ki n t nhiên và nhân t o nh ư nghiên c u các quá trình quang h p, c đ nh nit ơ phân t (N 2) và quá trình sinh tr ưng, phát tri n c a cây v.v - H ưng nghiên c u Sinh lý – Sinh thái: chuyên nghiên c u m i quan h gi a các quá trình sinh lý và các y u t sinh thái (n ưc, nhi t đ , ánh sáng, O 2, CO 2 và dinh d ưng, đt ). Trên c ơ s đĩ tìm ra đưc các quy lu t ho t đ ng c a các quá trình sinh lý trong các điu ki n sinh thái xác đ nh nh m xây d ng mơ hình sinh thái t i ưu cho các quá trình sinh lý giúp cây sinh tr ưng, phát tri n và cho n ăng su t cao, ch t l ưng t t. Sinh lý h c th c v t cịn đưc chia ra các chuyên khoa: - Sinh lý th c v t đ i c ươ ng - Chuyên nghiên c u các ch c n ăng sinh lý chung c a th c v t. - Sinh lý th c v t chuyên khoa - Nghiên c u các quy lu t sinh lý cho t ng nhĩm cây, t ng cây nh ư Sinh lý cây tr ng, Sinh lý cây r ng, Sinh lý cây ăn qu , Sinh lý cây lúa, cây đu t ươ ng, Sinh lý cây ngơ, cây khoai tây v.v - Sinh lý th c v t ng d ng . + C ơ s biên so n giáo trình Nh ng n ăm g n đây, Sinh lý h c th c v t ngày càng ti p c n v i nhi m v c a th c ti n sn xu t nơng nghi p, lâm nghi p, b o qu n và ch bi n nơng s n v.v và nĩ cĩ vai trị r t quan tr ng cho các ngành s n xu t này. Do khuơn kh giáo trình Sinh lý th c v t c ơ b n cĩ th i l ưng gi i h n, khơng th trình bày h t đưc nh ng ng d ng và kh n ăng ng d ng ca mơn khoa h c này vào s n xu t, trong khi nh ng v n đ ng d ng vào th c ti n s n xu t ng ưi k s ư nơng h c r t c n đưc trang b .Tr ưc b i c nh đĩ mơn h c Sinh lý th c vt ng d ng ra đ i. + ði t ưng và nhi m v c a mơn h c Sinh lý th c v t ng d ng. Hi u rõ nguyên lý và ng d ng vào đi t ưng cây tr ng. Vì v y, nhi m v chính c a Sinh lý th c v t ng d ng là nghiên c u, ng d ng nh ng quy lu t sinh lý c a cây tr ng đã bi t vào th c ti n s n xu t nh ư : • Các ki n th c v Sinh lý t bào đã và đang đưc ng d ng r ng rãi, hi u qu trong cơng ngh nhân gi ng vơ tính cây tr ng b ng con đưng nuơi c y mơ ( in vitro ), giâm chi t cành (in vivo) đ cung c p cho s n xu t cây gi ng cĩ ch t l ưng cao. • Các ki n th c v trao đ i n ưc và dinh d ưng khống đưc ng d ng vào vi c chu n đốn nhu c u n ưc, dinh d ưng đ i v i cây.T đĩ cĩ các bi n pháp t ưi nưc, bĩn phân h p lý c ũng nh ư ng d ng trong cơng ngh tr ng cây khơng dùng đt, gĩp ph n t o nên m t n n nơng nghi p s ch và b n v ng. • Các ki n th c v quang h p giúp chúng ta đưa ra các bi n pháp k thu t điu khi n h quang h p trong qu n th cây tr ng đ “kinh doanh” n ăng l ưng ánh sáng m t tr i hi u qu nh t. • Nh ng ki n th c v hơ h p đưa đn các bi n pháp k thu t b o qu n nơng s n ph m và ngâm h t gi ng, làm đt gieo h t • S hi u bi t v sinh tr ưng, phát tri n c a th c v t c ũng nh ư các ch t điu hồ sinh tr ưng th c v t đã và đang đưc ng d ng r ng rãi trong nơng nghi p đ điu khi n cây sinh tr ưng, phát tri n theo h ưng cĩ l i cho con ng ưi. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 1
3. Ngồi ra nh ng ki n th c hi u bi t v Sinh lý h c th c v t cịn đưc ng d ng trong điu khi n và khai thác các h sinh thái t i ưu, liên quan đn vi c b o v mơi tr ưng b n vng . + K t c u c a giáo trình sinh lý th c v t ng d ng: g m 7 ch ươ ng Ch ươ ng I : Nhân gi ng vơ tính cây tr ng . Ch ươ ng II: ðiu khi n trao đ i n ưc và dinh d ưng khống đ i v i cây tr ng . Ch ươ ng III: Tr ng cây khơng dùng đt . Ch ươ ng IV: Quang h p c a qu n th cây tr ng . Ch ươ ng V: ðiu khi n hơ h p trong tr ng tr t và b o qu n nơng s n ph m. Ch ươ ng VI: ng d ng ch t điu hồ sinh tr ưng trong tr ng tr t. Ch ươ ng VII: ðiu ch nh phát sinh hình thái c a cây. Trong quá trình biên so n giáo trình này chúng tơi đã k t h p nh ng ki n th c c a Sinh lý h c th c v t v i s hi u bi t v các ng d ng và kh n ăng ng d ng c a mơn h c này trong s n xu t . Do đĩ cu n giáo trình này khơng ch là tài li u h c t p c n thi t cho sinh viên ngành nơng h c mà cịn là tài li u tham kh o cho t t c nh ng ai quan tâm đ n l ĩnh vc này. Tuy nhiên, vì đây là giáo trình biên so n l n đ u và th i gian cĩ h n, l ưng thơng tin cĩ th cịn h n ch nên trong biên so n khơng tránh kh i nh ng khi m khuy t. Chúng tơi r t mong nh n đưc s gĩp ý c a các chuyên gia và b n đ c đ cu n sách này đưc hồn thi n h ơn. ð h c t t h ơn mơn h c này, nên tham kh o thêm m t s tài li u sau: 1. Lê Tr n Bình, H H u Nh , Lê Th Mu i. Cơng ngh sinh h c th c v t trong c i ti n gi ng cây tr ng. NXB nơng nghi p, Hà N i, 1997. 2. Tr n Minh Tâm. B o qu n và ch bi n nơng s n sau thu ho ch. NXB Nơng nghi p, Hà N i, 2002. 3. Nguy n Quang Th ch, Hồng Minh T n. Ch t điu hồ sinh tr ưng v i cây tr ng. NXB Nơng nghi p, Hà N i, 1993. 4. V ũ V ăn V . Sinh lý th c v t ng d ng. NXB Giáo d c, Hà N i, 1999. Các tác gi . Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 2
4. A. PH N LÝ THUY T CH ƯƠ NG I NHÂN GI NG VƠ TÍNH CÂY TR NG - Nm đưc các khái ni m và nh ng ưu nh ưc đim c a các hình th c nhân gi ng th c vt nĩi chung và nhân gi ng cây tr ng nĩi riêng. D a vào kh n ăng nhân gi ng vơ tính th c v t trong t nhiên đ con ng ưi v n d ng vào th c ti n s n xu t trong cơng tác nhân gi ng vơ tính cây tr ng. N m đưc c ơ s khoa h c và nh ng ưu nh ưc đim c a các ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính cây tr ng nhân t o - K thu t nhân gi ng vơ tính cây tr ng in vivo (ph ươ ng pháp giâm, chi t cành; ghép cành): nh ng ưu nh ưc đim, c ơ s khoa h c c a ph ươ ng pháp, các thao tác c th . ng dng c a t ng ph ươ ng pháp trong s n xu t. - K thu t nhân gi ng vơ tính cây tr ng in vitro (ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính b ng nuơi c y mơ t bào): c ơ s khoa h c, ưu nh ưc đim, các điu ki n c n thi t trong k thu t nuơi c y mơ t bào, k thu t c a t ng giai đon nuơi c y mơ t bào. ng d ng vào th c ti n s n xu t 1. M t s khái ni m liên quan đn nhân gi ng * Sinh s n (Reproduction) : là kh n ăng sinh v t tái t o các th h . Ph ươ ng th c sinh s n r t đa d ng nh ưng đu thu c hai hình th c chính là sinh s n h u tính và sinh s n vơ tính. Sinh s n h u tính ( Secxual reproduction) là hình th c sinh s n cĩ s k t h p c a giao t đ c và cái đ t o thành phơi, sau đĩ phát tri n thành c ơ th m i hồn ch nh. Sinh s n hu tính cĩ th là t ph i ho c t p giao. Sinh s n vơ tính (Asecxual reproduction ) là hình th c sinh s n khơng cĩ s k t h p ca giao t đ c và cái. Sinh s n vơ tính cây tr ng cĩ các hình th c sau : Sinh s n vơ ph i ( Agamic reproduction ): phơi đưc t o ra khơng do th tinh gi a t bào tr ng và tinh trùng, đây là hi n t ưng t nhiên đ t o ra dịng vơ tính thơng qua h t gi ng. Sinh s n sinh d ưng (Vegetative reproduction): là kh n ăng tái t o m t c ơ th mi hồn ch nh t m t b ph n nào đĩ đưc tách r i kh i c ơ th m nh ư thân, r , lá, c , ch i Trong t nhiên, nhi u lo i cây tr ng cĩ th sinh s n v a b ng hình th c h u tính, v a bng hình th c vơ tính, nh ưng c ũng cĩ nhi u lo i cây tr ng ch sinh s n bng hình th c hu tính ho c vơ tính * Nhân gi ng (Propagation) : là bi n pháp k thu t mà con ng ưi dùng đ tái t o các cá th c n thi t thơng qua h th ng sinh s n. Vì v y, cĩ th s d ng hình th c nhân gi ng bng ph ươ ng pháp h u tính ho c ph ươ ng pháp vơ tính tu ỳ vào m c đích c ũng nh ư các lo i cây tr ng. 2. Nhân gi ng cây tr ng b ng ph ươ ng pháp h u tính + Khái ni m : nhân gi ng b ng ph ươ ng pháp h u tính là hình th c cây con đưc hình thành t h t. Ðây là hình th c nhân gi ng c truy n mà con ng ưi s d ng t khi bi t tr ng tr t. H t là đưc hình thành do k t qu th tinh gi a giao t đ c (h t ph n) v i giao t cái (nỗn). T h t s hình thành m t cây m i mang đ c tính c a c cây b và cây m (trong tr ưng h p th ph n chéo) ho c nghiêng h n v cây b ho c cây m (trong tr ưng h p vơ ph i). H t đưc hình thành do quá trình t th ph n c a hoa ho c do th ph n nhân t o. + Nh ng ưu đim Ưu đim c a ph ươ ng pháp nhân gi ng h u tính đã đưc Edwin .F. George (1993) t ng kt thành b n đim chính sau: - Ph ươ ng pháp ti n hành đơ n gi n trong t nhiên ho c nhân t o mà khơng c n s d ng dng c thi t b ph c t p. Ðng th i, ph ươ ng pháp nhân gi ng h u tính t o nên đưc m t s l ưng l n cây gi ng nên giá thành cây gi ng th ưng r . Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 3
5. - H t gi ng cĩ th b o qu n đưc trong th i gian dài trong các d ng c đơn gi n nh ư bao bì, chum, v i, chai, l tu ỳ thu c t ng lo i h t và s r i ro trong quá trình b o qu n th p, h t gi ng đ m b o t l s ng cao. - D dàng v n chuy n và phân ph i kh i l ưng l n h t gi ng t n ơi s n xu t đ n n ơi tiêu th . - Các lo i sâu b nh và virut ph n l n là khơng lây truy n qua h t nên cây gi ng m c t ht là cây s ch b nh. + Nh ng nh ưc đim Nh ưc đim l n nh t c a ph ươ ng pháp nhân gi ng h u tính là đa s cây con đưc sinh ra t h t s cĩ nh ng tính tr ng thay đ i so v i cây m , m i m t s thay đ i đĩ là đi di n ca m t t h p gen m i đưc hình thành trong quá trình phân bào gi m nhi m. Vì v y cây nhân gi ng b ng ph ươ ng pháp h u tính th ưng khơng đ ng đ u và khơng hồn tồn mang các tính tr ng nh ư cây m . Ð i v i lo i cây ăn qu , cây cơng nghi p dài ngày thì nhân gi ng b ng ph ươ ng pháp hu tính ngày càng gi m, ng ưi ta ch áp d ng hình th c này trong các tr ưng h p khĩ thành cơng trong ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính, các lo i cây cĩ h t đa phơi, s d ng cho cơng tác lai t o và ch n l c gi ng. 3. Nhân gi ng cây tr ng b ng ph ươ ng pháp vơ tính Khái ni m : nhân gi ng vơ tính cây tr ng là ph ươ ng pháp t o cây con t các c ơ quan, b ph n dinh d ưng c a cây nh ư cành, thân, r , lá, c Ðây là hình th c nhân gi ng ph bi n nhi u lo i cây tr ng. Quá trình nhân gi ng vơ tính cĩ th di n ra trong t nhiên và nhân t o. 3.1 Nhân gi ng vơ tính t nhiên Là hình th c nhân gi ng mà con ng ưi l i d ng kh n ăng sinh s n dinh d ưng c a cây tr ng, l i d ng kh n ăng phân chia các c ơ quan dinh d ưng c a cây tr ng đ hình thành mt cá th m i cĩ kh n ăng s ng đ c l p v i cây m và mang các tính tr ng c a cây m . Hình th c này bao g m : * Dùng thân bị lan : ph n m t gi a hai lĩng, n u đưc ti p xúc vi đ t s m c r , phía trên m c ch i đ t o thành mt cây con hồn ch nh, tách r i kh i c ơ th m đem tr ng thành m t cây m i. Bi n pháp này th ưng áp d ng đ i v i m t s lo i cây cĩ tia thân nh ư cây dâu tây. Bi n pháp này rt đơn gi n vì lo i cây này khi tia thân bị đn đâu thì m i đ t s hình thành m t cây m i, ta ch vi c tách các cây m i em tr ng (hình 1.1). đ Hình 1.1: Thân bị lan * Tách ch i : Ch i đưc hình thành t g c thân chính cĩ đ y đ thân, lá, r . Tu ỳ t ng lo i cây tr ng mà cĩ các lo i ch i khác nhau nh ư ch i thân (chu i), ch i ng m (khoai nưc, sen), ch i cu ng qu , ch i chĩp qu (d a). Các ch i nay sau khi tách kh i c ơ th m cĩ th đem tr ng ngay ho c qua giai đon v ưn ươ m. * Nhân gi ng b ng thân c , thân r (thân sinh đ a) : Trên thân c a lo i cây sinh đa cĩ mang các ch i ho c nhi u m t ch i, m i m t cĩ th phát tri n thành ch i và thành cây hồn ch nh, do v y cĩ th dùng cây sinh đa đ nhân gi ng nh ư hành, khoai tây, g ng, hồng tinh 3.2. Nhân gi ng v tính nhân t o Là hình th c nhân gi ng vơ tính cĩ s tác đ ng c a các bi n pháp c ơ h c, hố h c, cơng ngh sinh h c đ điu khi n s phát sinh các c ơ quan b ph n c a cây nh ư r , ch i, lá hình thành m t cây hồn ch nh hồn tồn cĩ kh n ăng s ng đ c l p v i cây m . Cây đưc to nên t ph ươ ng thc nhân gi ng này mang hồn tồn đc tính di truy n nh ư cây m . Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 4
