Công nghệ Sinh học - Chương học II: Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại

Nội dung text: Công nghệ Sinh học - Chương học II: Các kỹ thuật nền của công nghệ sinh học hiện đại

1. CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI (10 TIẾT) . Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn . Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen . Các phương pháp lai phân tử . Phương pháp PCR, ứng dụng . Kỹ thuật xác định trình tự DNA . Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA 8/26/2014 BM CNSH TV – Khoa CNSH 1
2. CƠ SỞ KHOA HỌC . Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity) . Các dạng phức hợp lai bổ sung: – DNA - DNA Lai giữa các nucleic acid – DNA - RNA – Protein – Protein (thường ở dạng phức hợp kháng nguyên – kháng thể) 8/26/2014 2
3. LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) Lai phân tử là quá trình kết hợp lại của hai mạch đơn DNA hoặc DNA- RNA. Cơ sở của việc lai phân tử là các mối liên kết hydro giữa các base trên hai mạch. Giữa một base A và một base T (hoặc U) hình thành hai liên kết hydro còn giữa G và C hình thành ba liên kết. T A U A C G Lai giữa các nucleic acid 8/26/2014 3
4. LAI GIỮA CÁC NUCLEIC ACID (DNA – DNA hoặc DNA – RNA) 8/26/2014 4
5. MỘT SỐ KỸ THUẬT LAI PHÂN TỬ • LAI SOUTHERN (DNA – DNA) • LAI NORTHERN (DNA – RNA) • LAI WESTERN (PROTEIN – PROTEIN) 8/26/2014 5
6. So sánh sự phân tích gene X sử dụng các kỹ thuật lai Southern, Northern và Western 8/26/2014 6
7. LAI SOUTHERN • Lịch sử – Do Edwin Southern đề xuất năm 1975 và sau đó được tiếp tục hoàn thiện. – Với sự phát triển của kỹ thuật này, Southern đã nhận được giải thưởng Lancaster trong lĩnh vực Y học vào năm 2005. Edwin Southern 8/26/2014 7
8. LAI SOUTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa 2 phân tử DNA mạch đơn (DNA-DNA) – Cho phép xác định được sự có mặt của những trình tự nucleotide trên một đoạn DNA nào đó trong một hỗn hợp các đoạn DNA khác nhau dựa trên sự bắt cặp của mẫu dò đã được đánh dấu với đoạn DNA chứa trình tự bổ sung với mẫu dò đó. • Kỹ thuật lai Southern cho biết – Sự có mặt của đoạn DNA (gen) – Số lượng đoạn DNA có mặt (tương ứng với số gen) – Độ lớn của đoạn DNA – Trình tự tương tự giữa đoạn DNA mục tiêu và mẫu dò 8/26/2014 8
9. Các bước tiến hành Bước1: Chuẩn bị DNA mẫu. Bước 2: Chuyển ssDNA lên màng lai (giai đoạn này gồm nhiều bước) Bước 3: Lai ssDNA với mẫu dò Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 8/26/2014 9
10. Bước 1: Chuẩn bị DNA mẫu 1 2 3 1 2 3 Marker Đối chứng Mẫu nghiên cứu 8/26/2014 10
11. Bước 2: Chuyển DNA mạch đơn lên màng lai DNA Giấy thấm Gel Membrane Gel Membrane Buffer 8/26/2014 11
12. Bước 3: Lai phân tử Bổ sung chất “khóa” màng lai Bổ sung mẫu dò Màng lai sau khi rửa Màng lai có mang các DNA mạch Phần màng lai đơn không mang DNA Mẫu dò được phủ được phủ bằng trên toàn bộ chất “khóa” màng màng lai nhưng Mẫu dò chỉ còn có lai chỉ liên kết với mặt ở trạng thái liên 8/26/2014 các DNA bổ sung kết bổ sung với12 DNA
13. Bước 4: Thu kết quả Màng mang phân tử lai giữa mẫu dò và DNA Phim X-quang được đặt trên màng lai cho đến khi sự phát Các đoạn bổ sung xạ từ mẫu dò được với mẫu dò xuất hiện như các vạch 8/26/2014 ghi lên phim 13 băng
14. Bước 4: Thu kết quả Kết quả lai hiện lên phim nhờ phóng xạ tự ghi 8/26/2014 14
15. 8/26/2014 15
16. LAI NORTHERN • Lịch sử − Được phát triển vào năm 1977 bởi James Alwine và George Stark tại Stanford University. − Phát triển từ kỹ thuật lai Southern và được ứng dụng cho phân tích RNA 8/26/2014 16
17. LAI NORTHERN • Nguyên lý – Dựa trên sự bắt cặp bổ sung giữa DNA và RNA – Phương pháp lai Northern Blot là phương pháp lai RNA của tế bào với mẫu dò DNA. Các bước tiến hành cũng tương tự như phương pháp Southern blot. • Phương pháp này cho biết – Sự có mặt của mRNA trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của mRNA – Trình tự tương đồng giữa đoạn mục tiêu và mẫu dò 8/26/2014 17
