›
›

Đề tài Nghiên cứu chuyển hóa rong biển, phế thải nông nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học

pdf 155 trang vanle 2340
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Đề tài Nghiên cứu chuyển hóa rong biển, phế thải nông nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfde_tai_nghien_cuu_chuyen_hoa_rong_bien_phe_thai_nong_nghiep.pdf

Nội dung text: Đề tài Nghiên cứu chuyển hóa rong biển, phế thải nông nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học

  1. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu và kết quả được nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, 2015 i
  2. LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành bản luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng đồng nghiệp và bạn bè. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Ngô Quốc Anh và PGS.TS Đỗ Quang Kháng đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành bản luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa Học, Phòng Quản lý Tổng hợp, anh chị em phòng Công nghệ Vật liệu và Môi trường – Viện Hóa Học các đồng nghiệp trong và ngoài Viện đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi thực hiện luận án và hoàn thành mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Tác giả Luận án ii
  3. MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU. 1 Chương 1- TỔNG QUAN 3 1.1. VAI TRÒ VÀ TIỀM NĂNG CỦA ETHANOL SINH HỌC 3 1.1.1. Vai trò của ethanol sinh học 3 1.1.2. Tiềm năng sản xuất ethanol sinh học 5 1.1.3. Sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học 6 1.1.4. Các nguyên liệu thường dùng để sản xuất ethanol ngày nay 6 1.1.5. Lên men sản xuất ethanol 10 1.2. RONG BIỂN 12 1.2.1. Giới thiệu chung 12 1.2.2. Hình thái - Phân loại các loài rong biển ở Việt Nam 12 1.2.3. Phân bố, khai thác sản xuất rong biển 14 1.2.4. Tổng quan về rong nâu 16 1.3. PHẾ THẢI NÔNG NGHIỆP: RƠM, RẠ Ở VIỆT NAM 23 1.3.1. Phế thải nông nghiệp 23 1.3.2. Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp 23 1.4. VI SINH VẬT TRONG XÚC TÁC QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 29 1.4.1. Vi sinh vật 29 1.4.2. Xúc tác sinh học trong quá trình thủy phân 31 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC THUỘC LĨNH VỰC CỦA LUẬN ÁN 39 1.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 39 1.5.2. Các nghiên cứu trong nước 43 Chương 2 - NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 47 iii
  4. 2.1.1. Các nguyên vật liệu chứa cellulose 47 2.1.2. Các chủng vi sinh 48 2.1.3. Hóa chất 50 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 51 2.2.1. Phương pháp hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ 51 2.2.2. Phương pháp xác định độ ẩm của rong biển khô 52 2.2.3. Xác định protein tổng số bằng phương pháp Kieldahl 52 2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng tro 53 2.2.5. Xác định hàm lượng lipid tổng số bằng phương pháp Folch 54 2.2.6. Phương pháp định lượng đường khử theo phương pháp acid dinitrosalicylic (DNS) 55 2.2.7. Phương pháp tiền xử lý phế thải rong nâu 57 2.2.8. Phương pháp xử lí số liệu 60 2.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU 61 2.3.1. Quy trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu và phế thải nông nghiệp 61 2.3.2. Quy trình dự kiến lên men dịch đường tạo ethanol sinh học 64 2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu 65 2.3.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình lên men tạo ethanol 70 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 75 3.1. Nghiên cứu và chuẩn bị nguyên vật liệu sản xuất nhiên liệu sinh học 75 3.1.1. Xác định hàm lượng carbohydrate trong rong nâu thu tại Nha Trang và Hải Phòng 75 3.1.2 Xác định hàm lượng cellulose tách từ rơm rạ 76 3.1.3. Nghiên cứu thu nhận xúc tác sinh học cho sản xuất bioethanol 78 3.2. Nghiên cứu quá trình thủy phân carbohydrate từ các nguồn nguyên liệu thành saccharide hòa tan 81 3.2.1. Thủy phân carbohydrate trong rong nâu 81 3.2.2. Nghiên cứu thủy phân cellulose tách chiết từ rơm rạ 91 3.2.3. Đánh giá chung về quá trình thủy phân chuyển hóa carbohydrate trong rong biển, phế thải nông nghiệp thành đường 106 iv
  5. 3.3. Nghiên cứu quá trình lên men các sản phẩm trung gian hòa tan 108 3.3.1. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rong nâu và phế thải nông nghiệp 110 3.3.2. Nghiên cứu lên men bằng sản phẩm trung gian glucose từ quá trình thủy phân rơm rạ bởi chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 116 3.4. Chuyển hóa phế thải rong nâu thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học kết hợp với acid 118 3.4.1. Hàm lượng cellulose có trong phế thải rong nâu sau quá trình tách alginate 118 3.4.2. Hiệu quả quá trình thủy phân và lên men 119 Nhận xét 120 KẾT LUẬN 126 CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO 130 PHỤ LỤC v
  6. Đỗ Trung Sỹ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Diễn giải 1 ADP Adenosin diphosphate 2 ATP Adenosin triphosphate 3 BGL Glucosidase 4 BHT Butylated hydroxy toluen 5 CBH Cellobiohydrolase 6 DNS Acid dinitrosalicylic 7 EG Endoglucanase 8 FAO Food and Agriculture Organization 9 HPLC High performance liquid chromatography 10 IR Infrared spectroscopy 11 IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry 12 NADH Nicotinamide adenine dinucleotide 13 OD Optical density 14 PVA Polyvinyl alcohol 15 SHF Separate hydrolysis and fermentation 16 SPSS Statistical Package for the Social Sciences 17 SSF Simultaneous saccharification and fermentation 18 UV – VIS Ultraviolet–visible spectroscopy iv
  7. Đỗ Trung Sỹ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Tính chất hoá lý quan trọng của một số nhiên liệu 4 Bảng 1.2 Sản lượng ethanol trên thế giới 6 Bảng 1.3 Một số dự án sản xuất ethanol tại Việt Nam 7 Bảng 1.4 Các dạng carbohydrate trong 3 ngành rong biển. 14 Bảng 1.5 Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp (%) 23 Bảng 1.6 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu 24 Bảng 1.7 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose 31 Bảng 2.1 Các loài rong nâu được thu hái để nghiên cứu 48 Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose 49 Bảng 2.3 Các chủng vi sinh vật cho lên men ethanol 49 Bảng 2.4 Các hóa chất được sử dụng trong luận án 50 Bảng 2.5 Mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn glucose theo phương pháp DNS 57 Bảng 3.1 Kết quả xác định thành phần sinh hóa của 4 loài rong nâu 75 Bảng 3.2 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân rong nâu bởi các lượng enzyme Cellic HTech2 khác nhau 81 Bảng 3.3 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các giá trị pH khác nhau 83 Bảng 3.4 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các nhiệt độ khác nhau 85 Bảng 3.5 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 87 Bảng 3.6 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rong nâu đã qua xử lí acid kết hợp với enzyme Cellic HTech2 89 v
  8. Đỗ Trung Sỹ Bảng 3.7 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng vi khuẩn C32 92 Bảng 3.8 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng vi khuẩn C36 92 Bảng 3.9 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng vi khuẩn Hud 4-1 93 Bảng 3.10 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng xạ khuẩn 7P 93 Bảng 3.11 Kết quả xác định hàm lượng cellulose và glucose tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch lên men của chủng nấm A. terreus 93 Bảng 3.12 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bởi một số chủng vi sinh của Việt Nam 94 Bảng 3.13 Hiệu suất thủy phân cellulose của các chủng vi sinh 95 Bảng 3.14 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân cellulose bởi dịch enzyme của nấm Aspergillus terreus tại các thời điểm khác nhau và ở các giá trị pH khác nhau 99 Bảng 3.15 Kết quả xác định hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân cellulose bởi enzyme của nấm Aspergillus terreus tại nhiệt độ khác nhau 100 Bảng 3.16 Ảnh hưởng của lượng cellulose và enzyme ban đầu tới lượng glucose thu được 101 Bảng 3.17 Ma trận kế hoạch thực nghiệm và kết quả 101 Bảng 3.18 Xác địnhh giá trị tối ưu cho hàm lượng glucose nhận được 104 vi
  9. Đỗ Trung Sỹ Bảng 3.19 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi thay đổi tỷ lệ nấm men trong quá trình lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae V7028 110 Bảng 3.20 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men của nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 ở các giá trị pH khác nhau 113 Bảng 3.21 Kết quả xác định hàm lượng đường khử trước và sau khi lên men bằng nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 tại các thời điểm khác nhau 115 Bảng 3.22 Các thông số động học của quá trình lên men ethanol bởi chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 117 Bảng 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ acid loãng tới hàm lượng khử tạo thành trong quá trình thủy phân 119 vii
  10. Đỗ Trung Sỹ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Công thức Haworth của hai gốc polymer trong phân tử acid alginic 19 Hình 1.2 Công thức cấu tạo của alginate 19 Hình 1.3 Cấu trúc của alginate 20 Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của một loại fucoidan được chiết tách từ rong nâu 21 Hình 1.5 Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan 21 Hình 1.6 Cấu trúc của phân tử cellulose và hemicellulose 25 Hình 1.7 Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose 26 Hình 1.8 Cấu trúc của lignin 28 Hình 1.9 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy gián đoạn 29 Hình 1.10 Cơ chế thủy phân cellulose 36 Hình 1.11 Sơ đồ thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase 36 Hình 1.12 Cơ chế thủy phân glycoside bằng enzyme -glucosidase 37 Hình 1.13 Sơ đồ thiết bị thủy phân bằng phương pháp acid tại Brazil , 39 Hình 2.1 Các mẫu rong nghiên cứu 47 Hình 2.2 Phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) trước và sau khi xử lý cơ học 48 Hình 2.3 Phương pháp Hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ 51 Hình 2.4 Đường chuẩn tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ 57 Hình 2.5 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme 60 Hình 2.6 Sơ đồ quá trình thủy phân carbohydrate trong rong nâu 61 Hình 2.7 Sơ đồ quá trình thuỷ phân carbohydrate trong phế thải nông nghiệp 63 Hình 2.8 Quy trình dự kiến sản xuất ethanol 64 Hình 2.9 Sơ đồ thí nghiệm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 66 Hình 2.10 Sơ đồ thí nghiệm kết hợp thủy phân bằng acid và enzyme 70 viii
  11. Đỗ Trung Sỹ Hình 2.11 Sơ đồ xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men tạo ethanol. 71 Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng carbohydrate trong 4 loài rong nâu thu tại Hải Phòng và Nha Trang 76 Hình 3.2 Ảnh cellulose tách được từ rơm, rạ (trái) và phổ IR của cellulose thu được (phải) 77 Hình 3.3 Ảnh của một số chủng vi sinh vật và vòng phân giải của chúng 79 Hình 3.4 Chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 do phía Nga chuyển giao. 79 Hình 3.5 Ảnh các hạt xúc tác tạo thành từ các chủng vi sinh vật được cố định trên PVA (trái) và hình ảnh sử dụng các tế bào cố định này để thủy phân cellulose thành glucose (phải) 80 Hình 3.6 Tế bào nấm men cố định trên PVA (trái) và tế bào nấm men cố định trên PVA tham gia vào lên men ethanol (bên phải) 81 Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân rong nâu bởi các lượng enzyme Cellic HTech2 khác nhau 82 Hình 3.8 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các giá trị pH khác nhau. 84 Hình 3.9 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân rong nâu bởi enzyme Cellic HTech2 ở các nhiệt độ khác nhau. 85 Hình 3.10 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử tạo thành tại các thời điểm khác nhau trong quá trình thủy phân rong nâu bằng enzyme Cellic HTech2 87 Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử trong dịch thủy phân rong nâu đã qua xử lí acid kết hợp với enzyme Cellic HTech2 90 Hình 3.12 Sơ đồ quá trình thủy phân cellulose bằng dịch enzyme của các chủng vi sinh vật 92 Hình 3.13 So sánh thủy phân cellulose bằng các chủng vi sinh 94 Hình 3.14 Hiệu suất thủy phân cellulose thành glucose bằng các chủng vi sinh 95 Hình 3.15 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase của nấm A. terreus 96 ix