6. Ng ưi ta phân chia làm hai lo i : -Nhân gi ng vơ tính đưc th c hi n trong điu ki n t nhiên (in vivo), v i hình th c này, cây gi ng t o ra cĩ kích th ưc l n (Macro propagation) -Nhân ging vơ tính đưc th c hi n trong phịng thí nghi m (in vitro), v i hình th c này cây gi ng cĩ kích th ưc nh (Micro propagation). 4. Nhân gi ng vơ tính in vivo (Macro propagation) Nhân gi ng vơ tính in vivo t c là quá trình nhân gi ng đưc th c hi n trong điu ki n t nhiên g m các hình th c nh ư tách cây, giâm cành, chi t cành, ghép m t đ t o cây con cĩ đc tính gi ng h t cây m . * C ơ s khoa h c T t c các lo i th c v t đ u cĩ đ c tính tái sinh, t c là, khi tách r i m t c ơ quan b ph n nào đĩ c a cây ra kh i cây m thì lúc đĩ tr ng thái nguyên v n c a cây b vi ph m, nh cĩ đ c tính tái sinh mà cây cĩ kh n ăng khơi ph c l i tr ng thái nguyên v n c a mình. Ðc tính tái sinh th c v t l n h ơn đng v t r t nhi u. V n d ng đ c tính tái sinh c a th c vt mà con ng ưi điu khi n cây tr ng theo h ưng cĩ l i nh ư bi n pháp c t t a t o tán cho cây c nh, cây l y búp ; nhân gi ng vơ tính cây tr ng Trong bi n pháp nhân gi ng vơ tính cây tr ng thì kh n ăng ra r b t đ nh c a cành chi t, cành giâm ho c li n v t ghép đu d a vào đc tính tái sinh đ đ m b o tính nguyên v n c a cây. Khi tách m t cành ra kh i cây m thì cây đĩ đã b m t tính nguyên v n c a mình, đ khơi ph c l i tính nguyên v n c a mình, cây cĩ kh n ăng sinh ra m t ch i m i đ bù đp cành v a m t đi. Ð ng th i cành đưc tách ra kh i cây m lúc đĩ c ũng b m t tính nguyên vn c a m t cây, t c là, cành b thi u ph n r đ tr thành cây hồn ch nh, nên nĩ s t khơi ph c tính nguyên v n c a mình b ng kh n ăng hình thành r b t đ nh đ tr thành cây hồn ch nh. Ho c khi ghép m t thì nh kh n ăng tái sinh c a các t bào xung quanh ph n b c t đã làm li n v t th ươ ng và ti p nh n m t ghép. * Ưu đim c a ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vivo Nhân gi ng vơ tính in vivo b ng các bi n pháp giâm cành, chi t cành và ghép m t cĩ mt s ưu đim chính sau : - T l thành cơng trong nhân gi ng cao. Các bi n pháp giâm, chi t cành ho c ghép m t t l t o cây gi ng th ưng đ t đưc t 50% đ n 100% tu ỳ theo t ng đ i t ưng cây tr ng và các bi n pháp áp d ng. Hi n nay, ng ưi ta th ưng s d ng các ch t điu ti t sinh tr ưng đ khích thích s ra r b t đ nh cho cành chi t cành giâm thì t l ra r đ t t i 100%. - Th i gian t o cây gi ng nhanh. Thơng th ưng th i gian t o cây gi ng trong k thu t giâm, chi t cành ho c ghép m t ch t vài ngày đn vài tháng tu ỳ theo t ng đ i t ưng cây tr ng và bi n pháp áp d ng. B mơn Sinh lý th c v t- Tr ưng đ i h c Nơng Nghi p I r t thành cơng trong k thu t giâm cành c a nhi u lo i đ i t ưng cây tr ng nh ư cây khoai tây, cm ch ưng, cây roi, bưi, chanh ch sau t 3 đ n 7 ngày thì cành giâm ra r b t đ nh và sau kho ng 1- 4 tu n thì cây gi ng đ tiêu chu n xu t v ưn. - T o cây gi ng cĩ kích th ưc l n. Cây gi ng đưc t o b ng bi n pháp giâm, chi t cành ho c ghép m t cĩ kích th ưc l n h ơn nhiu so v i ph ươ ng pháp nhân gi ng in vitro. Kích th ưc c a cây gi ng kho ng t m t đ t đ n nhi u đ t cây tu ỳ thu c vào đi t ưng cây tr ng và nhu c u c a h s nhân gi ng. - Cây gi ng mang đ c tính c a cây m . Bi n pháp giâm chi t cành và ghép m t c ũng nh ư các bi n pháp nhân gi ng vơ tính nĩi chung, cây gi ng t o thành t các c ơ quan dinh dưng c a cây m nên cĩ tu i sinh h c c a cây m và mang đc tính di truy n c a cây m . - Thao tác và trang thi t b đơn gi n. K thu t nhân gi ng vơ tính b ng bi n pháp giâm, chi t cành ho c ghép m t r t d dàng áp d ng cho m i đ i t ưng lao đ ng trong ngh làm vưn. M i thao tác trong quy trình giâm chi t cành ho c ghép m t r t đơn gi n và hồn tồn khơng yêu c u các thi t b hi n đ i. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 5
7. 4.1. Nhân gi ng vơ tính b ng tách cây Mi cây th ưng ch cĩ m t g c và m t b r , tuy nhiên, con ng ưi cĩ th s d ng các bi n pháp k thu t tác đ ng đ cây phát sinh nhi u g c, m i g c cĩ b r riêng bi t, r i tách riêng t ng g c đem tr ng thành cây m i. Ví d bi n pháp c ưa g c cho n y ch i r i vun đt vào g c cho ra r , tách ra tr ng. Ph ươ ng pháp này ch m, hi u qu th p, t n cơng nên ít đưc áp d ng. 4.2. Nhân gi ng vơ tính b ng giâm, chi t cành Ph ươ ng pháp giâm, chi t cành d a trên kh n ăng hình thành r b t đ nh c a cành giâm ho c chi t khi đưc c t r i kh i cây m . Ph ươ ng pháp này th ưng đưc áp d ng cho c hai nhĩm cây thân g và thân th o nh ư cây v i, nhãn, cam, chanh, khoai tây, mía, d a, hoa cúc, c m ch ưng * C ơ s khoa h c c a s hình thành r b t đ nh Khi cĩ tác đng vào cây m nh ư c t cành giâm ra kh i c ơ th cây m ho c khoanh v cành chi t thì lúc đĩ trong c ơ th cây m s b t đ u ho t hố s hình thành r b t đ nh. Y u t gây ho t hố s hình r b t đ nh là auxin. Khi cĩ tác đng c t cành ho c khoanh v thì auxin s đưc hình thành m t cách nhanh chĩng t i đ nh sinh tr ưng và các c ơ quan non, sau đĩ qua h th ng m ch libe auxin đưc vn chuy n v ph n v t c t c a cành chi t, cành giâm đ kích thích t o r b t đ nh. Vì v y, s ra r b t đ nh c a cành chi t, cành giâm nhanh hay ch m là hồn tồn ph thu c vào kh n ăng t ng h p auxin n i sinh c a t ng lo i cây tr ng. Ng ưi ta cĩ th x lý b sung auxin ngo i sinh đ thúc đ y nhanh chĩng s ra r b t đ nh c a cành chi t, cành giâm. S hình thành r b t đ nh là m t quá trình, đĩ là quá trình ph n phân hố c a t bào ti n t ưng t ng, ti p đĩ là tái phân hố đ hình thành m m r (hình 2.1) Quá trình hình thành r b t đ nh chia làm ba giai đon : - Ph n phân hố c a t bào ti n t ưng t ng đ tr l i ch c n ăng phân chia t bào c a mơ phân sinh t ưng t ng đ t o kh i t bào b t đ nh (callus) - Tái phân hố t bào r t các t bào b t đ nh đ hình thành m m r b t đ nh - M m r sinh tr ưng đ hình thành r b t đ nh. Thơng th ưng, giai đon đ u c a s hình thành r b t đ nh c n l ưng auxin l n nh t cho s ph n phân hố t bào (10 -4 - 10 -5 g/cm 3), giai đon th hai c n l ưng auxin th p h ơn cho s tái phân hố m m r (10 -7 g/cm 3), cịn giai đon sinh tr ưng r l ưng auxin c n r t th p (10 -11 - 10 -12 g/cm 3) ho c khơng c n auxin trong giai đon này. a b Hình 2.1: S ph n phân hố t bào t ưng t ng đ hình thành r b t đ nh a, b. Lát c t d c và c t ngang m m r b t đ nh Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 6
8. Trong k thu t giâm, chi t cành, ng ưi ta th ưng x lý b sung các ch t thu c nhĩm auxin ngo i sinh đ kích thích s t o r b t đ nh nhanh và hi u qu h ơn nh ư IBA, α-NAA, 2,4D Tu ỳ theo ch t s d ng và lo i cây tr ng, c ũng nh ư tu ỳ theo ph ươ ng pháp x lý mà n ng đ s d ng là khác nhau. Cĩ ba ph ươ ng pháp chính đ x lý auxin cho s ra r b t đ nh: - Ph ươ ng pháp x lý n ng đ lỗng : n ng đ x lý vào kho ng vài ch c ppm. V i ph ươ ng th c giâm cành thì ngâm ph n g c vào dung d ch trong th i gian 12 đ n 24 gi r i c m cành giâm vào giá th . V i ph ươ ng th c chi t cành thì tr n dung d ch x lý v i đ t bĩ b u tr ưc khi bĩ b u xung quanh v t khoanh v . - Ph ươ ng pháp x lý n ng đ đ c: n ng đ x lý kho ng vài nghìn ppm. V i ph ươ ng th c giâm cành thì nhúng r t nhanh ph n g c vào dung d ch trong kho ng 1-2 giây r i c m ngay vào giá th V i ph ươ ng th c chit cành thì dùng bơng t m dung d ch x lý và ch c n bơi lên trên vt khoanh v trên (n ơi s xu t hi n r ) tr ưc khi bĩ b u - S d ng d ng b t: cĩ nhi u ch ph m giâm chi t cành d ng b t, trong thành ph n cĩ ch a auxin v i m t t l nh t đ nh đưc ph i tr n v i m t lo i b t nào đĩ. Khi giâm cành ch c n ch m v t c t c a cành giâm vào ch ph m b t r i c m vào giá th . a. Nhân gi ng vơ tính b ng chi t cành * Ưu đim : - Cây con d s ng, sinh tr ưng nhanh, m c kho - Cây con mang đy đ đ c tính di truyn c a cây m - Cây th p, tán g n nên thu n ti n cho ch ăm sĩc và thu ho ch * Nh ưc đim : - H s nhân gi ng khơng cao, ch s d ng trong s n xu t nh - Cây nhanh già c i, tu i th v ưn cây th p, kh n ăng ch ng ch u v i điu ki n b t l i ca mơi tr ưng khơng cao - Cây m b khai thác nhi u s làm gi m tu i th và s c s ng * Các hình th c chi t cành + Chi t cành b ng bi n pháp u n vít cành Bi n pháp u n cành th ưng áp d ng cho đi t ưng cây thân b i, thân th o nh ư cây đ quyên, kim ngân, ráy th ơm Cách ti n hành : u n vít cành xu ng r i ph đ t lên, sau m t th i gian ph n đưc ph đ t s ra r (hình 3.1). Ð kích thích ra r nhanh cĩ th gây v t th ươ ng nh lên cành u n t i ph n ph đ t. C t r i t ng ph n ã ra r t o cây gi ng m i. đ đ Hình 3.1: Bi n pháp u n vít cành + Chi t cành trên cây Ðây là bi n pháp áp d ng ph bi n cho nhĩm cây thân g nh ư lo i cây ăn qu nhãn, v i hng xiêm, chanh, roi, cam, quýt, b ưi ; nhĩm cây cơng nghi p nh ư chè, cà phê ; nhĩm cây r ng nh ư b ch đàn, qu , h ươ ng cành v n trên cây t khi đưc chi t đ n khi ra r bt đ nh t o cây hồn ch nh m i c t xu ng đem tr ng. Theo h c thuy t chu k ỳ tu i c a Trailakhyan thì m i cành trên cây cĩ tu i sinh h c khác nhau. N u cành cĩ tu i sinh h c trung bình s cĩ kh n ăng t o r b t đ nh t t h ơn nh ng cành cĩ tu i sinh h c quá l n ho c quá nh . Vì v y, v i m c đích nhân gi ng vơ tính b ng k thu t chi t cành ng ưi ta th ưng l a ch n nh ng cành trên cây cĩ tu i sinh hc trung bình hay cịn g i là cành bánh t đ chi t. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 7
9. Cách ti n hành: dùng dao s c c t hai khoanh v cách nhau kho ng 2-3 cm (hình 4.1. a,b) sau đĩ lo i b l p v ngồi, dùng dao s c c o s ch l p v tr ng ti p theo đ n t n ph n g (hình 4.1.c). Th ưng đ ph ơi cành kho ng m t bu i ho c m t ngày sau m i bĩ b u. Ð i v i nh ng cây khĩ ra r nh ư cây h ng xiêm, m n, m ơ, mít tr ưc khi bĩ b u ta nên x lý cho v t khoanh v (v t khoanh trên) dung dich auxin ( α-NAA) 4000 -8000 ppm ho c tr n dung dich auxin vào h n h p bĩ b u vi n ng đ th p h ơn (40 - 100 ppm). Nguyên li u dùng đ bĩ b u th ưng s dng là h n h p gi a đ t v ưn ho c đ t bùn ao ph ơi khơ, đp nh tr n v i m t trong s Hình 4.1: Cách khoanh v cành chi t a,b. khoanh v c. Bĩc và c o s ch l p v nguyên li u h u c ơ nh ư tr u b i, mùn c ưa, r ơm rác m c , r bèo tây v i t l 2/3 đ t v i 1/3 nguyên li u h u c ơ. Ðm b o 70% đ m c a h n h p bĩ b u. Giây bu c Phía ngồi c a b u chi t b c b ng gi y PE trong. Bu c ch t hai u b u chi t vào cành đ đ Hn h p bĩ b u khơng b xoay xung quanh cành chi t bu chi t (hình 5.1). Bc gi y PE trong Hình 5.1: Cách bĩ b u cành chi t a b Hình 6.1: S ra r b t đ nh c a cành chi t đ tiêu chu n c t a. Ra r b t đ nh b. C t cành chi t Sau đĩ theo dõi qua l p PE khi th y r đã m c ra phía ngồi b u và chuy n màu tr ng nõn sang màu tr ng ngà ho c h ơi ng màu xanh thì cĩ th c ưa cành chi t đ tr ng vào vưn ươ m (hình 6.1. a,b) b. Nhân gi ng vơ tính b ng giâm cành * Ưu đim : - Cây con gi đơc các tình tr ng di truy n c a cây m , v ưn cây đng đ u thu n ti n ch ăm sĩc, thu ho ch - Th i gian nhân gi ng t ươ ng đi nhanh, h s nhân gi ng cao - Chu k ỳ khai thác ng n, hi u qu kinh t cao Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 8
