Công nghệ sinh học (phần 1)

83 trang vanle 3150

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Công nghệ sinh học (phần 1)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

cong_nghe_sinh_hoc_phan_1.pdf

Nội dung text: Công nghệ sinh học (phần 1)

Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 1 ) microRNA kiểm soát chức năng của các tế bào gốc máu Tế bào gốc tạo máu cung cấp cho cơ thể nguồn tế bào máu ổn định, bao gồm hồng cầu – tế bào vận chuyển oxy và bạch cầu – tế bào tạo nên hệ thống miễn dịch. Tế bào gốc tạo máu (tế bào Hematopoitic) có thể tự tạo nhiều bản sao để chắc chắn rằng nó có đủ số lượng để cung cấp máu trong suốt một đời người. Điều này đòi hỏi nó phải đạt được sự cân bằng tinh tế giữa việc tự tái tạo và việc phát triển thành những dòng tế bào máu khác nhau. Sự mất cân bằng sẽ dẫn đến một số bệnh như bệnh bạch cầu (Leukemia) và bệnh thiếu máu (Anemia). Một yếu tố quan trọng để chống lại các căn bệnh liên quan đến rối loạn tế bào gốc máu là gia tăng sự hiểu biết về các gene và phân tử kiểm soát hoạt động của các tế bào gốc máu. Các nhà sinh học thuộc Viện Kỹ thuật California (Caltech, Mỹ) đã đạt được một bước tiến lớn trong quá trình nghiên cứu. Họ đã tìm ra một nhóm mới các phân tử có nồng độ cao trong tế bào gốc máu và nó có tác dụng điều tiết sử sản xuất tế bào gốc máu. David Baltimore, Giáo sư Sinh học Robert Andrews Millikan, người nhận giải Nobel năm 1975 Sinh lý và Y khoa, nghiên cứu chính của đề tài nói “khi những đoạn nhỏ bé của RNA (còn được gọi là microRNA hay miRNA) được kích thích biểu hiện ở nồng độ cao trong tế bào gốc máu
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - của chuột thí nghiệm, các miRNA sẽ cản trở hoặc thú đẩy chức năng của những tế bào này”. Bài báo về nghiên cứu này đã được công bố vào ngày 26/6/2010 trên phiên bản trực tuyến của Kỷ yếu của Viện Hàn lâm khoa học Quốc gia (The Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)). Ngạc nhiên hơn nữa, các nhà nghiên cứu đã tìm thấy một phần của miRNA, gọi là miR-125b, có một vai trò nổi bật. Khi nồng độ miR-125b hơi cao, nó sẽ đẩy mạnh việc sản xuất các tế bào máu trưởng thành từ các tế bào gốc máu tốt hơn nhiều so với các loại miRNA khác. “Nhưng khi mức biểu hiện của nó được đẩy lên mức cao hơn, nó sẽ nhanh chóng dẫn đến ung thư trong vòng 6 tháng”, Baltimore nói. Cơ chế chính xác của việc chuyển đổi công dụng này hiện nay vẫn chưa được làm rõ, nó được cho là có khả năng liên quan đến sự ức chế của miR-125b đến những gene đặc biệt đàn áp sự phát triển của khối u. “Chúng tôi ngạc nhiên khi thấy rằng ở nồng độ cao, miR-125b gây ra bệnh máu trắng cấp tính ở chuột” Aadel Chaudhuri, cử nhân thuộc Caltech, đồng tác giả của bài báo, nói. Bệnh máu trắng là bệnh mà các tế bào máu bình thường (bao gồm hồng cầu, tiểu cầu, bạch cầu) được thay thế bởi các tế bào bạch cầu bất thường phát triển liện tục không thể kiểm soát được, cuối cùng dẫn đến tử vong nếu không được điều trị. “Những nghiên cứu này được tiến hành trên chuột nhưng chúng tôi đã phân tích trên tế bào gốc máu của người và đã đã tìm thấy các miRNA với hàm lượng cao tương tự như trong chuột” theo Ryan O'Connell - người đang làm postdoc ở Caltech và là tác giả chính của bài báo đăng trên PNAS. Thêm vào đó, các nhà nghiên cứu đã tìm ra rằng sự biểu hiện của phân tử miRNA quan trọng đó tăng khả năng cấy ghép tế bào gốc máu của người khi nó đươc chuyển vào trong chuột. “Điều này chứng tỏ rằng sự biểu hiện và chức năng của các miRNA này được bảo tồn trong suốt quá trình tiến hóa” O’Connell nói. Aadel Chaudhuri nói “Điều này có nghĩa là hoàn toàn khả thi khi các bệnh về bạch cầu ở con người có thể được chữa trị bằng cách sử dụng các microRNA trong tế bào gốc mới được xác định này” “Các khám phá này khi kết hợp với báo cáo tương tự của bác sĩ David Scadden thuộc Bệnh viện Đa khoa Massachusetts và Viện Tế bào gốc Harvard cho thấy rằng các miRNA là những phân tử quan trọng kiểm soát chức năng của tế bào gốc máu” Aadel Chaudhuri nói “Những sự quan sát
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - này có sự liên kết chặc chẽ giữ chẩn đoán và điều trị ung thư và bệnh thiếu máu – căn bệnh do sự khiếm khuyết của tế bào gốc máu. Việc cấy ghép tế bào gốc máu đã trở thành phương pháp phổ biến trong điều trị ung thư, bệnh tự miễn dịch và thậm chí cả một số loại bệnh truyền nhiễm. Việc sử dụng các mức độ biểu hiện của miRNA trong tế bào gốc máu thông qua liệu pháp điều trị mục tiêu có thể được dùng để chứng minh thêm hiệu quả của cách tiếp cận này” “Hai nghiên cứu bổ sung cung cấp thêm bằng chứng rằng các miRNA là bộ phận điều khiển then chốt trong việc kiểm soát tỷ lệ các loại tế bào máu được tạo từ tủy xương của chuột và con người.” Baltimore nói. “Trong công việc này, chúng tôi đã chứng minh cơ chế này là có thật trong các tế bào gốc. Trong khi những nghiên cứu trước đó của chúng tôi và các nhà khoa học khác đã cho thấy mức độ của miRNA xác định nồng độ của các loại tế bào máu trưởng thành. Tuy nhiên liệu pháp miRNA mục tiêu (The targeting miRNAs therapy) vẫn là một thách thức lớn cho ngành Công nghệ sinh học”. Ngoài Baltimore, O'Connell và Chaudhuri, bài báo “MicroRNAs gia tăng trong quá trình biệt hóa tế bào gốc tạo máu điều tiết dài hạn việc sản xuất các tế bào gốc tạo máu” (MicroRNAs enriched in hematopoietic stem cells differentially regulate long-term hematopoietic output) còn có các đồng tác giả như Dinesh Rao, nhà khoa học trước đây làm việc tại Caltech và hiện nay thuộc Trường Y khoa David Geffen tại UCLA, William S. Gibson – Kỹ thuật viên của Caltech và Alejandro B. Balazs – nghiên cứu sinh hậu tiến sĩ của Caltech. Công việc nghiên cứu được tài trợ bởi Viện nghiên cứu Ung thư, Viện Tim, Phổi và Máu Quốc gia; Quỹ khoa học Quốc gia và Viện Ung thư Quốc gia. Tinh sạch protein I. Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn vị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. II. Nhận biết protein mục tiêu
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Kết quả của sự tinh sạch là một mẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thể như với enzyme lactate dehydrogenase, một enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhiên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn cần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng. III. Ly trích protein từ tế bào Khi đã tìm ra thử nghiệm phù hợp và chọn được nguồn protein, chúng ta cần phân đoạn dịch tế bào thành nhiều phần và xác định xem phần nào chứa nhiều protein mục tiêu. Quá trình tìm phân đoạn mục tiêu được phát triển bằng sự mày mò qua từng thí nghiệm. Bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, tạo thành hỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đoạn hỗn hợp bằng ly tâm, dịch nổi chứa phân tử có trọng lượng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơn lắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại được ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn và dịch nổi mới. Tiến trình này, được gọi là ly tâm phân đoạn, sẽ tạo được nhiều phân đoạn khác nhau với tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân tử protein khác nhau, sẽ được tinh sạch sau khi đã qua thử nghiệm hoạt tính. Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là nguồn vật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - IV. Thu nhận protein mục tiêu dựa trên độ hoà tan, kích thước, điện tích, và liên kết ái lực Hàng ngàn protein đã được tinh sạch ở dạng có hoạt tính dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực. Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng là một protein tinh sạch. Ở mỗi bước phân tách, thử nghiệm xác định hoạt tính và xác định nồng độ protein đều được thực hiện. Lượng đáng kể protein tinh sạch, khoảng vài miligram, có thể giúp ta biết được cấu trúc không gian ba chiều và cơ chế phản ứng của nó. Vì vậy, sản lượng toàn phần là một điểm quan trọng của quá trình tinh sạch. Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký. IV.1. Tủa bằng muối Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính hòa tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out). Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định. Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein. Ví dụ như fibrinogen tủa ở nồng độ muối ammonium sulfate 0.8 M trong khi phải đến nồng độ 2.4 M, albumin mới kết tủa. Hiện tượng này được sử dụng để tăng nồng độ của một dung dịch protein loãng chứa các phân đoạn có hoạt tính của các bước tinh sạch trước. Nếu cần thiết, lượng muối có thể được loại bỏ bằng sự thẩm tách IV.2. Sự thẩm tách Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ. Những phân tử có cấu trức không gian nhất định lớn hơn dường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi. Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau. IV.3 Sắc ký Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì nó thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh. Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách. Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (size exclusion chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (ion exchange chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (affinity chromagraphy) và sắc ký lỏng cao áp dựa vào kích thước của phân tử nhưng có độ phân giải cao nhờ vào áp suất (high pressure liquid chromagraphy). IV.3.1 Sắc ký lọc gel Phương pháp này tốt hơn các phương pháp trên vì nó dựa vào kích thước phân tử. Mẫu sẽ được nạp vào đầu một cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan nhưng có tính hydrate hóa cao như dextran, agarose (những dạng cabohydrate) hay polyacrylamide. Sephadex, Sepharose, và Bio-gel là những loại gel phổ biến trên thị trường có sẵn những hạt có lỗ với đường kính chuẩn là 100µm (0.1mm). Những phân tử nhỏ có thể ở cả bên trong lẫn giữa các hạt, trong khi đó những phân tử lớn hơn chỉ có thể ở bên ngoài các hạt. Vì vậy, những phân tử có kích thước lớn trong cột sẽ chảy nhanh hơn và ra ngoài trước . Phân tử có kích thước trung bình, có thể thỉnh thoảng vào được bên trong hạt sẽ rời khỏi cột ở vị trí giữa; còn những phân tử nhỏ sẽ phải đi qua đoạn đường dài hơn, quanh co nên sẽ ra sau cùng. IV.3.2 Sắc ký trao đổi ion Tại bất kỳ một điểm pH nào trừ điểm đẳng điện, các protein đều có mang một điện tích tương ứng với điểm pH đó. Dựa vào điện tích thực của chúng tại một điểm pH nhất định, ta có thể phân tách hỗn hợp protein. Phương pháp này gọi là phương pháp sắc ký trao đổi ion. Trong phương pháp này, pha tĩnh là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng. Cụ thể, nếu hạt mang điện âm (như cột carboxymethyl-cellulose (CM-cellulose)), tiến trình được gọi là sắc ký trao đổi ion dương, thì sẽ tương tác với những phân tử mang điện tích dương. Ngược lại, nếu hạt mang điện tích dương (như cột diethylaminoethyl-cellulose (DEAE- cellulose)), gọi là sắc ký trao đổi ion âm, thì tương tác với phân tử mang điện tích âm. Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột. Để phóng thích những protein này, ta tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử protein tương tác với các hạt mang điện tích. Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, ta thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch tách giải bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Hình 1: minh họa sắc ký trao đổi ion