  12. Đỗ Trung Sỹ Hình 3.16 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase của vi khuẩn C32 97 Hình 3.17 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase của xạ khuẩn 7P 97 Hình 3.18 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase của vi khuẩn Hud 4-1 97 Hình 3.19 Sự tạo thành glucose trong quá trình thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase của vi khuẩn C36 98 Hình 3.20 Ảnh hưởng của pH tới hàm lượng glucose tạo thành trong quá trình thủy phân cellulose bằng chủng nấm Aspergillus terreus 99 Hình 3.21 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng glucose tạo thành trong quá trình thủy phân cellulose bằng nấm A. terreus 100 Hình 3.22 Đồ thị xác định giá trị tối ưu của glucose thu được từ quá trình thủy phân cellulose 105 Hình 3.23 Cơ chế chuyển hóa đường thành ethanol 110 Hình 3.24 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại khi thay đổi tỷ lệ nấm men trong quá trình lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae V7028 111 Hình 3.25 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại sau khi lên men của nấm Saccharomyces cerevisiae V7028 ở các giá trị pH khác nhau 114 Hình 3.26 Biểu đồ biểu diễn hàm lượng đường khử còn lại sau khi lên men bằng Saccharomyces cerevisiae V7028 tại các thời điểm khác nhau 115 Hình 3.27 Sự biến đổi các thành phần trong quá trình lên men ethanol bằng chủng Saccharomyces cerevisiae V7028 (của Nga) 117 Hình 3.28 Ảnh hưởng của nồng độ acid loãng đến hàm lượng đường trong quá trình thủy phân phế thải rong 120 x
  13. MỞ ĐẦU Nền kinh tế thế giới cho đến nay phụ thuộc rất nhiều vào nhiên liệu hóa thạch, nhu cầu năng lượng cũng không ngừng gia tăng theo sự phát triển kinh tế - xã hội, an ninh quốc phòng của mỗi quốc gia. Theo tính toán của các chuyên gia năng lượng, dầu mỏ và khí đốt hiện chiếm khoảng 60-80% cán cân năng lượng thế giới. Với tốc độ tiêu thụ năng lượng như hiện nay và trữ lượng dầu mỏ hiện có, nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng bị cạn kiệt trong vòng 40-50 năm tới. Hơn nữa, các chất đốt hóa thạch làm tăng lượng carbon dioxide trong khí quyển, là một trong những nguyên nhân làm nhiệt độ trái đất ngày càng nóng lên, đây là một vấn đề mà nhiều tổ chức, quốc gia muốn tìm cách hạn chế trong nhiều năm qua. Do đó, nhiệm vụ tìm kiếm nguồn thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đã được đặt ra trong gần nửa thế kỷ qua và ngày càng trở nên cấp thiết. Một trong những hướng đi để giải quyết nhiệm vụ này là sản xuất nhiên liệu sinh học bằng cách sử dụng sinh khối, tức là các vật liệu có nguồn gốc hữu cơ để đốt trực tiếp, nhằm tạo ra nhiệt năng, điện năng hoặc chuyển hóa sang các chất mang năng lượng dạng khí hoặc nhiên liệu lỏng. Nhiên liệu sinh học được sản xuất từ thực vật và phế thải ví dụ như: các loại cây nông nghiệp, chất thải đô thị hay phụ phẩm nông lâm nghiệp [35]. Ethanol có thể được sản xuất từ thực vật bao gồm đường, tinh bột và lignocellulose. Ethanol được sản xuất từ những vật liệu như đường và tinh bột được coi như là thế hệ đầu tiên của nhiên liệu sinh học. Phần lớn nhiên liệu sinh học ngày nay trên thế giới là từ thế hệ đầu tiên. Tuy nhiên, việc sử dụng các nguyên liệu thế hệ này dẫn đến nhiều vấn đề nảy sinh bao gồm an ninh lương thực và việc thay thế đất nông nghiệp do nhu cầu về nhiên liệu sinh học ngày càng cao [104]. Thế hệ thứ hai của nhiên liệu sinh học là sử dụng phế thải có chứa cellulose làm nguyên liệu do có số lượng lớn và chi phí thấp. Việc sử dụng các phế thải có thể làm giảm đáng kể áp lực về nhu cầu đất đai và đáp ứng nhu cầu nhiên liệu sinh học trên thế giới [96]. Hiện tại, nguyên liệu được nghiên cứu trong sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ hai phần lớn là phế thải nông nghiệp từ vụ mùa, thực vật tươi hoặc đã qua chế biến [52], rơm rạ [102], ngô mía [111] với hàm lượng hemicellulose cao [72]. Trong nguồn nguyên liệu có nguồn gốc từ biển, 1
  14. Sargassum là loại rong nâu được sử dụng trong sản xuất alginate, mannitol Việc sử dụng các loài rong như một nguyên liệu thay thế để sản xuất nhiên liệu sinh học đã được nghiên cứu [123]. Tuy nhiên vẫn còn rất ít các nghiên cứu về việc dùng rong nâu làm nguyên liệu sản xuất ethanol. Trong khi đó, hàng năm một lượng lớn các phế thải rong được tạo ra từ công nghiệp sản xuất alginate, gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng do khả năng tái chế thấp. Các phế thải rong từ ngành công nghiệp chế biến rong nâu có hàm lượng cellulose cao, hàm lượng hemicellulose và lignin thấp. Vì vậy nó có tiềm năng cao trong quy trình chuyển hóa thành ethanol sinh học. Từ tình hình thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu chuyển hóa rong biển, phế thải nông nghiệp chứa carbohydrate thành ethanol sử dụng xúc tác sinh học” làm đề tài nghiên cứu cho luận án của mình. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là:  Xác định được thành phần lý hóa, sinh của rong biển và phế thải nông nghiệp, lựa chọn được loài rong biển có hàm lượng carbohydrate cao cho quá trình nghiên cứu luận án  Xác định được các điều kiện tối ưu để chuyển hóa carbohydrate từ rong biển và phế thải nông nghiệp thành ethanol sinh học Để thực hiện được các mục tiêu trên, các nội dung nghiên cứu đã được thực hiện bao gồm: 1. Xác định hàm lượng carbohydrate trong các rong nâu và trong phế thải nông nghiệp 2. Xác định các điều kiện tối ưu của quá trình thủy phân rong nâu bằng acid sulfuric loãng kết hợp với enzyme Cellic HTech2 3. Lựa chọn các chủng vi sinh vật thủy phân rơm, rạ thành các sản phẩm trung gian sau đó nghiên cứu xây dựng quy trình thủy phân tối ưu 4. Xác định điều kiện tối ưu trong quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân của rong biển và phế thải nông nghiệp 5. Đánh giá hiệu quả của các quá trình chuyển hóa carbohydrate từ rong biển và phế thải nông nghiệp thành ethanol sinh học 2
  15. Chương 1- TỔNG QUAN 1.1. VAI TRÒ VÀ TIỀM NĂNG CỦA ETHANOL SINH HỌC 1.1.1. Vai trò của ethanol sinh học Hiện nay, các nguồn nguyên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt, ước tính trữ lượng dầu mỏ của thế giới đến năm 2050 sẽ cạn. Trong khi đó, hoạt động sống của con người rất cần năng lượng. Mặt khác, nguồn năng lượng hóa thạch đã gây ra các vấn đề nghiêm trọng về ô nhiễm môi trường, hiệu ứng nhà kính. Chính vì vậy, nhu cầu về nguồn nguyên liệu thay thế cho xăng dầu đang là vấn đề cấp thiết cho toàn thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Việc đầu tư nghiên cứu “nhiên liệu sạch”- nhiên liệu sinh học ethanol sinh học đang trở thành đề tài được quan tâm hàng đầu trên thế giới [18]. Nhiên liệu sinh học là nhiên liệu được hình thành từ các hợp chất có nguồn gốc động thực vật trong đó bao gồm: ngũ cốc, chất thải nông nghiệp, sản phẩm thải trong công nghiệp Nhiên liệu sinh học được biết đến với nhiều lợi thế: là một trong những biện pháp giảm thiểu hiện tượng nóng lên toàn cầu, giúp các quốc gia chủ động, không bị lệ thuộc vào vấn đề nhập khẩu nhiên liệu, đặc biệt đối với các quốc gia không có nguồn dầu mỏ và than đá, ổn định tình hình năng lượng cho thế giới [7]. Nhiên liệu sinh học có thể được phân loại thành các nhóm chính như sau: - Diesel sinh học (Biodiesel) là một loại nhiên liệu lỏng có thể sử dụng thay thế cho loại dầu diesel truyền thống. - Xăng sinh học (Biogasoline) là loại nhiên liệu lỏng, trong đó có sử dụng ethanol như một loại phụ gia nhiên liệu pha trộn vào xăng thay cho phụ gia chì. Ethanol được sản xuất thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose. Ethanol được pha chế với tỷ lệ thích hợp với xăng tạo thành xăng sinh học có thể thay thế loại xăng sử dụng phụ gia chì truyền thống. - Khí sinh học (Biogas) có thành phần chủ yếu là CH4 (50-60%) và CO2 (>30%) còn lại là các chất khác như hơi nước, O2, N2, CO Biogas được tạo ra sau quá trình ủ lên men các sinh khối hữu cơ, phế thải nông nghiệp tạo thành sản phẩm dạng khí. Cho tới nay, ethanol sinh học được coi là nguồn năng lượng thay thế số một cho dầu mỏ [8]. Để chứng minh rằng, ethanol thực chất có thể làm nhiên liệu thay 3
  16. thế xăng, có thể xem xét một số tính chất quan trọng của dung môi này [18]. - Tính chất hóa lý của ethanol: o Ethanol (C2H5OH) là một chất lỏng không màu, sôi ở 78,3 C và là một dung môi hữu cơ đa dụng, có thể sản xuất từ dầu khí thông qua phản ứng hydrat hóa ethylene (ethanol tổng hợp, không sử dụng vào mục đích năng lượng) hoặc từ nguyên liệu sinh học (ethanol sinh học, sử dụng chủ yếu vào mục đích năng lượng). Ethanol sinh học có khả năng thay thế hoàn toàn xăng sản xuất từ dầu mỏ hoặc có thể pha trộn với xăng để tạo ra xăng sinh học. Xăng sinh học là hỗn hợp của xăng truyền thống và ethanol sinh học (bio-ethanol), được sử dụng làm nhiên liệu cho các loại động cơ đốt trong như xe gắn máy, ôtô. Được ghi danh bằng kí tự E kèm theo một con số chỉ số % của ethanol sinh học được pha trộn trong xăng đó. Trên thị trường người ta thường gặp các loại xăng sinh học như E5, E20, E95 tức là xăng chứa 5%, 20%, 95% ethanol. Công thức hóa học của ethanol: C2H5OH, CH3-CH2-OH, viết tắt là C2H6O. Ethanol là một loại nhiên liệu thay thế, được sản xuất bằng phương pháp lên men và chưng cất các loại ngũ cốc chứa tinh bột có thể chuyển hóa thành đường đơn, như bắp, lúa mì, lúa mạch, mía, củ cải đường, sắn, các phế phẩm nông nghiệp. Ngoài ra, ethanol còn được sản xuất từ cây, cỏ có chứa cellulose, gọi là ethanol sinh học. - Các phản ứng quan trọng của ethanol: Phản ứng đốt cháy (Combustion) C2H5OH + 3 O2 2 CO2 + 3 H2O Lên men (Fermentation) C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 Để thấy rằng ethanol có bản chất là nguyên liệu có thể so sánh các chỉ số đặc trưng với một số nhiên liệu khác (bảng 1.1) Bảng 1.1 Tính chất hoá lý quan trọng của một số nhiên liệu Nhiên liệu Ethanol Xăng Hydrogen Diesel Benzen Điểm sôi, °C 78,39 35-195 - 252,6 180-360 80,1 Điểm nóng chảy, °C -114,15 -259,1 5,53 20 Tỷ trọng, d4 , g/ml 0,79 0,70- 70,8 (lỏng) 0,79-0,86 0,876 0,78 4
  17. Nhiệt cháy ở 25°C, kJ/g 29,8 26,0 141,9 45,0 Nhiệt độ tự bốc cháy,°C 422,8 246°C 571°C 210°C 534 Giới hạn cháy trong không khí: - Dưới, vol% 4,3 1,4 4,0 1,3 - Trên, vol% 19,0 7,6 75,0 7,1 1.1.2. Tiềm năng sản xuất ethanol sinh học Ethanol sinh học trộn với xăng chế biến từ dầu thô để chạy xe. Sản xuất đủ ethanol thì thế giới sẽ giải quyết được vấn đề về năng lượng. Ngoài ra ethanol khi cháy thải ít khí nhà kính vào bầu khí quyển hơn là xăng chế biến từ dầu mỏ [8]. Ethanol là chất phụ gia để tăng trị số Octan (trị số đo khả năng kích nổ) và giảm khí thải độc hại của xăng. Trong chính sách năng lượng của mình, từ khối EU đến Mỹ, Trung Quốc, Australia, Nhật Bản đều chú trọng đến ứng dụng ethanol. Bên cạnh đó, thế giới đang lo ngại trữ lượng dầu mỏ toàn cầu đang có nguy cơ bị cạn kiệt. Trữ lượng dầu mỏ trên thế giới, qua nhiều thăm dò và nghiên cứu của những cơ quan khác nhau như: Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (1997), Báo Washington Post (1996), Kỷ yếu Năng lượng quốc tế 1998 (International Energy Annual), Phòng thống kê LHQ (1994) kết luận là trữ lượng dầu thô hiện chiếm vào khoảng 1.000 tỷ thùng (barrel) (1 barrel = 42 Gallon = 159 lít = 0,16 m3). Cũng theo ước tính của Cơ quan Địa chất Hoa Kỳ (US GS) thì với trữ lượng này, nhân loại chỉ có triển vọng sử dụng trong vòng 50 năm tới mà thôi. Ethanol đã được điều chế từ gạo, nếp, bắp từ hàng ngàn năm trước qua sự lên men rượu do vi khuẩn [9]. Hiện nay, với nhu cầu giải quyết nạn khan hiếm năng lượng xăng dầu và giảm thiểu ô nhiễm môi trường, ethanol quả thật là một nhu cầu cấp bách cho thế giới Ngoài ra, sự có mặt của ethanol trong xăng không chỉ giảm thiểu được một phần lượng xăng nhập khẩu mà còn góp phần không nhỏ vào việc giảm thiểu lượng lớn khí thải độc hại ra môi trường, hạn chế ô nhiễm môi trường, góp phần tăng khả năng đảm bảo an ninh năng lượng của một quốc gia, nhất là các quốc gia không có nguồn dầu mỏ [5]. 5
  18. 1.1.3. Sản xuất và sử dụng nhiên liệu sinh học Có thể nói, chương trình sản xuất nhiên liệu sinh học (ethanol) đang được thực hiện hoặc được chuẩn bị và sẵn sàng tại nhiều nước trên thế giới. Sản lượng ethanol trên thế giới trong những năm gần đây được trình bày trong bảng sau: Bảng 1.2 Sản lượng ethanol trên thế giới (Đơn vị triệu L) Khu vực 2008 2009 2010 2011 2012 Châu Âu 2,885 3,645 4,254 4,429 4,973 Châu Phi 65 100 130 150 235 Bắc và Trung Mỹ 35,946 42,141 51,584 54,765 54,580 Nam Mỹ 24,456 24,275 25,964 21,637 21,335 Châu Á/ Thái Bình Dương 2,753 2,927 3,115 3,520 3,965 1.1.4. Các nguyên liệu thường dùng để sản xuất ethanol ngày nay Dựa vào nguyên liệu sản xuất, nhiên liệu ethanol sinh học được chia làm 2 thế hệ: Thế hệ I: Thế hệ I được sản xuất từ các nguồn tinh bột như ngô, sắn, mía đường trong đó chủ yếu là tinh bột chứa amylose và một phần nhỏ là amylopectin. Tinh bột gồm amylose (10-20%) và amylopectin (80-90%) [9]. Amylose Amylose là polymer mạch thẳng của -D-glucose với liên kết -(1→4) có cấu trúc chặt chẽ. Amylopectin 6