10. * Nh ưc đim : - Tu i th v ưn cây th p, chu k ỳ kinh doanh ng n - Ðịi h i ng ưi s n xu t cĩ trình đ k thu t nh t đ nh - T n nhi u cơng ch ăm sĩc * Các hình th c giâm cành Tu ỳ theo t ng đ i t ưng cây tr ng và m c đích nhân gi ng mà ng ưi ta áp d ng các hình th c giâm cành khác nhau. Sau đây là m t s bi n pháp giâm cành ph bi n cho các đi t ưng cây tr ng : + Giâm cành b ng bi n pháp c t cành ho c c t thân . Ðây là bi n pháp áp d ng ph bi n cho nhi u đ i t ưng cây tr ng, các lo i cây thân g nh ư cây nhãn, v i, cam, chanh, b ưi, cà phê, chè ; các lo i cây rau, cây hoa thân th o nh ư khoai tây, hoa cúc M t s cây cĩ th th c hi n nhân gi ng b ng ph ươ ng pháp c t cành ho c c t thân quanh n ăm. Trong khi đĩ m t s cây đ c bi t là m t s cây thân g ch cĩ th th c hi n vào mùa r ng lá khi mà cây đang tr ng thái ng ngh . Cách ti n hành : dùng dao s c c t vát v trí phía d ưi c a đ t cành ho c đ t thân v i kích th ưc tu ỳ thu c vào t ng đ i t ưng cây tr ng và m c đích nhân gi ng. Cĩ th c t tng đ t đơn ho c đ t kép ( đ i v i cây cĩ lá đ i x ng) (hình 7.1. a,b,c,d). Lo i b b t m t ph n c a lá n u lá quá to. Nhúng nhanh auxin ( α-NAA vài nghìn ppm) vào v t c t n u c n thi t, sau đĩ c m vào giá th giâm cành v i chi u sâu kho ng 1cm ho c đ t n m ngang l p 1/2 thân vào giá th ( đ i v i cây mía, đay, mây ). Ðm b o đ m thích h p c a giá th và đ m bão hồ trên b m t lá đ n khi xu t hi n r b t đ nh c a cành giâm. Ch ăm sĩc cn th n đ n khi xu t v ưn. (a) (b) (c) (d) Hình 7.1: Giâm cành b ng các bi n pháp c t cành, c t thân a. C t cành ; b. C t thân n m ngang ; c. C t đ t đơn ; d. C t đ t kép Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 9
11. Hình 8.1: Giâm cành b ng bi n pháp c t lá a. Giâm lá nguyên v n b. Giâm m u lá + Giâm cành b ng bi n pháp c t lá Bi n pháp này đưc áp d ng đ i v i các lo i cây c nh, cây tr ng ch u trong nhà, đc bi t th ưng s d ng đ i v i cây lá b ng. Cĩ hai lo i ki u c t lá : c t tồn b lá và c t m u lá (hình 8.1. a,b) . Khi lá đưc c t r i kh i cây m thì r b t đ nh s đưc hình thành t i ph n cu ng lá ho c tr c ti p trên lá. Cách ti n hành : Bi n pháp này m i thao tác và quy trình ti n hành c ũng t ươ ng t nh ư bi n pháp c t cành đã nêu trên nh ưng ch dùng ph n lá cây đ giâm. Dùng dao s c c t m t m u lá cây ho c c lá cây g m c ph n cu ng ho c khơng cĩ cu ng tu ỳ theo t ng lo i cây, sau đĩ x lý auxin vào v t c t n u c n thi t. Ðt m u lá ho c cm ph n cu ng lá vào giá th . Sau m t th i gian trên lá ho c t i ph n cu ng s hình thành r b t đ nh. N u ph n cu ng lá cĩ c m t ng thì m t ng s b t ch i hình thành cây ho c cũng cĩ th t trên ph n lá hình thành ch i m i đ thành cây mà khơng c n cĩ m t ng . Trong k thu t giâm cành c n chú ý : - Giá th là cát m dùng đ giâm cành là t t nh t, cĩ nhi u lo i cát nh ư cát thơ, cát m n, cát đen, cát vàng tu ỳ theo t ng đ i t ưng cây tr ng mà s d ng lo i cát nào cho thích hp. Cát cĩ đ c tính tr ơ, thốt n ưc và x p s t o điu ki n thu n l i cho s ra r . Cát dùng làm giá th ph i s ch đ tránh n m, khu n ho c các t p ch t làm ch t cành giâm. Th ưng s d ng lo i cát m i khai thác ho c cát c ũ thì ph i đưc r a s ch b ng cách ngâm cát trong HCl ho c thu c tím trong vài gi sau đĩ r a nhi u l n d ưi vịi n ưc - Cành m i giâm v n x y ra quá trình thốt h ơi n ưc trên b m t lá nh ưng cành giâm ch ưa cĩ r đ hút n ưc d n đ n m t cân b ng n ưc, cành giâm b héo và ch t. Vì v y, c n ph i th ưng xuyên phun m đ m b o đ m bão hồ trên b m t lá làm gi m s thốt h ơi nưc cho đ n khi cành giâm xu t hi n r b t đ nh 4.3. Nhân gi ng vơ tính b ng ph ươ ng pháp ghép Ghép là ph ươ ng pháp đưc th c hi n b ng cách l y m t b ph n c a nh ng cây gi ng tt, đang sinh tr ưng nh ư đon cành, đon r , m m ng l p đ t vào v trí thích h p trên cây khác g i là g c ghép đ t o thành m t t h p ghép, cùng sinh tr ưng phát tri n và t o nên m t cây m i hồn ch nh. a. C ơ s khoa h c c a ph ươ ng pháp ghép Ph ươ ng pháp ghép d a vào đc tính tái sinh li n v t th ươ ng c a cây. T bào t i ph n b th ươ ng trên cây cĩ kh n ăng tái phân chia liên t c thành m t đám t bào đ li n v t th ươ ng và ti p nh n ph n đưc ghép vào cây. Khi ghép c n áp sát ph n mơ phân sinh t ưng t ng c a ph n ghép v i g c ghép, t i đĩ mơ phân sinh c a g c ghép ho t đ ng m nh làm l p đ y ch tr ng gi a hai v t c t, các t ch c mơ t bào c a ph n ghép và g c ghép d n d n hồ h p, g n v i nhau. H th ng m ch Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 10
12. floem và xylem d n đưc liên k t l i v i nhau và thơng su t. Lúc này, ch i ghép đưc cung c p ch t dinh d ưng và n ưc nên b t đ u sinh tr ưng, g c ghép và ch i ghép tr thành m t c ơ th m i. Cây nhân gi ng b ng ph ươ ng pháp ghép v n hồn tồn gi đưc nh ng tính tr ng nh ư cây m . b. M c đích và các ưu nh ơc đim c a ph ươ ng pháp ghép *M c đích - Nhân gi ng vơ tính cây tr ng trong tr ưng h p các ph ươ ng pháp nhân gi ng khác khĩ th c hi n ho c kém hi u qu . - Thay đi m t ph n ho c m t b ph n c a cây này b ng m t ph n ho c b ph n c a cây gi ng khác. - T n d ng nh ng ưu đim c a g c ghép cho các cây tr ng c n nhân gi ng - C i t o nh ng ph n b h i (gãy, sâu b nh) c a cây - S d ng ph ươ ng pháp ghép đ test cây ch ng ch u b nh * Ưu đim : - Gi đưc h u h t các tính tr ng c a cây m - H s nhân gi ng cao, cây ghép cĩ tu i th cao - Cĩ kh n ăng thay đ i gi ng khi c n mà khơng ph i tr ng m i (gi ng c ũ, n ăng su t th p, sâu b nh ) ho c c u ch a các b ph n h ng (b h i g c, r d n ti ch t tồn cây thì ghép đ thay r ) - Khai thác các ưu đim c a cây làm g c ghép nh ư : kh n ăng sinh tr ưng, kh n ăng ch ng ch u sâu b nh và điu ki n ngo i c nh b t l i (h n, úng, l nh ) - S d ng trong cơng tác lai gi ng * Nh ưc đim : - Cây s d ng làm g c ghép th ưng tr ng b ng h t nên sinh tr ưng khơng đ ng đ u khĩ ch ăm sĩc -Cn đ i ng ũ k thu t cĩ trình đ am hi u v k thu t ghép, gi ng cây tr ng - C n đ u t ư nhi u cơng s c đ ch n t h p ghép thích h p tu ỳ theo t ng lo i cây tr ng và t ng vùng nh t đ nh c. Ph ươ ng pháp ghép m t Trong k thu t ghép, cĩ m t s hình th c ghép khác nhau nh ư ghép áp, ghép cành, ghép m t. Tu ỳ theo t ng đ i t ưng cây tr ng và m c đích ghép đ l a ch n hình th c ghép thích h p. V i m c đích nhân gi ng vơ tính cây tr ng th ưng s d ng hình th c ghép m t. Ghép m t cĩ nhi u ki u đưc g i theo v t r ch ph n g c ghép : ghép nêm, ghép ch T, U, H, I, * Ưu đim c a ph ươ ng pháp : ghép m t là hình th c ghép r t ph bi n, áp d ng đưc cho nhi u lo i gi ng cây tr ng khác nhau. Thao tác đơ n gi n, thu n ti n. H s nhân gi ng cao. D dàng b o qu n và v n chuy n v t li u ghép. * Cách ti n hành : - L y m t ghép : ch n m t ghép trên cành "bánh t ", khơng b sâu b nh (hình 9.1). Tách m t ghép theo ki u bĩc v (cành táo ), ho c c t vát ph n m t (cành chanh, b ưi, cam ) (hình 10.1 a,b,c,d) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 11
13. Hình 9.1: Ch n a b c d mt ghép trên cành Hình 10.1 a,b : Tách m t ghép trên Hình 10.1 c,d : Tách m t ghép trên "bánh t cây thân g cây h cam chanh Hình 11.1: Bu c ch t m t ghép vào a b gc ghép Hình 12.1. a,b: Mt ghép sau khi tháo dây bu c (a) và n y ch i (b) - Chu n b g c ghép : dùng dao s c m "c a s " ph n v c a thân cây. Bĩc mi ng v trên v t khía. Ti n hành đt m t ghép vào phía trong "c a s " và đy c a s b ng l p v mi tách, cu n ch t ph n ghép b ng dây nilon m ng (tránh đ n ưc m ưa g m vào bên trong) (hình 11.1). Sau kho ng 15-20 ngày cĩ th m dây bu c và c t mi ng v đ y phía ngồi mi ng ghép (hình 12.1 a,b). Ð kích thích m t ng m c m m nhanh, sau khi m dây bu c kho ng 7 ngày ti n hành c t ng n g c ghép. Th ưng c t ng n g c ghép cách m t ghép kho ng 2-3 cm, nên c t nghiêng kho ng 45 o v phía ng ưc chi u v i m t ghép đ tránh n ưc nh vào m t ghép. Ph ươ ng pháp ghép "c a s " cĩ t l s ng cao kho ng t 70- 100% tu ỳ theo t ng lo i cây. 5. Nhân gi ng vơ tính in vitro ( Micro propagation ) Nhân gi ng vơ tính cây tr ng in vitro hay vi nhân gi ng (Micro propagation) là m t lĩnh v c ng d ng cĩ hi u qu nh t trong cơng ngh nuơi c y mơ t bào th c v t. Ðây là ph ươ ng pháp nhân gi ng hi n đ i đưc th c hi n trong phịng thí nghi m nên cịn g i là ph ươ ng pháp nhân gi ng trong ng nghi m. Khác v i các ph ươ ng pháp nhân gi ng truy n th ng nh ư giâm, chi t cành ho c ghép mt, ph ươ ng pháp nhân gi ng in vitro cĩ kh n ăng trong m t th i gian ng n, cĩ th t o ra mt s l ưng cây gi ng l n đ ng đ u đ ph kín m t di n tích đ t nh t đ nh mà các ph ươ ng pháp nhân gi ng khác khơng th thay th đưc. Ngồi ra ph ươ ng pháp này khơng ph thu c vào điu ki n th i ti t nên cĩ th ti n hành quanh n ăm. Ðây là m t h ưng đang đưc ng d ng rng rãi. Vi t Nam hi n nay cĩ nhi u phịng thí nghi m nuơi c y mơ, nhi u trung tâm s n xu t cây gi ng hàng nam đã cung c p m t l ưng đáng k cây gi ng cĩ ch t l ưng cao cho s n xu t nh ư chu i, d a, khoai tây, các lo i lan, cây c nh, cây lâm nghi p. 5.1. C ơ s khoa h c c a ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vitro K thu t nuơi cây mơ t bào ( tissue culture ) nĩi chung và k thu t nhân gi ng vơ tính in vitro nĩi riêng đu d a vào c ơ s khoa h c là cĩ tính tồn n ăng, s phân hố và ph n phân hố. a. Tính tồn n ăng c a t bào Haberland (1902) l n đ u tiên đã quan ni m r ng m i m t t bào b t k ỳ c a m t c ơ th sinh v t đa bào đu cĩ kh n ăng ti m tàng đ phát tri n thành m t c ơ th hồn ch nh. Theo quan đim c a sinh h c hi n đ i thì m i m t t bào đã chuyên hố đu ch a m t l ưng thơng tin di truy n (b ADN) t ươ ng đươ ng v i l ưng thơng tin di truy n c a m t c ơ th Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 12
14. tr ưng thành. Vì v y, trong điu ki n nh t đ nh m t t bào b t k ỳ đ u cĩ th phát tri n thành m t c ơ th hồn ch nh. Ðc tính đĩ c a t bào g i là tính tồn n ăng c a t bào. Nh ư v y, b t c m t t bào nào c ũng cĩ th hình thành m t cây hồn ch nh. ðĩ c ũng là c ơ s khoa h c c a k thu t nuơi cy mơ t bào ( in vitro ) nĩi chung và k thu t nhân gi ng vơ tính ( clone -nhân b n) nĩi riêng. Qua đĩ ng ưi ta cĩ th bi n m t t bào b t k ỳ (ho c m t m u mơ) thành m t c ơ th hồn ch nh khi đưc nuơi c y trong mt mơi tr ưng thích h p cĩ đ y các i u ki n c n thi t cho t đ đ bào th c hi n các quá trình phân hĩa, ph n phân hố (hình 13.1) Hình 13.1: S d ng nuơi c y các lo i mơ b t k ỳ trên cây b. Tính phân hố và ph n phân hố c a t bào + Tính phân hố c a t bào là s bi n đ i c a các t bào phơi sinh thành các t bào c a các mơ chuyên hố đm nhi m các ch c n ăng khác nhau. Trong c ơ th th c v t cĩ kho ng 15 lo i mơ khác nhau đ m nhi m các ch c n ăng khác nhau (mơ d u, mơ d n, mơ bì, mơ khuy t ) nh ưng chúng đu cĩ cùng ngu n g c t t bào phơi sinh đã tr i qua giai đon phân hố t bào đ hình thành các mơ riêng bi t. +Tính ph n phân hố c a t bào : đĩ là các t bào khi đã đưc phân hố thành các mơ riêng bi t v i các ch c n ăng khác nhau nh ưng trong điu ki n nh t đ nh chúng v n cĩ th quay tr v tr ng thái phơi sinh đ phân chia t bào. Ðĩ là tính ph n phân hố c a t bào. Trong k thu t nuơi c y các c ơ quan dinh d ưng c a cây nh ư lá, thân , thì giai đon to mơ s o ( callus ), đây chính là nh ng t bào đã quay tr v tr ng thái phơi sinh cĩ kh năng phân chia liên t c mà m t h n ch c n ăng c a các c ơ quan dinh d ưng nh ư lá, thân tr ưc đĩ. S phân hĩa và ph n phân hố gi a t bào phơi sinh và t bào đã chuyên hố đưc bi u di n theo s ơ đ sau: Phân hố t bào T bào phơi sinh T bào chuyên hố Ph n phân hĩa V b n ch t s phân hố và ph n phân hố là quá trình ho t hố gen. T i m t th i đim nào đĩ trong quá trình phát tri n cá th thì m t s gen đưc ho t hố và m t s gen khác b c ch . Ði u này x y ra theo m t ch ươ ng trình đã đưc mã hố trong c u trúc phân t ADN. Khi n m trong m t c ơ th hồn ch nh gi a các t bào cĩ s c ch l n nhau, nh ưng khi đưc tách r i và trong nh ng điu ki n nh t đ nh thì các gen đưc ho t hố d dàng hơn nên chúng cĩ kh n ăng m t t c các gen đ hình thành m t cá th m i. Ðĩ chính là c ơ s làm n n t ng cho k thu t nuơi c y mơ t bào. 5.2. M c đích c a ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vitro Trong l ĩnh v c nhân gi ng vơ tính in vitro thì k thu t nhân nhanh gi ng cây tr ng ph c v nh ng m c đích sau : Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 13