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Hình 2: minh họa cơ chế giữa protein trong hệ sắc ký trao đổi ion (a) Những hạt mang điện tích dương sẽ trao đổi ion âm với dung dịch đệm. Protein tích điện âm cũng ion dương tương tác với nó (b) Khi protein gắn với hạt, protein thay thế những ion âm tương tác với hạt cũng như hạt thay thế những ion dương tương tác với protein IV.3.3 Sắc ký ái lực Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein. Kỹ thuật này dựa trên ái lực cao của nhiều protein với những nhóm hóa học chuyên biệt. Ví dụ, concanavalin A, một loại protein thực vật, có thể được tinh sạch khi cho qua cột mang những phân tử glucose bằng liên kết cộng hóa trị. Concanavalin A gắn vào cột bởi vì nó có ái lực cao với glucose, trong khi đó những protein khác thì không. Concanavalin A có thể được tách giải khỏi cột khi ta cho thêm dung dịch glucose đậm đặc vào. Phân tử đường trong dung dịch sẽ gắn với Concanavalin A thay thế những phân tử glucose nối với cột.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Hình 3: minh họa cho cơ chế tinh sạch Concanavalin A bằng sắc ký ái lực Sắc ký ái lực còn là một công cụ hữu hiệu trong việc tách các yếu tố phiên mã, những protein điều hòa sự biểu hiện gen thông qua việc gắn đặc hiệu với trình tự DNA. Hỗn hợp protein thấm qua cột có chứa những trình tự DNA đặc hiệu được gắn vào thể mang; những protein có ái lực cao với trình tự DNA sẽ bắt vào các trình tự và được giữ lại. Trong thí dụ này, yếu tố phiên mã sẽ được phóng thích khi rửa cột với dung dịch có hàm lượng muối cao. Ngoài ra, hiện nay người ta dựa vào tính đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể để tinh sạch kháng nguyên hay kháng thể. Nhìn chung, sắc ký ái lực có thể được dùng để tách một protein vốn có khả năng nhận biết một nhóm X bằng nối cộng hóa với nhóm này hay những chất dẫn xuất của nó được gắn trên một cái cột, sau đó nạp hỗn hợp protein vào cột, cột này sẽ được rửa lại để loại bỏ những protein không tạo được nối, cuối cùng là tách giải protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hay thay đổi điều kiện để làm giảm lực liên kết. Sắc ký ái lực là phương pháp tinh sạch hiệu quả nhất khi tương tác giữa protein và phân tử được dùng như mồi bắt protein có độ chuyên biệt cao. IV.3. Sắc ký lỏng cao áp
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tương tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp. Kết quả thực có sự phân giải cao và phân tách nhanh.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 2 ) Hợp chất Flavonoid trong thực vật có hoa “Các hợp chất flavonoid là một trong những yếu tố quyết định màu sắc của hoa. Quá trình sinh tổng hợp flavonoid là một quá trình biến dưỡng tổng hợp tự nhiên đã được nghiên cứu một cách rất sâu rộng. Theo đó, hợp chất flavonoid được sinh tổng hợp theo con đường sinh tổng hợp phenylpropanoid, chính là con đường tổng hợp thứ cấp chủ yếu trong tất cả thực vật bật cao. Hầu hết các enzyme cũng như các đoạn gene tương ứng cần thiết cho quá trình trên đều đã được nghiên cứu cụ thể; trong số đó nhiều protein đã được tinh thể hóa và phân tích cấu trúc.” Hoa hồng xanh được sản xuất tại công ty Florigene từ việc ứng dụng thành tựu của kỹ thuật di truyền trong sắc tố hoa. Hình ảnh sử dụng trong minh họa được sự cho phép từ Tiến sỹ T. Tanaka. Loài người đã bị thu hút bởi màu sắc hoa có lẽ một thời gian rất dài, thậm chí trước khi bắt đầu nền văn minh. Nhà triết học đời nhà Tống, Chu Tử khuyên người dân trân trọng “hàng ngàn sắc tím với hàng ngàn sắc đỏ từ
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - những đóa hoa mùa xuân”. Hầu hết hàng ngàn sắc đỏ và sắc tím đó bắt nguồn từ flavonoid, một nhóm sắc tố độc đáo nhưng là những sản phẩm vô cùng phổ biến của quá trình biến dưỡng thứ cấp qua con đường phenypropanoid. Chức năng chủ yếu của flavonoid trong hoa là dùng để thu hút côn trùng và các loài động vật khác giúp cho quá trình thụ phấn chéo. Cấu trúc và sự kết hợp độc đáo của các flavonoid ở mỗi loài khác nhau tạo nên các quang phổ cực tím và thông thường được nhìn thấy bởi các loài côn trùng và động vật lớn hơn giúp gia tăng hiệu quả của việc thụ phấn và sự thụ tinh của hoa. Flavonoid trong hoa còn giúp chống lại bức xạ cực tím và có vai trò như một chất bảo vệ chống lại mầm bệnh giống như vai trò của chúng ở những cơ quan khác của thực vật. Hơn nữa, trong nghiên cứu của Van der Meer và cộng sự năm 1992 đã xác định được một nhóm các flavonoid đóng vai trò quan trọng trong sự nảy mầm của hạt phấn, từ đó chứng minh những sắc tố này có chức năng vô cùng quan trọng trong vai trò chính yếu của hoa là sinh sản. Cấu trúc của flavonoids gồm có bộ khung carbon C6-C3-C6 thường có hai vòng thơm (vòng A và B) và một vòng carbon có một nguyên tử oxygen. Sắc tố anthocyannins là một phân nhóm của flavonoid hiện diện chủ yếu trong không bào của tế bào thực vật. Dựa vào các nhóm OH của vòng B, có ba nhóm anthocyanin chính được tìm thấy trong thiên nhiên là pelargonidin, cyanidin và delphinidin. Methyl hóa cyanidin và delphinidin tạo ra thêm ba nhóm anthocyanin bổ sung nữa là peonidin, petudin và malvidin. Màu sắc của hoa được xác định bởi các yếu tố trong tế bào cũng như các yếu tố điều khiển sự phân bố theo thời gian và không gian của các sắc tố ở cấp độ mô – cơ quan thực vật. Trong các tế bào của cánh hoa, màu sắc được điều hòa bởi ít nhất 6 yếu tố sau: 1. Sinh tổng hợp anthocyanin – là yếu tố quan trọng nhất; 2. Sinh tổng hợp các sắc tố khác như carotenoid và betalain; 3. Sự chuyển đổi các phân tử anthocyanin cơ bản trong các quá trình hydro hóa, methyl hóa hoặc kết hợp; 4. Các sắc tố phụ như flavone và các ion kim loại; 5. Sự thay đổi của pH trong không bào; 6. Cấu trúc và đặc tính sinh hóa của các siêu phân tử sắc tố.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Tất cả yếu tố trên đều có khả năng thay đổi cường độ và quang phổ của màu sắc hoa. Từ những năm đầu của thế kỷ 19 từ khi nhà di truyền học Gregor Mendel coi màu hoa như là một marker trong các thí nghiệm di truyền cổ điển của ông, sự khám phá flavonoid đã đóng góp rất to lớn cho sự phát triển của nền sinh học hiện đại. Ngược lại sự phát triển của sinh học hiện đại cũng giúp các nhà khoa học hiểu biết một cách sâu rộng khoa học di truyền và sinh hóa của màu sắc hoa. Sự glycosyl hóa protein ở Eukaryote Các glycoprotein chiếm thị phần chính trên thị trường các protein dược phẩm. Hầu hết các protein này đều được sản xuất bởi công nghệ protein tái tổ hợp nhờ vào việc sử dụng các hệ thống biểu hiện như vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật. Hệ thống biểu hiện của nấm men và tế bào động vật có nhiều ưu điểm trong sản xuất các protein tái tổ hợp. Ở sinh vật nhân chuẩn, các protein thường được biến đổi sau quá trình dịch mã, điều này có liên quan mật thiết đến hoạt tính của các protein. Sự glycosyl hóa là sự biến đổi thông dụng nhất trong các hệ thống này và nó cần thiết cho các chức năng của protein như sự nhận diện, sự truyền tín hiệu, sự tương tác giữa các protein và tế bào. Vì vậy, bộ máy glycosyl hóa của các hệ thống này là một vấn đề rất quan trọng mà chúng ta cần phải hiểu khi biểu hiện một protein nào đó. 1. Các dạng glycosyl hóa protein 1.1. Glycosyl hóa protein ở vị trí N Sự glycosyl hóa protein ở vị trí N là quá trình biến đổi sau dịch mã được bảo tồn ở nấm men và các eukaryote khác. Glycosyl hoá ở vị trí N bắt đầu từ mạng lưới nội chất (ER) với sự chuyển chuỗi oligosaccharide vào vị trí asparagine của một protein [19,20]. Vị trí gắn bao gồm trình tự ba axit amin là Asn-Xaa-Ser/Thr nơi mà vị trí thứ hai không phải là Pro. Chuỗi oligosaccharide này chứa 3 phân tử đường glucose ở đuôi không khử của cấu trúc lõi Man9GlcNAc2 gắn vào protein và nó bị cắt bởi các enzyme glucosidase của lưới nội chất và enzyme α-1,2 mannosidase và đi vào bộ máy Golgi . Cơ chế glycosyl hóa ở vị trí N: - Glc3Man9GlcNAc2 được tập hợp ở mạng lưới nội chất nhám và được biến đổi thành Man8GlcNAc2.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - - Sự cắt bỏ bớt các phân tử đường diễn ra trong Golgi bởi các enzyme mannosidase tạo thành Man5GlcNAc2 để tổng hợp các oligosaccharide phức tạp hoặc hình thành các oligomannoside. - Sự chuyển thành dạng đa anten phức tạp xảy ra ở thuỳ giữa của Golgi và trans-Golgi, có hoặc không có đuôi sialic acid, và từ đó protein được tiết ra môi trường ngoại bào. 1.2. Glycosyl hóa ở vị trí O Sự glycosyl hóa ở vị trí O là việc tạo liên kết cộng hóa trị giữa một monosaccharide với axit amin Ser hay Thr. Tính đặc hiệu của trình tự cho thấy Glycosyl hoá ở vị trí O không quyết định sự gấp cuộn và tính tan của protein. Dạng phổ biến của hiện tượng glycosyl hoá ở vị trí O ở người thường xảy ra ở Golgi , liên quan tới sự chuyển GalNAc từ UDP-GalNAc sang axit amin Ser hoặc Thr thông qua hoạt động của enzyme GalNAc transferase kéo theo sự chuyển của hàng hoạt các phân tử đường khác nhau như galactose, GalNAc, and N-GlcNAc, fucose, glucose, mannose, hydroxyproline 2. Sự glycosyl hóa protein ở tế bào động vật có vú
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Các tế bào động vật có vú (như tế bào CHO, tế bào myeloma, tế bào HEK) đang được ưa chuộng bởi vì bộ máy glycosyl hoá của chúng rất giống ở người, mặc dù các phân tử đường được gắn vào protein không hoàn toàn giống ở người, chúng vẫn được bán trên thị trường. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N đều có cấu trúc nhánh chuẩn bao gồm mannose, galctose, N-acetylglucosamine (GlcNAc) và axit neuramic. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí O thì bao gồm một số lượng phân tử đường khác nhau bao gồm galactose, N- acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, axit sialic và axit neuramic. Kiểu mẫu glycosyl hóa các protein dược phẩm được sản xuất bởi hệ thống tế bào động vật có vú là khác nhau và thay đổi theo từng mẻ. Vì vậy, sự đa dạng này phải được kiểm tra lâm sàng và tiền lâm sàng. Trong thực tế, các kiểu mẫu glycosyl hóa này có thể được thay đổi bằng cách tối ưu hóa quy trình lên men, sử dụng các enzyme biến đổi, hoặc tạo ra những hệ thống biểu hiện được làm giàu hoặc loại bỏ những dạng gắn phân tử đường đặc biệt nào đó. 3. Sự glycosyl hóa protein ở hệ thống nấm men Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc sản xuất các glycoprotein dược phẩm bởi dễ thao tác, dễ sản xuất với quy mô lớn, chi phí sản xuất thấp và chu kỳ sản xuất ngắn. Một ưu điểm khác là chúng có khả năng tạo ra các kiểu mẫu glycosyl hóa giống nhau và đã được hiểu rõ vai trò của phần carbonhydrate. Các protein được glycosyl hóa ở vị trí N trong S. cerevisiae có đặc điểm phân nhánh rất nhiều và mang rất nhiều đường mannose. Trong khi các protein được glycosyl hóa ở vị trí O chỉ bao gồm nhiều nhất là 5 phân tử mannose. Sự glycosyl hóa ở vị trí N trong Pichia hầu hết bao gồm chuỗi ManGlcNAc, giống với kiểu glycosyl hóa protein điển hình trong tế bào động vật có vú. In Pichia, the outer oligosaccharide chain of secreted proteins is mostly unaltered and consists of Man8–9GlcNAc2. Mặc dù có nhiều sự khác nhau về số lượng và độ phức tạp của sự kiểu glycosyl hóa liên kết với N được thấy, nhưng chúng vẫn có chứa trình tự bảo tồn nhận biết cho sự khởi đầu sự glycosyl hóa, Asn-Xaa-Ser/Thr. Ở Pichia có sự gắn chuỗi oligosaccharide tại vị trí O nhưng nó không phải là thành phần quan trọng của các glycoprotein tan. Sự gắn chuỗi oligosaccharide chỉ bao gồm các phân tử mannose. Tuy nhiên, số lượng
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - mannose trên một chuỗi, các liên kết tạo ra, tần số và tính đặc hiệu của sự glycosyl hóa ở vị trí O trong Pichia pastoris vẫn chưa xác định được. Chúng ta không nên thừa nhận rằng một protein không bị glycosyl hóa ở vị trí O trong tế bào chủ tự nhiên thì sẽ không bị glycosyl hóa trong Pichia. 4. Các enzyme dùng cho nghiên cứu về glycoprotein Các enzyme thường được sử dụng trong những nghiên cứu về cấu trúc đường của các glycoprotein: Enzyme Loại enzyme Sự đặc hiệu Endoglycosidase Endo Cắt các phân tử D glycan chứa nhiều mannose Endoglycosidase Endo Cắt các phân tử F glycan chứa nhiều mannose Endoglycosidase Endo Cắt các phân tử H glycan chứa nhiều mannose β-galactosidase Exo Loại bỏ các enzyme galactosidase khỏi Gal-β1, 5, 8, 9 3-GlcNAc; Gal- β1,4-GlcNAc; Galβ1,3 GalNAc N-glycosidase F Endo Các glycoprotein giữa Asn và GlcNAc Stalidases Exo NeuAc-α2,6-Gal; (Neuraminidases) NeuAc-α2,6- GlcNAc; 2 or NeuAc-α2,3- Ga 5. Kết luận
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Glycosyl hóa là một quá trình phức tạp và đa dạng trong các sinh vật nhân chuẩn. Vì vậy, nó không thể khái quát hóa theo những kiểu mẫu glycosyl hóa chuẩn. Trước khi biểu hiện một protein tái tổ hợp, chúng ta nên hiểu rõ hệ thống biểu hiện và phải nắm được mục đích sử dụng của sản phẩm. Các nhà khoa học đang cố gắng tạo ra các chủng vi sinh vật mới có khả năng tổng hợp các glycoprotein với cấu trúc giống với khi chúng được tổng hợp ở người. Gần đây, nhóm nghiên cứu của Roland Contreras ở trường đại học Ghent, Bỉ và Tillman Gerngross ở trường Glycofi, Boston, Mỹ đã báo cáo về việc tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng sản xuất protein với kiểu gắn mannose giống với ở con người. Nhóm nghiên cứu này hy vọng sẽ có thể tạo ra được chủng Pichia pastoris có khả năng tổng hợp được các protein hoàn toàn giống như chúng được tổng hợp ở con người