  19. Amylopectin là polymer mạch thẳng, đa nhánh của glucose với liên kết -(1→4). Các mạch nhánh được tạo bởi các liên kết -(1→6). Khoảng từ 24 đến 30 glucose lại có một liên kết mạch nhánh. Tình hình sản xuất ethanol sinh học từ mía, đường Ngày 20/11/2007, Thủ tướng chính phủ đã ban hành quyết định số 177/2007/QĐ-TT về việc phê duyệt đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 nhằm mục tiêu “phát triển nhiên liệu sinh học, một dạng năng lượng mới tái tạo được để thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần đảm bảo an ninh lương thực và bảo vệ môi trường”. Trong 2-3 năm gần đây, việc sản xuất ethanol làm nhiên liệu đã được quan tâm với nhiều góc độ khác nhau về nghiên cứu cũng như sản xuất. Bảng 1.3: Một số dự án sản xuất ethanol tại Việt Nam Tên dự án Công suất Vốn đầu tư Nguyên liệu Nhà máy Ethanol Phú Thọ 100 triệu lít/năm 1.600 tỉ đồng 240 ngàn tấn sắn lát/năm Nhà máy Bio-ethanol Dung Quất 100 triệu lít/năm 1.600 tỉ đồng 240 ngàn tấn sắn lát/năm Nhà máy Bio-ethanol Bình Phước 100 triệu lít/năm 1.600 tỉ đồng 240 ngàn tấn sắn lát/năm Nhà máy Ethanol Đại Tân 125 triệu lít/năm > 900 tỉ đồng 300 ngàn tấn sắn lát/năm Nhà máy Ethanol Tùng Lâm 60 triệu lít/năm - - Tính đến cuối năm 2012, năng lực sản xuất ethanol nhiên liệu của cả nước đạt 535 triệu lít/năm, đủ để phối trộn 8,35 triệu tấn xăng E5 (5% ethanol) hoặc 4,17 triệu tấn xăng E10 (10% ethanol), đảm bảo đủ cung cấp cho thị trường cả nước. Theo lộ 7
  20. trình đã được Chính phủ phê duyệt, xăng sinh học E5 sẽ được phép pha trộn và tiêu thụ tại 7 tỉnh, thành phố như Hà Nội, Hải Phòng, TPHCM, Cần Thơ, Đà Nẵng, Bà Rịa - Vũng Tàu và Quảng Ngãi từ cuối năm 2014. Từ 1/12/2015 xăng E5 sẽ tiêu thụ đại trà trên cả nước. Điều này sẽ giúp các nhà sản xuất ethanol có được đầu ra. Vào năm 2007, khi các dự án sản xuất nhiên liệu sinh học được lập, giá sắn lát chỉ khoảng 1.200-1.500 đ/kg, đến năm 2011 giá sắn lát đã tăng lên 5.500- 5.800 đ/kg. Năm 2012 giá có giảm chút ít những vẫn khoảng 4.000-4.700 đ/kg. Nếu mỗi lít ethanol cần khoảng 2,4 kg sắn lát thì riêng giá vốn cho nguyên liệu chính đã là 11.280 đồng, cộng thêm các chi phí khác như: điện, phụ phẩm, lương lao động, khấu hao máy móc, lãi vay giá thành làm ra một lít ethanol khoảng 18.000-19.000 đồng/lít . Các công ty hiện nay chỉ đầu tư xây dựng các nhà máy sản xuất ethanol sinh học thế hệ I, sản xuất ethanol từ lương thực sắn, mía đường. Như vậy, chúng ta chỉ đầu tư vào những công nghệ đã lạc hậu trên thế giới. Điều này không chỉ lạc hậu về mặt khoa học công nghệ và còn tác động xấu tới chiến lược an ninh lương thực Quốc gia. Thế hệ II Thế hệ II được sản xuất từ sinh khối thực vật như các phế thải nông nghiệp của các loại thân cây lúa, ngô, lúa mỳ. Lignocellulose là thành phần chính cấu tạo nên sinh khối thực vật, chủ yếu bao gồm cellulose, hemicellulose, lignin. Thí dụ, trong sinh khối của thực vật như gỗ, cellulose có từ 30-50%, hemicellulose – 23- 32% và lignin – 15-25%. Hemicellulose gồm có Xylan (hemicellulose A) [5]. Cellulose Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-D-Glucose. Xylan (hemicellulose A) 8
  21. Xylan – polymer mạch thẳng của D-xylose với liên kết -(1 4) Arabinoxylan (hemicellulose B) có mạch phân nhánh. Thế hệ III Rong biển bao gồm 3 ngành rong: Lục, Đỏ và Nâu. Rong Đỏ chứa chất xơ fibrin khoảng 15-25%, galactan khoảng 50-70%, protein dưới 15% và lipid dưới 7% tổng trọng lượng khô. Rong Lục chứa chất xơ fibrin khoảng 5%, tinh bột 40-50%. Rong nâu chứa acid alginic khoảng 30-40% [15]. Agar là 1 polymer galactose có thể chuyển thành đường galactose và 3,6-anhydrogalactose. Fibrin gồm cellulose. Tinh bột là một polysaccharide của glucose, chất được tổng hợp từ carbohydrate ở trong lục lạp của thực vật và được dự trữ trong tế bào chất [6]. Galactose và Glucose có thể sử dụng như cơ chất cho quá trình lên men ethanol nhiên liệu. Quá trình đường hóa sẽ cho galactose, 3,6-anhydrogalactose, glucose, frucose Lựa chọn loại nguyên liệu nào phù hợp để sản xuất ethanol tùy thuộc vào điều kiện đất đai, khí hậu, chính sách phát triển của mỗi quốc gia. Các nguyên liệu chủ lực để sản xuất ethanol ở các nước như sau: Mỹ: bắp, Brazil: mía, Pháp: củ cải đường, Ấn Độ: mía, Việt Nam: sắn Tính theo diện tích canh tác, hiệu quả sản xuất ethanol từ củ cải đường cao nhất, có thể đạt 7.000 lít/ha, kế đến là mía và bắp. Tuy nhiên, sẽ thu được nhiều ethanol hơn khi lên men từ ngô, gần 400 lít/tấn hạt, trong khi củ cải đường chỉ đạt 100 lít/tấn. Dầu diesel sinh học được chế biến từ dầu thực vật và mỡ động vật. Vì vậy, nhiều nước đã tiến hành nghiên cứu trồng các loài cây nông, lâm nghiệp để cung cấp nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học. Các loài cây sau đây đang được sử dụng để cung cấp nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học. Với ưu thế về diện tích canh tác, Mỹ sử dụng ngô để sản xuất ethanol. Ấn Độ dùng cây Cọ dầu và Jatropha curcas L để sản xuất diesel sinh học. Uỷ ban phát triển nhiên liệu sinh học của Ấn Độ đề nghị trồng Cọ dầu trên diện tích 11,2 triệu ha đất thoái hoá, đất bỏ hoang và các loại đất khác. Từ năm 1975 Brazil đã có kế hoạch dùng mía làm nguyên liệu sản xuất cồn thay thế xăng và khuyến khích sử dụng nhiên liệu sinh học bằng các biện pháp như: sử dụng xăng để chạy xe phải pha một tỷ lệ ethanol nhiên liệu, đầu tư trồng và cải tạo giống mía để sản xuất nhiên liệu sinh học, cải tiến công nghệ sản xuất 9
  22. ethanol, nghiên cứu sản xuất ô tô chạy bằng ethanol, miễn giảm thuế sản xuất và tiêu thụ ethanol [8]. Các nước EU sử dụng đậu tương, hạt cải dầu và dầu mỡ phế thải từ động, thực vật để sản xuất nhiên liệu sinh học. Thuỵ Điển dự kiến sau 2020, ethanol sinh học từ cellulose sẽ thay thế toàn bộ nhiên liệu hoá thạch nhằm chấm dứt phụ thuộc vào dầu mỏ. Cách đây không lâu tại Indonesia chiếc xe ô tô đầu tiên chạy bằng 100% nhiên liệu sinh học chế biến từ hạt cây Jatropha đã hoàn tất cuộc chạy thử 3200 km ở tỉnh Tây Timor. Như vậy, hiện nay trên thế giới cũng như trong khu vực các loài cây mía, sắn thường được dùng để sản xuất ethanol sinh học còn cọ dầu và Jatropha dùng để sản xuất diesel sinh học, trong đó Jatropha đang được quan tâm ở nhiều nước. 1.1.5. Lên men sản xuất ethanol Ở nước ta, trong những năm gần đây, sản lượng lương thực đạt gần 40 triệu tấn/năm, phế thải nông nghiệp ước tính chừng 80 -100 triệu tấn. Phế thải nông nghiệp là dạng sinh khối chủ yếu chứa các polysaccharide (cellulose, hemicellulose) bỏ lãng phí không được sử dụng một cách có hiệu quả [5]. Việc tái sử dụng các loại phế thải này như một nguồn năng lượng tái tạo là một vấn đề có nhiều ý nghĩa trong khi các nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Một trong các hướng tái sử dụng các loại phế thải chứa các polysaccharide (cellulose, hemicellulose) này (gọi chung là lignocellulose) là lên men chuyển thành nhiên liệu sinh học ethanol thế hệ II. Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu sản xuất ethanol từ sinh khối. Sinh khối là phế thải của nông nghiệp như thân cây ngô, sắn, thân cây lúa mì, mía đang trở thành đối tượng có nhiều tiềm năng để sản xuất ethanol sinh học. Thân cây ngô và các loài thân gỗ khác cũng đang được chú ý. Thân gỗ các loài thông là loại sinh khối được chú ý nhiều để lên men sản xuất ethanol. Đặc biệt, ở Bắc Mỹ các loài thông (lodgepole pine) Pinus contorta mọc rất nhiều, có thể cao tới 50m, đường kính đạt 2m cho khối lượng gỗ rất nhiều, nên là nguồn nguyên liệu rất dồi dào để sản xuất ethanol từ sinh khối. 10
  23. Tuy nhiên, việc sản xuất ethanol dựa trên nguyên liệu từ các loài cây trồng nông nhiệp như trên đều ảnh hưởng đến giá lương thực và thực phẩm, nguồn nước ngọt, đất canh tác, cũng như ảnh hưởng đến sự nghèo kiệt và xói mòn đất. Để tháo gỡ vấn đề này, các nhà khoa học đã tìm kiếm và nhận thấy rằng sinh khối rong biển có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu thay thế để sản xuất ethanol sinh học [8]. Quá trình lên men sản xuất ethanol từ sinh khối rong biển ngoài các khâu tiền xử lý nguyên liệu, gồm 2 giai đoạn chính: Thủy phân nguyên liệu (đường hóa) và lên men: Thủy phân (đường hóa) là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành các sản phẩm trung gian tan như các oligosaccharide, các đường đơn chủ yếu như glucose. Lên men là quá trình chuyển hoá các sản phẩm trung gian tan thành ethanol Phương pháp lên men ethanol “Thủy phân và Lên men riêng biệt” và “Đường hóa và Lên men đồng thời” Sản xuất ethanol từ sinh khối rong biển có thể thực hiện bằng phương pháp “Thủy phân và Lên men riêng biệt” (separate hydrolysis and fermentation – SHF) hoặc bằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời” (simultaneous saccharification and fermentation - SSF). Trong phương pháp “Thủy phân và Lên men riêng biệt” hai giai đoạn: thủy phân (đường hóa) và lên men ethanol được tiến hành nối tiếp nhau trong hai bình phản ứng riêng biệt (thủy phân có thể tiến hành trong bình thứ nhất. Sản phẩm của giai đoạn này được chuyển sang bình thứ hai để lên men) hoặc trong cùng một bình phản ứng (khi giai đoạn thủy phân kết thúc thì bắt đầu giai đoạn lên men). Khi thực hiện phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời” hai giai đoạn trên được tiến hành đồng thời trong cùng một bình phản ứng (giai đoạn lên men được bắt đầu ngay sau khi sản phẩm của giai đoạn thủy phân hình thành). Một ưu điểm rõ nét nhất của phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời” là sản phẩm của giai đoạn đầu (glucose sinh ra trong thủy phân nguyên liệu) không tích lũy nhiều trong bình phản ứng, không gây nên hiện tượng ức chế giai đoạn sau (lên men ethanol). Đã có nhiều nghiên cứu và thực nghiệm chứng minh rằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời”, trong nhiều trường hợp, có nhiều ưu điểm hơn so với phương pháp “Thủy phân và Lên men riêng biệt”. 11
  24. Nhưng để thực hiện “Đường hóa và Lên men đồng thời” cần chú ý rằng, trong sản xuất nhiên liệu sinh học - ethanol từ sinh khối rong biển, giai đoạn thủy phân có nhiệt độ tối ưu trong khoảng 45 - 50оC. Như vậy, để sản xuất nhiên liệu sinh học - ethanol có hiệu quả bằng phương pháp “Đường hóa và Lên men đồng thời”, cần phải lựa chọn các chủng vi sinh vật lên men hoạt động có hiệu lực cao tại nhiệt độ nêu tối ưu cho giai đoạn thủy phân. Các chủng vi sinh vật đáp ứng được yêu cầu ấy thường là các nấm men chịu nhiệt. 1.2. RONG BIỂN 1.2.1. Giới thiệu chung Việt Nam có hệ động, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều nguồn gen qúy hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm. Một trong những điều kiện tạo nên sự phong phú và giàu có ấy chính là doViệt Nam có vùng biển nhiệt đới với diện tích rộng hơn 3,5 triệu km2 và đường bờ biển dài hơn 3600 km bao bọc hết phía đông và phía nam đất nước. Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và giàu có của vùng biển chúng ta chính là rong biển [15]. Rong biển (tên tiếng Anh là marine-alage, marine plant hay seaweed) là thực vật thủy sinh có đời sống gắn liền với nước. Chúng có thể đơn bào, đa bào sống thành quần thể, có kích thước hiển vi hoặc có thể dài hàng chục mét. Hình dạng có thể là hình cầu, hình sợi, hình phiến lá hay hình thù rất đặc biệt. Rong biển thường phân bố ở các vùng nước mặn, nước lợ, cửa sông, vùng triều sâu, vùng biển cạn Chúng hấp thụ một lượng thức ăn phong phú hay trôi dạt từ lục địa ra. Đời sống của rong biển phụ thuộc vào các yếu tố: địa bàn sinh trưởng, nhiệt độ, ánh sáng, độ muối, độ pH, muối dinh dưỡng, khí hòa tan, mức triều, sóng, gió, hải lưu [18]. Trên thế giới, việc nghiên cứu về rong biển đã được tiến hành từ thế kỷ 18, vào thời kỳ đó cũng có những công trình công bố về rong biển thuộc vùng biển Việt Nam. Đó là những công trình điều tra, nghiên cứu về sinh thái, sinh học của rong. Việc nghiên cứu sử dụng rong biển mới được đẩy mạnh trong thế kỷ 20. 1.2.2. Hình thái - Phân loại các loài rong biển ở Việt Nam So với các nước vùng Đông Nam Á, nước ta thuộc vào nước có nguồn rong biển phong phú và đa dạng. Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, các tác giả Việt Nam đều cùng một quan điểm xếp chúng vào 4 ngành 12