15. - Nhân nhanh các ki u gen quý hi m làm v t li u cho cơng tác t o gi ng - Nhân nhanh và duy trì các cá th đ u dịng t t đ cung c p cây gi ng c a các các lo i cây tr ng khác nhau nh ư cây l ươ ng th c, cây rau, cây hoa, cây c nh, cây d ưc li u, cây lâm nghi p - Nhân nhanh k t h p v i làm s ch virút. - B o qu n các t p đồn gen, đc bi t đ i v i lo i cây d b nhi m b nh trong điu kin t nhiên (khoai tây, khoai lang,) ho c các cây d b giao ph n. 5.3. Ưu, nh ưc đim c a ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vitro Ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vitro đã đưc E.F. Gerge (1993) nêu lên m t s ưu, nh ưc đim chính sau đây: a. Nh ng ưu đim - Ph ươ ng pháp nhân gi ng in vitro cĩ kh n ăng hình thành đưc s l ưng l n cây gi ng t m t mơ, c ơ quan c a cây v i kích th ưc nh kho ng 0,1- 10 mm. Trong khi đĩ ph ươ ng pháp nhân gi ng truy n th ng (giâm chi t cành) thì đ t o thành m t cây gi ng, ít nh t ph i s d ng m t ph n c ơ quan dinh d ưng c a cây v i kích th ưc t 5-20 cm - Hồn tồn ti n hành trong điu ki n vơ trùng nên cây gi ng t o đưc s khơng b nhi m b nh t mơi tr ưng bên ngồi. - S d ng v t li u s ch virút và cĩ kh n ăng nhân nhanh s l ưng l n cây s ch virút. - Hồn tồn ch đ ng điu ch nh các tác nhân điu ch nh kh n ăng tái sinh c a cây nh ư thành ph n dinh d ưng, ánh sáng, nhi t đ , ch t điu ti t sinh tr ưng theo ý mu n - H s nhân gi ng cao nên cĩ kh n ăng s n xu t s lưng l n cây gi ng trong m t th i gian ng n. H s nhân gi ng các lo i cây n m trong kho ng t 3 6 đn 10 12 / n ăm, nh ư vy khơng cĩ m t k thu t nhân gi ng vơ tính nào khác l i cĩ h s nhân gi ng cao h ơn - Cĩ th ti n hành quanh n ăm mà khơng b chi ph i b i điu ki n ngo i c nh c a th i v. - Cây gi ng in vitro n u ch ưa cĩ nhu c u s d ng thì cĩ th b o qu n đưc trong th i gian dài trong điu ki n in vitro b. Nh ng nh ưc đim - M c dù cĩ h s nhân gi ng l n nh ưng cây gi ng t o ra cĩ kích th ưc nh và đơi khi xu t hi n các d ng cây khơng mong mu n (bi n d , m ng n ưc). - Cây gi ng in vitro do đưc cung c p ngu n hydrat carbon nhân t o nên kh n ăng t tng h p các v t li u h u c ơ (t d ưng) c a cây kém. Ðng th i, cây gi ng in vitro đưc nuơi d ưng trong bình thu tinh ho c bình nh a nên đ m khơng khí th ưng bão hồ. Do đĩ, khi tr ng cây ra ngồi điu ki n t nhiên cây th ưng b m t cân b ng n ưc, gây hi n tưng cây b héo và ch t. Vì v y, tr ưc khi chuy n cây t điu ki n in vitro ra điu ki n in vivo , cây c n tr i qua giai đon "hu n luy n " đ quen d n v i điu ki n mơi tr ưng bên ngồi cĩ đ m khơng khí th p và ánh sáng m nh. - C n trang thi t b hi n đ i, k thu t viên cĩ tay ngh cao. 5.4. Ði u ki n c n thi t c a nuơi c y in vitro * Ði u ki n tr ưc tiên là vơ trùng . T t c các khâu nuơi c y đ u đưc thanh trùng: d ng c nuơi c y, m u nuơi c y, mơi tr ưng (giá th ) và các thao tác nuơi c y S thành cơng hay th t b i c a cơng vi c nuơi c y mơ là ph thu c vào vi c vơ trùng. N u cĩ m t khâu nào đĩ khơng vơ trùng thì m u nuơi c y l p t c b nhi m vi sinh v t ho c n m và s ch t. Kh trùng đưc th c hi n b ng các ph ươ ng ti n sau: - N i h p : kh trùng b ng h ơi n ưc cĩ nhi t đ và áp su t cao. Th ưng áp d ng ti t trùng cho mơi tr ưng nuơi c y, dng c c y (chai, l , panh, dao, kéo, bơng ) V i áp su t 1 atm t ươ ng đươ ng v i 121 oC trong kho ng th i gian t 20 phút đ n 30 phút là đm b o kh trùng t t. - T s y: kh trùng b ng nhi t đ cao nên ch áp d ng kh trùng cho các d ng c thu tinh và d ng c c y m u b ng kim lo i. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 14
16. - Ph u l c vơ trùng ( Microspore ): kh trùng qua ph u l c cĩ màng l c kích th ưc nh (0,2 µm), ch áp d ng đ i v i dung d ch trong điu ki n nhi t đ và áp su t cao s b phân hu nh ư vitamin B 2, gibberellin - Hố ch t kh trùng: áp d ng đ kh trùng b m t m u c y ho c đ t d ng c , th ưng dùng: Ca-hypocloride, Na-hypocloride, clorua thu ngân (HgCl 2), n ưc brơm, oxy già (H 2O2), c n * Phịng nuơi c y mơ là phịng thí nghi m chuyên hố cao v i các thi t b chuyên d ng. Bao g m m t phịng chu n b m u, phịng c y m u, phịng nuơi cây và nhà l ưi đ đưa cây ra đt. Tu ỳ theo quy mơ và m c đích mà di n tích các b ph n khác nhau. Các thi t b quan tr ng nh t c a phịng nuơi c y mơ g m cĩ n i h p đ vơ trùng d ng c và m u nuơi cy, máy c y vơ trùng đ thao tác c y m u, phịng nuơi cĩ đ ánh sáng nhân t o và điu hồ nhi t đ đ nuơi cây Hình 14.1 đn hình 17.1. Trang thi t b và phịng nuơi c y mơ t i B mơn Sinh lý th c vt - khoa Nơng h c- ðHNNI . a . T s y (kh trùng khơ) b. N i h p (kh trùng ưt) c. Cân phân tích , cân k thu t d. Máy đo pH Hình 14.1 (a,b,c,d): Các thi t b trong phịng chu n b mơi tr ưng Hình 15.1: T c y m u vơ trùng (a.T c y đơn ; b.T c y đơi) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 15
17. Hình 16.1: Bu ng nuơi c y Hình 17.1: Vưn ươ m cây - Mơi tr ưng nuơi c y là giá th cĩ đ y đ ch t dinh d ưng, các ho t ch t nh ư các nguyên t vi l ưng, vitamin, ch t điu hồ sinh tr ưng. Tu ỳ theo t ng lo i cây và c ơ quan nuơi c y mà ng ưi ta đã cĩ các mơi tr ưng riêng cho chúng. Ví d : Mơi tr ưng c ơ b n nh t là mơi tr ưng MS (Murashige Skoog) cho nhi u đ i t ưng cây tr ng, mơi tr ưng Adnerson cho cây thân g , mơi tr ưng Gamborg cho nuơi c y t bào tr n, mơi tr ưng CHU cho nuơi c y bao ph n 5.5. Thành ph n mơi tr ưng dinh d ưng Năm 1898, Haberland đ x ưng ra tính tồn n ăng c a t bào và ơng ti n hành nh ng thí nghi m đ u tiên v nuơi c y mơ nh ưng các thí nghi m đ u khơng thành cơng. Khi đĩ do nh ng hi u bi t v nhu c u dinh d ưng khống c a mơ và t bào th c v t cịn r t h n ch , đc bi t là vai trị c a các ch t điu ti t sinh tr ưng h u nh ư ch ưa đưc khám phá. Ð n nay đã cĩ hàng tr ăm lo i mơi tr ưng dinh d ưng nhân t o đã đưc xây d ng và th nghi m cĩ k t qu . H u h t các lo i mơi tr ưng đ u bao g m nh ng nhĩm ch t chính sau đây: + Các lo i mu i khống + Ngu n carbon h u c ơ + Vitamin + Ch t điu ti t sinh tr ưng + Nhĩm ch t t nhiên + Ch t làm đơng mơi tr ưng a. Các lo i mu i khống Các nguyên t khống dùng trong mơi tr ưng dinh d ưng cho nuơi c y mơ, t bào th c vt đưc phân chia thành hai nhĩm theo hàm l ưng s d ng : nhĩm nguyên t đa l ưng và nhĩm nguyên t vi l ưng. * Các nguyên t khống đa l ưng Bao g m các nguyên t khống cĩ trong thành ph n dinh d ưng c a mơi tr ưng v i nng đ trên 30 ppm (part per million) . G m nh ng nguyên t : N, P, K, S, Mg, Ca - + - Nit ơ (N) : đưc s d ng d ng NO 3 và NH 4 riêng r ho c ph i h p c hai lo i 2- - L ưu hu ỳnh (S): th ưng s d ng d ng SO 4 . các lo i SO 3 ho c SO 2 th ưng kém tác dng, th m trí cịn đc. - Phospho (P) : mơ và t bào nuơi c y cĩ nhu c u v phospho r t cao. Phospho là m t trong thành ph n c u trúc phân t axit nucleic và phân t n ăng l ưng ATP. Ngồi ra phospho d ng H 2PO 4 và HPO 4 cịn cĩ tác d ng nh ư h th ng đ m (buffer) làm n đ nh pH c a mơi tr ưng trong quá trình nuơi c y. + 2+ - Kali và can xi (K và Ca): d ng ion K , Ca t bào và mơ d dàng h p thu và đng hố * Các nguyên t vi l ưng: Bao g m các nguyên t cĩ trong thành ph n dinh d ưng c a mơi tr ưng nuơi c y v i nng đ th p h ơn 30 ppm. Ðĩ là các nguyên t : Fe, B, Mn, Mo, Cu, Co, Ni Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 16
18. - S t (Fe) : s t th ưng t o ph c v i các thành ph n khác làm m t kh n ăng gi i phĩng ion s t cho nhu c u c a cây. Vì v y, th ưng s d ng s t d ng ph c chelat v i citrat ho c vi EDTA (Ethylene Diamine Tetraacetic Acid). T ph c s t này ion Fe đưc gi i phĩng trong ph m vi pH khá r ng. S t quy t đ nh kh n ăng phân chia c a t bào. Thí nghi m v i s t đánh d u b ng đ ng 59 v phĩng x Fe cho th y s t đưc d tr trong nhân t bào r t nhi u. Thi u s t s làm gi m l ưng ARN và gi m kh n ăng sinh t ng h p protein, nh ưng làm t ăng l ưng AND. - Bo (B) : đĩng vai trị quan tr ng trong s hình thành nên thành t bào và màng t bào th c v t. N u thi u Bo s c ch s phát sinh r th c p và c ch sinh tr ưng chi u dài ca r . B i vì, khi thi u Bo s kích thích ho t tính c a enzym IAA oxidaza nên hàm l ưng ca IAA b gi m. Thi u Bo thì mơ nuơi c y s chuy n hố thành mơ s o, nh ưng th ưng là mơ s o x p, m ng n ưc, kh n ăng tái sinh ch i kém. - Ð ng (Cu): cây h p thu d ng ion Cu 2+ . Kho ng 50% Cu 2+ cĩ m t trong l c l p. Ðng là thành ph n c a m t s enzyme, là thành viên c a chu i v n chuy n đin t c a h th ng quang hố I và II trong quang h p. Vì v y, thi u đ ng s làm gi m nhanh chĩng ho t đ ng quang h p. - Mangan (Mn) : thi u Mn làm cho hàm l ưng các amino axit t do và ADN t ăng lên, nh ưng l ưng ARN và kh n ăng sinh t ng h p protein b gi m d n đ n kh n ăng phân bào kém. Mangane xúc tác cho ph n ng quang phân ly n ưc trong quang h p. - Molypden (Mo) : là ion đĩng vai trị co-factor trong h th ng nitrat reductaza, vì v y, Mo đĩng vai trị quan tr ng trong quá trình trao đi đ m trong t bào. - K m (Zn) : là ion tham gia vào en zyme t ng h p ARN, trong ARN-polimeraza ch a hai ion Zn. N ng đ Zn th p s làm t ăng ho t đ ng c a en zyme phân gi i ARN (RNAse). Xúc tác cho ph n ng t ng h p IAA. - Coban (Co): cĩ vai trị quan tr ng trong quá trình cĩ đnh nit ơ, t ng h p ARN và methionine. b. Ngu n carbon h u c ơ: mơ và t bào th c v t trong nuơi c y in vitro s ng ch y u theo ph ươ ng th c d d ưng, c ũng cĩ th s ng bán d d ưng nh vào kh n ăng quang h p trong điu ki n ánh sáng nhân t o, nh ưng r t y u nên khơng đ ngu n carbon h u c ơ cho s sinh tr ưng phát tri n c a cây. Vì v y, trong mơi tr ưng nuơi c y c n đưc b sung ngu n carbon h u c ơ và th ưng dùng saccaroza v i li u l ưng 2-3%. Trong m t s tr ưng hp đ c bi t nh ư nuơi c y bao ph n lúa, nuơi c y t bào tr n cĩ th dùng glucoza, maltoza, galactoza c. Vitamin Mc dù mơ và t bào nuơi c y in vitro đu cĩ kh n ăng t t ng h p đưc các lo i vitamin c n thi t, nh ưng th ưng khơng đ v l ưng, do đĩ ph i b sung thêm t bên ngồi vào, đc bi t là vitamin thu c nhĩm B v i n ng đ kho ng 1 ppm. + Vitamin B1 (Thiamin. HCl) : khi kh trùng mơi tr ưng b ng ni h p nhi t đ và áp su t cao thì b phân tách thành pyrimidin và thiazol nh ưng sau đĩ t bào l i cĩ kh n ăng tng h p chúng l i thành vitamin B1. + Vitamin B2 (Riboflavin): cĩ th kh trùng b ng nhi t nh ưng l i d b ánh sáng làm phân gi i. Ði v i nuơi c y ngồi sáng thì ch dùng n ng đ 0,01 ppm. nh ưng đi v i nuơi cy trong t i cĩ th t ăng lên 10-15 ppm. + Vitamin B6 (Pyridoxin): là ti n thân c a pyridoxalphosphat - cofactor c a các nhĩm enzym nh ư carboxylaza và transaminaza. Khi h p nhi t đ cao xy ra ph n ng : pyridoxin + phosphat > pyridoxalphosphat + Mio Inositol : cĩ vai trị quan tr ng cho s phân chia t bào vì thúc đy s hình thành thành t bào (sinh t ng h p polygalacturonic axit và pectin). Th ưng s d ng n ng đ cao 50-100 ppm. Trong n ưc d a c ũng cĩ inositol. + Pantotenic axit : là thành ph n c a coenzym A. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 17