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 3 ) MicroRNA làm giảm tác động của cocaine Người sử dụng cocaine sẽ bị nghiện càng ngày càng nặng. Tuy nhiên, về lâu dài, cocaine bị hấp thu vào cơ thể sẽ cảm ứng sự biểu hiện của một loại vi RNA (microRNA) trong não. MicroRNA này dường như có khả năng làm giảm lượng cocaine mà con nghiện phải dung nạp. Bộ não có một khả năng đáp ứng lại với những tín hiệu từ môi trường rất to lớn và do đó những điều kiện khác thường cũng dần dần trở nên bình thường. Việc sử dụng lâu dài những chất gây nghiện như cocaine, heroin, và nicotine sẽ dẫn đến sự thích nghi về mặt thần kinh, làm cho người sử dụng bị “lờn thuốc”, kém nhạy cảm với những chất này. Một người nghiện lâu năm chỉ có phản ứng vừa phải với một lượng heroin tương đối lớn, trong khi đó lượng heroin này có thể gây các phản ứng sốc quá liều đối với những người mới “tập tành”. Do đó những con nghiện lâu năm chỉ cảm thấy bình thường nếu có heroin trong người, và liều chất gây nghiện phải ngày càng cao thì mới gây những cảm giác hưng phấn cho họ. Nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Paul J. Kenny tại Viện nghiên cứu Scripps ở bang Florida (Hoa Kỳ) vừa công bố trên Tạp chí Nature số 466 (năm 2010) về việc phát hiện một cơ chế phân tử giới hạn lượng chất gây nghiện cần cho chuột đã bị nghiện cocaine trong thời gian dài. Những thay đổi trong mạng lưới tế bào thần kinh (neuron) làm cho phản ứng của cơ thể đối với một loại chất gây nghiện giảm dần, thường được gọi là “quen thuốc”. Sự linh hoạt của hệ thống nội cân bằng này khởi đầu từ những phản ứng ở mức phân tử và tế bào của mạng tế bào thần kinh đối với những thay đổi môi trường. Chúng có liên quan đến sự kích hoạt các phản ứng thích nghi thứ cấp ở mức phân tử buộc các chức năng tế bào và mạng thần kinh quay trở lại mức bình thường. Tuy nhiên, nếu sử dụng chất gây nghiện trong thời gian dài thì khả năng thích nghi này sẽ bị phá vỡ, dẫn đến nhiều thay đổi trong hành vi như lên cơn nghiện và cảm giác thôi thúc phải dung nạp thêm thuốc. Nhóm nghiên cứu trên đã tìm ra một microRNA, gọi là miR-212, có tác động làm giảm biểu hiện của một nhóm gene có liên quan đến hành vi tìm kiếm thuốc ở chuột. Thí nghiệm của nhóm cho thấy nếu làm tăng sự biểu hiện của miR-212 thì lượng cocaine cần thiết giảm đi ở chuột cho nghiện đã lâu, trong khi nếu ức chế sự biểu hiện của microRNA này thì chuột phải cần có nhiều cocaine hơn.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Các microRNA được nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Victor Ambros (Đại học Harvard, bang Massachussetts, Hoa Kỳ) phát hiện lần đầu tiên vào năm 1993 ở tuyến trùng Caenorhabditis elegans và sau đó được chứng minh là có khả năng bất hoạt các gene liên quan đến phát triển. Bộ gene người mang hơn 1000 loại trình tự có khả năng là microRNA. Điều này khiến cho các nhà khoa học đặt ra giải thiết rằng các trình tự không mã hóa cho protein này có thể có vai trò quan trọng trong việc điều phối các thay đổi ở mức phân tử dẫn tới sự thay đổi hành vi cơ thể như trong trường hợp ở chuột. Công trình của nhóm Paul J. Kenny về khả năng microRNA giới hạn các thay đổi hành vi ở chuột nghiện cocaine mở ra một phương thức mới nhằm tìm hiểu các cơ chế tiến hóa chống lại sự nghiện hút ở người. Một phát hiện nữa rất thú vị từ nghiên cứu của nhóm Paul J. Kenny là miR-212 điều hòa hoạt động của CREB, đây là một nhân tố điều hòa phiên mã có liên quan đến cảm giác “phê” cocaine. Hai nhóm nghiên cứu của Tiến sĩ Eric J. Nestler (Đại học Yale, bang Conneticut) và Tiến sĩ Robert C. Malenka (Đại học Standford, bang California) ở Mỹ đã chứng minh rằng làm giảm hoạt động của CREB ở vùng vân bụng, tức là vùng kiểm soát cảm giác “phê” cocaine trên não, thì cảm giác “phê” thuốc sẽ tăng lên và ngược lại. Nhóm của Paul J. Kenny cho rằng cho chuột sử dụng cocaine trong thời gian dài sẽ làm tăng hoạt động của cả CREB lẫn cofactor của nó là TORC và cả hai sẽ điều hòa sự phiên mã của miR-212. Cơ chế này tạo ra một vòng điều hòa phản hồi, CREB-TORC làm tăng sự biểu hiện của miR-212, rồi đến lượt miR-212 làm tăng hoạt động của CREB-TORC và do đó làm giảm lượng cocaine cần phải sử dụng. Tuy nhiên, cơ chế này chỉ có tác dụng ở cơ thể của những con nghiện lâu năm. Nhóm Paul J. Kenny còn xác định con đường phân tử giới hạn lượng cocaine sử dụng của miR-212 (xem hình). Hầu hết các microRNA ngăn cản sự phiên mã của gene mục tiêu. MicroRNA trong công trình mới này cũng không phải là ngoại lệ, khi miR-212 được tăng biểu hiện thì các protein giới hạn hoạt tính của Raf1 (một GTPase nhỏ, có vai trò then chốt trong việc phát sinh chất truyền tín hiệu thứ cấp AMP-vòng nhờ enzyme adenylyl cyclase) bị giảm biểu hiện. Các tác giả xác định một vị trí bám chuyên biệt cho miR-212 trên vùng promoter của gene mã hóa cho SPRED1, một trong những protein giới hạn sự truyền tín hiệu do Raf1 điều hòa. Khi biểu hiện một dạng “kháng” miR-212 của SPRED1 thì miR-212 không còn khả năng giới hạn lượng cocaine sử dụng nữa. Khi miR-212 ức chế sự biểu hiện của SPRED1 và các protein ức chế Raf1 khác thì hoạt tính của Raf1 tăng lên, tạo ra nhiều AMP-vòng hơn, dẫn đến tăng hoạt tính phosphoryl hóa và hoạt tính của CREB. Ở mỗi bước trong con đường truyền tín hiệu này, các tác giả đều chứng minh rằng bắt
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - chước theo hoạt động của miR-212 thì lượng cocaine sử dụng sẽ bị giới hạn, còn ngược lại thì làm tăng lượng cocaine sử dụng ở chuột nghiện. Hình: Con đường hoạt động của miR-212 Nghiên cứu này có ý nghĩa rất to lớn. Vì các nhân tố môi trường có thể cảm ứng sự biểu hiện của các microRNA chuyên biệt dẫn đến thay đổi sự nội cân bằng nên khoa học có thể phát triển các phương pháp chữa trị nghiện thuốc hay ma túy ở người bằng cách lặp lại hoạt động của các microRNA. Khả năng thay đổi nội cân bằng dẫn tới sự “quen” thuốc. Để tiếp tục nghiên cứu này, các nhà khoa học nên tìm hiểu xem miR-212 có liên quan đến việc cơ thể “quen” với cocaine không; và một khi con nghiện ngưng sử dụng cocaine, sự “quen” thuốc có làm tăng các triệu chứng rối loạn khi cai nghiện hay không. Insulin và công nghệ sản xuất insulin trên thế giới Người ta đã nhận thấy rằng bệnh tiểu đường là một trong những căn bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.Trên thế giới, con số những người mắc bệnh tiểu đường ước tính khoảng từ 151 triệu đến 171 triệu (năm 2000), và dự kiến con số này sẽ là 221 triệu (năm 2010), năm 2030 sẽ lên đến 366 triệu người. Và đương nhiên, việc gia tăng con số những người mắc bệnh tiểu đường sẽ kéo theo sự gia tăng các biến chứng của căn bệnh này như thần kinh,
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - xơ vữa động mạch Theo ước tính, số người tử vong trên thế giới do bệnh tiểu đường trong năm 2000 là 2,9 triệu và con số này sẽ còn tiếp tục gia tăng. Trong đó, tiểu đường type 2 chiếm khoảng hơn 90% tổng số ca bệnh. Điều đó đòi hỏi phải tìm ra những hướng tiệp cận mới cho việc ngăn ngừa và điều trị căn bệnh này. Bệnh tiểu đường là một căn bệnh chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố. Tiểu đường gây ra do tác động phức tạp giữa gene và các yếu tố môi trường, từ đó dẫn tới sự bất bình thường trong quá trình điều hoà lượng glucose trong cơ thể liên quan tới những vấn đề về hormone insulin. Insulin là một hormone được tiết ra bởi tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy khi động vật tiêu ăn thức ăn, đây là hormone quan trọng nhất cho quá trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin và acid béo và duy trì lượng đường trong máu. Hàm lượng đường trong máu (hay còn gọi là hàm lượng glucose trong máu) là nguồn năng lượng thiết yếu cho cơ thể. Nếu lượng đường trong máu không duy trì ở mức bình thường có thể gây ra những căn bệnh nguy hiểm. Hàm lượng đường trong máu tăng có thể gây ra sự bài tiết đường qua nước tiểu, kết quả là bị mất glucose, hiện tượng này còn gọi là bệnh tiểu đường. Nếu tình trạng này tiếp diễn trong thời gian dài, sẽ gây ra những biến chứng nguy hiểm trong mô, các cơ quan của cơ thể. Mặt khác, hàm lượng đường trong máu giảm dẫn đến năng lượng cung cấp cho cơ thể bị thiếu hụt gây nguy hiểm cho sự duy trì cơ thể sống. Hàm lượng đường trong máu được duy trì ở mức bình thường là do sự cân bằng giữa các yếu tố làm tăng lượng đường trong máu (như glucagon, hormone, cortisol, catecholamine) với các yếu tố làm giảm lượng đường trong máu. Insulin là hormone duy nhất có thể làm giảm lượng đường trong máu. Do đó, khi khả năng tiết hormone này giảm đi (do một số nguyên nhân) thì insulin không cung cấp đủ cho cơ thể gây ra bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus - IDDM), còn gọi là tiểu đường type I. Với những bệnh nhân mắc tiểu đường type I thì insulin là phương thuốc điều trị duy nhất. Insulin người là một polypeptide bao gồm một chuỗi A với 21 acid amin và một chuỗi B với 30 acid amin, có một cầu nối disulfur trong chuỗi A và 2 cầu nối disufur nối giữa hai chuỗi A và B. Insulin ban đầu được tổng hợp ở dạng “preproinsulin” (tiền insulin) trên ribosome trong tế bào beta trong đảo Langerhans của tuyến tụy. Preproinsulin là một phân tử dạng thẳng bao gồm: một peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (C) và chuỗi A nối với nhau theo thứ tự SP-B- C-A. Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo ra
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - proinsulin (B-C-A). Proinsulin hình thành cầu nối disulfur trong lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba. Proinsulin bị phân cắt bởi enzyme PC1/3 tại liên kết giữa chuỗi B và peptide C và sau đó bị phân cắt bởi enzyme PC2 ngay vị trí liên kết giữa chuỗi A và peptide C. Hai acid amin đầu N của peptide nối với đầu C của chuỗi B khi bị phân cắt bởi PC1/3 sẽ được phân cắt ra khỏi chuỗi B bởi enzyme carboxypeptidase H. Kết quả cuối cùng của quá trình phân cắt tạo thành insulin. Hình 1. Cấu trúc của phân tử insulin Trong năm 2005, nhu cầu insulin dùng trong trị bệnh tiểu đường ước tính khoảng 4.000 đến 5.000 kg và dự kiến năm 2010 là 16.000 kg. Nhu cầu về insulin của thế giới vượt qua con số vài tấn/năm và vì thế nguồn cung cấp insulin cho trị bệnh tiểu đường đang thiếu hụt. Từ những thập niên 1920 cho đến những năm đầu của thập niên 1980, insulin được tạo ra bằng cách cô lập từ tuyến tụy của động vật như heo và bò. Tuy nhiên, insulin người có sự khác biệt trong thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí trong chuỗi A và một vị trí trong chuỗi B) và insulin heo (một vị trí trong chuỗi B). Do đó gây ra những tác dụng không mong muốn (như dị ứng) khi sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bò. Ngoài ra, quá trình sản xuất và tinh sạch insulin từ động vật còn gặp nhiều khó khăn. Sau đó, các phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo và bò đã được phát triển bằng các sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin. Tuy nhiên, insulin tái tổ hợp được sản xuất bằng công nghệ tái tổ hợp di truyền hiện đang được sử dụng chủ yếu do chi phí sản xuất thấp và hiệu quả sản xuất cao. Insulin người được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền đầu tiên tạiCông ty Genetech (Hoa Kỳ) và sản phẩm này được đưa ra thị trường vào năm 1982. Trong lịch sử, đây cũng là lần đầu tiên các nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Về sau, nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp đã được phát triển. Ví dụ: phương pháp sản xuất của Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất này biểu hiện chuỗi A và chuỗi B riêng biệt bằng cách sử dụng Escherichia coli, sau đó thu chuỗi A và chuỗi B, trộn với nhau in vitro tạo cầu nối disulfur. Phương pháp này có hiệu quả sản xuất thấp. Do đó, Eli Lilly phát triển một phương pháp cải tiến hơn, phương pháp này biểu hiện proinsulin thay vì biểu hiện chuỗi A và B riêng biệt như phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau đó phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A và B bằng trypsin và carboxypeptidase, tạo thành insulin. Hình 2. Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt Một phương pháp khác được phát triển bởi tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp này biểu hiện miniproinsulin bao gồm chuỗi B và chuỗi A nối với nhau bằng 2 acid amin, được biểu hiện trong nấm men, sau đó xử lý miniproinsulin in vitro bằng trypsin tạo thành insulin. Phương pháp này có nhiều thuận lợi như cầu nối disulfur được hình thành trong quá trình biểu hiện và quá trình tiết miniproinsulin, và miniproinsulin này được tách chiết và tinh sạch dễ dàng do được tiết thẳng ra môi trường nuôi cấy. Hiện tại, người ta vẫn tiếp tục phát triển những phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp. Công ty Hoechst đã đưa ra một phuơng pháp sản xuất insulin bao gồm: biểu hiện một dạng dẫn xuất mới của insulin hoặc biểu