  25. trong hệ thống phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977: rong Lam Cyanophyta; rong Đỏ Rhodophyta; rong nâu Phaeophyta và rong Lục Chlorophyta. 10 ngành rong theo phân loại của Gollerbakh là: - Rong Lam – Cyanophyta. - Rong Giáp – Pyrophyta. - Rong Vàng ánh – Chrysophyta. - Rong Khuê - Bacillariophyta. - Rong nâu – Phaeophyta. - Rong Đỏ - Rhodophyta. - Rong Vàng - Xanthophyta. - Rong Mắt – Euglenophyta. - Rong Lục – Chlorophyta. - Rong Vòng – Charophyta. Trong đó, ba ngành có giá trị kinh tế cao là rong Lục, rong nâu, rong Đỏ. Ngành rong Lục: có trên dưới 360 chi và hơn 5.700 loài, nét đặc trưng của loài rong này là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột. Rong có dạng tế bào đơn giản hoặc phức tạp, nhiều tế bào hình phiến hay dạng sợi, chia nhánh hoặc không chia nhánh. Trừ một số trường hợp rong chỉ là tế bào trần không có vỏ còn lại đại đa số có vỏ riêng như chất pectin hay cellulose. Ngành rong nâu: Có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số chi, loài tìm thấy trong nước ngọt không nhiều lắm. Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn thành dạng cây có gốc, rễ, lá, thân. Rong sinh trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các rong. Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt. - Ngành rong Đỏ: có 2.500 loài, gồm 400 chi, thuộc nhiều họ, phần lớn sống ở biển, có cấu tạo từ nhiều tế bào, trừ một số dạng từ một tế bào hay quần thể. Rong có dạng hình trụ dẹp dài, phiến chia hoặc không chia nhánh. Sinh trưởng chủ yếu ở đỉnh, ở giữa đốt hay phân tán. Đặc trưng của loài này là chứa nhiều sắc tố đỏ. 13
  26. Các dạng carbohydrate trong 3 ngành rong nâu [87] được thể hiện trong bảng sau: Bảng 1.4. Các dạng carbohydrate trong 3 ngành rong biển. Carbohydrate Đỏ Lục Nâu Cellulose Cellulose Cellulose Hemopolysaccharide Xylan Xylan - Mannan Mannan - Agar Hetero - complex Alginate Carrageenan Ion/trung tính Fucoidan Heteropolysaccharide Carragar - - Xylan sulfate hóa - - Các loại khác - - Tinh bột Tinh bột Laminaran Trong tế bào Floridean Floridosid - Mannitol Dạng khối lượng Iso-floridosid - - phân tử thấp Sorbitol - - 1.2.3. Phân bố, khai thác sản xuất rong biển Xét về số lượng các loài rong, thì rong lục (Chlorophyta) trên thế giới chủ yếu phân bố tập trung tại Philippin, tiếp theo là Hàn Quốc, kế tiếp là Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài Caulerpa racemosa, Ulva reticulata, Ulva lactuca. Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước bao gồm: Achentina, Bangladesh, Canada, Chile, Pháp, Hawaii, Israel, Italy, Kenya, Malaysia, Myanmar, Bồ Đào Nha, Thai Lan Rong đỏ (Rhodophyta) phân bố nhiều ở Việt Nam bao gồm một số loài như: Betaphycus gelatinum, Calaglossa leprieurii, Gelidiella acerosa, Gigartinaintermedia, Gloiopeltis spp., Gracilaria spp., Gracilaria asisatica, Gracilariacoronopifera, Gracilaria eucheumoides, Gracilaria firma, Gracilariaheteroclada, Gracilaria salicornia, Gracilaria tenuistipitata var. liui, Hypneamuscoides, Hypnea valentiae, Kappaphycus cottonii, Porphyra crispata, Porphyra suborbiculata, Acanthophora spicifera. Sau đó cùng với số lượng loài 14
  27. tương đương nhau ở Nhật Bản, Chile, Indonesia, Philippin, Canada, Hàn Quốc tiếp theo sau là Thái Lan, Brazil, Pháp, Bồ Đào Nha, Trung Quốc, Hawaii, Myanmar, Nam Phi, ít hơn nữa là Anh, Bangladesh, Caribbe, Ireland, Peru, Tây Ban Nha, Achentina, Ấn Độ, Italy, Malaysia, Mexico, New Zealand, Mỹ, rải rác có mặt ở Iceland, Alaska, Kenya, Madagascar, Kiribati, Ai Cập, Israel, Namibia, Tanzania. Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Hệ thống phân loại Sargassum spp. trên thế giới rất phức tạp, năm 1753 ba loài thuộc chi Fucus: Fucus natans, F. acinarius và F. lendigerus do Linnaeus mô tả lần đầu tiên nay được thay thế bằng chi Sargassum. Giữa những năm 1808 đến 1819, 36 loài rong thuộc chi Fucus được mô tả ngày nay cũng được chuyển sang chi Sargassum, năm 1820 J. Agardh giới thiệu chi Sargassum với số loài lúc này là 62 loài. Sau thời gian đó rất nhiều tác giả khác tiếp tục giới thiệu về Sargassum như Yendo (1907), Reinbold (1913), Grunow (1915, 1916) và Setchell (1931). Số loài Sargassum lên đến 230. Năm 1954 Womersley công bố hệ thống phân loại Sargassum của mình ở Úc, cùng với các tác giả đương thời ở nhiều vùng khác nhau trên thế giới như Phạm Hoàng Hộ của Việt Nam, Chou, Chiang của Taiwan và Ang, Trono của Philippin [6], đến nay tổng số loài của chi Sargassum đã lên đến hơn 500. Sargassum tại Việt Nam hiện nay có khoảng 70 loài (theo Thực vật chí Việt Nam), số lượng loài Sargassum phân bố trên các nước luôn thay đổi theo các nghiên cứu gần đây nên khó có thể kết luận hiện nay Sargassum phân bố nhiều nhất ở nước nào. Riêng tính đến 1998 thì nhiều nhất là ở Ấn Độ, Philippin và Việt Nam. Phân bố về số loài rong biển tuy đã được tổng kết sơ bộ, tuy nhiên, tuỳ theo diện tích lãnh hải, điều kiện môi trường phát triển, kỹ thuật nuôi trồng khác nhau của các nước mà sản lượng rong biển trên thế giới khác với phân bố các loài rong. Rong biển đã được sử dụng từ rất sớm, khoảng 2700 năm trước công nguyên ở Trung quốc. Sze Teu đã viết rằng 600 năm trước công nguyên, rong biển đã được chế biến thành một món ăn quí dành cho vua chúa [18]. Thuốc “trường sinh bất tử” được vị hoàng đế đầu tiên của Trung Hoa là Tần Thuỷ Hoàng sử 15
  28. dụng vào năm 200 trước Công nguyên đã được khoa học hiện đại chứng minh đó chính là thành phần của rong nâu sau hơn 2000 năm. Tại Nhật rong nâu đã được sử dụng làm thức ăn từ thế kỷ thứ V, cuối năm 2001 cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm đã xem xét và cấp phép cho các sản phẩm thực phẩm chức năng của Nhật được bổ sung thêm thành phần fucoidan để tăng cường hệ miễn dịch, giảm cholesterol, giảm mỡ máu và trở thành thực phẩm hỗ trợ trị bệnh nan y phổ biến của nước Nhật [88]. Rong biển đã được dùng làm thực phẩm trên toàn thế giới rất quen thuộc với chúng ta (rong đỏ: agar, carrageenan, rong nâu: alginate), chúng cũng là nguồn bổ sung dưỡng chất (protein, vitamin, khoáng vi lượng) cho thức ăn nuôi tôm, thức ăn gia súc, được dùng trong công nghiệp dệt, nhuộm, mực in, sơn, hàn điện, lọc và hấp phụ các hợp chất, công nghiệp giấy, trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh, điện di, agar, nó còn là nguyên liệu không thể thiếu cũng như trong công nghiệp nước giải khát và đồ hộp, socola, mỹ phẩm cao cấp (carrageenan), ngoài ra rong biển còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng với chất oligo alginate, laminaran (rong nâu) cùng các hợp chất như auxin, gibberelin, cytokinin (trong hầu hết các ngành rong). Rong biển còn được sử dụng chữa trị ung thư theo các bài thuốc gia truyền dưới dạng dùng kết hợp với các thuốc khác [26] và polyphenol trong rong nâu cũng được dùng làm trà chống lão hoá. Đặc biệt trong thời gian gần đây tại trung tâm đăng ký phát minh sáng chế của Mỹ đã có qui trình sản xuất biodiesel từ rong. Rong biển thuộc vào loại những tài nguyên quý hiếm, có vai trò quan trọng và là một trong những nguồn lợi kinh tế lớn trong nền kinh tế biển. 1.2.4. Tổng quan về rong nâu 1.2.4.1. Nguồn gốc, đặc điểm Rong nâu là một trong các loại rong biển, sinh sống ở biển là chủ yếu. Rong nâu có nhiều loài, có độ đậm nhạt của màu nâu khác nhau do sự khác nhau về các thành phần sắc tố trong cấu tạo. Cây rong sẽ tùy vào từng loại sẽ có độ dài khác nhau nhưng đều là loài rong to, mọc thành bụi, gồm vài chục chính quanh nhánh, nhánh mang phiến có dạng lá, phiến có răng mịn, hầu như các loài rong nâu đều có phao, tuy nhiên số lượng và kích thước của phao khác nhau, hình dạng của phao 16
  29. là hình cầu hay trái xoan, đường kính của phao nhỏ khoảng 0,5-0,8 mm, phao lớn khoảng 5-10 mm. 1.2.4.2. Điều kiện sinh trưởng và phát triển Là loài mọc ở những vùng biển ấm nóng, trên nền đá vôi, san hô chết, nơi sóng mạnh và nước trong, nhất là ven các đảo. Chúng mọc trên tất cả các loài vật bám cứng, trên vách đá dốc cứng, trên các vách đá dốc đứng, các bãi đá tảng. Trên các bờ dốc đứng, chúng phân bố thành các đai hẹp ở các mức thủy triều thấp đến sâu khoảng 0,5 m. Đa số chúng thích mọc ở nơi sóng mạnh, ở các đảo, bờ phía đông chúng mọc dày và phong phú hơn bờ phía tây. Ở các bãi đá hướng ra biển khơi, chúng phát triển mạnh và có số lượng nhiều hơn. Chúng sinh trưởng mạnh vào các tháng 2-3, đa số các loài có kích thước tối đa vào tháng 3-4 và hình thành cơ quan sinh sản, sau đó bị sóng biển nhổ đánh tấp vào bờ và tàn lụi. Đến tháng 7 các bãi rong đều trơ. 1.2.4.3. Thành phần hóa học của rong nâu Sắc tố Sắc tố trong rong nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố (Xantophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tùy theo tỷ lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu - vàng nâu - nâu đậm - vàng lục. Nhìn chung sắc tố của rong nâu khá bền. Carbohydrate a. Monosaccharide Mannitol: có công thức là HOCH2-(CHOH)4–CH2OH Mannitol thuộc nhóm đường kép của rong nâu, được phát hiện đầu tiên vào năm 1884 và nghiên cứu sâu hơn vào năm 1913. Mannitol cũng là một thành phần đáng chú ý trong rong mơ. Ở trong rong Việt Nam hàm lượng này nằm trong khoảng 3,20 – 17,68% (trọng lượng rong khô). Trong đó rong Sargassum mcclurei có hàm lượng cao nhất (7,66 - 17,68%). Cũng như các hợp chất khác trong rong, mannitol tích lũy trong rong thay đổi theo mùa và nơi sống. Các kết quả nghiên cứu cho thấy rong ở vùng biển phía Nam có hàm lượng mannitol cao hơn ở phía Bắc [11]. Hàm lượng này thường cao vào các tháng 17
  30. mùa hè và có xu hướng tăng dần theo thời gian sinh trưởng của rong. Một số tác giả cũng đã nghiên cứu và đề xuất quy trình chiết tách mannitol ở quy mô phòng thí nghiệm dựa trên nguyên tắc: làm lạnh dung dịch mannitol sau khi đã được chiết bằng cồn nóng để thu các tinh thể mannitol [11]. Mannitol được sử dụng nhiều trong dược phẩm, trong công nghiệp để làm nguyên liệu tổng hợp một số chất hữu cơ, làm thuốc nổ, diêm và trong công nghiệp thực phẩm đặc biệt là trong công nghiệp bánh kẹo để sản xuất các loại bánh gato có độ ngọt cao nhưng đảm bảo độ mềm và xốp của bánh. b. Polysaccharide Alginic: Acid alginic với công thức tổng quát (C6H8O6)n là một polysaccharide làm nguyên liệu cấu tạo thành tế bào của các loài rong biển thuộc ngành Phaeophyta. Khi được chiết ra khỏi tế bào của rong biển thì polysaccharide này có thể ở dạng acid hoặc dạng muối (alginate) tùy thuộc vào điều kiện chiết tách [24]. Alginate là tên gọi chung họ các muối của acid alginic. Alginate được khám phá đầu tiên ở Anh vào năm 1883 và đến năm 1896 mới tách được ở dạng tinh khiết [23]. Alginate tồn tại khá phong phú trong tự nhiên, trong thành phần cấu trúc trong rong nâu lên đến 40% khối lượng khô và dưới dạng các polysaccharide vỏ ngoài của vi khuẩn đất. Gần đây đã có một số kết quả nghiên cứu theo hướng sản xuất alginate bằng phương pháp vi sinh cũng như bằng phương pháp biến tính polymer hóa phân tử alginate. Tuy nhiên, toàn bộ alginate thương mại hiện nay vẫn lấy từ nguồn tách ra từ rong biển [21]. Alginate là một polysaccharide mạch thẳng có phân tử lượng lớn từ 105 - 106 Da tùy thuộc vào từng loại rong biển và phương pháp chiết tách. Người ta đã thu được alginate thương phẩm có khối lượng phân tử lên đến 150.000 Da với độ polymer hóa là 750 [119], [120]. Về mặt cấu trúc, alginate là co-polymer của acid  -D- mannuronic (ký hiệu là M) và acid -D-guluronic (ký hiệu là G) qua liên kết glycoside 1 4. Cấu tạo của 2 polymer theo công thức cổ điển Haworth được chỉ ra trên hình 1.1, theo công thức này, 2 polymer chỉ khác nhau ở chỗ nhóm carboxyl nằm ở trên và dưới mặt phẳng của vòng pyranose [24]. 18
  31. Acid β-D-mannuronic Acid α-D-mannuronic Hình 1.1. Công thức Haworth của hai gốc polymer trong phân tử acid alginic Hai polymer này gắn với nhau bằng các liên kết 1 4 glycoside. Nhưng sự kết hợp này không phải là ngẫu nhiên mà thành 3 loại chuỗi như sau (hình 1.2): Chuỗi homopolymannuronic: gồm các gốc mannuronic MMMMMM Chuỗi homopolyguluronic: gồm các gốc guluronic GGGGGG Chuỗi luân phiên: 2 gốc luân phiên nhau MGMGMGM Hình 1.2. Công thức cấu tạo của alginate Trong phân tử alginate, các gốc acid -D-mannuronic và acid -D-guluronic này có thể kết hợp với nhau tạo thành các block kiểu M-block, G-block và MG- block. Thành phần và cấu trúc của các block này ảnh hưởng trực tiếp đến tính chất alginate [105]. 19