19. d. Nhĩm ch t t nhiên Các nhà sáng l p ngành nuơi c y mơ tr ưc đây th ưng s d ng mơi tr ưng dinh d ưng rt đơn gi n ch bào g m mu i khống và đưng. Ngày nay ng ưi ta đã kh ng đ nh r ng lo i mơi tr ưng đơn gi n nh ư v y ch ưa đ cho t bào sinh tr ưng t t. Vì v y, thành ph n mơi tr ưng ngày càng phong phú, đy đ và ph c t p h ơn. Ng ưi ta đã b sung vào mơi tr ưng m t s nhĩm ch t t nhiên nh m làm gia t ăng thành ph n dinh dưng và c ũng cĩ c các ch t cĩ ho t tính sinh lý nên kích thích s sinh tr ưng phát tri n c a cây in vitro . Th ưng bao g m : + N ưc d a: theo k t qu phân tích thành ph n n ưc d a c a Tulecke và ctv (1961) cho th y trong n ưc d a cĩ nhi u nhĩm ch t c n thit cho s sinh tr ưng c a t bào nh ư : Axit amin, axit béo, axit h u c ơ, đưng, ARN, ADN, myo inositol, các ch t cĩ ho t tính auxin, các glucosit c a xytokinin + D ch chi t n m men : White (1934) l n đ u tiên đã nuơi c y thành cơng r cây cà chua trong mơi tr ưng cĩ d ch chi t n m men. Thành ph n c a d ch chi t n m men g m cĩ : đưng, nucleic axit, amino axit, vitamin, axin, khống. Tác d ng c a d ch chi t n m men cho s sinh tr ưng c a r r t t t nh ưng v i mơ s o thì khơng t t. + D ch chi t m m lúa mì (m ch nha) : ch a ch y u m t s đưng, vitamin và m t s ch t cĩ ho t tính điu ti t sinh tr ưng. + D ch chi t m t s lo i rau, qu t ươ i (khoai tây, chu i, cà r t ) thành ph n cĩ đưng, axitnucleic, axit amin, vitamin, khống e. Ch t làm đơng mơi tr ưng (Agar) Agar - là m t lo i polysacarit c a t o (ch y u t o h ng- Rodophyta). Agar khi ngâm n ưc 80 oC s chuy n sang d ng sol và 40 oC thì tr v tr ng thái gel. Kh n ăng ng m n ưc c a agar cao (6-12 g/ 1lit n ưc). Tuy tr ng thái gel nh ưng agar v n đ m b o cho các ion v n chuy n d dàng. Vì v y, thu n l i cho s hút dinh d ưng c a cây tronng nuơi c y mơ. g. Ch t điu ti t sinh tr ưng Trong mơi tr ưng nuơi c y mơ và t bào th c v t, thành ph n ph gia quan tr ng nh t quy t đ nh đ n k t qu c a nuơi c y in vitro đĩ là các ch t điu ti t sinh tr ưng. Nhĩm các nhà khoa h c Netherandl do giáo s ư F.T.M. Kors ch biên trong cu n "Catalo 2000- 2001" đã tĩm t t vai trị c a các ch t điu ti t sinh tr ưng trong nuơi c y mơ theo b ng dưi đây: CH T ÐI U TI T SINH TR ƯNG VAI TRỊ TRONG NUƠI C Y MƠ NHĨM AUXIN Indol-3acetic axit (IAA) - Phát sinh r b t đ nh ( n ng đ cao) Indol-3butyric axit (IBA) -Phát sinh ch i b t đ nh ( n ng đ th p) Naphthaleneacetic axit (NAA) - T o phơi vơ tính(2,4D) Phenylacetic axit (PAA) - Phân chia t bào 2,4 dichlorophenoxyacetic axit (2,4D) - Phát sinh và sinh tr ưng callus 2,4,5 trichlorophenoxyacetic axit (2,4,5T - c ch b t ch i bên P-chlorophe noxyacetic axit (CPA) - c ch sinh tr ưng c a r CYTOKININ Zeatin (Z) -Phát sinh ch i b t đ nh ( n ng đ cao) Zeatinriboside (ZR) - c ch s phát sinh r Isopentenyladenin (iP) - Thúc đy s phân chia t bào Isopentenyladenosin (iPA) - Kích thích s b t ch i bên 6- benzylaminoburin (BAP) - c ch s kéo dài c a ch i Kinetin - c ch s hố già Thidiazuron (TDZ) N(2-chloro-4pyridil)N 'phenylurea (CPPU) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 18
20. GIBBERELLIN Gibberellic Axit (GA3) - V ươ n dài ch i, phá ng c a h t, c Gibberellin 1 (GA1) - Phá ng c a h t, phơi vơ tính, ch i bên Gibberellin 4 (GA4) - c ch phát sinh r b t đ nh Gibberellin 7 (GA7) - Kích thích s hình thành ch t c ch ca quá trình trình t o r , ra c , r hành ABSCISIC AXIT - Làm chín phơi vơ tính - Kích thích phát sinh ch i, c - Ði u khi n s ng ngh ETHYLEN - Hố già lá - Làm chín qu POLYAMIN - Thúc đy s phát sinh r b t đ nh - Thúc đy s phát sinh ch i - Thúc đy s hình thành phơi vơi tính JASMONIC AXIT - Thúc đy s phát sinh c , d hành - Làm t ăng s hình thành meristem h. ð pH c a mơi tr ưng . pH c a mơi tr ưng nuơi c y thích h p cho đa s các lo i cây tr ng dao đ ng t 5,5 - 6,0. N u pH th p thì agar s khơng đơng sau khi h p kh trùng. Khi pH 7 thì s làm k t t m t s mu i vơ c ơ và phân gi i m t s ch t h u c ơ s làm ch t cây. 5.6. Các ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vitro Cĩ hai hình th c nhân gi ng vơ tính in vitro : + Nhân gi ng vơ tính b ng cách t o cây t ch i nách, ch i đ nh ho c mơ phân sinh. Tu ỳ theo t ng m c đích mà chúng ta s d ng ngu n đ nuơi c y là ch i nách, ch i đ nh hoc mơ phân sinh. Hình 18.1. Nuơi c y ch i nách, ch i đ nh Hình 19.1: Mơ phân sinh đnh (meristem) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 19
21. Khái ni m mơ phân sinh (meristem) ch đúng khi m u nuơi c y đưc tách t đ nh sinh tr ưng cĩ kích th ưc kho ng t 0,1 - 0,5 mm. Khi v i m c đích nuơi c y làm s ch virus cho cây tr ng thì b t bu c ph i nuơi c y meristem . T l thành cơng trong k thu t nuơi cy meristem th ưng khơng cao. Tuy nhiên, cho đn nay ng ưi ta đã nuơi c y thành cơng cho nhi u đ i t ưng cây tr ng t o cây s ch b nh nh ư khoai tây, khoai lang, d a, mía Quy lu t v s t ươ ng quan gi a đ l n c a ch i nuơi c y v i t l s ng và m c đ n đnh v m t di truy n c a ch i đưc bi u hi n nh ư sau : khi kích th ưc ch i nuơi c y càng tăng thì t l s ng và tính n đ nh c ũng càng t ăng và ngưc l i kích th ưc ch i nuơi c y càng nh thì t l s ng và tính n đ nh c ũng gi m. Nh ưng xét v hi u qu kinh t trong nuơi c y mơ thì: n u kích th ưc c a ch i nuơi c y tăng thì hi u qu kinh t gi m và ng ưc l i kích th ưc c a ch i nuơi c y gi m thì hi u qu kinh t l i t ăng (th tích bình nuơi, l ưng mơi tr ưng ) Khi s d ng m u nuơi c y là ch i nách ho c ch i đ nh thì kh n ăng nuơi c y thành cơng là r t cao b i vì đây là hình th c phát đ ng s sinh tr ưng c a ch i ho c phá ng ch i nên ch i sinh tr ưng d dàng đ hình thành cây. Hình th c này th ưng s d ng cho các lo i cây hai lá m m nh ư khoai tây, cam, chanh, thu c lá Tuy nhiên c ũng cĩ m t s cây m t lá m m nh ư d a qu , d a s i + Nhân gi ng vơ tính b ng phát sinh ch i b t đ nh (adventitiou shoots) ho c phơi vơ tính (somatic embryos) Ch i cĩ th hình thành b ng hình th c tr c ti p ho c gián ti p : - Ch i phát sinh tr c ti p t m t m u mơ ho c c ơ quan tách ra t cây m Trên c ơ th cây, ngồi mơ phân sinh và đnh sinh tr ưng là ngu n m u nuơi c y nh ư đã trình bày trên thì các b ph n cịn l i đ u cĩ th s d ng cho vi c nhân gi ng in vitro. Các b ph n đĩ là : Ðo n thân : thu c lá, cam, chanh Mnh lá : thu c lá, cà chua, b p c i Các b ph n c a hoa : supl ơ, lúa m ỳ, đ ng ti n, phong lan Nhánh c , b c : hành t i, h hoa hu Liliaceae, Iridaceaee Trong tr ưng h p này c n ph i th c hi n qu trình ph n phân hố và tái phân hố t bào đ b t các t bào dinh d ưng hình thành ch i tr c ti p ho c gián ti p thơng qua giai đon phát tri n mơ s o các đ i t ưng m t lá m m nh ư lan, d ưa, chu i, hoa loa kèn s phát tri n ch i th ưng ph i qua giai đon d hành (protoccorm), nh ư v y, m u c y s hình thành hàng lo t th protocorm, ti p theo, các protocorm s n sinh protocorm m i ho c phát tri n thành cây Hình 20.1. Th protocorm và s phát sinh ch i t protocorm cây phong lan Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 20
22. Tuy nhiên, v i mc đích nhân gi ng vơ tính, thì hình th c tái sinh cây tr c ti p t m u nuơi c y khơng qua giai đon callus (mơ s o) s rút ng n th i gian t o cây đng th i cây đng nh t v m t di truy n. Hình 21.1: Nuơi c y qua giai đon callus Ch i phát sinh gián ti p qua giai đon mơ s o s lâu cho cây và mơ so khi c y chuy n nhi u l n th ưng khơng n đ nh v m t di truy n nên cây hay xu t hi n d ng b t th ưng Vì v y, đ tránh tr ưng h p đĩ ng ưi Hình 22.1: ta ch s d ng mơ s o Nuơi c y mơ phân sinh đ nh (meristem) - a,b mơ v a phát sinh t c là phân sinh ; c tái sinh cây; d,e cây hồn ch nh mơ s o s ơ c p đ phát sinh cây thì gi m đưc hi n t ưng bi n d . T t bào mơ s o c ũng cĩ th tái sinh tr c ti p thành cây ho c cĩ th ph i qua giai đon to phơi vơ tính (somatic embryos) đ thành cây. 5.7. Các b ưc ti n hành trong k thu t nuơi c y mơ t bào Cho t i nay vi c s d ng ph ươ ng pháp nhân gi ng in vitro đã đưc áp d ng cho nhi u lo i cây tr ng (trên 400 lồi). Giáo s ư Murashige c a tr ưng Ði h c California đã chia quy trình nhân gi ng in vitro làm ba giai đon (Murashige, 1974) và m t giai đon ti p sau in vitro: 1) T o v t li u nuơi c y kh i đ u in vitro 2) Nhân nhanh ch i, c m ch i in vitro 3) T o cây hồn ch nh, hu n luy n cây con 4) Chuy n cây ra tr ng ngồi điu ki n t nhiên Ba giai đon nhân cây in vitro đưc Edwin F. George (1993) tĩm t t trong b ng d ưi đây : Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 21
23. Các giai đon nuơi c y in vitro 3) T o cây hồn 1) T o v t li u nuơi 2) Nhân nhanh ch i, c m ch nh, hu n luy n cy kh i đ u in vitro ch i in vitro cây con Các hình th c Yêu c u : mơ, c ơ quan Yêu c u: cây con nhân cây in vitro Yêu c u: h s nhân ch i kho , s ch các vi sinh hồn ch nh, kho ho c phơi vơ tính cao, ch i vt mnh, t l s ng kho cao Mu s d ng là ch i Nhân nhanh ch i nách đnh ho c ch i bên đưc (axilary shoots) ho c c m Sinh tr ưng ti p cy vào mơi tr ưng l ng ch i (adventitiou shoots) và v chi u cao ch i Nuơi c y ch i ho c đ c đ kh i đ ng khi ch i sinh tr ưng đ kích tươ ng t giai đon cho s sinh tr ưng ch i. th ưc thì tách riêng ch i đ 2. Ra r t o cây in Ch i sinh tr ưng đ t nhân ti p giai đon 2 ho c vitro hồn ch nh chi u cao 10 mm chuy n sang giai đon 3 Mu s d ng là đnh sinh tr ưng v i kích th ưc r t nh (0,1-0,5 Sinh tr ưng ch i đ t 10 Nuơi c y mơ mm) đ nuơi c y. C ũng mm, sau đĩ nhân nhanh ch i Tươ ng t nh ư phân sinh đnh cĩ th s d ng đ nh sinh ho c c m ch i và chuy n ph n trên (Meristem) tr ưng kích th ưc l n sang giai đon 3 hơn (1-2 mm) t nh ng mu đã x lý nhi t đ . Nhân nhanh b ng vi c gia C ng nh nuơi c y ũ ư t ng ch i bên. M i m t t s ch i nh nh ng m u s ă đ T ng t nh Nuơi c y đ t đ ư sinh tr ng thành ch i riêng ươ ư d ng là 1 o n c a t ư ph n trên thân đ đ bi t. C y chuy n cĩ th l p thân li nhi u l n ho c vơ h n. Tái sinh ch i tr c ti p t mơ, c ơ quan nuơi c y mà Mu s d ng nuơi Nuơi c y mơ, c ơ khơng qua giai đon callus. cy tu ỳ thu c vào t ng Tươ ng t nh ư quan - Tái sinh Ch i phát sinh s đưc nhân lo i cây : lá, thân, r , ph n trên ch i tr c ti p nhanh giai đon 2 theo ki u hoa đã đưc kh trùng nhân c m ch i ho c nhân ch i đ nh. Phát sinh callus, tách riêng callus đ c y chuy n Nuơi c y mơ, c ơ Ch i đưc tách trong mơi tr ưng nhân quan - Tái sinh riêng bi t và cho ra Tươ ng t nh ư ph n trên nhanh. Sau đĩ chuy n sang ch i gián ti p r t o cây hồn mơi tr ưng tái sinh ch i. qua callus ch nh Ch i sinh tr ưng đ t chi u cao 10 mm Tái sinh cây Mơ, c ơ quan đưc Tái sinh tr c ti p phơi vơ Phơi vơ tính tr c ti p t phơi nuơi c y t o phơi vơ tính trên các m u nuơi c y sinh tr ưng hình vơ tính ( somatic tính tu ỳ thu c t ng lo i mà khơng cĩ callus. Nhân thành cây hồn embryo) cây. nhanh phơi vơ tính ch nh M u nuơi c y gi ng nh Khi cây t tr ng thái ư đ Sau 2-3 tháng thì 2. Hình th c t o nhân cây in vitro, t c là dinh d ưng nh t đ nh thì thu ho ch. B o c in vitro cĩ th dùng ch i đ nh, chuy n vào mơi tr ưng t o qu n c trong kho (microtuber) ch i nách, v y c đ c, đ t trong t i ho c ánh lnh phát sinh cây in vitro sáng ngày ng n Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 22