18. Mẫu RNA Vật nặng Giấy Màng lai thấm Khoảng trống Khay chứa Giá đỡ Tập giấy Đặt màng lai lên trên gel, đặt giấy dung dịch đệm thấm thấm, vật nặng lên trên. RNA di Phân tách RNA theo kích chuyển lên màng lai nhờ mao dẫn thước nhờ chạy điện di Bổ sung mẫu dò phóng xạ mạch đơn Túi lai Các bước tiến hành Bước1: chuẩn bị RNA mẫu. (E) Ghi nhận kết quả Bước 2: Chuyển RNA lên màng lai bằng phóng xạ tự ghi - Chạy điện di Vị trí không lai - Chuyển RNA lên màng lai Vị trí xảy ra lai Bước 3: Lai RNA với mẫu dò RNA-DNA Bước 4: Kết thúc phản ứng lai, thu kết quả lai. 8/26/2014 18
19. LAI WESTERN • Lịch sử − Phương pháp này được thực hiện đầu tiên ở phòng thí nghiệm của George Stark ở Stanford. Kỹ thuật này đã được W. Neal Burnette đặt tên là Western blot (1981), nối tiếp theo tên Southern blot. 8/26/2014 19
20. LAI WESTERN • Nguyên lý – Lai Western Blot được thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể • Phương pháp này cho biết – Sự thể hiện của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô – Mức độ thể hiện của gen – Độ lớn của protein 8/26/2014 20
21. Các bước tiến hành 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện 8/26/2014 21
22. Chuẩn bị mẫu 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện 8/26/2014 22
23. Chuẩn bị mẫu Tách chiết protein Hòa tan và biến tính protein Protein ở dạng cấu trúc 2' and 3' thường không tích điện âm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tích âm 8/26/2014 23
24. Chạy điện di SDS-PAGE 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE Cực âm 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Cực dương 8/26/2014 24
25. Chuyển protein lên màng 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Cực dương Bọt biển Giấy thấm Màng Gel Giấy thấm Bọt biển Cực âm 8/26/2014 25
26. Cố định màng 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện Sau khi sử dụng hệ thống chuyển protein lên màng, màng sẽ chứa các protein ở vị trí giống như vị trí của chúng ở trên gel. Màng được ủ với các protein “khóa” (thường sử dụng BSA hoặc sữa bột) để “khóa” những khoảng trống trên màng tránh kháng thể bám vào khoảng trống của màng. 8/26/2014 26
27. Ủ với kháng thể và phát hiện 1. Chuẩn bị mẫu protein 2. Chạy điện di SDS-PAGE 3. Chuyển protein lên màng 4. Cố định màng 5. Ủ với kháng thể và phát hiện 8/26/2014 27
28. Ủ với kháng thể và phát hiện Ủ với kháng thể 1: trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở 4oC. Kháng thể 1 gắn với kháng nguyên đặc hiệu. Các kháng thể không liên kết với kháng nguyên thì được rửa đi. Ủ với kháng thể 2: trong 1-3 giờ ở nhiệt độ phòng. Màng được ủ với kháng thể thứ 2, kháng thể này nhận biết và chỉ bám vào kháng thể 1. Kháng thể này liên kết với một phân tử cho phép chúng ta phát hiện được vị trí liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể trên màng. 8/26/2014 28
29. Một số phương pháp phát hiện khác • Phát hiện nhờ tạo màu • Phát hiện nhờ quang hóa học • Phát hiện nhờ phóng xạ • Phát hiện nhờ phát huỳnh quang 8/26/2014 29
30. Ủ với kháng thể và phát hiện Cơ chất VD: Hydrogen peroxide + luminol HRP 3-aminophtalate (nhạy với ánh sáng) Kháng thể 2 Kháng thể 1 Kháng nguyên nằm trên màng Sự phát hiện nhờ phát quang hóa học 8/26/2014 30
31. Tóm tắt quy trình thực hiện Western blot Chuẩn bị mẫu protein Chạy điện di SDS-PAGE phân tách các phân tử protein theo kích thước Bổ sung cơ chất (hoặc không cần), phát hiện vị trí lai giữa kháng Màng lai được xử lý nguyên – kháng thể Chuyển protein với kháng thể thứ 2 lên màng lai mang phân tử giúp nhận biết sự liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Kháng thể này liên kết với kháng thể 1. Màng lai mang các phân tử protein có vị trí Màng lai được xử lý với giống như trên bản gel kháng thể 1, kháng thể này bám đặc hiệu vào Xử lý BSA hoặc sữa kháng nguyên (protein) bột để “khóa” chỗ 8/26/2014 mục tiêu 31 trống trên màng lai
32. So sánh 3 phương pháp lai Kỹ thuật Gel Phân tử Phát hiện Southern agarose DNA nucleic acid Northern agarose RNA nucleic acid Western polyacrylamide Protein Kháng thể 8/26/2014 32