  32. a) polymer, b) cấu trúc không gian, c) cẩu trúc chuỗi Hình 1.3. Cấu trúc của alginate Ở dạng acid hay muối kết hợp với các ion kim loại hóa trị 2 trở lên, polymer này không tan trong nước nhưng có khả năng hút nước rồi trương nở tạo thành thể + + + gel. Khi kết hợp với các cation hóa trị một như Na , K , NH4 , alginate tan trong nước tạo thành các dung dịch có độ nhớt cao. Các muối alginate tan trong nước được sử dụng như các chất làm tăng độ nhớt, các chất ổn định và các tác nhân tạo màng trong các ngành công nghiệp dược, thực phẩm, dệt và công nghiệp giấy [16]. Fucoidan: Năm 1913, Kylin tìm ra một loại fucoidan đầu tiên, sau đó cấu trúc của nhiều loại fucoidan của nhiều loại rong nâu được tìm ra [73], [97]. Theo IUPAC, fucan sulfate hóa là một polysaccharide có nền chính là L-fucose sulfate hóa với các đường đơn khác nhỏ hơn 10%. Fucan sulfate hóa của rong nâu thường được gọi là fucoidan [44]. Cấu trúc của fucoidan trong rong biển là vô cùng phức tạp và không giống nhau với những thay đồi trong liên kết, sự phân nhánh, vị trí nhóm sulfate và các loại đường đơn khác nhau trong polysaccharide [62], [100]. Cấu trúc của fucoidan còn phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng. Vì vậy, cho tới nay, việc làm sáng tỏ cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề khó khăn, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật NMR phân giải cao mới nhất [64], [90]. Trong rong nâu, fucoidan chiếm hàm lượng khoảng 0,6 - 4%, alginate chiếm hàm lượng khoảng 40% và mannitol chiếm khoảng 3,1-17% trọng lượng khô, cấu trúc của nó thay đổi theo loài nhưng thành phần chính vẫn là fixcose và sulfate [12]. 20
  33. Fucoidan là một polysarccharide sulfate hóa, có cấu tạo chủ yếu từ α -L- fucose sulfate, ngoài ra còn có các tỷ lệ khác nhau của các đường đơn khác là D- galactose, D-mannose, D-xylose, acid uronic và sulfate. Nhóm sulfate tham gia trong cấu trúc của fucoidan gắn vào vị trí C-4 (tới 30% trong mắt xích fucose) [47]. Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của một loại fucoidan được chiết tách từ rong nâu Conchie và Percival [47] đã chiết fucoidan bằng nước sôi trong 24 giờ, xác định được trong dịch thủy phân từ Fucus vesiculosus, Fucus spiralis, Himanthalia lorea và Laminaria cloustoni ngoài fucose còn có acid uronic, galactose, xylose, với tổng sulfate 32,4%. Lần đầu tiên đã xác định được cấu trúc của một phân đoạn fucoidan, đó là flican polysulfate, với liên kết 1 2 glycoside và sulfate ở vị trí C-4. Cấu trúc này được khẳng định lại một lần nữa bởi O' Neill [95]. Hình 1.5. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan Gần đây một số dạng cấu trúc khác của fucoidan đã được công bố. Năm 2001, Marais và các cộng sự [83] đã tìm ra cấu trúc fucoidan từ rong nâu Ascophyllum nodosum có công thức với mạch fucan có liên kết 1 3, 1 4, nhánh 1 2 và nhóm 21
  34. sulfate ở vị trí C-2, C-3. Trong khi đó vào năm 2007, Roogis Daniel và cộng sự [49] tìm được cấu trúc fucoidan của loài rong này với nhóm sulfate chỉ ở vị trí C-2. Laminarin: Laminarin có hàm lượng từ 10-15% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào loại rong, vị trí địa lý và môi trường sinh sống của rong nâu. Cellulose: là thành phần tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng cellulose trong rong nâu nhiều hơn trong rong đỏ. Protein Protein của rong nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo. Do vậy rong nâu có thể dùng làm thực phẩm. Protein của rong nâu thường ở dạng kết hợp với iot tạo nên iot hữu cơ như: Mono IodInzodizin. Iot hữu cơ rất có giá trị trong y học. Do vậy rong nâu còn được dùng làm thuốc phòng chống bệnh bướu cổ. Hàm lượng protein rong nâu vùng biển Nha Trang dao động từ 8,05- 21,11% so với trọng lượng rong khô. Chất khoáng Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong nâu thường lớn hơn nước biển. Hàm lượng khoáng của các loài rong nâu Nha Trang dao động từ 15,51- 46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng. Ngoài ra trong rong nâu còn có mặt các chất khác như acetogenin, polyphenolic, terpenoids, lipid Rong nâu phân bố tại Việt Nam chủ yếu là rong mơ bao gồm các loài Sargassum spp. và turbinaria spp 1.2.4.4. Tình hình chế biến và nghiên cứu ứng dụng các sản phẩm từ rong nâu Rong biển được sử dụng chế biến rộng rãi trong công nghệ thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, hóa học, mỹ phẫm và dược phẩm. Công nghệ chế biến các sản phẩm từ rong biển chủ yếu ở các nước ở châu Á như: Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Triều Tiên, Indonesia Mỹ, Canada và một số nước châu Âu như Pháp, Đức đang cố gắng thiết lập sản xuất rong biển ở quy mô lớn [22]. Giá trị công nghiệp của rong biển là cung cấp các chất keo quan trọng như agar, alginate, carrageenan, furcellazan dùng cho thực phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác. Các loại keo rong biển là các loại polysaccharide có tính keo khi hòa tan trong nước, được chiết suất từ rong biển. Từ rong nâu có thể chiết suất được: alginic, alginate, laminarin. Keo alginate, agar và carrageenan được chiết rút từ khoảng 1.300.000 tấn rong tươi các loại. Tổng sản lượng keo rong biển gồm: 35.000 tấn alginate, 25.000 tấn carrageenan và 10.000 tấn agar, với tổng giá trị lên đến 750 triệu USD [18]. 22
  35. Ở nước ta cũng đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng các hợp chất được chiết rút từ rong nâu. Cụ thể là các đề tài “Nghiên cứu sử dụng Iod chiết rút từ rong nâu để phối chế nước mắm Iod”, “Nghiên cứu hoàn thiện và cải tiến quy trình công nghệ sản xuất Alginate Natri” của tác giả Trần Thị Luyến [32]. Ngày nay, các hợp chất khác có hoạt tính sinh học của rong nâu như mannitol, fucoidan cũng đang được nghiên cứu rộng rãi. 1.3. PHẾ THẢI NÔNG NGHIỆP: RƠM, RẠ Ở VIỆT NAM 1.3.1. Phế thải nông nghiệp Năm 1977, tại Ấn Độ có 38,6 triệu ha đất trồng lúa đã thu hoạch 42,8 triệu tấn lúa và 81 triệu tấn phế thải nông nghiệp, bao gồm 66 triệu tấn rơm, rạ và 15 triệu tấn trấu (husks-vỏ hạt lúa) [5] . Tình hình ở Việt Nam cũng tương tự: diện tích đất trồng lúa năm 2007 là 7,3 triệu ha, tăng 20% so với năm 1977 nhưng sản lượng lúa tăng gấp hơn 3 lần năm 1977 và đạt 35,5 triệu tấn thóc. Với sản lượng lúa như vậy, theo kinh nghiệm nêu trên của Ấn Độ “khối lượng phế thải nông nghiệp sẽ gấp gần 2 lần sản lượng lúa” thì lượng phế thải nông nghiệp ước tính sẽ thu được khoảng 70 - 80 triệu tấn. Như vậy, một cách tương đối có thể cho rằng khối lượng phế thải nông nghiệp (rơm rạ) tăng tuyến tính với sản lượng lúa. 1.3.2. Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp Thành phần của các phế thải nông nghiệp chứa chủ yếu là cellulose, hemicellulose và số ít các hợp phần khác [5] (bảng 1.5). Bảng 1.5 Thành phần hóa học của phế thải nông nghiệp (%) Thành phần hóa học Rơm, rạ Trấu Cellulose 43 35 Hemicellulose 25 25 Lignin 12 20 Protein thô (N x 6.25) 3-4 3 Hàm lượng tro 16-1 17 (silic 83%) (silica 94%) 23
  36. Tính chất và đặc trưng cấu trúc của cellulose Cellulose là thành phần cơ bản của vách tế bào thực vật và có lẽ là hợp chất sinh học phong phú nhất trên trái đất, hàng năm được tạo thành với khối lượng lớn đến mức vượt tất cả các sản phẩm tự nhiên khác. Theo tính toán của một số tác giả khác nhau, sinh khối thực vật của trái đất là 2-3.1012 tấn trong đó cellulose chiếm 40%. Do vậy, tổng lượng cellulose của toàn thế giới là 7-8.1011 tấn, còn lượng cellulose tạo thành hàng năm là 4.1010 tấn [5]. Trong vách tế bào thực vật cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt chẽ với các polysaccharide khác: hemicellulose, pectin, ligin tạo thành những phức hợp bền vững. Hàm lượng cellulose trong xác thực vật thường thay đổi trong khoảng 50 - 80%, trong giấy là 61%, trong trấu là 31%, bã mía là 46% (tính theo trọng lượng khô), trong sợi bông hàm lượng này vượt trên 90% (bảng 1.6). Bảng 1.6 Cellulose tinh khiết trong nguyên liệu [5] Nguyên liệu % Cellulose tinh khiết Sợi bông 90 – 99 Cây lanh 70 – 75 Cây gai dầu 75 – 80 Đay 60 – 65 Bông gạo 70 – 75 Gai (cây) 70 – 75 Phế thải nông nghiệp 40 – 50 Thân cây ngô, lúa Rơm lúa mì 48 Rơm lúa nước 43 Cây dứa sợi 40 – 45 Bã mía 42 Tre 40 – 50 Gỗ 40 – 50 Mùn cưa 38 Vỏ hạt bông 42 Cỏ 33 Lõi ngô 29 24
  37. Cellulose, có công thức: (C6H10O5)n là polymer mạch thẳng của β-D-glucose với liên kết -(1 4) (gọi là polysaccharide), cấu tạo từ 10.000 - 20.000 gốc glucose, nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucosid. Kiểu liên kết này đối lập với liên kết α-1,4-glucosid có trong tinh bột, glycogen và các carbohydrate khác. Cellobiose là đơn vị cấu trúc lặp lại của cellulose gồm có 2 gốc glucose [64]. Cellulose Xylan – Hemicellulose A Arabinoxylan Hemicellulose B Hình 1.6 Cấu trúc của phân tử cellulose và hemicellulose Phân tử cellulose chứa 3 dạng anhydroglucose. Dạng thứ nhất có đầu khử với nhóm bán acetal tự do (hoặc aldehyd) ở C-1. Dạng thứ hai có đầu không khử với nhóm hydroxyl tự do ở C-4 và dạng thứ 3 có vòng nối giữa C-1 và C-4 [67]. Không giống như các alcohol đơn giản, phản ứng thủy phân cellulose bị kiểm soát nhiều bởi yếu tố không gian hơn so với khả năng phản ứng được dự tính theo tính chất vốn có của các nhóm hydroxyl trong vòng anhydroglucose. 25
  38. Các nhóm hydroxyl của gốc glucose ở mạch này tạo liên kết hydro với nguyên tử oxy của mạch khác giữ cho các mạch ở bên cạnh nhau một cách vững chắc, hình thành nên các vi sợi (microfibril) với độ bền cao. Đặc điểm quan trọng và đặc trưng của cellulose tự nhiên đó là cấu trúc không đồng nhất, gồm hai phần. Phần cellulose có cấu trúc tinh thể với trật tự cao rất bền vững và phần có cấu trúc vô định hình không chặt chẽ kém bền vững (hình 1.7). - Vùng kết tinh có trật tự cao và rất bền vững với các tác động bên ngoài - Vùng vô định hình có cấu trúc không chặt chẽ do đó kém bền vững hơn vùng kết tinh vùng vô định hình vùng kết tinh Hình 1.7. Cấu trúc không đồng nhất của phân tử cellulose Cellulose có cấu trúc tinh thể là cellulose chỉ tạo nên từ polymer glucose. Cellulose có cấu trúc tinh thể (Cellulose microcrystalline) còn gọi là α cellulose hoặc “cellulose thực”. Khi cho tác động với dung dịch 17,5% NaOH ở 20°C, cellulose tinh thể (α cellulose) có đặc trưng là không tan, phần tan trong dung dịch này là β cellulose và γ cellulose, β cellulose kết tủa khi cho thêm acid, phần còn lại không kết tủa với acid là γ cellulose. β cellulose gọi là hemicellulose A (xylan), γ cellulose gọi là hemicellulose B (Arabinoxylan) [67]. Cellulose của bông có trật tự cao nhất, tuy vậy, trong cấu trúc lượng đường glucose chỉ đạt 90%, còn lại là các đường xylose, arabinose và rất ít rhamnose. Vùng vô định hình có thể hấp thụ nước và trương lên, còn vùng kết tinh mạng lưới liên kết hydrogen ngăn cản sự trương này. Trong tự nhiên, các chuỗi glucan của cellulose có cấu trúc dạng sợi. Mỗi đơn vị sợi nhỏ nhất có đường kính khoảng 3 nm. Các sợi sơ cấp hợp lại thành vi sợi có đường kính 10 – 40 nm, dài 100 - 40000 nm và bao gồm đến 40 chuỗi cellulose [78]. Những vi sợi này hợp thành bó sợi to có thể quan sát dưới kính hiển vi quang học. Toàn bộ bó sợi có một lớp vỏ hemicellulose và lignin bao bọc bên ngoài làm 26
  39. cho sự xâm nhập của enzyme vào cấu trúc bên trong hết sức khó khăn. Điều này làm tăng thêm độ bền vững của cellulose nói chung. Cellulose kết tinh là hợp chất bền vững, nếu như nấu ở 60-70oC, tinh bột đã từ trạng thái kết tinh chuyển sang vô định hình, đối với cellulose nấu ở 320oC mới xảy ra chuyển trang thái như vậy. Cellulose không tan trong nước, trong nhiều dung môi hữu cơ và các dung dịch kiềm loãng. Cellulose có thể bị phân hủy thành glucose khi đun nóng với acid hoặc kiềm. Liên kết glucoside không bền với acid, dưới tác dụng của acid, cellulose tạo thành các sản phẩm thủy phân, có độ bền cơ học kém hơn, cellulose khi bị thủy phân hoàn toàn sẽ thu được sản phẩm cuối cùng là đường hòa tan D-glucose [79]. Hemicellulose là một số polymer dị thể, cùng có mặt với cellulose trong thành tế bào thực vật. Trong khi cellulose có cấu trúc tinh thể bậc cao chặt chẽ rất khó bị thủy phân thì hemicellulose có cấu trúc vô định hình (amorphous structure) với mạch ngắn cấu trúc vô định hình dễ bị thủy phân bởi kiềm hoặc acid cũng như bởi các enzyme hemicellulose. Hemicellulose chứa phần lớn các đường D-pentose, và rất ít đường dạng L. Xylose luôn có mặt với lượng lớn, ngoài ra còn có acid mannuronic và acid galacturonic. Khi bị thủy phân thì hemicellulose cho glucose, và các đường khác như xylose, mannose, galactose, rhamnose, arabinose. Không có mạch dài như cellulose, hemicellulose có mạch ngắn hơn bao gồm chừng 500-3000 gốc đường đơn [79]. Trong khi cellulose là polymer có mạch dài thẳng, thì hemicellulose là polymer có mạch phân nhánh. Hemicellulose bao gồm chủ yếu xylan (gọi là hemicellulose A) và arabinoxylan (gọi là hemicellulose B). Xylan là polymer mạch thẳng của D-xylose với liên kết -(1 4). Arabinoxylan gồm mạch chính là xylan gắn với mạch nhánh là L-arabinofuranose bởi các liên kết (1→2). Như vậy, đơn vị thành phần tạo nên cấu trúc hemicellulose chính là D-xylose và một ít L-arabinofuranose. Lignin Lignin là polyme tạo nên bởi các monome là p-coumaryl alcohol, coniferyl alcohol và sinapyl alcohol. Lignin coi như là một số polyme dị thể, cùng có mặt với cellulose trong thành tế bào thực vật, cùng với cellulose bao bọc xung quanh cellulose tạo thành những bó sợi vững chắc. Lignin có thể bị thủy phân bởi các tác 27