24. • Giai đon 1 : T o v t li u kh i đ u in vitro La ch n, đưa m u vào nuơi c y ph i đ m b o yêu c u : - T l nhi m th p - T l s ng cao - Tc đ sinh tr ưng nhanh Kt qu giai đon này ph thu c r t nhi u vào cách l y m u, tu ỳ thu c vào m c đích khác nhau, lo i cây khác nhau đ l y m u nuơi c y phù h p cĩ th s d ng đ nh sinh tr ưng, ch i nách, hoa, thân, r , lá Khi l y m u c n ch n đúng lo i mơ, đúng giai đon phát tri n c a cây, th ưng ch n mơ non (ít chuyên hố - đnh ch i, m t ng , lá non, v y c ) Ví d ch n m u nuơi c y : M ăng tây: ch i ng n (Kohler, 1975) Khoai tây: m m (Morel, 1952) D a: ch i nách, ch i đ nh (Paunethier, 1976) B p c i: m nh lá (Bimomilo, 1975) Supl ơ: hoa t (Kholer, 1978) C n thi t ph i kh trùng m u tr ưc khi đưa vào nuơi c y b ng hố ch t kh trùng đ lo i b các vi sinh v t (n m, khu n ) bám trên b m t m u c y. Ch n đúng ph ươ ng pháp kh trùng s đưa l i t l s ng cao và ch n mơi tr ưng dinh d ưng thích h p s đ t đưc tc đ sinh tr ưng nhanh. Th ưng dùng các ch t: HgCl 2 0,1% x lý trong 5-10 phút, NaOCl ho c Ca(OCl)2 5-7% x lý trong 15-20 phút, ho c H 2O2, dung d ch Br Mt s d ng mơi tr ưng dinh d ưng ph bi n : Mu i khống: theo White (1943) , Heller (1953) , Murashige và Skoog (1962) Ch t h u c ơ: đưng sarcaroza Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit Hocmon: auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4D); Xytokinin (BA, BA, Kin, 2P); Gibberelin (GA3) • Giai đon 2 : Nhân nhanh Mc đích giai đon này là kích thích s phát sinh s l ưng l n ch i trên m t đơn v m u cy trong m t th i gian nh t đ nh. Ðơn v m u c y cĩ th tính theo s ch i c y ban đ u, s đt c y ban đ u, s protocom ban đ u T c là đt h s nhân gi ng l n nh t. V t li u kh i đ u in vitro đưc chuy n sang mơi tr ưng nhân nhanh cĩ b sung ch t điu ti t sinh tr ưng nhĩm xytokinin đ tái sinh t m t ch i thành nhi u ch i. H s nhân ph thu c vào s l ưng ch i t o ra trong m t ng nghi m. giai đon này c n đ m b o m t trong các yêu c u : - Phát tri n ch i nách - To ch i b t đ nh (c m ch i) - To phơi vơ tính Kt qu giai đon này ph thu c nhi u vào vi c s d ng các tác nhân kích thích s phân hố c ơ quan mà đc bi t là phân hố ch i nh ư nhĩm ch t xytokinin và t ăng c ưng ánh sáng c v th i gian và c ưng đ (16h và 2000 lux), ánh sáng tím là thành ph n quan tr ng đ kích thích phân hố ch i (weiss và Jaffe, 1969) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 23
25. * S phát tri n c a ch i nách đưc kích thích b ng cách lo i b ưu th ng n khi nuơi cy các đ nh ch i và đon thân mang m t ng . Theo ph ươ ng th c này s phát tri n ch i di n ra theo hai cách: -Ct đon thân: cây phát tri n tr c ti p t ch i đ nh ho c ch i nách. Th ưng áp d ng cho nuơi c y lo i cây hai lá m m nh ư thu c lá, khoai tây, hoa cúc -Tách ch i: t o c m ch i t ch i đ nh ho c ch i nách. Th ưng áp d ng cho lo i cây 1 lá m m nh ư chu i, mía, lúa, lily, đ ng ti n, lay ơn - T o c in vitro : c đưc hình thành t cây in vitro trong mơi tr ưng và điu ki n phù hp cho s ra c . Th ưng s d ng đ i v i cây nhân gi ng b ng c nh ư khoai tây, khoai lang, cây h hành t i * T o ch i b t đ nh (adventitiou shoots) : trong tr ưng h p này c n ph i th c hi n quá trình ph n phân hố và tái phân hố đ b t các t bào soma hình thành ch i tr c ti p ho c gián ti p thơng qua giai đon phát tri n mơ seo. các đ i t ưng m t lá m m nh ư lan, d a, chu i, hoa loa kèn th ưng g p s phát tri n cây qua giai đon d hành (protocorm): t m u c y t o thành hàng lo t protocorm, t đĩ, ho c ti p t c s n sinh protocorm m i ho c phát tri n thành cây. *T o phơi vơ tính ( somatic embryos ): t ươ ng t nh ư t o ch i b t đ nh, đ t o phơi vơ tính c ũng c n ph i th c hi n quá trình ph n phân hố và tái phân hố t bào đ t bào soma hình thành phơi tr c ti p ho c gián ti p thơng qua giai đon phát tri n mơ s o. Phơi vơ tính cĩ c u trúc l ưng c c bao g m c ch i m m và r m m Các phơi vơ tính cĩ th tái sinh thành cây hồn ch nh ho c s d ng làm nguyên li u s n xu t h t gi ng nhân t o. * T o c in vitro ( Microtuber) : đi v i m t s lo i cây nh ư khoai tây, khoai lang, hoa loa kèn ngồi ph ươ ng pháp nhân gi ng b ng cây in vitro thì ng ưi ta cịn nhân gi ng bng t o c in vitro. V i ph ươ ng pháp t o c in vitro, giai đon đ u m i thao tác t ươ ng tr ưc nh ư k thu t nhân cây in vitro, đ n khi cây đ t tr ng thái sinh tr ưng t t thì đưc chuy n sang mơi tr ưng ra c , sau m t th i gian kho ng t 2-3 tháng đ c già sinh lý thì thu ho ch, c thu đưc cĩ kích th ưc nh nh ưng hồn tồn s ch b nh. • Giai đon 3 : T o cây hồn ch nh và hu n luy n cây con . K t thúc giai đon nhân cây chúng ta cĩ đưc s l ưng l n ch i nh ưng ch ưa hình thành cây hồn ch nh vì ch ưa cĩ b r cây. Vì v y, c n chuy n ch i t mơi tr ưng nhân nhanh sang mơi tr ưng t o r . Tách các ch i riêng c y chuy n vào mơi tr ưng nuơi c y cĩ b sung ch t điu ti t sinh tr ưng nhĩm auxin. M i ch i khi ra r là thành m t cây hồn ch nh. Mt s lo i cây cĩ th phát sinh r ngay sau khi chuy n t mơi tr ưng nhân nhanh giàu xytokinin sang mơi tr ưng khơng ch a ch t điu ti t sinh tr ưng. Ði v i các phơi vơ tính ch c n c y chúng trên mơi tr ưng khơng cĩ ch t điu ti t sinh tr ưng ho c mơi tr ưng cĩ ch a xytokinin n ng đ th p thì phơi s phát tri n thành cây hồn ch nh. Khi đã cĩ cây in vitro hồn ch nh đ y đ các c ơ quan nh ư thân, r , lá thì tr ưc khi đưa ra ngồi điu ki n t nhiên c n cĩ giai đon hu n luy n cây đ thích nghi v i nh ng thay đi v nhi t đ , m đ , s m t n ưc, sâu b nh đ chuy n tr ng thái cây t d d ưng sang t d ưng. Hình t 23.1 đ n 28.1. Minh ho các hình th c nhân gi ng vơ tính cây và c in vitro (ngu n : b mơn Sinh lý th c v t- ðHNNI và website www.ars.usda.gov) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 24
26. Hình 23.1 : Phát sinh c m ch i Hình 24.1 : Phát tri n ch i nách cây khoai tây Hình 25.1 . To c khoai tây in vitro và c in vitro n y m m tr ưc khi tr ng Hình 26.1 : Tái sinh cây t phơi vơ tính (somatic embryo) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 25
27. Hình 27.1. Ra r t o cây hồn ch nh in vitro cây d ưa lai (a) (b) (c) Hình 28.1 . Ra cây in vitro trong v ưn ươ m. Cây khoai tây (a,b). Cây d ưa lai (c) Th i gian hu n luy n cây in vitro kho ng t 1- 2 ngày đn 1-2 tu n tu ỳ thu c vào t ng lo i cây. Các ph ươ ng pháp hu n luy n cây in vitro nh ư ph ươ ng pháp đt bình cây ngồi điu ki n t nhiên, m n p bình nuơi, cy chuy n vào giá th tr u ho c x ơda trong bình nuơi • Giai đon 4 : Ra cây ngồi điu ki n t nhiên . Khi cây trong ng nghi m đã đ tiêu chu n (v chi u cao, s lá, s r ), đưc chuy n ra tr ng ngồi điu ki n t nhiên. Tr ưc khi tr ng ngồi đt, cây trong ng nghi m th ưng đưc chuy n ra tr ng vào giá th x p nh (tr u hun, s ơ d a ) đ t trong nhà l ưi cĩ điu ch nh ánh sáng, đ m thích h p cho cây thích nghi d n v i mơi tr ưng t nhiên. Sau m t th i gian cây con c ng cáp s đưc tr ng ra đ t. 5.8. Gi i thi u m t s lo i mơi tr ưng dinh d ưng nuơi c y in vitro Trong k thu t nuơi c y mơ t bào, vi c s d ng mơi tr ưng dinh d ưng thích h p cho mi lo i cây tr ng là quan tr ng, b i vì điu này s quy t đ nh đ n t l thành cơng, ch t lưng cây gi ng và giá thành c a s n ph m. Mơi tr ưng dinh d ưng cho nuơi c y in vitro đã đưc nghiên c u t nh ng n ăm 50 và ngày càng hồn thi n d n cho m i lo i cây tr ng, cho đn nay cĩ r t nhi u lo i mơi tr ưng dinh d ưng đã đưc ng d ng cĩ hi u qu cao cho các lo i cây khác nhau và đã đưc đă ng t i trên các sách v l ĩnh v c dinh d ưng khống cho cây tr ng ho c k thu t nuơi c y mơ t bào Sau đây là m t vài lo i mơi tr ưng dinh d ưng s d ng trong các m c đích và các loai mơi tr ưng khác nhau (Ngu n : "Catalo 2000-2001" , ch biên F.T.M. Kors ) MƠI TR ƯNG CHU (N 6) (1975) MACRO ELEMENTS CaCl 2 125,33 mg/l 1,13 mM KH 2PO 4 400,00 mg/l 2,94 mM KNO 3 2830,00 mg/l 27,99 mM MgSO 4 90,27 mg/l 0,75 mM (NH 4)2SO 4 463,00 mg/l 3,50 mM MICRO ELEMENTS FeNaEDTA 36,70 mg/l 0,10 mM H3BO 3 1,60 mg/l 25,88 mM Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 26
28. KI 0,80 mg/l 4,81 µM MnSO 4.H 2O 3,33 mg/l 19,70 mM ZnSO 4.7H 2O 1,50 mg/l 5,22 µM VITAMINS Glycin 2,00 mg/l 26,64 µM Thiamine HCl 1,00 mg/l 2,96 µM Pyridoxine HCl 0,50 mg/l 2,43 µM Nicotinic acid 0,50 mg/l 4,06 µM Ghi chú: Mơi tr ưng CHU (N 6) th ưng s d ng cho nuơi c y bao ph n lúa MƠI TR ƯNG CLC/IPOMOEA (1992) MACRO ELEMENTS CaCl 2 332,02 mg/l 2,99 mM KCl 2237,00 mg/l 30,00 mM KH 2PO 4 170,00 mg/l 1,25 mM KNO 3 2022,00 mg/l 20,00 mM MgSO 4 180,54 mg/l 1,50 mM NH 4NO 3 1601,00 mg/l 20,00 mM MICRO ELEMENTS CoCl 2.6H 2O 0,025 mg/l 0,11 µM CuSo4.5H 2O 0,025 mg/l 0,10 µM FeNaEDTA 36,70 mg/l 0,10 mM H3BO 3 6,20 mg/l 0,10 mM KI 0,83 mg/l 5,00 µM MnSO 4.H 2O 16,90 mg/l 0,10 mM Na 2MoO 4.2H 2O 0,25 mg/l 1,03 µM ZnSO 4.7H 2O 8,60 mg/l 29,91 µM VITAMINS myo-Inositol 90,10 mg/l 0,50 mM Nicotinic acid 1,23 mg/l 10,00 µM Pyridoxine HCl 1,03 mg/l 5,00 µM Thiamine HCl 1,69 mg/l 5,00 µM Ghi chú: Mơi tr ưng CLC/IPOMOEA s d ng cho nuơi c y t o phơi vơ tính khoai lang MƠI TR ƯNG GAMBORG B5 (1968) MACRO ELEMENTS CaCl 2 113,23 mg/l 1,02 mM NaH 2PO 4 250,00 mg/l 24,73 mM KNO 3 121,65 mg/l 1,01 mM MgSO 4 130,44 mg/l 1,09 mM (NH 4)2SO 4 134,00 mg/l 1,01 mM MICRO ELEMENTS CoCl 2.6H 2O 0,025 mg/l 0,11 µM CuSO 4.5H 2O 0,025 mg/l 0,10 µM FeNaEDTA 36,70 mg/l 0,10 mM H3BO 3 3,00 mg/l 48,52 mM KI 0,75 mg/l 4,52 µM MnSO 4.H 2O 10,00 mg/l 59,16 mM Na 2MoO 4.2H 2O 0,25 mg/l 1,03 µM ZnSO 4.7H 2O 2,00 mg/l 6,96 µM Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 27
29. VITAMINS myo-Inositol 10,00 mg/l 0,56 mM Nicotinic acid 1,00 mg/l 8,12 µM Pyridoxine HCl 1,00 mg/l 4,86 µM Thiamine HCl 10,00 mg/l 29,65 µM Ghi chú: Mơi tr ưng GAMBORG B5 th ưng s d ng cho nuơi c y huy n phù t bào r cây đu t ươ ng. MƠI TR ƯNG LINSMAIER & SKOOG (1965) MACRO ELEMENTS CaCl 2 332,02 mg/l 2,99 mM KH 2PO 4 170,00 mg/l 1,25 mM KNO 3 1900,00 mg/l 18,79 mM MgSO 4 180,54 mg/l 1,50 mM NH 4NO 3 1650,00 mg/l 20,61 mM MICRO ELEMENTS CoCl 2.6H 2O 0,025 mg/l 0,11 µM CuSo 4.5H 2O 0,025 mg/l 0,10 µM FeNaEDTA 36,70 mg/l 0,10 mM H3BO 3 6,20 mg/l 0,10 mM KI 0,83 mg/l 5,00 µM MnSO 4.H 2O 16,90 mg/l 0,10 mM Na 2MoO 4.2H 2O 0,25 mg/l 1,03 µM ZnSO 4.7H 2O 8,60 mg/l 29,91 µM VITAMINS myo-Inositol 100,00 mg/l 0,56 mM Thiamine HCl 0,40 mg/l 1,19 µM Ghi chú: Mơi tr ưng LINSMAIER & SKOOG th ưng s d ng cho nuơi c y mơ thu c lá MƠI TR ƯNG ORCHIMAX (1987) MACRO ELEMENTS CaCl 2 166,00 mg/l 1,50 mM KH 2PO 4 85,00 mg/l 0,62 mM KNO 3 950,00 mg/l 9,40 mM MgSO 4 90,35 mg/l 0,75 mM NH 4NO 3 825,00 mg/l 10,31 mM MICRO ELEMENTS CoCl 2.6H 2O 0,0125 mg/l 0,05 µM CuSO 4.5H 2O 0,0125 mg/l 0,05 µM FeNaEDTA 36,70 mg/l 0,10 mM H3BO 3 3,10 mg/l 0,05 mM KI 0,415 mg/l 2,50 µM MnSO 4.H 2O 8,45 mg/l 0,05 µM Na 2MoO 4.2H 2O 0,125 mg/l 0,52 µM ZnSO 4.7H 2O 5,30 mg/l 18,42 µM VITAMINS myo-Inositol 100,00 mg/l 0,56 mM Nicotinic acid 1,00 mg/l 8,12 µM Pyridoxine HCl 1,00 mg/l 4,86 µM Thiamine HCl 10,00 mg/l 29,65 µM Ghi chú : mơi tr ưng ORCHIMAX s d ng cho cây hoa phong lan Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 28