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - hiện preproinsulin trong E. coli; tạo các cầu nối disulfur invitro; sau đó, xử lý bằng lysylendopeptidase hoặc clostripain/carboxypeptidase B; cuối cùng tạo ra insulin. Mới đây nhất, Công ty Bio-Technology General đã đưa ra một phương pháp mới. Trong phương pháp này, một dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin được biểu hiện trong tế bào E. coli. Bằng cách này, hiệu suất của quá trình biểu hiện protein và hiệu quả của quá trình hình thành các cầu nốii. Sau đó, proinsulin được chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin và carboxypeptidase B. Bằng những cách tương tự như thế, người ta đã đưa ra ngày càng nhiều các phuơng pháp sản xuất insulin tái tổ hợp và cải tiến nhièu hơn để nâng cao hiệu quả của các quá trình biểu hiện protein, hình thành cầu nối disulfur, chuyển proinsulin thành insulin. Hình 3. Sản xuất insulin tái tổ hợp trên vi khuẩn Hiện nay, hầu hết những phương pháp sản xuất insulin thương mại đều dựa trên các chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) hoặc vi khuẩn (E. coli) kết hợp với các kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp. Người ta nuôi cấy các chủng này trên quy mô lớn, trong những bồn lên men bằng thép đặt tiền, sau đó, insulin được ly trích ra, tinh sạch để được sản phẩm cuối cùng.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Nói về các hệ thống tế bào dùng để biểu hiện insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng rất đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật và cả thực vật. Trong số đó, tế bào vi sinh vật được sử dụng nhiều nhất do chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng ở quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều nhất là E. coli và nấm men. Gần đây, người ta đưa ra một hệ thống biểu hiện khác cho các loại protein tái tổ hợp – đó là Bacillus brevis. Mục đích của những nghiên cứu, phát minh hiện tại là muốn phát triển một hệ thống biểu hiện và 1 phương pháp sản xuất insulin có năng suất cao và hiệu quả sản xuất phải ngang bằng hay vuợt trội hơn so với những hệ thống sản xuất insulin đã từ trước tới nay. Hay nói cách khác, các nghiên cứu trong giai đoạn này nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển các tiền chất của insulin thành insulin; nghiên cứu tìm ra môi trường tối ưu cho việc hình thành các cầu nối cần thiết cho việc biểu hiện hoạt tính của insulin; tìm ra một hệ thống biểu hiện insulin cho năng suất, sản luợng cao.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 4 ) Dung hợp protoplast và lai vô tính tế bào thực vật Các phương pháp lai tế bào thực vật - dung hợp tế bào trần được ứng dụng trong tạo giống thực vật. Hiện nay có các phương pháp dung hợp tế bào trần như sau : 1. Xử lý bằng NaNO3 Năm 1970, Power và cs. Đã dung NaNO3 (0,25 M) kích thích dung hợp hai protoplast. Carlson và cs. (1972) cũng dung phương pháp này để sản xuất cây lai đầu tiên (Nicotiana glance × N. langsdorffii). Tuy nhiên phương pháp này cho hiệu suất thấp vì NaNO3 không thích hợp với tế bào bị không bào hoá mạnh như protoplast từ nhu mô lá. 2. Xử lý bằng PEG Tác nhân kích thích dung hợp là PEG (polyethylene glycol). Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của thí nghiệm dung hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp (<100) không thể tạo ra một sự dính chặt chắc chắn, trong khi PEG trọng lượng phân tử 6000 cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống sót của protoplast. PEG có hai tác dụng: hoặc cung cấp cầu nối để Ca2+ có thể liên kết các bề mặt màng với nhau hoặc dẫn đến sự rối loạn điện tích bề mặt màng trong suốt quá trình rửa giải. 3. Dung hợp bằng điện Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây độc đối với tế bào như thường tìm thấy ở các protoplast hoặc các thể dị nhân được xử lý bằng PEG. Senda và cs. (1979) là những người đầu tiên nghiên cứu theo hướng dung hợp bằng điện ở Rauwolfia. Sau đó Zimmermann và Scheurich (1981) cũng đã chứng minh rằng các protoplast có thể dung hợp bằng điện trường và đưa ra một protocol có thể sử dụng rộng rãi. Quá trình dung hợp bao gồm hai bước: Đầu tiên các protoplast được đưa vào một ngăn dung hợp nhỏ có 2 dây kim loại song song với nhau đóng vai trò là các điện cực. Tiếp theo, sử dụng điện áp thấp và trường AC dao động nhanh, kích thích các protoplast sắp xếp thành chuỗi tế bào giữa các điện cực.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Phương pháp này cho phép tế bào tiếp xúc hoàn toàn với nhau trong một vài phút. Sau khi các tế bào xếp hàng hoàn chỉnh, quá trình dung hợp được thực hiện theo từng đợt ngắn của xung DC điện áp cao. Xung DC điện áp cao tạo ra sự phá vỡ thuận nghịch của màng nguyên sinh chất ở vị trí tiếp xúc của các tế bào, tạo ra sự dung hợp và tái tổ chức lại màng một cách hợp lý. Quá trình bắt đầu từ lúc đưa các protoplast vào bên trong ngăn và chuyển chúng lên môi trường nuôi cấy, có thể được hoàn chỉnh trong 5 phút hoặc ít hơn. Các thể dị nhân hình thành nhờ dung hợp bằng điện đã phân chia trong môi trường nuôi cấy và có khả năng tái sinh chồi hoặc cây lai soma. Phương pháp tạo tế bào trần trong lai tế bào Tế bào thực vật khác biệt với tế bào động vật về nhiều đặc tính trong đó có đặc tính là tế bào thực vật có thành cellulose bao quanh (cell wall) sau đó đến màng nguyên sinh (membrane). Thành cellulose giữ cho tế bào thực vật có hình dáng nhất định, còn các hợp chất pectin nằm trong thành có nhiệm vụ liên kết gắn các tế bào với nhau thành mô. Màng nguyên sinh cho phép protoplast có thể hấp thu vào tế bào các đại phân tử (acid nucleic, protein) thậm chí cả các cơ quan tử như lục lạp, ty thể. Nếu để các protoplast cạnh nhau, chúng có thể hòa làm một, đó là hiện tượng dung hợp tế bào. Nếu các protoplast có nguồn gốc từ các tế bào soma thuộc các giống, loài hoặc chi dung hợp lại thì có thể dẫn đến hiện tượng lai tế bào soma. Có một số phương pháp phân lập protoplast sau đây: 1. Phương pháp cơ học Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất cùng màng sinh chất tách khỏi vỏ cellulose. sử dụng kim nhọn và dao phẩu tích để cắt các mô cùng lớp vỏ, sau đó ngâm vào môi trường nuôi cấy pha loãng, tế bào chất sẽ phồng to và tách khỏi vỏ cellulose ra ngoài, tạo thành các protoplast tự do. Phương pháp này cho hiệu suất thấp. Sự phân lập protoplast của thực vật bậc cao bằng phương pháp cơ học được Klercker tiến hành đầu tiên vào năm 1892. Nói chung, các protoplast được phân lập từ các tế bào không bào hóa cao của các mô dự trữ như chồi hành (bulbs) và vảy hành (scales) của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả giữa của dưa chuột và rễ củ cải đường. 2. Phương pháp sử dụng enzyme
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Phương pháp này có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ học. Phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Do vách tế bào có thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose, nên sử dụng enzyme pectinase, cellulase, hemicellulase để phân hủy lớp vỏ tạo tế bào trần. Tùy theo loại mô và cây được sử dụng, người ta thay đổi nồng độ enzyme thích hợp. Protoplast thực chất là tế bào trần không có thành nên có thể tách được từ nhiều nguồn khác nhau như các bộ phận của cây (lá, rễ, hạt phấn ), callus, tế bào đơn, Để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy, phải bổ sung những chất tăng áp lực vào dung dịch enzyme để duy trì thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài Phương pháp gây đa bội Năm 1895 lần đầu tiên Hugo De Vries tìm ra một dạng đa bội trong tự nhiên ở cây Oenothera lamarckiana. Cây này có kích thước khổng lồ và sinh trưởng rất nhanh. Nhưng mãi đến 1907, sau công trình nghiên cứu về tế bào học của Lute người ta mới biết nó là một cây tứ bội. Bằng phương pháp gây mô tái sinh, Winkler (1916) là người đầu tiên đã thu được những dạng đa bội ở một số loài cà như Solanum nigrum và S. lycopersicum. Phương pháp này khá đơn giản: khi cây con được 6; 7 lá thật thì khía 1/2 ngọn cây rồi ghép trở lại chổ cũ, hoặc cắt ngọn chính và những cành bên. Sau 10-14 ngày, từ vết ghép hoặc chổ bị thương tổn sẽ hình thành nên những cành mới. Trong số những cành như vậy, có thể có một số là đa bội. Nguyên nhân gây ra hiện tượng đa bội ở phương pháp này có thể là do sự hình thành các cành đa bội từ những mô đã bị phân hoá sau khi xử lý hoặc do sự kết hợp nhân giữa các tế bào của các mô sát thương. Với phương pháp dùng tia Rơnghen để xử lý, lần đầu tiên vào năm 1930 Goodspeed và Demol đã thu được những dạng đa bội ở thuốc lá và một số cây khác. Bằng phương pháp lai cũng có khả năng thu được những dạng cây đa bội. Có ý nghĩa lớn nhất là công trình của Carpesenco (1927) khi lai giữa củ cải Raphanus sativus với bắp cải Brassica oleracea, con lai thu được bất thụ, nhưng dạng dị tứ bội của nó lại hữu thụ cao. Song, việc tạo dạng đa bội bằng những tác nhân hoá học vẫn là phương pháp được nhiều người chú ý và có hiệu quả nhất. Ngay từ 1896 Gheraximop đã dùng clorofooc, ete, cloralhydrat tác động đến tảo Spyrogyra. Tuy nhiên, chỉ sau những công trình thực nghiệm của Blakeslee và Avery (1937) về việc sử dụng chất colchicine thì vấn đề đa bội thể thực nghiệm mới có những bước tiến khổng lồ. Cùng với
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Blakeslee và Avery, những công trình rất có giá trị tiếp theo của Levan, Dustin, Kostov, Navasin, Gheraximop, Lương Đình Của v.v. đã mở ra một kỷ nguyên mới trong phương pháp gây đa bội thể thực nghiệm. Khi sử dụng colchicine người ta rút ra những kết luận sau: (i) Colchicine ở dạng dung dịch có khả năng khuếch tán mạnh vào các mô thực vật; (ii) Hiện tượng đa bội hoá chỉ xảy ra do tác dụng của colchicine đến những mô đang phân chia mạnh; (iii) Khả năng cho cây đa bội tăng lên trong những điều kiện gieo trồng tốt; (iv) Thời gian xử lý thích hợp tuỳ thuộc vào thời gian phân bào khác nhau của các loài cây; (v) Nồng độ colchicine được sử dụng tuỳ từng loài cây. Phương pháp xử lý và thời gian xử lý Colchicine là một alkaloid có ở nhiều loài thực vật, nhưng chủ yếu là ở loài Colchicum autumnale (tập trung ở vùng Địa trung hải). Bộ phận của đối tượng được xử lý có thể là hạt, mầm cây, chồi, nách, rễ, hoa Colchicine rất dễ tan trong nước, ở dạng dung dịch nó khuếch tán rất mạnh vào các mô. Trong phạm vi nồng độ từ 0,01% - 1% colchicine đều gây hiệu quả. Nhưng nồng độ thông dụng nhất cho mọi cây trồng là 0,2%. Khi xử lý colchicine ở nồng độ cao, thời gian ngắn cho hiệu quả hơn khi xử lý nồng độ thấp, thời gian dài. Thời gian xử lý có thể thay đổi từ vài giờ cho đến vài ngày hoặc hơn. Tuy nhiên, nếu thời gian xử lý quá ngắn thì hiệu quả rất thấp. Theo Dermen, nếu thêm vào dung dịch colchicine một vài giọt glycerin thì hiệu quả có thể tăng. Kỹ thuật xử lý Xử lý hạt hay mầm: Phương pháp xử lý hạt áp dụng cho nhiều loại cây có hạt nhỏ và dễ nảy mầm. Nồng độ thích hợp nhất là 0,1% và 0,2%, xử lý từ 3 giờ đến vài ngày hoặc hơn. Trong một giới hạn nhất định khi nhiệt độ tăng thì hiệu quả tác dụng của colchicine tăng. Đơn giản nhất là ngâm hạt khô vào trong dung dịch colchicine hay đặt trên lớp giấy thấm có tẩm colchicine. Đối với hạt to và khó nảy mầm, nếu xử lý trực tiếp hạt khô vào colchicine thì hiệu quả rất kém, mà trước đó phải ngâm hạt bằng nước. Phương pháp xử lý mầm cho hiệu quả cao nhất. Phương pháp chung la ngâm hạt đang nảy mầm vào dung dịch vào dung dịch xử lý. Với từng loại cây thời gian và nồng độ xử lý mầm thích hợp có khác nhau. Ở những hạt nảy mầm đã có rễ hay cây con thì chỉ xử lý mầm bằng cách đặt ngược mầm vào dung dịch colchicine chứa trong đĩa Petri qua lớp vaỉ màn hoặc thấm colchicine lên mầm bằng bàn chải mềm. Ví dụ:
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - - Lúa (Lương Đình Của, 1951): Đặt hạt trong đĩa Petri cho nảy mầm. Khi mầm dài 3 -5 cm dùng dao khía xiên một nhát ở gốc mầm. Kẹp một sợi bông thấm nước có tẩm dung dịch colchicine 0,05 - 0,1% hoặc rỏ dung dịch colchicine ấy vào vết cắt. Xử lý 2 lần /1 ngày. Sau lần xử lý thứ hai rửa sạch mầm và trồng trong nhà kính. - Củ cải (Taraxevich, 1965): Ngâm hạt nảy mầm trong dung dịch colchicine 0,05%-0,1% trong 6-12 giờ hoặc ngâm mầm non trong dung dịch colchicine 0,1% trong 6 giìơ. - Ngô (Sumnui, 1961)" Hạt sau khi nảy mầm ngâm vào dung dịch colchicine 0,2% trong 18-24 giờ. Cũng có thể xử lý như sau: Khi chồi mầm dài 2-3cm khía một nhát ở gốc mầm rồi nhét vào đấy một lát bông có tẩm dung dịch colchicine 0,2% một ngày đêm; tẩm ướt lát bông bằng colchicine 2-3 lần. Xử ký các bộ phận khác của cây - Ở cây thuộc họ Hoà thảo (Poaceae) phương pháp xử lý cho hiệu quả cao: ngâm toàn bộ rễ vào dung dịch xử lý. Ngâm luân phiên 12 giờ ở dung dịch xử lý rồi lại 12 giờ ở trong nước. - Với các mầm nách, người ta đặt lên đấy hỗn hợp ở dạng sền sệt của colchicine với lanonin hay tiêm trực tiếp dung dịch colchicine vào mầm. - Với hoa, có thể ngâm trực tiếp vào dung dịch colchicine 0,02-0,05%. Ngoài colchicine, để gây tạo cây đa bội người ta còn hay dùng chất acenaphthen. Vì chất này tan rất kém trong nước, nên thường được dùng ở nồng độ thấp. Ví dụ, với hạt lúa mì dùng dung dịch acenaphthen 0,002%.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 5 ) Chọn giống kháng sâu bệnh 1. Chọn giống kháng sâu và côn trùng 1.1. Những thiệt hại do sâu và côn trùng gây ra Sâu và côn trùng có thể được chia làm hai loại dựa trên phương thức sử dụng thức ăn của chúng: - Côn trùng chích hút: bọ rầy, rệp, bọ xít - Côn trùng ăn các bộ phận khác nhau của thực vật: đục thân, đục rễ, cuốn lá, đục quả, ăn lá. Tất cả các loại này đều làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Sự mất mát về chất lượng thường xuyên hơn và ở mức độ cao hơn sự mất mát về sản lượng. Một giống nhiễm sâu thường đưa đến các hậu quả sau: - Giảm sự phát triển của cây trồng - Phá hủy lá, thân, cành, nụ hoa, hoa, chồi vô tính, quả và hạt, - Làm gãy cây Mức độ thiệt hại trước hết phụ thuộc vào cường độ tấn công của côn trùng và mức độ nhiễm của ký chủ. Côn trùng còn có thể gây tác hại gián tiếp, rất nhiều loại côn trùng là vật truyền bệnh virus. Sự chấn thương do côn trùng gây ra tạo điều kiện cho nấm và vi khuẩn phát triển. 1.2. Cơ chế của tính kháng sâu và côn trùng Tính kháng sâu và côn trùng được chia làm 4 nhóm: Không ưa thích; Kháng sinh; Chống chịu; Cơ chế tránh. 1.2.1. Cơ chế không ưa thích Ký chủ tạo ra sự không hấp dẫn cho sâu và côn trùng, chính là sự không thích ứng cho việc tạo vùng sống và vùng đẻ trứng. Kiểu kháng này hạn chế khả năng tấn công của sâu hại hoặc sự không chấp nhận tấn công. Sự không chấp nhận xuất hiện khi côn trùng không dùng thức ăn của ký chủ hoặc ký chủ không có thức ăn phù hợp cho côn trùng. Cơ chế không ưa
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - này có liên quan đến nhiều thuộc tính hình thái sinh lý hoặc sinh hóa của cây chủ. 1.2.2. Cơ chế kháng sinh Các chất kháng sinh có tác dụng kháng lại sự ăn cây chủ của sâu để bảo tồn sự phát triển và tái sinh của cây trồng. Trong một số trường hợp, côn trùng bị tiêu diệt khi chúng tàn phá cây trồng. Chất kháng sinh có liên quan đến: Thuộc tính hình thái; đặc tính sinh lý; đặc tính hóa sinh; có thể là tổng hợp của 3 đặc tính trên. 1.2.3. Cơ chế tránh Cây trồng tránh sâu cũng như tránh bệnh, đó không phải là tính kháng thực. Tuy vậy nó có ảnh hưởng như là tính kháng thực trong việc bảo vệ cây trồng khỏi sự phá hoại của côn trùng và sâu hại. Tất cả các trường hợp tránh sâu thực chất là hiện tượng cây chủ không ở trong giai đoạn khi côn trùng đang ở đỉnh cao phát triển. Ví dụ: giống bông ngắn ngày có thể tránh được sự phá hại của sâu phá hoại vào cuối vụ trồng. Có trường hợp, sự phát triển trong điều kiện không phù hợp cho sự phát triển của sâu và côn trùng. Ví dụ: sản xuất khoai tây hạt là để tránh sự phá hại của rệp. 1.2.4. Cơ chế chống chịu Tính chống chịu sâu cũng như tính chống chịu bệnh. Giống chống chịu sâu cũng bị tấn công ở mức độ giống như giống nhiễm nhưng giống kháng vẫn cho năng suất cao hơn. Trong một số trường hợp, giống kháng phục hồi nhanh hơn sau khi bị côn trùng tàn phá. Tính kháng côn trùng thể hiện liên quan đến các thuộc tính hình thái, sinh lý hoặc hóa sinh của ký chủ. 2. Chọn tạo giống kháng bệnh 2.1. Bản chất của tính chống bệnh Tính chống bệnh của cây chủ có thể là thật khi được hình hthành lúc cây chủ và thể gây bệnh tiếp xúc nhau hay có thể do một số cơ chế được gọi chung là “tránh né”. Sự tránh né làm giảm tiếp xúc giữa cây chủ và thể gây bệnh. Sự chống chịu nấm có thể được hình thành do các yếu tố vật lý như tăng độ dày tầng cutin hoặc phân bố thêm các mô cứng. Cũng có thể là do phản ứng cực nhạy làm cho chỗ bị nhiễm bệnh chết đi và cản trở bệnh lan
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - rộng thêm. Đôi khi tính chống chịu biểu hiện ra làm cho sinh trưởng và sinh sản của thể bệnh bị hạn chế một cách đáng kể so với giống hoàn toàn mẫn cảm. 2.2. Phát hiện và đánh giá sức đề kháng Sức đề kháng có thể được phát hiện bằng cách đánh giá cây trồng hoặc bộ phận cây trồng trên đồng ruộng trong điều kiện tự nhiên khi bệnh phát triển. Sàng lọc tính đề kháng trong điều kiện tự nhiên thường được tiến hành khi không có phương pháp gây nhiễm nhân tạo hoặc với các bệnh ít quan trọng, không cần đến phương pháp phức tạp hay tốn kém. Người ta đưa ra các phương pháp sàng lọc nhân tạo đối với các bệnh quan trọng của cây trồng chủ yếu. Một phương pháp sàng lọc tốt phải có đủ các điều kiện sau: + Có thể lặp lại được + Có thể xác định từng mức tác động khác nhau lên thể gây bệnh + Phản ánh được phản ứng của thể chủ trong điều kiện đồng ruộng + Thao tác được dễ dàng + Ứng dụng được cho các chương trình chọn tạo giống cây trồng + Có thể sàng lọc được một số lượng cây mà không tốn nhiều chỗ và thời gian. Các phương pháp sàng lọc nhân tạo bao gồm: + Tăng liều gây nhiễm của một nòi gây bệnh thích hợp lên thể chủ + gây nhiễm cho cây hay bộ phận của cây bằng phun, tiêm, ngâm hay trộn với đất + Nuôi bệnh trong điều kiện môi trường tối ưu + Cần chú ý tăng liều gây nhiễm vào lúc nuôi bệnh cho cây. Việc sàng lọc để chọn tính đề kháng cũng có thể thực hiện bằng cách xử lý cây được khảo nghiệm với độc tố nòi gây bệnh. Môi trường chọn lọc được tạo ra bằng cách hỗn hợp các hóa chất đặc biệt có thể kích thích sự sinh trưởng của các loài nấm gây bệnh thực vật thích
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - hợp. Có thể gây dịch bệnh nhân tạo trên đồng ruộng ở mức độ thí nghiệm. Các kiểu gene mẫn cảm truyền bệnh được gieo thành hàng xen với các kiểu gene cần được khảo nghiệm. Các hàng truyền bệnh được gây nhiễm với một nòi gây bệnh thích hợp sớm hơn nhiều so với thời điểm phát bệnh tự nhiên, do đó khi mầm gây nhiễm tự nhiên xuất hiện thì trên ruộng thí nghiệm đã đầy mầm bệnh nhân tạo. Bằng cách điều chỉnh thời điểm gieo trồng có thể đảm bảo các kiểu gene khảo nghiệm sẽ ở vào thời kỳ thích hợp đúng lúc thời tiết thuận lợi cho bệnh phát triển. 2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến cách biểu hiện và mức độ đề kháng Bệnh của cây trồng là kết quả tương tác giữa chủ thể, thể gây bệnh, môi trường và khoảng thời gian mà ba yếu tố ây tương tác với nhau. + Tác động của cây chủ Kiểu gene của thể chủ, mức độ phát triển và tình trạng sinh lý của thể chủ có thể ảnh hưởng đến cách phản ứng của nó đối với một bệnh cụ thể nào đó. Phản ứng của cây trồng với bệnh có thể thay đổi theo tuổi vì các gene đề kháng có thể hoạt động trong thời kỳ này mà không hoạt động thời kỳ khác. Sức đề kháng hay mẫn cảm có thể liên quan với giai đoạn phát triển của cây. Thông thường sức đề kháng là tối đa ở giai đoạn trước khi các cấu trúc sinh sản xuất hiện. + Tác động của thể gây bệnh Độ gây hại, sức tấn công và mật độ gây nhiễm của thể gây bệnh phụ thuộc vào các yếu tố có ảnh hưởng đến sức đề kháng của một thể chủ nhất định biểu hiện ra. Các nòi gây bệnh mang các gene gây hại giống nhau có thể khác nhau về sức tấn công và như thế sẽ gây ra mức độ bệnh khác nhau đối với một kiểu gene nhất định của thể chủ. Sức đề kháng có thể giảm khi mật độ gây nhiễm tăng. Thông thường sức đề kháng đa gene biểu hiện ra vào mức độ trung gian chịu ảnh hưởng nhiều hơn của mật độ gây nhiễm, sức đề kháng dọc đơn gene chịu ảnh hưởng ít hơn. Có mối tương quan giữa mật độ gây nhiễm với sức đề kháng đối với các thể gây bệnh do đất mang theo. Tác động của mật độ gây nhiễm đối với sức đề kháng phụ thuộc vào cách sinh sản của thể gây bệnh. + Tác động của môi trường
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Môi trường tác động khác nhau lên thể chủ và thể gây bệnh. Cả khi thể gây bệnh xâm nhiễm thể chủ trong điều kiện tối ưu và sức đề kháng của thể chủ đối với một yếu tố đặc biệt của môi trường không thay đổi, thì mức đề kháng được quan sát thấy cũng thay đổi từ mức tối đa đến mức tối thiểu tùy thuộc vào các tổ hợp đặc biệt giữa thể chủ và thể gây bệnh. Từng yếu tố riêng của môi trường cũng có thể tác động đến cách phát triển của bệnh qua sự ảnh hưởng của các yếu tố khác. Điều kiện môi trường như thành phần và độ pH của môi trường, cường đọ ánh sáng và nhiệt độ cũng có thể tác động đến sức gây bệnh của thể bệnh. + Nguồn kháng bệnh Sức đề kháng có thể gặp ở các giống địa phương đã thích ứng hay ở giống ngoại lai hoặc ở các loài thân thuộc. Các giống địa phương đã thích ứng là nguồn đề kháng tốt chống các bệnh đã trở nên trầm trọng bất ngờ được nhập vào khi cải lương một tính trạng có giá trị kinh tế nào đó. Các giống địa phương đã thích ứng cũng là nguồn đề kháng có giá trị để chống lại các bệnh ít quan trọng hay chỉ có giá trị địa phương. Sức đề kháng của các giống địa phương được chú ý vì: `+ Sức đề kháng có thể chỉ mang theo một lượng ít các liên kết không mong muốn so với sức đề kháng ngoại lai + Sức đề kháng của giống ngoại lai có thể liên kết với tính mẫn cảm đối với một số loại sâu bệnh mà các giống địa phương đã thích ứng thường không mắc phải. 2.4. Thủ tục chọn tạo giống Thủ tục thường được dùng khi chọn tạo giống kháng bệnh: chọn tạo qua lai trở lại, chọn lọc truy hồi, tạp giao trong loài. 3. Bản chất di truyền Bản chất di truyền của tính kháng sâu cũng tương tự như tính kháng bệnh. Tính kháng sâu có thể do đơn gene điều khiển với một số lượng lớn các cá thể có hiệu lực, có thể do nhiều gene điều khiển có tác dụng cộng tính hoặc do gene tế bào chất. 3.1. Các nguồn gene kháng sâu và côn trùng Nguồn gene kháng sâu và côn trùng có thể tìm thấy ở:
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - + Các giống cây trồng + Nguồn tài nguyên di truyền của các loài + các loài hoang dại có quan hệ huyết thống với cây trồng 3.2. Các phương pháp tạo giống kháng sâu Các phương pháp thường được sử dụng để tạo giống kháng sâu: 3.2.1. Nhập nội: Giống nhập nội kháng với một loại sâu nào đó có thể sử dụng để gieo trồng trong điều kiện môi trường mới nhưng nó vẫn thể hiện các đặc tính nông học quý. Nhưng thường giống nhập nội lại không phát triển tốt trong điều kiện mới, nó có thể nhiễm biotype của một loài sâu hại nào đó hoặc nhiễm một loại sâu mới có mặt trong điều kiện nhập nội. 2.2.2. Chọn lọc: Các kiểu gene kháng sâu có thể cơ mặt trên một giống nhất định của một loại cây trồng nào đó. Trong trường hợp này, việc chọn lọc là để phân lập được các kiểu gene kháng. Đối với cây tự thụ phấn, sử dụng phương pháp chọn hỗn hợp hoặc chọn dòng thuần để chọn giống kháng. Đối với cây giao phấn, thường dùng phương pháp chọn lọc hỗn hợp và chọn lọc hồi quy. Cây giao phấn có hiệu quả chọn lọc cao hơn cây tự thụ phấn vì nó có hệ số biến dị cao hơn. 3.2.3. Lai hữu tính Thường cho lai giữa một giống có các đặc tính nông học tốt nhưng mẫn cảm với sâu với một giống hoang dại nhưng kháng sâu 3.2.4. Biến nạp gene Sử dụng kỹ thuật tách DNA của nguồn bệnh, tách các gene kháng quý hiếm và thực hiện biến nạp các gene này vào các giống cây trồng bằng phương pháp lai tế bào trần, phương pháp xung điện hoặc súng bắn gene. 4. Kỹ thuật sàng lọc 4.1. Sàng lọc trên đồng ruộng Việc sàng lọc tính kháng sâu trong chương trình chọn tạo giống thường được tiến hành trên đồng ruộng vì số lượng cá thể chọn lọc lớn hơn trong điều kiện nhà kính.Hơn nữa, trên đồng ruộng, cây trồng được đặt trong điều kiện các sâu và côn trùng thường xuất hiện trong khu vực. Tuy nhiên thử nghiệm đồng ruộng lại tiến hành trong điều kiện hầu như không có sự điều tiết cuả con người; trong nhiều trường hợp không có khả năng đảm