  40. nhân hóa học hoặc bởi các enzyme như manganese peroxidase, lignin peroxidase cellobiose dehydrogenase [78]. Khi nhiệt phân, lignin cho sản phẩm là methoxy phenol. Các monome này có các liên kết với nhau tạo nên mạng lưới polyme –lignin. Hình 1.8 Cấu trúc của lignin [22] 28
  41. 1.4. VI SINH VẬT TRONG XÚC TÁC QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN 1.4.1. Vi sinh vật 1.4.1.1. Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Quá trình nuôi cấy vi sinh vật trong nuôi cấy gián đoạn có thể chia thành 4 giai đoạn như hình sau: Hình 1.9 Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật trong nuôi cấy gián đoạn Pha tiềm phát (giai đoạn tiềm phát): Đây là giai đoạn vi khuẩn bắt đầu thích nghi với môi trường. Pha lũy thừa (giai đoạn tăng trưởng): Các tế bào vi khuẩn tiến hành phân bào và tăng nhanh về số lượng. Trong giai đoạn này vi sinh vật sinh trưởng và phát triển theo lũy thừa. Pha cân bằng (giai đoạn ổn định): Mật độ vi khuẩn được giữ ở một số lượng ổn định do các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình tăng trưởng của vi khuẩn đã sử dụng hết và số lượng vi khuẩn sinh ra bằng số lượng vi khuẩn chết đi. Pha suy vong (giai đoạn suy vong): Trong giai đoạn này, số lượng vi khuẩn chết đi nhiều hơn số lượng vi khuẩn sinh ra. Nguyên nhân là do: chất dinh dưỡng trong môi trường bị cạn kiệt và môi trường bị nhiễm độc. 1.4.1.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh trưởng của vi sinh vật Phần lớn các vi sinh vật phát triển thuận lợi trong môi trường có pH trong khoảng pH 5,5 - pH 7,5. Rất ít các vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH nhỏ hơn 4,0 hoặc cao hơn 9,0. Tuy vậy, vẫn tồn tại các vi sinh vật phát triển trong môi trường thậm chí nhỏ hơn 2,0 hoặc cao hơn 10,0. Các chủng vi sinh vật phát triển 29
  42. trong môi trường có pH thấp (tính acid cao) gọi là Ưa acid (acidophile). Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH trung tính (quanh vùng 7) gọi là obligate (acidophile). Các chủng vi sinh vật phát triển trong môi trường có pH cao (tính kiềm cao) gọi là Ưa kiềm (alkaliphile). Đồ thị hoạt tính thủy phân cellulose của các chủng vi sinh thụ thuộc vào pH thường có dạng quả chuông với cực đại ở pH tối ưu. Vị trí cực đại đồ thị thụ thuộc vào pH tối ưu của các chủng vi sinh [19]. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình phát triển của vi sinh vật Căn cứ vào khả năng chịu nhiệt, vi sinh vật có thể được chia thành 3 nhóm như sau: Vi sinh vật ưa lạnh (thấp hơn 25oC), Vi sinh vật ưa ẩm (25-40oC), Vi sinh vật ưa nóng (35-60oC). Ngoài các chủng vi sinh vật thuộc 3 nhóm nêu trên, còn có chủng thích nghi với nhiệt độ rất thấp dưới vùng nhiệt độ cho các chủng vi sinh vật thuộc nhóm chịu lạnh, chúng được gọi là “Quá ưa lạnh”, các chủng vi sinh vật này có thể phát triển ở nhiệt độ rất thấp - 100C đến -150C. Chúng được tìm thấy ở những biển băng giá thuộc 2 cực của trái đất như Arthrobacter sp., Psychrobacter sp Đối nghịch với các chủng vi sinh vật thuộc nhóm “Quá ưa lạnh”, có một số loài vi sinh vật này có thể phát triển ở nhiệt độ rất cao, cao hơn cả nhiệt độ phát triển cho các chủng thuộc nhóm Ưa nóng, có thể tới 70°C hoặc cao hơn nữa. Chúng được gọi là “Quá ưa nóng”. Một số chủng còn thích hợp với nhiệt độ 80°C đến 105°C, được gọi là Hyperthermophile. Những chủng này được tìm thấy ở các vùng cận núi lửa, suối nước nóng như ở công viên Yellowstone National Park châu Phi hoặc vùng Kamchatka của Nga. 1.4.1.3. Vi sinh vật phân hủy cellulose Trong điều kiện tự nhiên, cellulose bị phân huỷ bởi vi sinh vật cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí. Các loài vi sinh vật có thể có tác động hiệp lực hoặc thay phiên nhau phân huỷ cellulose đến sản phẩm cuối cùng là glucose. Các loài vi sinh vật tham gia phân huỷ cellulose rất phong phú. Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn, thậm chí cả nấm men [9]. Hiện nay, người ta đã biết được một số vi sinh vật có khả năng phân huỷ cellulose (bảng 1.7) 30
  43. Bảng 1.7 Vi sinh vật phân huỷ lignocellulose Xạ khuẩn Nấm Vi khuẩn Actinomyces Aspergillus Bacillus Actinomyces diastaticus A. oryzae B. amylogenas Actinomyces roseus A. terreus B. flavefacicus Actinomyces thermofucus A. syndovii B. megaterium Actinomyces diastaticus A. flarus B. menssenteroides A. niger B. ruminicola Streptomyces Trichoderman Clotridium Str. Rectus T. reseii Clos. Butyricum Str. Thermofuscus T. viridae Clos. Lochehesdii Str. Thermonitrificans T. lignorum Acetobacter xylinum Str. Thermoviolaceus T. hazianum Pseudomonas fluorescens Str. Thermovulgaris Pen. Notatum Str. violaceus Cephalosporium Ruminococcus albus Thermomonospora curvata Neurospora Bacteroides amylophilus Thermomonospora vulgaris AaBasii diomycetes amylophillus sp Fusarium culmorum Cellulosemonas 1.4.2. Xúc tác sinh học trong quá trình thủy phân 1.4.2.1. Khái niệm về xúc tác enzyme Xúc tác là hiện tượng làm thay đổi tốc độ của phản ứng hay kích thích phản ứng, xảy ra dưới tác động của một số chất và các chất này được gọi là các chất xúc tác Xúc tác enzyme: Mỗi enzyme xúc tác một quá trình hóa học nhất định hay một nhóm nhất định các biến đổi hóa học. Xúc tác sinh học đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của các cơ thể và được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp và đời sống, đặc biệt là trong chế biến thực phẩm (sản xuất bánh mì, chế biến sữa, sản xuất rượu bia ), ở đây các quá trình lên men đóng vai trò chính. 31
  44. Các đặc điểm của xúc tác sinh học Enzyme có nhiều ưu điểm so với các chất xúc tác hoá học truyền thống. Nổi bật nhất là tính hiệu quả, tính đặc hiệu và tính chọn lọc của chúng không chỉ đối với các phản ứng hoá học đặc biệt mà chúng xúc tác mà cả trong sự phân biệt giữa các phần khác nhau của các phân tử và cấu trúc không gian hay các đồng phân lập thể, trung tâm bất đối của phân tử cơ chất. Chúng chỉ xúc tác các phản ứng với một phổ cơ chất rất hẹp, một nhóm chất duy nhất, điều này có nghĩa là phản ứng đã lựa chọn có thể được xúc tác để loại trừ các phản ứng phụ, loại bỏ các sản phẩm phụ không mong muốn [19]. Như vậy, có thể đạt được hiệu suất cao nhờ giảm các chi phí về vật chất. Điểm lợi là sản phẩm tạo ra ở dạng không bị tạp bẩn, nên làm giảm chi phí cho làm sạch và gánh nặng cho môi trường. Tính hiệu quả của xúc tác sinh học được thể hiện ở làm tăng tốc độ các phản ứng hóa học. Tốc độ phản ứng có xúc tác enzyme so với phản ứng model (mẫu) thường tăng từ 106 - 1012 lần. Nhiều phản ứng khi không có enzyme xúc tác, xảy ra rất chậm hoặc hầu như không xảy ra. Các phản ứng trong cơ thể sống thường xảy ra rất nhanh từ 10 tới 30 giây và hầu như không xảy ra nếu đưa ra ngoài cơ thể. Tính chọn lọc hóa học là tính phản ứng chọn lọc của một nhóm chức khi có mặt các nhóm chức khác. Trong xúc tác sinh học tính chọn lọc hóa học thể hiện ở khía cạnh sau: thường mỗi chất phản ứng cùng một lúc có thể tham gia vào nhiều phản ứng hóa học, vì vậy khi tiến hành phản ứng hóa học của một chất thì ngoài phản ứng chính ra còn xảy ra một số phản ứng phụ. Tuy nhiên trong xúc tác sinh học không có phản ứng phụ nào xảy ra (không có sản phẩm phụ nào được tạo thành). Enzyme tác động lên một nhóm chức duy nhất, chỉ thúc đẩy một phản ứng hóa học duy nhất trong số các phản ứng hóa học có thể đối với cơ chất đã cho [19]. Tuy nhiên, cũng có một số hạn chế trong sử dụng các enzyme mà không dễ khắc phục. Đặc biệt, giá thành cao của tách chiết và làm sạch vẫn cản trở việc sử dụng chúng, nhất là trong các lĩnh vực có một quy trình (hay sự lựa chọn) khác đã được thiết lập. Bản chất nói chung là không bền của các enzyme khi bị tách khỏi môi trường tự nhiên của chúng, cũng là một trở ngại lớn cho việc sử dụng chúng. 32
  45. 1.4.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến xúc tác enzyme Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Năm 1913 hai nhà khoa học Michaelis và Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và enzyme [19]. Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất (ES). Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E). Enzyme được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới. Trong đó: k+1, k-1, k2: là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng. Phương trình Michaelis – Menten: VM[S]0 V = KM + [S]0 k2 + k-1 Trong đó VM = k2[E]0 và KM = k+1 Từ phương trình xác định nồng độ cơ chất và enzyme thích hợp để đạt được vận tốc phản ứng cao nhất. Ảnh hưởng của nhiệt độ Do bản chất của enzyme là protein nên sự thay đổi về nhiệt độ thường ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme. Thông thường đối với đa số enzyme thì nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40oC – 50oC, ở nhiệt độ cao hơn 70oC đa số enzyme bị bất hoạt. Do vậy, nhiệt độ 70oC được coi là nhiệt độ tới hạn của enzyme. Theo quy luật của các phản ứng hóa học thông thường trong khoảng nhiệt độ mà enzyme chưa bị biến tính, khi tăng nhiệt độ lên 10oC thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên 1,4 – 2 lần. Nhiệt độ tối thích cho một enzyme không phải là hằng số mà nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố: cơ chất, pH môi trường, nồng độ enzyme Ảnh hưởng của pH môi trường pH có ảnh hưởng rất lớn tới vận tốc phản ứng enzyme, mỗi enzyme chỉ hoạt động thích hợp nhất ở một pH xác định gọi là pH tối ưu của enzyme. pH 3 3
  46. tối ưu của đa số enzyme nằm trong vùng acid yếu, kiềm yếu hoặc trung tính, chỉ một số ít hoạt động trong vùng acid mạnh hoặc kiềm mạnh. Ảnh hưởng của thời gian Thời gian thủy phân kéo dài hay rút ngắn đều ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân và chất lượng của sản phẩm thủy phân. Hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân phụ thuộc nhiều vào đội dài của các mạch carbohydrate trong sản phẩm thủy phân. Thời gian kéo dài, enzyme có điều kiện để cắt mạch triệt để, dẫn đến sự biến đổi sâu sắc của cơ chất. Tuy nhiên, nếu kéo dài thời gian thủy phân quá mức sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật hoạt động, sản sinh nhiều sản phẩm thứ cấp, đồng thời làm giảm thời gian thủy phân. 1.4.2.3. Cơ chế thủy phân cellulose bằng phương pháp xúc tác enzyme Hệ enzyme cellulase trong thủy phân cellulose Các vi sinh vật có khả năng phân hủy cellulose là do chúng có thể tiết ra các enzyme tạo thành một hệ enzyme gọi là hệ cellulase. Các enzyme hệ cellulase này xúc tác quá trình thủy phân cắt ngắn mạch cellulose [53]. Nhiều tác giả cho rằng hệ cellulase gồm các enzyme chính sau đây: - Endo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4), còn gọi là cellulase (Cx). Enzyme này tác động thuỷ phân lên các liên kết bên trong mạch cellulose một cách tuỳ tiện làm trương phồng cellulose, dẫn đến làm giảm nhanh chiều dài mạch và tăng chậm các nhóm khử. Enzyme này hoạt động mạnh ở vùng vô định hình nhưng lại hoạt động yếu ở vùng kết tinh của cellulose. - Exo-1,4-glucanase (EC 3.2.1.91), còn gọi là cellobiohydrolase (C1). Enzyme này giải phóng cellobiose hoặc glucose từ đầu không khử của cellulose. Enzyme này tác động yếu lên vùng vô định hình ở phía bên trong của mạch, nhưng tác động mạnh lên mạch bên ngoài của cellulose kết tinh hoặc cellulose đã bị phân giải một phần. Hai enzyme exo và endo-glucanase có tác dụng hiệp đồng cho hiệu quả rõ rệt. - -1,4-glucosidase (EC 3.2.1.21), còn gọi là cellobiase. Enzyme này thuỷ phân cellobiose và các cellodextrin hoà tan, chúng có hoạt tính thấp và giảm khi chiều dài của mạch cellulose tăng lên. Tuỳ theo vị trí mà -glucosidase được coi là 34
  47. nội bào, ngoại bào hoặc liên kết với thành tế bào. Chức năng của -glucosidase có lẽ là điều chỉnh sự tích luỹ các chất cảm ứng của cellulase. Người ta cho rằng tính đa hình của cellulase là nhằm phù hợp với cấu trúc phức tạp của mạch phân tử cellulose, gồm nhiều vùng có hoạt tính thủy phân khác nhau. Tuỳ thuộc vào các chủng vi sinh vật cũng như các điều kiện môi trường nuôi cấy, tỷ lệ các thành phần trong hệ enzyme, hiệu lực phân giải cellulose của các hệ cellulase là khác nhau, nhưng để phân giải hoàn toàn cellulose, cần có sự tác động hiệp đồng của cả ba enzyme trong hệ cellulase [65]. - Cơ chế thủy phân cellulose được giả thiết có ít nhất hai bước (hình 1.10): Bước 1: Endoglucanase (ký hiệu Cx) sẽ làm trương hoặc hydrat hóa các liên kết trong mạch cellulose. Bước 2: Exoglucanase (ký hiệu C1) và β-glucosidase (cellobiase) thủy phân các liên kết mạch phía ngoài giải phóng glucose. 35