30. MƠI TR ƯNG MURASHIGE & SKOOG (1962) MACRO ELEMENTS CaCl 2 332,02 mg/l 2,99 mM KH 2PO 4 170,00 mg/l 1,25 mM KNO 3 1900,00 mg/l 18,79 mM MgSO 4 180,54 mg/l 1,50 mM NH 4NO 3 1650,00 mg/l 20,61 mM MICRO ELEMENTS CoCl 2.6H 2O 0,025 mg/l 0,11 µM CuSO 4.5H 2O 0,025 mg/l 0,10 µM FeNaEDTA 36,70 mg/l 0,10 mM H3BO 3 6,20 mg/l 0,10 mM KI 0,83 mg/l 5,00 µM MnSO 4.H 2O 16,90 mg/l 0,10 µM Na 2MoO 4.2H 2O 0,25 mg/l 1,03 µM ZnSO 4.7H 2O 8,60 mg/l 29,91 µM VITAMINS Glycine 2,00 mg/l 26,64 µM myo-Inositol 100,00 mg/l 0,56 mM Nicotinic acid 0,50 mg/l 4,06 µM Pyridoxine HCl 0,50 mg/l 2,43 µM Thiamine HCl 0,10 mg/l 0,30 µM Ghi chú : mơi tr ưng MURASHIGE & SKOOG thích h p cho nhi u lo i cây tr ng khác nhau nh ư khoai tây, d a, mía, c m ch ưng, đ ng ti n, hoa h ng 5.9. M t s h n ch trong k thu t nhân cây in vitro *.Tính b t đ nh v m t di truy n (genetic instability). M c đích c a nhân gi ng in vitro là t o ra qu n th cây đ ng nh t (True-to-type) v i s lưng r t l n. Tuy nhiên, trong m t s tr ưng h p ph ươ ng pháp này c ũng t o ra nh ng bi n d soma. T n s bi n d c ũng hồn tồn khác nhau và khơng l p l i. cây t o ra thơng qua giai đon nuơi c y mơ s o (callus) s cĩ nhi u bi n d h ơn so v i nuơi c y ch i đ nh. Nh ng nhân t gây ra bi n d t bào soma cĩ th là: -Ki u di truy n (Genotype) : t n s bi n d nh h ưng b i genotyp c a các lồi cây tr ng khác nhau. Nĩi chung cây càng cĩ m c b i th cao thì càng d bi n b . -S l n c y chuy n (Subcultures) s l n c y chuy n càng nhi u thì đ bin d càng cao. Theo Amstrong và Phillips (1988): khi nuơi c y lâu dài th ưng gây ra bi n d nhi m s c th . -Lo i mơ (Tissue): nĩi chung nuơi c y đ nh sinh tr ưng trong nhân nhanh in vitro ít b bi n d h ơn so v i nuơi c y các c ơ quan khác. *.S nhi m mu (explant contamination). Các vi sinh v t nh ư n m, vi khu n nĩi chung đ u b lo i tr trong giai đon kh trùng m nt ưc khi đưa vào nuơi c y. Tuy nhiên, m t s lo i vi khu n nh: Agrobacterium, Bacillus, Corylabacterium, Erwinnia và Pseudomonas cĩ th xâm nhi m vào mơ d n, t n ti trong mơ và gây tác h i khi t bào b t đ u phân chia (sau 1-2 tu n nuơi c y). ð kh c ph c hi n t ưng trên c n: Tr ưc h t c n ph i l a ch n cây m đúng tiêu chu n. Cĩ th s d ng m t s ch t kháng sinh đ ch ng hi n t ưng nhi m khu n và n m . Nh ưng mơ th c v t r t m n c m v i kháng sinh và cĩ ph n ng đ n ki u di truy n do đĩ c n r t th n tr ng khi s d ng kháng sinh. Ch t kháng sinh th ưng gây ra s hu ho i ty th và lp th nên s nh h ưng đ n di truy n t bào ch t. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 29
31. *Vi c s n sinh các ch t đ c t mơ nuơi c y (Toxic compounds phenol). Trong nuơi c y mơ th ưng quan sát th y hi n t ưng hố nâu hay đen m u, m u này cĩ th khuy ch tán trong mơi tr ưng. Hi n t ưng này là do m u nuơi c y cĩ ch a nhi u ch t tanin ho c hydroxyphenol . Thí d các ch t phenol eucomicacid và tyramine đã làm hố nâu m u c y c a cây lan Cattleya khi nuơi c y. Các ph ươ ng pháp lo i tr s hố nâu: - B sung than ho t tính vào mơi tr ưng nuơi c y (0,1 - 0,3%): ph ươ ng pháp này đc bi t cĩ hi u qu trên các lồi phong lan Phalenopsis, Cattleya và Aerides . Tuy nhiên than ho t tính cĩ th làm ch m quá trình nhân nhanh cây do h p ph m t s ch t điu ti t sinh tr ng và dinh d ưng c n thi t khác. - B sung polyvinyl pyrolidone (PVP) cĩ tác d ng kh nâu hố t t m u m t s cây ăn qu , (táo, h ng). - S d ng mơ non ho c gi m thi u nh ng v t th ươ ng cho m u c y khi kh trùng. - Ngâm m u vào dung d ch ascorbic và xytric vài gi tr ưc khi c y. - Nuơi c y m u trong mơi tr ưng l ng, cĩ n ng đ oxy th p, khơng cĩ ánh sáng (1 - 2 tu n). - C y chuy n m u liên t c(1-2ngày/l n) sang mơi tr ưng m i trong 1 - 2 tu n *Hi n t ưng thu tinh hố (Vitrification). Hi n t ưng cây b “thu tinh hố”t c là thân lá cây m ng n ưc, trong su t, cây r t khĩ s ng khi đa ra ngồi mơi tr ưng do b m t n ưc r t m nh. Hi n t ưng này th ưng x y ra khi nuơi c y trong mơi tr ưng l ng hay mơi tr ưng ít agar, s trao đ i khí th p. ð c bi t th ưng x y ra khi nuơi c y các lo i cây nh ư táo, m n, hoa c m ch ưng, hoa đ ng ti n, hoa cúc. Cây b thu tinh hố th ưng cĩ hàm l ưng l p sáp b o v th p, c u t o cĩ nhi u phân t phân c c nên d h p th n ưc. Cây in vitro th ưng cĩ m t đ khí kh ng cao, khí kh ng cĩ d ng trịn ch khơng elip, khí kh ng m liên t c trong quá trình nuơi c y nên khi đưa ra mơi tr ưng t nhiên d m t n ưc. ð tránh hi n t ưng thu tinh hố cĩ th ti n hành m t s gi i pháp: -Gi m s hút n ưc c a cây b ng cách t ăng n ng đ đưng ho c các ch t gây áp su t th m th u cao. -Gim n ng đ các ch t ch a nit ơ trong mơi tr ưng. -Gi m s s n sinh ethylen trong bình nuơi c y. -X lý axit absixic ho c m t s ch t c ch sinh tr ưng. Trên đây là tĩm t t tồn b các b ưc trong qui trình vi nhân gi ng in vitro chung cho các lo i cây tr ng. Tu ỳ theo t ng lo i cây mà cĩ các quy trình nhân gi ng riêng mang tính đc thù cho m i gi ng. n ưc ta, do tính ưu vi t c a ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính b ng k thu t nuơi c y in vitro mà hi n nay, trên tồn qu c đã cĩ h ơn 30 t nh thành đã xây d ng phịng nuơi c y mơ và th m chí trong m i t nh thành nh ư Hà N i, Ðà L t, TP. H Chí Minh l i cĩ nhi u phịng nuơi c y mơ v i quy mơ l n nh khác nhau, hàng n ăm đã cung c p l ưng đáng k cây gi ng s ch b nh, ch t l ưng cao cho th c ti n s n xu t : - Vi n sinh h c nơng nghi p - tr ưng Ði h c Nơng nghi p I m i n ăm s n xu t hàng ch c v n c khoai tây in vitro và hàng v n cây gi ng in vitro các lo i cho s n xu t nh ư cây phong lan, c m ch ưng, đ ng ti n, khoai tây - Vi n Di truy n Nơng Nghi p, Vi n Khoa h c k thu t Nơng Nghi p, Vi n Rau Qu n Tr ươ ng ươ ng, Trung tâm nghiên c u ng d ng KH & CN H i Phịng, S Khoa h c & Cơng ngh Nam Ðnh, Cơng ty gi ng cây tr ng Trung ươ ng I , Vi n Sinh h c Ðà L t, mi n ăm s n xu t hàng tri u cây gi ng in vitro , c gi ng in vitro c a các lo i cây hoa, cây khoai tây, cây mía, d a, chu i T i Ðà L t t nhi u n ăm nay, r t nhi u phịng nuơi c y Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 30
32. mơ c a t ư nhân ra đi, ho t đ ng r t cĩ hi u qu và m i n ăm c ũng đã cung c p m t l n lưng cây gi ng in vitro (khoai tây, hoa các lo i, cây rau ) cho vùng s n xu t t i Ðà L t và các vùng lân c n. - Trung tâm nghiên c u ng d ng KH vào s n xu t nơng lâm nghi p Qu ng Ninh, S Nơng Nghi p Tuyên Quang, Vi n Khoa h c Lâm Nghi p Vi t Nam, Tr ưng Ði h c Lâm nghi p, Cơng ty gi ng vùng Ðơng Nam B , m i n ăm s n xu t hàng tri u cây r ng in vitro các lo i nh ư cây b ch đàn, keo lai, t ch, hơng, tr m, gia v , Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 31
33. BNG TĨM T ĂT QUY TRÌNH NHÂN GI NG VƠ TÍNH M T S CÂY TR NG B NG PH ƯƠ NG PHÁP NUƠI CÂY IN VITRO Lo i cây Giai đon t o v t li u kh i đ u in vitro Giai đon nhân nhanh in Giai đon ra r t o cây vitro hồn ch nh Cây hoa đng ti n - C ơ quan nuơi c y : n hoa non - MS + 1,5 BAP + 10% n ưc MS + 0,5 NAA + 0,6% ( D ươ ng Minh Nga và cs, 2003. - Kh trùng : HgCl 2 0,1% trong 10 phút da + 5% sacaroza + 0,3% agar agar + 5% sacaroza "Nh ng v n đ c ơ b n trong KH - Mơi tr ưng t o callus và tái sinh ch i : MS + 0,2 TDZ s s ng". H i ngh Cơng ngh + 0,1 NAA + 5% sacaroza + 0,6% agar sinh h c tồn qu c) - C ơ quan nuơi c y : m t ng trên hoa và đnh ng n c a - VW + 30g/l khoai tây + 30 g/l Cây hoa phong lan phát hoa carot + 1g/l pepton +1% Phalaenopsis - Kh trùng : HgCl 0,1% hai l n 5 phút và 1 phút (kh sacaroza + 10% n c d a + 2 ư (lan H đip) trùng kép) 0,65% agar ( Nguy n Quang Th ch và cs, -Cho m t ng phát hoa : VW + 3 kinetin + 2 BA + 1% - Nên b sung 1g/l polyvinyl 2003. "Nh ng v n đ c ơ b n sacaroza + 10% n ưc d a + 0,65% agar pirollidon (PVP) đ ng ăn ng a trong KH s s ng". H i ngh -Cho đnh ng n phát hoa :VW + 3 kinetin + 1% sacaroza hi n t ưng hố đen cho mơi Cơng ngh sinh h c tồn qu c) + 10% n ưc d a + 0,65% agar tr ưng nuơi c y. Cây hoa h ng - C ơ quan nuơi c y : m t ng cành hoa ho c ch i đnh MS + 2BA + 2% sacaroza + - MS + 2 NAA ho c 2 - Kh trùng : HgCl 2 0,5% trong 5phút 0,65% agar IBA + 1,5 g/l than ho t ( Nguy n Th Kim Thanh, 1/2005 - Mơi tr ưng b t ch i : MS + 1BA ho c kinetin + 2% tính + 2% sacaroza + Tp chí Nơng nghi p và phát tri n sacaroza + 0,65% agar 0,65% agar nơng thơn) Cây nho -Cơ quan nuơi c y : m t ng cành nho ho c ch i đ nh - MS + 0,7BA + 2% sacaroza -MS + 3g/l thanh ho t o ( Nguy n Th Kim Thanh, 10/2004 - Kh trùng : C n 70 + HgCl 2 0,1% trong 3 phút + 0,65% agar tính + 2% sacaroza + Tp chí Nơng nghi p và phát tri n 0,65% agar nơng thơn. NXBNN) - C ơ quan nuơi c y : ð nh sinh tr ưng (kích th ưc 2cm) MS + 3BA + 10% n ưc d a + MS + 1 g/l thanh ho t o Cây chu i l y b t - Kh trùng : r a s ch m m chu i r i lau b ng c n 70 , 2% sacaroza + 0,65% agar tính + 2% sacaroza + ti n hành bĩc b l y ph n đ nh sinh tr ưng trong bu ng 0,7% agar ( Nguy n Th Kim Thanh, 11/2003 c y vơ trùng Tp chí Nơng nghi p và phát tri n nơng thơn. NXBNN) - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 2% sacaroza + 0,65% agar Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 32
34. - C quan nuơi c y : ng n d a Cây d a Cayen ơ (Nguy n Th Nhân, Nguy n - Kh trùng : Ca(OCl) 2 7% trong 20 phút MS + 2BA + 2,5% sacaroza + MS + 0,5 NAA + 1 IBA Quang Th ch,1995 - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 1,5 BA + 2% sacaroza + 0,6% agar + 2,5 % sacaroza + 0,6% Vi sinh v t và Cơng ngh sinh 0,6% agar agar hc. H i th o qu c gia khu v c) - C ơ quan nuơi c y : m m c gi ng - Mơi tr ưng nhân cây : MS + - Cây t ra r trong giai Cây Khoai tây - Kh trùng : Ca(OCl) 2 7% trong 15 phút ho c HgCl 2 10% n ưc d a + 2% sacaroza đon nhân nhanh Nguy n Th Kim Thanh,1995 0,1% trong 7 phút (cĩ ho c khơng cĩ agar) - ngồi - C in vitro sau 2 tháng Vi sinh v t và Cơng ngh sinh - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 2% sacaroza + 0,65% sáng thu ho ch hc. H i th o qu c gia khu v c) agar - Mơi tr ưng nhân c : MS + 1 2% sacaroza - trong t i - C quan nuơi c y : ch i ng n Cây tràm Úc ơ ( Nguy n V ăn Nghi, V ũ V ăn V và - Kh trùng : HgCl 2 0,2% trong 10 phút MS + 0,4 kinetin + 0,5 BA + MS + 0,5 IBA ho c 0,5 cs, 2003. "Nh ng v n đ c ơ b n - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 0,5 BA + 2,5% sacaroza 2% sacaroza + 0,7% agar NAA + 2% sacaroza + trong KH s s ng". H i ngh + 0,7% agar 0,7% agar Cơng ngh sinh h c tồn qu c) - C ơ quan nuơi c y : ch i đ nh và ch i nách Cây keo lai o (Mai Tr ưng, Nguy n H u H và - Kh trùng : c n 70 và n ưc Javen 30% + 1-2 gi t MS + 0,05 BA + 2,5 % MS + 0,05 NAA + 2 % cs, 2003. "Nh ng v n đ c ơ b n Tween 20 trong 10 phút sacaroza + 0,67 % agar sacaroza + 0,67 % agar trong KH s s ng". Hi ngh - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 0,05 BA + 2,5 % Cơng ngh sinh h c tồn qu c) sacaroza + 0,67 % agar - C ơ quan nuơi c y : ch i đ nh ho c ch i nách - B ch đàn : MS +1 BAP + 0,2 - B ch đàn và hơng : MS o - Kh trùng : c n 70 và HgCl 2 0,1% trong 10 phút kinetin + 2 % glucoza + 0,7 % +0,5 IBA + 2 % Cây b ch đàn, t ch, tr m, - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 2 % glucoza + 0,67 % agar sacaroza + 0,65 % agar hơng agar - T ch : MS +1 BAP + 2 % - T ch : MS +0,3 IBA + (Chu Bá Phúc, Ph m Kim H nh glucoza + 0,7 % agar 2 % sacaroza + 0,65 % và cs, 2003. "Nh ng v n đ c ơ - Cây hơng : MS +2 BAP + 2 agar bn trong KH s s ng". Hi ngh % glucoza + 0,7 % agar - Tr m : MS +0,1 NAA Cơng ngh sinh h c tồn qu c) - Tr m : MS +0,2 BAP + 2 % + 2 % sacaroza + 0,65 glucoza + 0,7 % agar % agar Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 33