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - bảo sự lây nhiễm đồng đều cho các cá thể trong quần thể. Do đó sai số thí nghiệm đồng ruộng là lớn hơn nhiều so với thí nghiệm trong phòng. Các kỹ thuật tăng mức độ đồng đều cho lây nhiễm trên đồng ruộng: + Kỹ thuật đơn giản nhất là trồng xen kẽ một hàng giống nhiễm với hai hàng giống định đánh giá. Kỹ thuật này chỉ phù hợp với việc đánh giá các loại sâu và côn trùng phân tán trong vùng. + Mỗi loại côn trùng hoặc sâu thường xuyên được phát hiện ở một vài vùng. việc chọn lọc khả năng kháng với một loại sâu nào đó trên những vùng sẽ đảm bảo sự lây nhiễm tự nhiên mạnh mẽ đối với cây trồng định đánh giá. + Nếu là sâu trong đất, giống cây trồng cần đnh giá sẽ được trồng trong điều kiện đất có số lượng lớn sâu. + Cây nhiễm tự nhiên một số côn trùng có thể xảy ra trong những vụ nhất định. Ví dụ lây nhiễm sâu đục thân lúa trong vụ muộn sẽ nặng hơn trong chính vụ vì thời vụ muộn đôi khi là ký chủ trung gian cho bướm cái đẻ trứng. Do đó việc sàng lọc sẽ thuận lợi hơn rất nhiều trong thời vụ muộn. + Một số lượng đồng đều trứng hoặc sâu non có thể chuyển bằng tay đến từng cây được đánh giá, bảo đảm cho sự lây nhiễm đồng đều. ví dụ nhiễm sâu đục thân lúa bằng cách chuyển đến mỗi cá thể một ổ trứng gồm 60 trứng. Số lượng sâu non nở ra sẽ được đếm và như vậy sẽ xác định được số cá thể kháng sâu. 4.2. Sàng lọc trong nhà kính Trong nhà kính, số lượng cá thể được đánh giá nhỏ hơn trên đồng ruộng nhưng kết quả lại chính xác hơn vì sự lây nhiễm ban đầu đồng đều và chính xác hơn. Sàng lọc trên đồng ruộng và trong nhà kính là hai phương pháp bổ trợ cho nhau. Những cây kháng được chọn trong nhà kính sẽ được trồng để đánh giá trên đồng ruộng và ngược lại. Những khó khăn của việc chọn giống kháng sâu: + Trong một số trường hợp chọn được giống kháng sâu này lại bị các sâu khác gây hại. Điều này có thể do thuộc tính của cây chủ, gene kháng trội một loại sâu này có thể liên kết với gene không kháng loại sâu khác.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - + Trong một số trường hợp chọn tạo giống kháng sâu làm giảm chất lượng sản phẩm, thậm chí không thể sử dụng được + Trong trường hợp gene kháng sâu chỉ có ở các loài hoang dại. Việc chuyển gene bằng phương pháp lai giữa các loài là rất khó khăn và thường có sự liên kết giữa gene kháng với các gene bất lợi khác. Thường giống hoang dại mang gene kháng lại cho năng suất thấp và chất lượng kém. + Sàng lọc tính kháng sâu là một khâu vô cùng khó khăn trong công tác tạo giống. Đòi hỏi phải có sự phối hợp chặt chẽ giữa các nhà tạo giống với các nhà côn trùng học, các nhà bệnh học, hóa sinh, sinh lý. + Chọn tạo giống kháng sâu là một chương trình dài hạn cần phải được đầu tư thích đáng về tài chính và các mặt khác.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 6 ) Chọn giống ở cây sinh sản sinh dưỡng 1. Khái niệm chung Sinh sản sinh dưỡng là hình thức sinh sản mà cơ thể mới được phát triển từ những phần cơ thể ban đầu như củ, thân, mầm, lá Đó là những bộ phận ở trên hoặc là ở dưới mặt đất - Từ những phần thân dưới mặt đất: những cây trồng mới được nhân lên từ những phần dưới mặt đất như khoai tây, củ gừng, chuối, hành, tỏi, - Bằng những chồi bất định: như ở cây tầm gửi, khoai lang và nhiều loài thân bò khác. - Bằng thân hành con như cây bạch đầu khấu, hành, tỏi, - Sinh trưởng bằng những đoạn sinh dưỡng: những cây này thường được nhân lên bằng những đoạn thân hoặc chồi, mầm cắt ghép như khoai lang, dong riềng, Trong sinh sản sinh dưỡng, cây được nhân lên bằng phương pháp vô tính nên qua các đời trồng của hệ vô tính không xảy ra phân ly và tái tổ hợp. Điều này đã dẫn đến: - Các hệ vô tính dần dần tích lũy các đột biến tự nhiên, làm độ dị hợp tăng lên - Các gene có hại cũng được tích lũy dần - Các cơ quan sinh sản thường xuyên không hoạt động nên dần dần đưa đến bất dục đực và cái. Bất dục đực thường xảy ra nhiều hơn. 1.1. Phương pháp chọn tạo Chọn tạo giống cây sinh sản sinh dưỡng thì kỹ thuật được ứng dụng cơ bản giống như các phương pháp chọn tạo giống cây hữu tính, bao gồm: nhập nội, chọn lọc và tạp giao, chỉ khác về cách xử lý quần thể lúc khảo nghiệm. Đối với cây nhân vô tính, khi một kiểu gene đã được xác định nó có thể được duy trì vĩnh viễn bằng phương pháp vô tính hay sinh dưỡng mà
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - không mất độ toàn vẹn di truyền, đó là một lợi thế lớn. Tuy nhiên cũng kèm theo một số nhược điểm sau: - Vì các đời sinh dưỡng nối tiếp nhau không qua sàng lọc di truyền của phân bào giảm nhiễm nên các hệ sinh dưỡng có xu hướng tích lũy thành hệ thống các bệnh truyền nhiễm, nhất là các bệnh virus và mycoplasma. Chúng cũng tích lũy lại các đột biến mà đa số đều gây hại. Để tránh được vấn đề này, cần: (i) Duy trì nguồn giống ưu tú trong điều kiện sạch bệnh là cần thiết; (ii) Bản thân nguồn giống phải được thường xuyên tái tạo lại bằng cách chọn lọc cây dùng làm giống từ một quần thể nhân lên bằng phương pháp sinh dưỡng. Gần đây có thể tránh được một số khó khăn trên bằng cách duy trì các hệ vô tính dưới dạng nuôi cấy mô. - Duy trì nguồn gene cần thiết cho các chương trình chọn tạo giống gặp khó khăn và tốn kém do các nguyên nhân nói trên. - Đa số các giống biểu hiện bất dục đực, sức sống yếu, hạt lép với nhiều mức độ khác nhau. Do đó bất dục là hậu quả của việc các hệ vô tính không được phân bào sàng lọc - Một số loài và nhiều giống của đa số cây nhân vô tính không có hoa. 1.2. Kích cỡ quần thể Đa số giống cây trồng nhân vô tính ở trạng thái dị hợp nên đời "phân ly" đầu tiên là đời F1 chứ không phải F2. Do đó kích cỡ của quần thể đời F1 phải lớn hơn so với cây tự thụ phấn. Ngoài ra một tỷ lệ lớn các cây nhân sinh dưỡng là cây đa bội như mía, khoai tây, khoai lang, chuối và đòi hỏi phải nhân một quần thể lớn hơn để thu được các kiểu gene mong muốn. Nhiều giống cây nhân sinh dưỡng không ra hoa hoặc ra hoa nhưng bất dục ở mức độ cao, nên cần phải tạo nhiều thể lai hơn so với nhu cầu thông thường đối với cây nhân hữu tính. Như vậy, phương pháp và thủ tục ứng dụng để cải tiến cây nhân vô tính tương tự như đối với cây nhân hữu tính. Sự khác nhau giữa chúng ở một số chi tiết, các chi tiết này mục đích sử dụng cuối cùng, theo mức độ bội thể và tình trạng bất dục trong loài. 2. Cơ sở di truyền
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 2.1. Dòng vô tính Dòng vô tính là một nhóm của những cây được sản xuất ra từ một cây riêng qua sinh sản vô tính. Như vậy những giống nhân vô tính bao gồm số lượng lớn dòng vô tính. Tất cả các thành viên của dòng vô tính có cùng kiểu gene như cây bố mẹ nếu không có đột biến soma xảy ra. Sự chọn lọc ở một dòng vô tính là không cần thiết. Các đặc tính của dòng vô tính: - Tất cả các cá thể trong một dòng vô tính riêng biệt giống hệt nhau về kiểu gen, vì chúng là kết quả của quá trình sinh sản vô tính nhờ phân bào nguyên nhiễm. - Sự khác nhau của kiểu hình ở trong 1 dòng vô tính là do môi trường - Kiểu hình của một dòng vô tính là do hiệu quả của kiểu gene (G), của môi trường (E) và ảnh hưởng qua lại giữa kiểu gene và môi trường (GE) trên ý nghĩa quần thể (µ). Kiểu hình của một dòng vô tính được biểu thị bằng công thức: P = µ + G + E + GE - Một dòng vô tính có thể được duy trì không giới hạn qua sinh sản vô tính. Nhưng các dòng vô tính cũng luôn luôn thoái hóa do bị tấn công bởi virus hoặc vi khuẩn và do sự phát sinh đột biến soma. Một dòng vô tính có thể bị tiêu diệt phụ thuộc vào khả năng nhạy cảm của nó đối với vật phá hoại như các côn trùng hoặc các bệnh. Hơn nữa, sự khác nhau về gene có thể phát sinh trong một dòng vô tính làm thay đổi những đặc tính của nó. - Nhìn chung, những dòng vô tính có độ dị hợp cao và thể hiện mất sức sống khi lai gần. 2.2. Sự khác nhau về gene Sự khác nhau về gene trong một dòng vô tính có thể phát sinh do đột biến phần sinh dưỡng, sự hỗn hợp cơ học và sinh sản vô tính không thường xuyên. 2.2.1. Đột biến Đột biến phần sinh dưỡng được hiểu là những đột biến chồi (bud mutation). Tần số đột biến nói chung rất thấp (10-7 – 10-5). Thường những đột biến trội sẽ được biểu hiện ở phần mô sinh dưỡng, vì các đột biến lặn
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - chỉ được biểu hiện khi ở dạng đồng hợp tử. Một allele đột biến thành đồng hợp tử khi tất cả các allele trong một tế bào đột biến cùng đồng thời sản xuất ra cùng một allele đột biến hoặc allele đột biến đã có sẵn trong điều kiện dị hợp tử ở dòng vô tính ban đầu. Từ những đột biến chồi có thể chọn được những dòng vô tính mới. Chọn lọc chồi có tầm quan trọng trong việc cải tạo cây lâu năm như cây ăn quả. 2.2.2. Sự hỗn hợp cơ học Hỗn hợp cơ học tạo ra sự khác nhau về gene ở trong một dòng vô tính; về phương pháp, giống như trong trường hợp dòng thuần. Sinh sản vô tính cũng tạo ra sự phân ly và tái tổ hợp do sự phân tách bộ phận của cơ thể để tạo ra cá thể hoặc trao đổi chéo soma. 3. Sự thoái hóa dòng vô tính Các dòng vô tính có thể duy trì được vô thời hạn. Nhưng thực tế, các dòng vô tính có một đời sống giới hạn và dòng cũ bị mất sức sống và năng suất. Sự mất hoặc giảm sức sống và năng suất của các dòng vô tính theo thời gian được biết như là sự thoái hóa dòng vô tính (clonal degeneration). Sự thoái hóa dòng vô tính là vốn có trong dòng vô tính, nhờ sự sinh sản dinh dưỡng của chính bản thân nó. Thực tế, các kết quả nghiên cứu chi tiết đã chứng minh rằng kết quả thoái hóa dòng vô tính là do: + Sự đột biến: Đột biến là một quá trình lặp đi lặp lại, do đó nó có thể trở thành một vấn đề bao trùm một thời gian dài. Hơn nữa một đột biến xảy ra ở tần số khá cao trong một dòng vô tính và trở nên nghiêm trong trong bảo quản các dòng này. + Bệnh virus: Bệnh virus dễ truyền qua nhân giống sinh dưỡng. Theo thời gian ở các dòng vô tính, bệnh virus có thể gây ra lan truyền sự thoái hóa vô tính trầm trọng. + Bệnh vi khuẩn: Một số trường hợp, sự thoái hóa dòng vô tính là kết quả của sự lây nhiễm vi khuẩn. Bệnh kìm hãm sinh trưởng chồi gốc ở cây mía. Sinh sản sinh dưỡng bản thân nó không ảnh hưởng đến sức sống hoặc khả năng năng suất của dòng vô tính. Mặt khác, sinh sản vô tính đã giữ nguyên những tổ hợp gene đặc biệt tạo ra một dòng vô tính mới hoặc những dòng vô tính khác thỏa mãn mong muốn của nhà chọn giống.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Chọn giống ở cây giao phấn Các loài giao phấn (thụ phấn chéo) có độ dị hợp hay độ không đồng nhất cao về kiểu gene và mang nihều đột biến hơn so với cây tự thụ phấn. Cách sinh sản như vậy tạo cho chúng một thế cấn bằng dị hợp rất lớn trong cấu trúc của một quần thể toàn phối Trong thực tế, cây trồng thụ phấn chéo rất thuận tiện cho việc sử dụng các phương pháp chọn giống mới để đạt hiệu quả tối đa bằng cách kết hợp các chu kỳ tự phối và ngoại phối với nhau. Các phương pháp chọn tạo giống hiện nay đối với cây giao phấn chéo có thể chia ra hai nhóm: tạo các thể lai và cải tiến các quần thể. Hai nhóm này tuy độc lập với nhau nhưng không loại trừ nhau. Để tạo ưu thế lai cần thiết phải cố định gen qua nhiều chu kỳ tự phối. Thể đồng hợp đạt được qua quá trình tự phối ban đầu đến cuối chương trình chọn tạo giống lại được chuyển lại thể dị hợp. 1. Tạo thể lai và dòng tự phối Thể lai là đời con thứ nhất (F1) của tạp giao giữa bố mẹ khác biệt về mặt di truyền. Các bố mẹ có thể là dòng thuần, dòng tự phối, giống hay quần thể. Đối với cây trồng thụ phấn chéo thì dòng tự phối được tạo ra bằng cách tự phối từng cây riêng rẽ. Nguồn cho tự phối có thể là các giống thu phấn tự do, hỗn hợp, tổng hợp, nguồn gene phức hợp hoặc bất kỳ một quần thể dị hợp nào. Vật liệu ban đầu để tạo dòng tự phối, nên có nền di truyền rộng, chứa nhiều kiểu gene khác nhau và mang nhiều đặc tính nông sinh học quý, thường là những giống tổng hợp hoặc giống nhập nội. Tuy nhiên nếu vật liệu ban đầu là những giống địa phương thì dòng thuần được tạo ra từ đó lại có tính thích nghi cao, còn nếu vật liệu ban đầu là các giống lai thì kết quả tạo giống mới sẽ nhanh hơn. Có 3 phương pháp cơ bản để tạo dòng tự phối ở ngô (bắp): - Phương pháp chuẩn: chọn các cây khỏe mạnh và điển hình cho quần thể của vật liệu ban đầu rồi cho tự phối bằng phương pháp cách ly. Các bắp tốt được lựa chọn theo kiểu bắp/hàng. Sự chọn lọc được lặp lại như vậy ở các thế hệ tiếp theo