  48. Hình 1.10. Cơ chế thủy phân cellulose Hình 1.11. Sơ đồ thủy phân cellulose bằng hệ enzyme cellulase 36
  49. Hình 1.12. Cơ chế thủy phân glycoside bằng enzyme -glucosidase Trung tâm phản ứng của enzyme -glucosidase bao gồm hai amino acid glutamic và aspartic. Quá trình phản ứng trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn đầu là sự bám dính của cơ chất vào trung tâm phản ứng của enzyme phụ thuộc vào cấu hình của carbonanome trong hợp phần carbohydrate, với enzyme -glucosidase chỉ liên kết -glucoside mới bám dính được. Giai đoạn thứ hai là quá trình phân cắt liên kết glycoside dưới tác dụng của tác nhân nucleophil glutamte tách proton của nước tạo thành tác nhân nucleophil thứ cấp, tác nhân nucleophil thứ cấp là anion hydroxy phản ứng với trung tâm cacbonanome electrophil và phản ứng chuyển proton từ hợp phần aspartic vào nguyên tử oxi trong hợp phần aglycol. Trong trình tự peptid của enzyme, amino acidaspatic chuyển thành dạng muối aspartate, muối glutamte chuyển thành dạng acid glutamic. Sản phẩm của quá trình là glucose. Phương pháp công nghệ sinh học sử dụng enzyme, vi sinh có phần ưu điểm hơn. Các liên kết  (1-4), có trật tự cao của cellulose rất dễ bị phá vỡ bởi các vi sinh có chứa enzyme cellulase. Các thí nghiệm thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase thường được tiến hành trong tủ ấm với các điều kiện tối ưu để enzyme có hoạt tính cao nhất (40- 37
  50. 45°C, pH = 4,0-4,5). Năm 2010, người ta đã xây dựng hệ enzyme cellulase công nghiệp bao gồm chế phẩm Cytolase CL (Genencor, Menlo Park, CA) và β- glucosidase (Novozyme 188) có hoạt tính thủy phân cao ở pH = 4,8 [78]. 1.4.2.4. Cơ chế thủy phân cellulose bằng phương pháp hóa học Việc thủy phân cellulose để tạo nên các mạch/đoạn oligocellulose ngắn hơn và cho tới glucose có ý nghĩa rất lớn về mặt kinh tế. Việc sử dụng các cơ chất cellulose sau thủy phân sẽ trở nên đơn giản hơn và thuận lợi hơn rất nhiều. Việc tìm ra biện pháp thích hợp và rẻ tiền là rất quan trọng, tính chất phức tạp và chi phí cao cho các cách xử lý này đang là một trong những yếu tố cơ bản đối với vấn đề khai thác cellulose cũng như sử dụng cellulose ở quy mô công nghiệp [68], [69], [78]. Phương pháp hoá học ít có hiệu quả đối với các phần cellulose có cấu trúc tinh thể hoặc cấu trúc trật tự bậc cao với liên kết  (1 - 4), song lại thích hợp để phá vỡ thành phần lignin của sợi cellulose. Trong phương pháp hóa học, người ta hay dùng acid với nồng độ loãng, thí dụ H2SO4 5% hoặc H2SO4 5% và HCl 5%. Để tránh bị phá hủy glucose, sản phẩm của thủy phân, người ta còn dùng hỗn hợp dung dịch HCl 0,5% cùng ZnCl2 (65% - 74%) (pH = 4,8, 100°C, 4 giờ). Sau 4 giờ thủy phân, 80% của cellulose chuyển thành dextrin hòa tan [97], [108], [120]. Phương pháp hóa học đòi hỏi những trang thiết bị rất tốn kém mà lại khó thu được sản phẩm tinh khiết, vì vậy hiệu quả kinh tế thấp (hình 1.13). Trong khi đó, phương pháp sinh học sử dụng enzyme vi sinh vật có tính đặc hiệu cao nên có thể thu được sản phẩm tinh khiết, dưới điều kiện nhiệt độ và áp suất thường. 38
  51. Hình 1.13. Sơ đồ thiết bị thủy phân bằng phương pháp acid tại Brazil , công ty “Usina Nova America S/A (Tarumax/SP Brazil)” 1.5. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC THUỘC LĨNH VỰC CỦA LUẬN ÁN 1.5.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trên thế giới, công nghệ sản xuất ethanol sinh học đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công ở nhiều quốc gia, trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, nguyên liệu phục vụ cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học chủ yếu từ các cây lương thực, rơm rạ [46], [88], [1] còn từ nguồn rong biển chưa được nghiên cứu và ứng dụng nhiều. Đối với Việt Nam vấn đề này vẫn còn rất mới mẻ và đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học. Rong biển là sinh vật tự dưỡng nhờ quá trình quang hợp mà sinh trưởng, phát triển nên sản lượng rong biển trên thế giới rất dồi dào. Theo số liệu của tổ chức FAO, năm 2006 thống kê, nguồn rong biển tự nhiên ở các vùng biển trên thế giới rất lớn, có thể sử dụng nguồn này để sản xuất ethanol sinh học thay thế cho các nguồn lương thực khác, như Trung Quốc sản lượng rong tươi hàng năm là 323 nghìn tấn/năm, Chile là 305 nghìn tấn/năm, Na Uy là 145 nghìn tấn/năm, Nhật Bản là 113 nghìn tấn/năm, Pháp là 75 nghìn tấn/năm và Ireland là 29 nghìn tấn/năm. Ngoài ra, tổ chức FAO cũng thống kê các nước trồng rong lớn nhất thế giới thuộc vào các nước Châu Á, như Trung Quốc là 10,800 nghìn tấn/năm, 39
  52. Philippin là 1,300 nghìn tấn/năm, Indonesia là 900 nghìn tấn/năm và những nước khác là 2,000 nghìn tấn/năm [61] Những nguyên liệu có thể dùng để sản xuất ethanol là đường, tinh bột và nguyên liệu chứa cellulose. Monosaccharide có thể biến đổi trực tiếp thành ethanol nhưng tinh bột phải được thủy phân thành monosaccharide dưới tác dụng của enzyme rồi mới lên men thành ethanol, còn cellulose cũng phải biến đổi thành monosaccharide. Sở dĩ có thể dùng rong biển để sản xuất ethanol vì nhiều loài rong biển có chứa hàm lượng carbohydrate cao, có thể dùng để chuyển hóa lên men rượu. Đã có nhiều tài liệu nước ngoài công bố về vấn đề này như rong nâu Laminaria ở vùng biển Ireland được đất nước này khai thác để sản xuất ethanol sinh học có chứa 6% cellulose, 23% alginate, 12% mannitol, fucoidan 5%, laminaran 14%, proteins 2%, lipid 2%, không thấy có tinh bột, hemicellulose và lignin. Khác với rong nâu, rong lục có hàm lượng ẩm cao hơn rất nhiều, hàm lượng khoáng 24%, protein 19%, lipid 2%, cellulose 18%, ulvan 20%, tinh bột 2%, hợp chất sunfat 8% và chất màu nhỏ hơn 1% [32], [61]. Alginate là một polysaccharide trong rong nâu không thể lên men nhờ những vi sinh vật truyền thống, mà muốn lên men được phải qua xử lý ở nhiệt độ cao trước khi lên men hoặc dùng những vi sinh vật lên men thích hợp. Năm 2004, ở Na Uy, Horn và cộng sự đã tìm ra chủng nấm men P. angophorae để lên men rong nâu nhưng hiệu suất lên men không cao, còn các nhà nghiên cứu của trường đại học quốc gia Ireland (NUIG) đã tách được một enzyme từ nấm kỵ khí Talaromyces emersonii được xem là cắt đứt rất tốt các hợp chất saccharide phức tạp để tạo ra saccharide đơn giản [61]. Năm 2007, nhóm tác giả Aizawa, của trường Đại học Tokai Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học của Nhật Bản do Tokyo Fisheries Promotion Foundation đầu tư trên tạp chí Oceans 2007. Dự án sản xuất ethanol từ rong biển Sargassum horneri là một loại rong nâu, có hàm lượng carbohydratee 5,8%, kết quả thu được 29,6 kg ethanol hoặc 38 lít ethanol trên 1 tấn rong tươi có độ ẩm 90% [27]. Năm 2009, nhóm tác giả Dubok Choi và các cộng sự của hai trường Đại học Cho-dang và Chusun Hàn Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất đường từ 40
  53. nguyên liệu rong biển thô trên tờ báo Industrial and Engineering Chemistry. Kết quả công bố, rong biển thô được cắt nhỏ 5 cm, sau đó bổ sung HCl, ascorbic acid và NaOH từ 0,25 ÷ 2%, hỗn hợp được gia nhiệt ở 121oC; 0,98 bar, trong thời gian 1-3h, tác giả so sánh hiệu quả thủy phân giữa các mẫu bằng cách so sánh độ nhớt giữa các hỗn hợp sau khi kết thúc thủy phân, trường hợp rong biển thủy phân trong ascorbic acid cho thấy độ nhớt giảm một cách nhanh chóng, tiếp đến là mẫu xử lý HCl và cuối cùng mẫu xử lý NaOH. Nhóm tác giả cũng công bố khi rong biển thủy phân bằng hỗn hợp enzyme Liquozyme, Dextrozyme, Cellic HTech2 và Rapidase trong điều kiện nhiệt độ 30oC, thời gian 360 phút thì hàm lượng đường sinh ra nhiều hơn so với dùng ascorbic acid [55]. Năm 2010 nhóm tác giả Churl Kim và các cộng sự của trường đại học Kyung Hee đã công bố kết quả nghiên cứu trên tạp chí Bull. Korean Chem. Soc về sử dụng chất lỏng ion để chuyển hóa agar thành hỗn hợp đường. Phản ứng đường hóa agar được tiến hành như sau: Một hỗn hợp 10 g agar được trích ly từ Gelidium amansii cho vào hỗn hợp nước chứa chất lỏng ion có tính chất acid ([Chol][HSO4]). Phản ứng thủy phân được thực hiện ở 121oC trong 15 phút, sau đó điều chỉnh pH hỗn hợp về 5,5 bằng cách bổ sung CaCO3 và chất lỏng ion được tách ra bằng cách ly tâm [46]. Năm 2011, nhóm tác giả Kazunori Nakashima và cộng sự của trường Đại học Kobe Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất bioethanol từ cellulose bằng cách kết hợp giữa nấm men có chứa enzyme cellulase với tiền xử lý chất lỏng ion (ionic liquid). Cellulose được tiền xử lý với các chất lỏng ion như [Emim][Cl]; [Emim][OAc]; [Emim][DEP] ở điều kiện 80oC, thời gian 30 phút; sau đó hỗn hợp được trung hòa bằng dung dịch đệm acetate, điều chỉnh pH về 5,0. Hỗn hợp tiếp tục được bổ sung 5 ml hỗn hợp enzyme endoglucanase (EG), cellobiohydrolase (CBH), và glucosidase (BGL), đồng thời bổ sung 5 ml nấm men S. cerevisiae tiến hành lên men ở nhiệt độ 30oC, thời gian 96 h thì hiệu suất thu ethanol lên đến 90% và có thể tái sử dụng các chất lỏng ion đến 82% [67]. Na Uy đã nghiên cứu sản xuất ethanol từ hai loài rong nâu là Laminaria hyperborea và Ascophyllum nodosum thành công, họ đã chiết laminaran, mannitol từ rong nâu Laminaria hyperborea để sản xuất ethanol [70], [88]. Hàm lượng mannitol và laminaran trong rong nâu khô khoảng 25 ÷ 30%. Quá trình lên men 41
  54. ethanol từ mannitol nhờ vi khuẩn Zymobacter palmae, còn vi khuẩn Pichia angophorae có thể tham gia sản xuất ethanol từ cả hai nguồn mannitol và laminaran. Những vi sinh vật phổ biến được sử dụng để lên men ethanol là Saccharomyces cerevisiae V 7028 và vi khuẩn Zymomonas mobilis [61]. Năm 2011 nhóm tác giả Krish Purnawan và các cộng sự của trường Đại học Mulawarman Indonesia đã công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học từ rong đỏ Eucheuma cottonii trên vùng biển Baotang của Indonesia theo quy trình sau: Rong sau khi thu hoạch được phơi khô và bảo quản trong các túi nilon, đưa về phòng thí nghiệm được bảo quản ở nhiệt độ phòng, 100 g rong khô cho vào 300 ml nước, sau đó đun sôi ở nhiệt độ 80oC trong 2 giờ cho đến khi gel được hình thành, sau đó làm nguội xuống nhiệt độ phòng 25 ml H2SO4 5% rót vào một lọ thủy tinh chứa 100 g gel rong biển đem đun sôi ở 100oC trong 2 giờ, sau đó dung dịch được điều chỉnh về pH = 5 bằng cách nhỏ 0,1 M NaOH, hàm lượng đường được xác định theo phương pháp Nelson Somogyi là 15,8 mg/ml dịch thủy phân. Hỗn hợp được lên men từ 5-6 ngày ở nhiệt độ phòng từ 28-300C bằng nấm men Saccharomyces cereviceae thì thu được sản lượng ethanol tối đa là 4,6% [70]. Năm 2011 nhóm tác giả Leilei Ge và các cộng sự của trường College of Food Science and Engineering và Ocean University của Trung Quốc đã công bố kết quả nghiên cứu trên tạp chí Renewable Energy về nghiên cứu công nghệ đường hóa bã rong để sản xuất ethanol. Nguyên liệu dùng nghiên cứu là phần bã thừa của quá trình sản xuất alginate được xay nhỏ và sấy khô ở 40oC, sau đó bảo quản ở nhiệt độ phòng. Bã rong được tiền xử lý bằng acid sulfuric loãng lần lượt là 0,1; 0,2; 0,5 và 1% trong thời gian 0,5; 1,0 và 1,5 giờ tại nhiệt độ 121oC. Sau đó, phần bã không tan được lọc tách ra và rửa với nước nóng. Hỗn hợp được điều chỉnh về pH = 4,8 bằng dung dịch đệm acetate, tiếp tục bổ sung enzyme cellulase và cellobiase để thủy phân cellulose, hemicellulose và lignin không tan ở nhiệt độ 50oC trong 48 h. Sau đó hỗn hợp được lên men bằng Saccharomyces cerevisiae V7028 ở nhiệt độ 30oC trong 36 h, thu được lượng ethanol là 41,2%, tương ứng với hiệu suất 80,8% [77]. Nhóm tác giả Mitsunori Yanagisawa và các cộng sự của Viện công nghệ Tokyo và trường đại học công nghệ Kochi Nhật Bản đã công bố kết quả nghiên cứu thủy phân các loài rong có chứa polysaccharide để sản xuất ethanol sinh học 42