35. - C ơ quan nuơi c y : h t gi ng Cây bơng - Kh trùng : c n 70 o và n ưc Javen 50% + 1-2 gi t MS + 2 BA + 2 g/l than ho t MS + 2 g/l than ho t (Mai Tr ưng, Nguy n H u H và Tween 20 trong 15 phút. Dùng dao tách v và kh trùng tính + 2 % glucoza + 0,67 % tính +2 % glucoza + cs, 2003. "Nh ng v n đ c ơ b n b ng cefotaxime agar 0,67 % agar trong KH s s ng". Hi ngh Cơng ngh sinh h c tồn qu c) - Mơi tr ưng kh i đ ng : MS + 2 % glucoza + 0,7 % agar Cây dâu tây - C ơ quan nuơi c y : ch i đ nh c a thân bị dâu tây 1/2 MS + 1 BA + 3% sacaroza 1/2 MS + 1 IBA + 1 g/l o (Nguy n Th Thanh H ng, D ươ ng - Kh trùng : c n 70 trong 30 giây và HgCl 2 0,1% trong + 0,65 % agar than ho t tính + 2% Tn Nh t, 2003. "Nh ng v n đ 8 phút sacaroza + 0,65 % agar cơ b n trong KH s s ng". Hi - Mơi tr ng kh i ng : MS + 2 % glucoza + 0,67 % ngh Cơng ngh sinh h c tồn ư đ qu c) agar Cây đu đ - Mơ c y: ð nh sinh tr ưng ng n MS + 0,2 α- NAA + 0,5 BA 0,025 ppm α-NAA (Nguy n Th Nh n, T p chí - Kh trùng : Hypocloric Canxi 5% trong 15 phút ho c (ppm) (Ho c gi m ½ MS KHKTNN, 3/2004) HgCl 2 0,1% trong 5-7 phút. chu n) - Mơi tr ưng: MS+ 1 ppm BA - Mơ c y: ð nh sinh tr ưng ng n và các m t ng trên MS + 0,5 α-NAA + 1 BA MS + 0,5 α-NAA (Ho c Cây mía thân cây. (ppm) 7,5% Saccaroza) (Nguy n Th Nh n, T p chí - Kh trùng : Hypocloric Canxi 5% trong 15 phút ho c KHKTNN, 4/2005) HgCl 2 0,1% trong 10 phút. - Mơi tr ưng: 0,5 α- NAA+ 1 BA (ppm) Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng . 34
36. CÂU H I ƠN T P CH ƯƠ NG I 1. Trình bày các khái ni m liên quan đn nhân gi ng cây tr ng? Nh ng ưu nh ưc đim c a hình th c nhân gi ng h u tính và nhân gi ng vơ tính ? 2. Các hình th c nhân gi ng vơ tính trong t nhiên và nhân t o ? 3. Cơ s khoa h c, ưu nh ưc đim và các thao tác k thu t c a nhân gi ng vơ tính cây tr ng b ng ph ươ ng pháp giâm cành, chi t cành và ghép cành ? 4. Cơ s khoa h c, ưu nh ưc đim c a ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính in vitro (nuơi c y mơ t bào) ? Trình bày các hình th c nhân gi ng vơ tính in vitro ? Nh ng ng d ng c a ph ươ ng pháp này trong th c ti n s n xu t ? 5. Trình bày các điu ki n c n thi t cho ph ươ ng pháp nhân gi ng vơ tính b ng k thu t nuơi c y in vitro ? 6. Trình bày c th k thu t c a t ng giai đon trong nhân gi ng vơ tính in vitro ? Ly ví d cho t ng giai đon ? Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng .35
37. CH ƯƠ NG II ðIU CH NH S TRAO ð I N ƯC VÀ DINH D ƯNG KHỐNG CA CÂY TR NG - Trao đi n ưc và dinh d ưng khống là hai ch c n ăng sinh lý quan tr ng, nh h ưng rt m nh – cĩ tính ch t quy t đ nh t i tr ng thái và các ho t đ ng sinh lý, chi u h ưng bi n đ i các ch t trong cây. - C n n m đưc vai trị sinh lý c a n ưc và các nguyên t dinh d ưng khống đ i v i cơ th th c v t, v i các ho t đ ng s ng khác di n ra trong cây nh ư quang h p, hơ h p, v n chuy n và phân b v t ch t trong cây, kh n ăng ch ng ch u v i các điu ki n ngo i c nh bt thu n trong quá trình sinh tr ưng, phát tri n và hình thành n ăng su t c a cây tr ng. - C n n m v ng c ơ s sinh lý c a vi c điu ch nh trao đ i n ưc và dinh d ưng khống, các ph ươ ng pháp t ưi tiêu và s d ng các lo i phân bĩn h p lý; ưu, nh ưc đim c a t ng ph ươ ng pháp, t ng lo i phân bĩn và nh ng y u t liên quan đ ch n l a các bi n pháp k thu t c th , cĩ hi u qu giúp cây tr ng sinh tr ưng, phát tri n thu n l i, cho n ăng su t cao, ph m ch t t t. 1. Khái quát chung v s trao đ i n ưc và dinh d ưng khống c a th c v t 1.1. T i sao cây c n trao đ i n ưc và dinh d ưng khống Cây tr ng luơn đưc coi là m t trong nh ng đ i t ưng chính trong b t k ỳ h th ng canh tác nào c a s n xu t nơng nghi p. Cây s ng đưc ph i nh n ưc và các ch t dinh d ưng. Nưc và các nguyên t khống là c ơ s đ xây d ng c ơ th th c v t, là điu ki n đ duy trì và quy t đ nh chi u h ưng ho t đ ng c a t t c các ch c n ăng sinh lý khác trong cây. T lâu đi ơng cha ta v n th ưng nĩi đ i v i cây tr ng là “ nh t n ưc, nhì phân, tam c n, t gi ng” . Ði u đĩ cĩ ngh ĩa là: hai y u t quan tr ng hàng đu đ i v i b t k ỳ cây tr ng nào là nưc và ch t dinh d ưng (tr ưc h t là các nguyên t khống). Nĩi cách khác: cây tr ng nào c ũng c n đưc đ m b o đ n ưc và phân bĩn h p lý m i phát huy đưc ti m n ăng năng su t, ph m ch t c a mình. Nưc đưc cung c p cho cây t nhi u ngu n khác nhau thơng qua các h th ng t ưi tiêu. Các ch t dinh d ưng đưc cung c p cho cây thơng qua các lo i phân bĩn. Hai y u t này cùng v i ánh sáng, nhi t đ , khơng khí, các điu ki n s ng c n thi t cĩ liên quan m t thi t v i nhau, h tr l n nhau, cùng tác đng t i quá trình sinh tr ưng, phát tri n c a cây tr ng. Ðng v m t ho t đ ng sinh h c, vi c cung c p đ n ưc s giúp cây hút thu các ch t dinh d ưng t t h ơn, ti n hành các quá trình sinh lý, sinh hố thu n l i h ơn. B i vì, ch khi đưc cung c p đ n ưc, cây tr ng m i cĩ th s d ng thu n l i, cĩ hi u qu các y u t dinh d ưng và các điu ki n sinh thái khác (ánh sáng, nhi t đ , khơng khí). Các nguyên t khống đưc cây hút vào cùng v i n ưc, là nguyên li u đ xây d ng nên các yu t c u trúc c a cây, là thành ph n hố h c quan tr ng đĩng vai trị quy t đ nh chi u h ưng bi n đi sinh hố, trao đ i ch t, trao đ i n ăng l ưng trong cây - c ơ s đ cây sinh tr ưng, phát tri n thu n l i, cho n ăng su t cao, ph m ch t t t. Chính t th c t s n xu t c a mình, nơng dân Vi t Nam đã đúc k t thành kinh nghi m trong vi c s d ng, điu ch nh ch đ n ưc và phân bĩn cho cây: nh t n ưc, nhì phân. 1.2. Ý ngh ĩa c a vi c nghiên c u điu ch nh s trao đ i n ưc và dinh d ưng khaĩng ca cây tr ng Hi u đưc c ơ s sinh lý c a vi c t ưi n ưc và s d ng phân bĩn s giúp cho vi c điu ch nh ch đ n ưc và dinh d ưng khống c a cây tr ng m t cách h p lý. Trên c ơ s đĩ, áp dng các bi n pháp k thu t c th nh m nâng cao n ăng su t, ph m ch t s n ph m thu ho ch; nâng cao hi u qu kinh t trong vi c s d ng và qu n lý ngu n n ưc, ngu n dinh dưng cung c p cho cây, đ ng th i duy trì đưc đ phì c a đ t. Ðĩ c ũng là m c tiêu quan tr ng trong nghiên c u, xây d ng h th ng canh tác nơng nghi p sinh thái b n v ng. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng .36
38. 2. Vai trị c a n ưc đ i v i các ho t đ ng sinh lý c a cây 2.1. N ưc trong cây và vai trị c a nĩ đ i v i các ho t đ ng sinh lý c a cây Trong các t bào, mơ c a cây ch a l ưng n ưc r t l n (kho ng 3/4 kh i l ưng cây), bao gm n ưc t do và n ưc liên k t. Hàm l ưng và t l hai d ng n ưc này quy t đ nh tr ng thái ch t nguyên sinh, c ưng đ , chi u h ưng trao đ i ch t, kh n ăng sinh tr ưng, phát tri n và ch ng ch u c a cây. C th :
    N ưc quy t đ nh s n đ nh c u trúc c a ch t nguyên sinh. N ưc t o màng thu hố bao quanh ch t nguyên sinh và tu ỳ theo đ thu hố mà h keo nguyên sinh ch t tr ng thái sol, coaxecva hay gel. Nh v y mà duy trì đưc c u trúc và ho t tính c a keo nguyên sinh ch t, quy t đ nh m c đ ho t đ ng s ng, quy t đ nh tính ch ng ch u c a keo nguyên sinh ch t c a t bào và c a cây.
    N ưc tham gia vào các ph n ng hĩa sinh, các bi n đ i ch t trong t bào. Nưc v a là dung mơi cho các ph n ng, v a là nguyên li u tham gia tr c ti p vào các ph n ng + trong cây. Ch ng h n, n ưc cung c p đin t và H cho vi c kh CO 2 trong quang h p, tham gia oxi hĩa nguyên li u hơ h p, tham gia vào các ph n ng th y phân
    N ưc là dung mơi hịa tan các ch t h u c ơ và các ch t khống. N ưc liên quan đn đ pH c a dung mơi, nh h ưng đ n l ưng hồ tan các ch t trong mơi tr ưng n ưc.
    Nưc t o dịng v n chuy n các ch t trong t bào và gi a các t bào v i nhau, đn các cơ quan trong tồn c ơ th và tích l ũy vào c ơ quan d tr quy t đ nh s hình thành n ăng su t kinh t c a cây tr ng. N ưc t o nên dịng v n chuy n v t ch t, t o nên m ch máu l ưu thơng trong cây nh ư tu n hồn máu đ ng v t.
    N ưc điu ch nh nhi t trong cây . Quá trình bay h ơi n ưc làm gi m nhi t đ đ c bi t là c a b lá, đ m b o ho t đ ng quang h p và các ch c n ăng sinh lý khác ti n hành thu n li.
    N ưc cĩ ch c n ăng d tr trong cây . Th c v t ch u h n nh ư các th c v t m ng n ưc cĩ hàm l ưng n ưc d tr l n. Hàm l ưng n ưc liên k t trong c ơ th th c v t này r t cao, quy t đ nh kh n ăng ch ng ch u c a chúng đ i v i điu ki n b t thu n nh t là ch u nĩng và hn.
    N ưc t o nên s c tr ươ ng P trong t bào. Nh cĩ s c tr ươ ng P mà đm b o cho t bào luơn tr ng thái tr ươ ng n ưc t o t ư th thu n l i cho các ho t đ ng sinh lý và sinh tr ưng phát tri n c a cây.
    Nưc là thành ph n quan tr ng trong vi c duy trì s cân b ng t l O 2/CO 2 trong khí quy n, thu n l i cho các ho t đ ng s ng c a m i sinh v t thơng qua quang h p c a cây. Ði v i t ng ch c n ăng sinh lý c th , n ưc cĩ vai trị đc tr ưng riêng. a. Vai trị c a n ưc đ i v i quang h p Nưc trong lá và trong t bào th c v t nĩi chung đ u nh h ưng đ n s hình thành và kích th ưc c a b máy quang h p. N ưc khơng ch là ngu n nguyên li u mà cịn là điu ki n đ c bi t quan tr ng trong qua trình sinh t ng h p các ch t h u c ơ quan tr ng – c ơ s cho vi c hình thành n ăng su t c a cây tr ng (hình 1.2).Thi u n ưc gây s phân hu b máy quang h p, làm suy thối l c l p, phá hu m i liên k t gi a di p l c và protein Thi u n ưc làm khí kh ng đĩng, h n ch s xâm nh p CO 2 vào lá, đ thu hố c a ch t nguyên sinh gi m làm ho t tính c a enzym RDP-cacboxylaza, tc đ bi n đ i các ch t trong pha sáng và pha t i c a quang h p; các sn ph m quang h p khơng đưc v n chuy n ra kh i lá làm gi m sút ho t đ ng quang h p c a lá, th m chí c ch quang h p. Cây đ nưc, khí kh ng m , nh h ưng t t t i t c đ xâm nh p CO 2 vào lá cung c p cho quang hp. Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng .37
39. Các thí nghi m đ u cho th y rng: hàm l ưng n ưc trong lá đ t tr ng thái bão hồ và thi u bão hồ m t ít (90 - 95%) thì quang h p đ t c c đ i. Tuy nhiên, n u đ thi u bão hồ nưc t ăng lên trên 10% thì quang h p b gi m sút. Quang h p ng ng khi đ thi u bão hồ nưc trong lá t ăng trên 30%. Tuy nhiên, tu ỳ theo kh n ăng ch ng ch u h n c a cây mà m c đ gi m sút quang h p khác nhau. Th c vt càng ch ng ch u h n t t thì quang hp càng gi m ít h ơn khi thi u n ưc, ví d : cây bơng r p c ưng đ quang h p gi m ch m và ch ng ng khi đ thi u bão hồ n ưc lên t i >35%. Chính vì v y, trong s n xu t c n cĩ ch đ t ưi n ưc h p lý cho cây tr ng đ chúng cĩ ho t đ ng quang h p t i ưu và tránh h n x y ra, nh t là trong th i k ỳ hình thành c ơ quan kinh t . b. Vai trị c a n ưc đ i v i s v n chuy n và phân b các ch t trong cây Nưc nh h ưng đ n quá trình v n chuy n các ch t trong cây m nh nh t so v i các y u t khác. N ưc quy t đ nh t c đ và c chi u h ưng v n chuy n, phân b các ch t trong cây b i nĩ v a là dung mơi hồ tan, v a là mơi tr ưng đ các ch t này đưc v n chuy n. Các ch t vơ c ơ đưc r hút vào và v n chuy n trong m ch g (xylem) theo h ưng chính là t r lên ng n. Các ch t h u c ơ đưc t ng h p lá, v n chuy n trong h m ch rây (libe, floem) theo h ưng chính là t lá xu ng r và hưng khác là t i các c ơ quan d tr nh ư c, qu , h t - khi các c ơ quan này hình thành (hình 2.2). Hình 2.2. Mơ hình v n chuy n n ưc, các cht khống và các ch t đưc t ng h p. Khi thi u n ưc thì t c đ v n chuy n các v t ch t trên đu gi m. Các thí nghi m đã kh ng đ nh r ng t c đ dịng v n chuy n trong m ch libe gi m t 1/3- 1/2 l n khi thi u nưc. N u thi u n ưc nhi u s gây hi n t ưng ch y ng ưc dịng: các ch t h u c ơ l i v n chuy n t c ơ quan d tr , c ơ quan tích lu đ n c ơ quan dinh d ưng. H u qu là cây sinh tr ưng kém, n ăng su t gi m, th m chí khơng cho n ăng su t. Ví d : lúc lúa tr ch c mà g p h n thì h t b lép, l ng nhi u; khoai tây b h n thì ít c và c nh ; đ u, l c khi vào ch c mà thi u n ưc thì h t khơng m y. Vì v y, vi c đ m b o nhu cu n ưc cho cây tr ng đ c bi t là giai đon hình thành c ơ quan kinh t là r t c n thi t, bi đây là m t y u t quy t đ nh n ăng su t kinh t . c. Vai trị c a n ưc đ i v i hơ h p c a cây N ưc là mơi tr ưng cho các ph n ng sinh hố, là nguyên li u tr c ti p tham gia vào các quá trình ơxi hố trong hơ h p. Hàm l ưng n ưc trong mơ nh h ưng r t m nh, cĩ tính Tr ưng ð i h c Nơng nghi p Hà N i – Giáo trình Sinh lý Th c v t ng d ng .38