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - - Phương pháp hốc đơn: đây là một biến dạng của phương pháp chuẩn, hàng được thay thế bằng hốc đơn 3 cây trong mỗi chu kỳ chọn lọc. Vì thế phương pháp này có ưu điểm là cho phép đánh giá được số lượng thế hệ nhiều hơn trên cùng một đơn vị diện tích, nhưng lại hạn chế về khả năng chọn lọc trong mỗi thế hệ. - Phương pháp tạo dòng lưỡng bội đồng hợp tử bằng kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn in vitro kết hợp với phương pháp gây đa bội hóa bằng colchicine. Sau quá trình tự phối 5-6 thế hệ như vậy, các dòng thu được phải đồng đều về mọi tính trạng như độ cao cây, hình thái hạt, màu sắc Đem những cây trong cùng một dòng giao phối với nhau, nếu ở thế hệ sau không có gì sai khác với các cây giao phối ban đầu thì các dòng ấy đã thuần. Đem hai dòng tự phối lai với nhau, thu được con lai đơn giữa dòng. Hai con lai đơn giao phối với nhau cho con lai kép giữa dòng. 2. Cải tiến quần thể Theo Sprague, cải tiến quần thể chỉ một hệ thống bao gồm tất cả các biện pháp dùng để tạo ra một dạng cải tiến của cây trồng được nhân lên bằng phương pháp hữu tính. Cải tiến quần thể của các loài giao phấn chéo bao hàm ý nghĩa cải tiến thành tích trung bình của một quần thể gồm các kiểu gene thụ phấn ngẫu nhiên đã trải qua chọn lọc mà sản phẩm cuối cùng còn giữ được một độ dị hợp cao. Về mặt di truyền học, cải tiến quần thể hoàn toàn dựa trên chủ định tận dụng hiệu quả các gen cộng tính hay gene đa phân. Sự tích lũy liên tục hiệu quả di truyền tích cộng đưa đến việc cải tiến tuần tự tăng lên. Cải tiến quần thể có nhiều dạng. Trong mỗi dạng, thủ tục chọn lọc quyết định độ hiệu quả mà các gene cộng tính được khai thác. Liên quan với cải tiến quần thể có thể tóm tắt như sau: - Các tính trạng quan trọng khác nhau có độ phương sai rất lớn. - Quần thể nguồn mang phương sai di truyền cộng tính cao với tính trội một phần. - Các tính trạng có hệ số di truyền cao. - Giữa các tính trạng cần cải tiến không có liên kết.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - - Không có tổ hợp âm tính giữa các tính trạng mong muốn. Ví dụ: chọn lọc tính chín sớm đưa đến giảm năng suất. - Hiện diện độ biến thiên rất rộng của các gene điều khiển các tính trạng mong muốn mà trước kia chưa từng qua chọn lọc. các gene như thế là dự trữ lớn để tạo ra một cơ sở di truyền rộng cho quần thể khởi đầu.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 7 ) Chọn giống ở cây tự thụ phấn Tự thụ phấn hay tự phối là việc chuyển phấn hoa từ nhị đực đến nhuỵ cái trong cùng một hoa, hay đến nhuỵ cái của hoa trong cùng một cây. Đó là quá trình kết hợp giao tử đực và giao tử cái của cùng một cây. Cây tự thụ phấn cũng có một số trường hợp giao phấn, phụ thuộc vào: - Giống hay dòng cây trồng - Điều kiện mùa vụ, nhất là nhiệt độ và độ ẩm - Hướng và tốc độ gió vào thời điểm thụ phấn - Quần thể côn trùng thụ phấn. Tự thụ phấn không những duy trì kiểu gene của bố mẹ từ đời này sang đời khác mà còn nhanh chóng phục hồi tình trạng đồng hợp cho kiểu gene trong các đời tiếp theo. Tỷ lệ dị hợp Aa trong các đời tiếp theo sẽ giảm đi một nữa. Mức độ đồng hợp của mỗi đời có thể tính theo công thức (2m – 1/2m)n, với m: số đời, n: số cặp gene đồng hợp. Các phương pháp chọn tạo giống 1. Nhập nội Nhập nội thường được dùng như nguồn cung cấp gen hay tổ hợp gen để cải lương một kiểu gen thích ứng tốt nhưng còn thiếu một hay nhiều tính trạng. 2. Thích nghi Tính thích nghi là khả năng tự phục hồi và thích ứng của quần thể với vùng khí hậu mới. Quá trình thích nghi là kết quả của sự chuyển dịch lệch di truyền về phía các dạng thích ứng trong một quần thể được đặt trong các điều kiện bất thuận của môi trường. Hiệu quả của quá trình thích nghi phụ thuộc vào: + Mức độ không đồng nhất trong quần thể; + Phương thức sinh sản của loài;
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - + Thời lượng của chu kỳ sống của loài; + Tính chất và cường độ của các điều kiện bất thuận trong môi trường. Cây giao phấn thích nghi nhanh hơn cây tự thụ phấn do có tần số tái tổ hợp cao hơn, sẽ tạo ra các kiểu gene có lợi với tính thích nghi. Trong khi đó một dòng thuần biến đổi rất ít. 3. Chọn lọc Chọn lọc là một quá trình nhờ đó cá thể hay một nhóm cá thể được chọn ra từ một quần thể hỗn hợp và không đồng nhất. Chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn bằng chọn lọc hàng loạt hay chọn lọc hõn hợp (chọn lọc quần thể) và chọn lọc cá thể hay dòng thuần (chọn lọc phổ hệ) 3.1. Chọn lọc quần thể Ở phương pháp chọn lọc quần thể, người ta chọn bông hay cây tốt rồi trộn lẫn hạt giống của chúng để trồng lại đời sau. Chọn lọc quần thể dựa trên cơ sở chọn lọc kiểu hình, không thử nghiệm đời con, nên có những khuyết điểm sau: - Không thể biết được cây tập hợp lại là đồng hợp hay dị hợp. Cây dị hợp thì đời sau sẽ phân ly nên chọn lọc kiểu hình cần được tiếp tục lặp lại - Không thể biết được kiểu hình ưu tú được chọn do các tính trạng di truyền hay do môi trường. Hiện nay, thực hiện việc tuyển chọn đời con của các cá thể, sau đó dồn hạt giống của những đời con giống nhau đã phần nào làm tăng hiệu quả chọn lọc quần thể. Theo Allard (1960) thì sai biệt chủ yếu giữa chọn lọc quần thể đối với các cây tự thụ phấn liên quan đến số lượng dòng giữ lại. Đối với chọn lọc quần thể thì dạng được chọn chỉ xuất phát từ một bông và các dòng được chọn và giữ lại gộp thành một quần thể hỗn hợp các dòng thuần. Quần thể chọn ra trên thực tế đồng đều về các tính trạng nông học quan trọng như màu hạt, kích cỡ hạt, chiều cao cây, thời gian sinh trưởng và khả năng chống chịu bệnh. Chọn lọc quần thể chủ yếu được dùng để lọc các giống lẫn hoặc lọc các lô hạt giống lẫn của các chương trình sản xuất hạt giống. Việc lọc các giống lẫn bằng chọn lọc quần thể được tiến hành như sau:
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - + Chọn lọc từ 200 đến 2.000 cây (cá thể) đúng dạng hình chính của giống. Số lượng cây chọn tùy thuộc vào nguồn giống có được + Gieo cây đời con trên ô gồm 3-4 hàng và quan sát độ đồng đều của các tính trạng kiểu hình khác nhau. + Trộn hạt các đời con có dạng giống và đồng đều lại để nhân giống. Chọn lọc quần thể được xem như là một phương pháp chọn tạo giống để cải lương các giống cây trồng tự thụ phấn. 3.2. Chọn lọc cá thể - Giống dòng thuần Chọn lọc cá thể với mục đích tạo ra giống dòng thuần được thực hiện trong hai trường hợp: - Tạo các dòng thuần từ một giống địa phương thích ứng tốt hay từ một quần thể nhân tạo hay giống quần thể được chọn lọc theo phương pháp chọn lọc quần thể đã và đang được dùng nhiều trong sản xuất. - Tạo các dòng thuần từ một quần thể đang phân ly của thể lai. Trong cả hai trường hợp trên, chi tiết chọn lọc đời sau của từng cá thể phụ thuộc vào các điều kiện sau: - Trường hợp các giống địa phương hình thành từ các quần thể bằng phương pháp chọn lọc quần thể, mang ít cây dị hợp, số lớn cây là đồng hợp tại nhiều locus. - Trường hợp của quần thể đang phân ly, từng cây riêng rẽ ban đầu dị hợp trở thành đồng hợp sau các đời liên tiếp. Nhiều chương trình chọn tạo giống cây trồng tự thụ phấn quan tâm đến việc chọn tạo các giống dòng thuần vì: (i) Giống dòng thuần có độ đồng đều cao về hình dạng và về chất lượng sản phẩm; (ii) Một dòng thuần đã thích ứng với các điều kiện sinh thái và canh tác riêng thì chắc chắn sẽ cho thành tích cao hơn quần thể hỗn hợp các kiểu gene; và (iii) Dễ nhận diện và duy trì một dòng thuần. 4. Tạp giao Tạp giao chỉ việc lai hai cá thể có tính di truyền khác nhau. Về mặt chọn tạo giống, tạp giao phối hợp tính trạng của hai giống và tạo thuận lợi cho việc chọn lọc ra các cây mang các đặc tính mong muốn của hai bố mẹ thông qua tái tổ hợp trong quá trình phân ly đời con cháu.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Chương trình tạp giao của cây trồng tự thụ phấn chủ yếu gồm hai bố mẹ, nhằm mục đích loại bỏ một khiếm khuyết ra khỏi một giống được xem là thích ứng tốt và ưu việt về các mặt còn lại. Gồm có hai dạng: (1) Lai giống thích ứng với giống thích ứng cao sản (2) Lai dòng có nguồn gene thích ứng với dòng không thích ứng. Các cặp lai dạng (1) được thực hiện giữa các dòng hay giống chị em. Các giống này có cơ sở di truyền hẹp vì trong một địa bàn nhất định, khả năng cao sản chỉ tập trung vào một số ít dòng và các dòng này liên tục được dùng để tạo ra giống mới. Các cặp lai dạng (2) thường được thực hiện với các dạng trung gian có năng suất thấp hơn so với giống thích ứng cao sản nhưng lại cung cấp một tính trạng quan trọng như tính chống chịu với bệnh. Chuyển gene - Kỹ thuật di truyền Kỹ thuật di truyền thực vật là sự chuyển một đoạn DNA lạ, thường là một gene có chức năng mã hoá cho một thông tin hay đặc điểm có lợi nhất định vào tế bào thực vật như khả năng kháng sâu hại, kháng virus hay kháng thuốc trừ cỏ. Cây tái sinh từ tế bào chuyển nạp có gene lạ được lồng vào genome, biểu hiện ra kiểu hình va di truyền ổn định được gọi là cây chuyển gene. Trong các bước trên, kỹ thuật chuyển gene đóng một vai trò quyết định đối với kết quả chuyển gene. Chuyển gene vào tế bào thực vật có thể thực hiện gián tiếp thông qua vector hay trực tiếp. Sau đây là ví dụ về sự chuyển qua thông qua Ti-plasmid của vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens A. tumefaciens là vi khuẩn gây khối u ở cây hai lá mầm và phản ứng hình thành khối u là kết quả của sự kiện chuyển gene tự nhiên. Mấu chốt của sự hình thành khối u là Ti-plastmid (Ti: tumor inducing) của vi khuẩn chứa các gene mã hoá sinh tổng hợp các horrmon (auxin và cytokinin) chịu trách nhiệm cho sự hình thành khối u. Các gene này nằm trong vùng T-DNA (transfered DNA) của plasmid. Khi plasmid xâm nhập vào tế bào của cây, cùng T-DNA được chuyển vào genome. Đoạn T-DNA là yếu tố di truyền vận động trong quá trình chuyển gene. Ý nghĩa của Agrobacterium trong kỹ thuật di truyền là khả năng chuyển đoạn DNA vào tế bào thực vật. Lợi dụng phương thức chuyển gene tự nhiên các nhà khoa học thực vật dựa vào kỹ thuật phân tử điều khiển T-
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - DNA để thiết kế hệ vector bằng cách lồng đoạn DNA cần chuyển gắn vào cùng T-DNA của vi khuẩn, sau đó cho cây nhiễm các vi khuẩn chứa plasmid đã biến đổi. Để lây nhiễm người ta nuôi cấy tế bào trần thực vật, tế bào đơn trong trong mooi trường lồng, hoặc đặt mô cấy trong dung dịch huyền phù chứa vi khuẩn có plasmid biến đổi trong một thời gian nhất định. Quá trình chuyển nạp thông qua Agrobacterium gồm các bước sau đây: - Phân lập gene có ích từ thể cho (DNA lạ) và nhân gene - Loại bỏ T-DNA khỏi Ti-plasmid của các dong vi khuẩn đã chọn lọc - Chuyền DNA lạ vào Ti-plasmid cùng với promotor và một gene chỉ thị có khả năng chọn lọc dễ dàng (ví dụ gene uidA của vi khuẩn mã hoá β- glucuronidaza thường gọi là gene GUS, hay gene kháng kháng sinh). - Đưa plasmid đã biến đổi vào tế bào thực vật - Chọn tế bào được chuyển gene - Tái sinh tế bào được chuyển gene - Chọn cây biểu hiện được chuyển (cấy chuyển gene) Ở một số loài cây dễ nuôi cấy như khoai tây và cà chua, các mẫu lá cắt rời được nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn trong một thời gian ngắn. Sau đó các mẫu lá được đưa vào môi trường dinh dưỡng. Trong khoảng thời gian đó vi khuẩn tiếp tục sinh trưởng và xâm nhập vào các tế bào lá rồi tạo ra một số tế bào chuyển gene. Vì chỉ một phần nhỏ tế bào được chuyển gene nên cần phải tiến hành chọn lọc. Việc chọn lọc thông thường dựa vào gene chọn lọc, đó là gene kháng kháng sinh hay kháng thuốc trừ cỏ. Sau đó các mẫu lá được chuyển vào môi trường khác chứa một chất kháng sinh để diệt Agrobacterium còn sót lại và một chất kháng sinh khác hay thuốc trừ cỏ để loại trừ các tế bào không chuyển gene. Các tế bào được chọn được chuyển sang một loạt các môi trường dinh dưỡng để tái sinh cây. Kết quả tái sinh và tạo cây chuyển gene phụ thuộc vào loài cây. Phương pháp chuyển gene thông qua Agrobacterium được áp dụng rất thành công ở nhiều loài cây hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây và cà chua.