  55. trên tạp chí Process Biochemistry. Nhóm tác giả đã nghiên cứu trên ba đối tượng rong: rong lục Ulva pertusa Kjellman, rong nâu Alaria crasssifolia và rong đỏ Gelidium elegans Kuetzing, đối với rong lục và rong nâu sau khi thu hoạch về được phơi nắng trong 5 h để dùng làm thí nghiệm, còn rong đỏ được sấy ở 60oC trong 2 ngày. Tất cả các loại rong đều xay nhỏ đến 0,5 mm. Tổng hàm lượng carbohydrate trong 3 loại rong này được xác định bằng tổng của NFE (nitrogen – free extract) và phần sợi thô được xác định bằng phương pháp chuẩn dùng phân tích thực phẩm lần lượt là 68,8; 61,0 và 83,2%, glucan trong các loại rong này lần lượt là 22,0; 24,5 và 21,8% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Galactan chỉ có trong rong đỏ với hàm lượng 26,5% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Đây là những polysaccharide chứa các đường có thể lên men một cách dễ dàng [87]. Như vậy, kết quả nghiên cứu của nhiều nhóm tác giả đã công bố cho thấy, sản xuất ethanol sinh học từ rong biển có thể sử dụng nhiều phương pháp thủy phân rong để tạo dung dịch đường như thủy phân bằng acid H2SO4 [77], [110], HCl [55], acid ascorbic [55], xút (NaOH) [55], enzyme [77], [87] hoặc kết hợp giữa các phương pháp với nhau [77]. Sử dụng chất lỏng ion kết hợp với phương pháp dùng enzyme hoặc acid hiệu quả đối với nguyên liệu chứa nhiều cellulose như phụ phẩm nông nghiệp [46]. Hàm lượng cellulose trong rong biển không cao [32], [61], [8] trong khi chất lỏng ion lại đắt nên việc sử dụng chất lỏng ion để tiền xử lý rong biển không hiệu quả. 1.5.2. Các nghiên cứu trong nước Hiện nay, tại Việt Nam cũng đã và đang bắt đầu những nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu sinh học thế hệ II từ sinh khối (phế thải). Theo hướng này, đã có một số công trình, nhưng trong quá trình thực hiện đang còn gặp những khó khăn rất lớn. Về nghiên cứu sử dụng nguồn phế thải nông nghiệp thành nhiên liệu sinh học theo 2 hướng: - Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất ethanol sinh học - Sử dụng nguồn phế thải để sản xuất diesel - sinh học Theo hướng sử dụng nguồn phế thải nông, lâm nghiệp để sản xuất ethanol sinh học đã có một số đề tài, công trình sau: 43
  56. - “Sản xuất ethanol sinh học từ phế thải nông nghiệp”, Chủ nhiệm đề tài PGS. TS Vũ Nguyên Thành, Viện Công nghiệp thực phẩm, Bộ Bông Thương, (2009-2011). - “Nghiên cứu công nghệ hiện đại để sản xuất ethanol nhiên liệu từ gỗ phế liệu nguyên liệu giấy”, Thuộc Đề án thuộc Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025 của Bộ Bông Thương. Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Doãn Thái Hòa, ĐHBK Hà Nội. (2009 - 2010). - “Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ”, Trần Diệu Lý, Luận văn, 2009, Mã số: 7759, Trường ĐH Bách Khoa Tp. HCM. Dùng enzyme để thủy phân phế thải để tạo đường tan nhìn chung đạt hiệu quả thấp, chưa tìm được enzyme thích hợp cho hiệu suất cao (đề tài của PGS. TS Vũ Nguyên Thành). - Hầu hết sinh khối từ thực vật và phế thải nông nghiệp rơm rạ chứa nhiều hemicellulose 23-32% và lignin – 15-25%. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp thực sự hiệu quả thủy phân thành phần hemicellulose, lignin. - Một số hợp phần có trong phế thải như Silic làm giảm hiệu suất thủy phân. - Dùng acid để thủy phân phế thải để tạo đường tan thì gặp khó khăn trong việc tạo thiết bị chịu acid, nhiệt độ (1800C, áp suất 15 atm) (đề tài của PGS.TS Doãn Thái Hòa) Hiện nay, tại Việt Nam chưa có bất kỳ tác giả nào công bố kết quả nghiên cứu về sản xuất ethanol sinh học từ rong biển mà chỉ dừng ở việc nghiên cứu khảo sát sản lượng rong biển phục vụ sản xuất ethanol và nghiên cứu một số thành phần hóa học của một số loại rong có tại Việt Nam, trong đó có hàm lượng polysaccharide, như tác giả Lê Như Hậu và cộng sự của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang với đề tài “Nghiên cứu và đề xuất giải pháp khai thác hợp lý và bền vững cho rong nguyên liệu sản xuất ethanol ở ven biển Nha Trang” năm 2010 đã công bố, trữ lượng các ngành rong biển tại Nha Trang như sau: Khu vực vịnh Nha Trang có diện tích rong Mơ 546,20 ha. Rong Mơ phát triển thành thảm với sinh lượng trung bình đạt 571,90 g.khô/m2, trữ lượng 4840,4 tấn khô/năm. Rong Đỏ là 231,97 tấn khô/năm và rong lục là 16,53 tấn khô/năm [2]. Tác giả cũng công bố kết quả nghiên cứu trong báo cáo hội nghị khoa học nhân dịp kỷ niệm 35 44
  57. năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam diễn ra tại Hà Nội vào tháng 10 năm 2010 là Rong biển Việt Nam gồm những chi có sản lượng lớn Sargassum, Hormophysa, Hydroclathrus (rong nâu); Gracilaria, Hydropuntia, Hypnea, Kappaphycus (Rong Đỏ); Ulva, Chaetomorpha, Cladophora (Rong Lục), hiện nay có thể khai thác 79.126,3 tấn rong khô trên diện tích 75.322,0 ha. Diện tích mặt nước có tiềm năng nuôi trồng và khai thác rong biển trong thời kỳ 2010-2015 khoảng 900.000 ha với sản lượng 600-700.000 tấn khô/năm. Như vậy, rong biển Việt Nam, cũng như rong biển tại các vùng biển Khánh Hòa có trữ lượng rất lớn, có khả năng đáp ứng nguồn nguyên liệu cho công nghệ sản xuất ethanol sinh học ở quy mô công nghiệp bằng khai thác nguồn nguyên liệu tự nhiên và nuôi trồng bằng mô hình kết hợp hoặc luân canh trong các ao nuôi tôm và ở các bãi triều ven biển, đặc biệt vùng ven biển Nha Trang các nhóm rong có trữ lượng lớn là rong đỏ, rong lục và rong mơ. Nghiên cứu về hàm lượng carbohydrate trong rong biển: Monosaccharide quan trọng trong rong nâu là đường mannitol được Stenhouds phát hiện ra năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm. Hàm lượng mannitol trong rong nâu dao động từ 14-25% trọng lượng rong khô tùy thuộc vào hoàn cảnh địa lý và nơi sinh sống. Theo kết quả nghiên cứu của Viện Hải Dương học Nha Trang năm 1979, xác định sự biến động hàm lượng mannitol trên 2 đối tượng rong nâu S. mcclurie và S. kjellmanianum tại vùng biển Hòn Chồng, Nha Trang lần lượt là 15,79 – 16,36% (từ tháng 3 đến tháng 5); 12,40-13,82% (từ tháng 3 đến tháng 4). Còn kết quả nghiên cứu của Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Trường Đại học Nha Trang, xác định hàm lượng mannitol vào tháng 4 trong rong nâu S. mcclurie ở vùng biển Quảng Nam - Đà Nẵng, Bình Định, Khánh Hòa, Ninh Thuận lần lượt là 15,6; 11,3; 15,4 và 14,8%. Nếu rong bảo quản không tốt, độ ẩm cao làm cho mannitol bị phá hủy. Hàm lượng mannitol trong rong nâu ở vùng biển Khánh Hòa được phân tích có hàm lượng trung bình vào khoảng 6,3 – 11,35% trọng lượng rong khô tuyệt đối. Trong đó, loài S. mcclurie có hàm lượng cao hơn cả. Tháng 4 và 5 là lúc rong nâu đã trưởng thành, có kích thước lớn nhất, hàm lượng acid alginic và mannitol cao nhất [22]. 45
  58. Polysaccharide trong rong nâu chủ yếu là alginic, hàm lượng alginic dao động từ 13-15% trọng lượng rong khô. Hàm lượng này phụ thuộc vào loài rong và vị trí địa lý môi trường rong sinh sống. Theo các tài liệu tổng kết của Miyake (1995) cho thấy hàm lượng alginic trong các loài rong nâu ở các vùng biển Liên Xô cũ dao động từ 13-40%. Theo tài liệu phân tích các chuyên gia Bộ Thủy sản cho thấy hàm lượng alginic trong các loại rong nâu ở Hải Phòng dao động từ 22-40%. Theo số liệu nghiên cứu của Viện Hải Dương học năm 1979, hàm lượng alginic trong rong S. mcclurie và S. kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt Nam dao động từ 39,24 – 44,40% so với rong khô tuyệt đối từ tháng 3 đến tháng 5. Còn kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học Trường Đại học Nha Trang năm 1998 - 2000, hàm lượng alginic trong rong S. mcclurie và S. kjellmanianum ở vùng biển miền trung Việt Nam trong tháng 4 dao động từ 35,9 đến 39,4% so với trọng lượng rong khô tuyệt đối [22]. Như vậy, từ các tài liệu đã công bố tại Việt Nam và thế giới cho thấy, sản lượng rong biển rất dồi dào với giá thành thấp, trong rong biển chứa một hàm lượng carbohydrate cao nên việc sử dụng rong biển để sản xuất ethanol sinh học có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. 46
  59. Chương 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1. Các nguyên vật liệu chứa cellulose 2.1.1.1. Các mẫu rong nâu Các mẫu rong biển được thu ngay sau thời kỳ sinh sản. Thời gian thu hoạch tùy thuộc vào từng loại rong nhưng thông thường vào khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong được giám định và xác định tên khoa học bởi TS. Lê Như Hậu (Viện nghiên cứu và ứng dụng Công nghệ Nha Trang). Sau khi thu hái, mẫu được rửa sạch bằng nước để loại muối, cát và phơi trong bóng râm. Rong được sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 40-50°C, cắt nhỏ. Rong khô đã cắt nhỏ được nghiền thành bột và bảo quản ở nhiệt độ phòng Sargassum henslowianum Sargassum swartzii S.oligocystum S. binderi Hình 2.1. Các mẫu rong nghiên cứu 47
  60. Bảng 2.1 Các loài rong nâu được thu hái để nghiên cứu STT Tên loài rong Địa điểm thu mẫu 1 Sargassum swartzii Nha Trang 2 Sargassum henslowianum Hải Phòng 3 Sargassum binderi Nha Trang 4 Sargassum oligocystum Nha Trang 2.1.1.2. Phế thải rơm rạ Thu nhận lấy mẫu rơm, rạ của một số tỉnh trong nước. Tại miền Bắc chúng tôi lấy mẫu ở rơm thuộc giống lúa Thiên Hương HYT – 100 của vùng Đông Hưng Thái Bình. Mẫu lấy về được rửa sạch, phơi khô, cắt từng đoạn nhỏ có chiều dài từ 5 đến 10 cm, cho vào lọ nhựa, dán tên, đậy nắp kín và bảo quản tại nhiệt độ phòng từ 26 đến 32oC (hình 2.2). Trước khi phân tích mẫu, tiến hành xử lý cơ học: cắt nhỏ mẫu cho tới khi có chiều dài < 0,5 cm. Mẫu được sấy khô, sau đó cho nghiền trong máy nghiền thực vật chuyên dụng cho tới kích thước 0,5 - 1,0 mm. Hình 2.2. Phế thải nông nghiệp (rơm, rạ) trước và sau khi xử lý cơ học 2.1.2. Các chủng vi sinh Bao gồm các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose tạo thành các sản phẩm trung gian tan (hydrolizat) (bảng 2.2) và các chủng vi sinh vật để chuyển hóa (lên men) các sản phẩm trung gian tan thành ethanol (bảng 2.3). 48
  61. Bảng 2.2 Các chủng vi sinh vật để thủy phân cellulose Ch ủ ng vi sinh v ậ t Xuất xứ 1 Chủng vi khuẩn C32 Phân lập ở Hà Nội 2 Chủng Xạ khuẩn 7P Phân lập ở Hà Nội 3 Chủng nấm Aspergillus terreus (fungus) Nga chuyển giao 4 Chủng Vi khuẩn VK Hud 4-1 Phân lập tại Hà Nội 5 Chủng vi khuẩn C36 Phân lập ở Hà Nội Bảng 2.3 Các chủng vi sinh vật cho lên men ethanol STT Chủng nấm men Xuất xứ 1 Saccharomyces cerevisiae V7028 Việt Nam 2 Kluyveromyces sp. Việt Nam 3 Candida sp. Việt Nam 4 Kluyveromyces marxianus Nga 5 Saccharomyces cerevisiae V7028 Nga 6 Saccharomyces cerevisiae V7028 Т2 Nga Nấm men Nấm men được dùng để lên men ethanol là loài nấm men Saccharomyces cerevisiae V7028 do phía Nga chuyển giao. Điều kiện hoạt động:  Nhiệt độ hoạt động: 42 – 46oC  pH hoạt động: 5,0 – 5,5 49
  62. 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng có xuất xứ Trung Quốc, một số hóa chất chuẩn chỉ thị có xuất xứ từ MERCK đảm bảo các chỉ tiêu chất lượng về hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm. Bảng 2.4 Các hóa chất được sử dụng trong luận án Một số chỉ tiêu chất lượng Độ tinh Hóa chất Trạng thái, tính chất Cl SO4 Fe As khiết (≤%) (≤%) (≤%) (≤%) (≥ %) Chất lỏng sánh, không màu Acid sulfuric CTPT: H2SO4 95-98 0,0003 - 0,00005 0,000003 M = 98,08 Chất rắn, màu vàng - - - - Acid 3,5- CTPT:C7H4N2O7 98 dinitrosalicylic M = 228,12 Tinh thể màu trắng 99 0,001 0,005 - - Na-K-tactarat CTPT: C4H4O6KNa.4H2O M = 282,22 Chất rắn khan, màu trắng 96 0,005 0,005 - - Natri hydroxid CTPT: NaOH M = 40 Chất lỏng sánh, không màu 99,5 0,001 0,0001 0,002 - Acid acetic CTPT: CH3COOH M = 60,05 Tinh thể màu trắng 99 0,002 - - - Natri acetate CTPT:CH3COONa pH = 7,5-9,0 Enzyme Cellic HTech2 Cellic HTech2 là chế phẩm enzyme thương mại của hãng Novozymes Đan Mạch, Cellic HTech2 là một phức hợp đa enzyme bao gồm các enzyme hoạt tính: cellulase, hemicellulose, xylanase Nó cũng hoạt động trên các nhánh giống như pectin chất được tìm thấy trong thành tế bào thực vật. Chế phẩm enzyme thương mại Cellic HTech2 hoạt động tối ưu ở pH 5,0-5,5, nhiệt độ 45-50oC. 50
  63. Enzyme Cellic HTech2 cũng có thể sử dụng trong ngành công nghiệp, đặc biệt là nơi các sản phẩm hữu ích được chiết xuất từ nguyên liệu thực vật trong chế biến các loại ngũ cốc và rau quả. Nó có thể tăng cường sự sẵn có của tinh bột trong quá trình lên men làm giảm polysaccharide trong nguyên liệu thực vật. Nó thường làm giảm độ nhớt của vật liệu có nguồn gốc từ thực vật và do đó có thể cải thiện sản lượng khai thác. 2.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Phương pháp hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ Tách riêng cellulose từ nguyên liệu thực hiện theo phương pháp sau [37][109] Cân 10 g rơm đã được nghiền nhỏ (cỡ 1,0 mm) cho vào cốc thủy tinh, thêm vào đó 500 ml nước cất và 50 ml NaOH 10%. Cốc sau đó được đặt trong nồi đun cách thủy, cho đun sôi trong 5 phút, sau đó lọc dung dịch bằng cách đổ lên một mảnh vải popeline màu trắng đặt trên miệng phễu. Khi lọc xong, rơm được rửa với nước nhiều lần. Tiếp theo rơm được chuyển từ mảnh vải vào trong cốc thủy tinh bằng bình tia và thể tích khoảng 500 ml bằng nước cất, thêm vào đó 50 ml HCl 10%, hỗn hợp được đem đun sôi trong bình cách thủy 5 phút. Rơm lại được lọc rửa như trên. Tiếp theo, thêm 5 ml dung dịch NaClO. Hỗn hợp này được để ở chỗ tối trong 20 phút. Rơm được lọc, rửa, chuyển vào cốc thủy tinh và được clo hóa lần hai với NaClO trong 20 phút. Tiếp đó rơm được lọc qua vải, rửa sạch với nước lạnh, với 500 ml H2O2 2%, rồi rửa nhiều lần với nước sôi, cuối cùng cellulose còn lại sau khi đã được rửa sạch, được chuyển vào cốc đã biết khối lượng và sấy đến khô ở 100oC. Cân và xác định lượng cellulose thu được. Hình 2.3. Phương pháp Hypoclorit tách cellulose từ rơm rạ 51