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Công nghệ sinh học ( phần 8 ) Lai tế bào soma - Dung hợp tế bào trần Trong các phương pháp chọn tạo giống truyền thống lai hữu tính là phương pháp cơ bản nhất để tạo ra biến dị tổ hợp thông qua dung hợp giao tử. Tuy nhiên, việc lai hữu tính chỉ thực hiện được các cá thể trong một loài hay các loài có quan hệ thân thuộc. Đó là kỹ thuật cho phép hợp nhất các tế bào soma không có thành tế bào của cá thể hoặ các loài khác nhau, và sau đó cho tái sinh cây lai từ các tế bào đã dung hợp. Trong lai hữu tính, các tính trạng liên quan DNA bào quan kiểm soát hoàn toàn giống cây mẹ vì không có sự tổ hợp các cơ quan tử của bố và mẹ. Trong dung hợp tế bào trần, ngoài khả năng dung hợp nhân, còn có khả năng xảy ra hỗn hợp tế bào chất, hình thành tổ hợp di truyền hoàn toàn mới. Ty thể và lạp thể của hai tế bào khác nhau có thể hợp nhất hoặc là tái tổ hợp tạo ra một tế bào dị tế bào chất, gọi là cybrid. Như vậy, bằng con đường lai soma người ta có thể thu được tổ hợp mới của lạp thể hay ty thể và tương tác mới giữa nhân và tế bào chất. Dung hợp tế bào trần là một quá trình nhiều giai đoạn, bao gồm việc phân lập tế bào trần từ các loài khác nhau, dung hợp tế bào trần từ hai loài khác nhau, giám định, nhân sản phẩm dung hợp và cuối cùng là tái sinh cây lai hữu dục là sản phẩm dung hợp. Lai soma được sử dụng có hiệu quả để kết hợp khả năng kháng các bệnh virus ở khoai tây từ các kiểu gene trong một loài cũng như từ các loài khác nhau (Venzen, 1994). Lai soma là một phương tiện có hiệu quả để chuyển bất dục đực tế bào chất và đa dạng hoá nguồn bất dục trong việc tạo giống lai. Nuôi cấy mô và tế bào Đầu thế kỷ 20, Haberlandt đã nhấn mạnh tính toàn năng của tế bào soma ở thực vật và chỉ ra khả năng tạo ra cây hoàn chỉnh bằng con đường nuôi cấy mô và tế bào. Tuy nhiên, đến 50 năm sau việc tái sinh cây hoàn chỉnh từ tế bào đơn hoặc tế bào trần (protoplast) mới trở thành hiện thực. Nuôi cấy mô và tế bào là kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng. Sau đó, các mô cấy được cho tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Người ta đã xây dựng được các quy trình tương đối hoàn chỉnh để tái sinh cây cho một số loài như thuốc lá, khoai tây, mía, hoa lan, một số cây ăn quả v.v. Đối với phần lớn cây trồng trên đồng ruộng, như bông và đậu lấy
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - hạt thì việc thiết lập các quy trình để áp dụng rộng rãi khó hơn nhiều. Ở những loài cây này tần số tái sinh thấp và kết quả tái sinh từ nuôi cấy không chỉ thay đổi theo loài mà còn phụ thuộc vào kiểu gene trong một loài, nguồn mô cấy, tuổi và sức khoẻ của mô cấy, môi trường dinh dưỡng và nhiều yếu tố khác. Nhìn chung, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào cho phép nhân nhanh những kiểu gene có giá trị hay vật liệu chọn giống trong một môi trường có kiểm soát. Một số khả năng ứng dụng của nhân nhanh đối với cây trồng là: Nhân quy mô lớn kiểu gene dị hợp tử, nhân kiểu gene tự bất hợp, nhân bố mẹ bất dục trong chương trình chọn giống lai, nhân vật liệu sạch bệnh, bảo quản và trao đổi nguồn gene quốc tế Ở đây chỉ giới thiệu sơ lược một số kỹ thuật nuôi cấy in vitro liên quan trực tiếp tới quá trình chọn giống. (1) Nuôi cấy phôi, noãn và thụ phấn in vitro Các nhà chọn giống chủ yếu đã và đang tận dụng biến dị di truyền hiện có trong nguồn gene trồng trọt bằng cách sử dụng nhiều sơ đồ lai và chọn lọc khác nhau. Tuy nhiên với thâm canh và độc canh, một ít kiểu gene chọn lọc về những tính trạng có ý nghĩa kinh tế biến dị di truyền ngày một giảm trong nguồn gene trồng trọt. Thậm chí trong một số trường hợp, nguồn biến dị đối với một số tính trạng có ý nghĩa kinh tế không đủ thoả mãn, ví dụ: tính kháng bệnh vàng lụi, sâu đục thân, chịu mặn ở lúa Để khắc phục những vấn đề nghiêm trọng ảnh hưởng đến năng suất, nhà chọn giống cần có nguồn gene kháng sâu bệnh từ các loài hoang dại thân thuộc hoặc không thân thuộc. Một khó khăn lớn khi sử dụng các loài hoang dại để lai với cây trồng là tính bất hợp khi lai. Trong một số trường hợp, các phôi lai từ các tổ hợp lai giữa các loài có quan hệ xa nhau thường yếu và không có khả năng sống do sự cung cấp dinh dưỡng từ nội nhũ không đầy đủ và chúng thường bị chết trong một thời gian ngắn sau khi hình thành hợp tử và không thể phát triển thành hạt có khả năng sống. Vì vậy, nuôi cấy phôi hay cứu phôi là một phương pháp để khắc phục hàng rào bất hợp, bảo đảm để phôi non sinh trưởng, nảy mần, và phát triển thành cây con. Thông qua sử dụng phương pháp này người ta đã tạo ra nhiều con lai khác loài ở nhiều loại cây trồng như lúa mì, lúa nước, đại mạch, bông, đậu, đỗ, các loài cây ăn quả, cây cảnh và nhờ vậy nhiều gene có ích đã được chuyển vào cây trồng. Noãn đã thụ tinh đôi khi được nuôi cấy để cứu phôi từ các tổ hợp lai xa mà không cần tách phôi ra khỏi noãn. Noãn chứa phôi lai non được tách ngay sau khi thụ tinh trong điều kiện vô trùng rồi nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng. Bằng con đường nuôi cấy noãn phôi có thể nuôi cấy ở
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - giai đoạn sớm hơn so với nuôi cấy phôi tách rời. Hơn nữa, phôi phát triển trong noãn có môi trường hoá học và lý học thuận lợi hơn phôi nuôi cấy bên ngoài noãn. Thụ phấn và thụ tinh in vitro gồm việc thu nhập noãn chưa thụ tinh, cấy noãn trên môi trường dinh dưỡng trong điều kiện vô trùng, và thụ phấn cho noãn với các hạt phấn tươi. Ống phấn xuyên qua thành noãn và túi phôi sẽ thụ tinh cho tế bào trứng. Phương pháp này đã được áp dụng để tạo con lai giữa các loài mà ống phấn không thể sinh trưởng và xuyên vào noãn bình thường sau khi thụ phấn. (2) Nuôi cấy bao phấn và sản xuất cây đơn bội: Trong phần lớn các chương trình chọn giống việc tạo giống mới cải tiến bao gồm việc gieo trồng quần thể F2 lớn và chọn lọc các dòng mong muốn trong các thế hệ phân ly từ F2 đến F7 để cuối cùng tạo ra các dòng đồng hợp tử. Nuôi cấy bao phấn hay hạt phấn là một kỹ thuật hữu hiệu để tạo ra các dòng đồng hợp tử ngay từ thế hệ đầu tiên (dòng đơn bội kép), do đó tiết kiệm nguồn lực và rút ngắn thời gian cần thiết để tạo ra giống mới. Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro các bao phấn chứa tiểu bào tử hay hạt phấn chưa thành thục trên môi trường dinh dưỡng để tạo ra cây đơn bội. Số nhiễm sắc thể của cây đơn bội được nhân đôi để tạo ra cây lưỡng bội đồng hợp tử hoàn toàn, gọi là thể đơn bội kép. Việc nuôi cấy bao phấn rất có ích đối với nhà chọn giống vì thế đơn bội kép có thể được sử dụng để làm các dòng thuần ở cả cây tự thụ phấn và cây giao phấn. Thời gian cần thiết để tạo ra một giống hay một dòng tự phối bằng phương pháp đơn bội kép được rút ngắn nhiều thế hệ so với phương pháp truyền thống. Các dòng đơn bội kép tạo ra cơ hội duy nhất để cải thiện hiệu quả chọn lọc đối với nhiều tính trạng vì trong quần thể không có phương sai trội, đồng thời gene lặn cũng biểu hiện ra kiểu hình. Kỹ thuật này đã được áp dụng thành công ở Trung Quốc trong việc tạo ra giống lúa và lúa mì. Tuy nhiên, hạn chế trong việc áp dụng rộng rãi phương pháp này là khả năng nuôi cấy khó và tính đặc thù cao của kiểu gene. Ví dụ, các nhà chọn giống lúa Indica không thể sử dụng kỹ thuật này có hiệu quả bằng các nhà chọn giống lúa Japonica do các kiểu gene Indica khó nuôi cấy hạt phấn còn bị ảnh hưởng bởi giai đoạn phát triển của bao phấn, điều kiện sinh lý của cây cho phấn, điều kiện xử lý trước khi nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy và hiệu quả lưỡng bội hoá bằng colchicine. (3) Biến dị dòng soma và chọn lọc dòng tế bào:
Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - Ban đầu nuôi cấy mô được sử dụng làm kỹ thuật mới để tạo sinh khối và phương pháp nhân giống lý tưởng để sản xuất hàng loạt cây dồng nhất và như bố mẹ ban đầu của các giống ưu tú. Tuy nhiên, với thời gian các công trình nghiên cứu ở nhiều loài cây trồng có giá trị kinh tế người ta thấy rằng tế bào và mô được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo thường xuất hiện các biến đổi di truyền bao gồm số lượng và cấu trúc nhiếm sắc thể, sự sắp xếp lại trong nhiễm sắc thể, đột biến gene v.v. Các biến dị này được truyền lại cho cây khi tái sinh. Tập hợp các biến dị di truyền hình thành do quá trình nuôi cấy được gọi là biến dị dòng soma (somaclonal variation) (Larkin và Scowcroft, 1983). Biến dị dòng soma chịu ảnh hưởng bởi loài cây, kiểu gene trong loài và mô cấy, chế độ nuôi cấy, thời gian nuôi cấy in vitro, và tính ổn định của genome. Như vậy bản thân nuôi cấy mô và tế bào là một nguồn biến dị di truyền quan trọng, mới mẻ và phong phú trong các điều kiện đã thích ứng và rất có ích cho sự cải thiện giống cây trồng. Một số thể biến dị dòng soma có ích đã được phân lập, đó là khả năng để kháng virus Fiji, bệnh đốm vàng viền nâu và bệnh sương mai ở mía (Heinz và cộng sự, 1977); khả năng kháng bệnh đốm lá nhỏ ở ngô (Bretell và Ingram, 1979); kháng sương mai ở khoai tây (Shepard và cộng sự, 1980); chịu hạn và chịu lạnh ở lúa (Lê trần Bình và cs, 1996). Một ưu điểm của biến dị di truyền trong quá trình nuôi cấy là khả năng chọn lọc dòng tế bào in vitro. Có thể nuôi cấy và xử lý hàng triệu tế bào trong một không gian hạn chế, chẳng hạn trong đĩa petri và chọn lọc bằng cách xử lý tế bào nuôi cấy trong điều kiện bất lợi là tác nhân chọn lọc. Cũng có thể kết hợp xử lý đột biến trong nuôi cấy để tăng tần số biến dị di truyền. Tuy nhiên, chỉ những tính trạng biểu hiện ở mức tế bào mới có thể xác định được bằng cách sàng lọc tế bào nuôi cấy, bao gồm các đặc tính như kháng thuốc diệt cỏ, chịu mặn hay chịu kim loại như sắt, nhôm, axit amin tương đồng, chịu nhiệt độ thấp, các yếu tố dinh dưỡng và khả năng kháng độc tố do các tác nhân gây bệnh tạo ra. Các kiểu gene phân lập kháng với các điều kiện bất lợi này có thể được sử dụng trực tiếp trong chương trình chọn giống. Ưu thế lai Ưu thế lai (heterossis) là thuật ngữ do nhà chọn giống ngô G.H.Shull (Mỹ) đưa ra năm 1914 để chỉ hiệu quả lai biểu hiện vượt trội về sức sinh trưởng, sinh sản và chống chịu của con lai ở thế hệ thứ nhất so với các dạng bố mẹ của chúng. Hiện tượng này thể hiện rất rõ ở những con lai thu được từ sự giao phối giữa các dòng tự phối với nhau.