›
›

Công nghệ sinh học - Bài giảng thực hành Hóa sinh

pdf 39 trang vanle 5120
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Công nghệ sinh học - Bài giảng thực hành Hóa sinh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfcong_nghe_sinh_hoc_bai_giang_thuc_hanh_hoa_sinh.pdf

Nội dung text: Công nghệ sinh học - Bài giảng thực hành Hóa sinh

  1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HCM KHOA MƠI TRƯỜNG & CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÀI GIẢNG THỰC HÀNH HĨA SINH TS. Nguyễn Hồi Hương CN. Bùi Văn Thế Vinh Dùng cho sinh viên ngành Mơi trường và Cơng nghệ Sinh học Năm xuất bản: 2009
  2. MỤC LỤC Trang Giới thiệu mơn học 4 Quy tắc làm việc trong phịng thí nghiệm Hĩa 5 sinh 1. An tồn khi làm việc với axit và kiềm 5 2. Quy tắc làm việc với hĩa chất thí nghiệm 6 Bài 1 Cách pha chế các dung dịch dùng trong thí 8 nghiệm Hĩa sinh I Lý thuyết 8 1. Dung dịch 8 2. Dung dịch đệm 14 II Thực hành 20 III Bài nộp 20 Bài 2 Định lượng đường khử bằng phương pháp Acid 21 dinitro-salicylic (DNS) I Lý thuyết 21 1. Định nghĩa 21 2. Nguyên tắc 21 3. Xử lý mẫu 21 II Thực hành 22 1. Dụng cụ - hĩa chất 22 2. Tiến hành thí nghiệm 23 3. Tính kết quả 24 III Bài nộp 24 Bài 3 Định lượng Nitơ tổng số bằng phương pháp 25 Kjeldahl I Lý thuyết 25 1. Định nghĩa 25 2
  3. 2. Nguyên tắc 26 II Thực hành 26 1. Dụng cụ - hĩa chất 26 2. Tiến hành thí nghiệm 27 3. Tính kết quả 28 III Bài nộp 28 Bài 4 Định lượng protein bằng phương pháp Bradford 30 I Lý thuyết 30 1. Định nghĩa 30 2. Nguyên tắc 30 II Thực hành 31 1. Dụng cụ - hĩa chất 31 2. Tiến hành thí nghiệm 31 3. Tính kết quả 32 III Bài nộp 32 Bài 5 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 33 I Lý thuyết 33 1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme 33 2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 34 3. Enzyme amylase và phương pháp xác định hoạt 35 tính II Thực hành 36 1. Dụng cụ - hĩa chất 36 2. Tiến hành thí nghiệm 36 3. Tính kết quả 38 III Bài nộp 38 Tài liệu tham khảo 39 3
  4. GIỚI THIỆU MƠN HỌC Bài giảng “Thực hành sinh hố” dành cho sinh viên năm thứ hai khoa Mơi trường & Cơng nghệ Sinh học, trường Đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ TP.HCM. Với thời lượng 30 tiết và tuỳ thuộc điều kiện, cơ sở vật chất của phịng thí nghiệm cho phép, sinh viên tiến hành làm 5 bài thực hành gồm các nội dung chính của học phần lý thuyết hĩa sinh cơ sở. 1. Giới thiệu phịng thí nghiệm hĩa sinh, cách pha chế các dung dịch dung trong thí nghiệm hĩa sinh ; 2. Định lượng đường khử bằng phương pháp acid dinitro-salicylic (DNS); 3. Định lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl; 4. Định lượng protein bằng phương pháp Bradford; 5. Xác định hoạt tính enzyme amylase. 4
  5. QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHỊNG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I. An tồn khi làm việc với axit và kiềm 1. An tồn khi làm việc với axit: Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nĩng axit hoặc thực hiện phản ứng với các hơi axit tự do. Khi pha lỗng, luơn phải cho axit vào nước trừ phi được dùng trực tiếp. Giữ để axit khơng bắn vào da hoặc mắt bằng cách đeo khẩu trang, găng tay và kính bảo vệ mắt. Nếu làm văng lên da, lập tức rửa ngay bằng một lượng nước lớn. Luơn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng và tính chất của chúng. H2SO4: Luơn cho acid vào nước khi pha lỗng, sử dụng khẩu trang và găng tay để tránh phịng khi văng acid Các acid dạng hơi (HCl) thao tác trong tủ hút và mang găng tay, kính bảo hộ. 2. An tồn khi làm việc với kiềm Kiềm cĩ thể làm cháy da, mắt gây hại nghiêm trọng cho hệ hơ hấp. Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc. Thao tác trong tủ hút, mang mặt nạ chống độc để phịng ngừa bụi và hơi kiềm. Amoniac: là một chất lỏng và khí rất ăn da, mang găng tay cao su, khẩu trang, thiết bị bảo vệ hệ thống hơ hấp. Hơi amoniac dễ cháy, phản ứng mạnh với chất oxy hố, halogen, axit mạnh. Amoni hydroxyt: chất lỏng ăn da, tạo hỗn hợp nỏ với nhiều kim loại nặng: Ag, Pb, Zn và muối của chúng. Kim loại Na, K, Li, Ca: phản ứng cực mạnh với nước, ẩm, CO2, halogen, axit mạnh, dẫn xuất clo của hydrocacbon. Tạo hơi ăn mịn khi cháy. Cần mang dụng cụ bảo vệ da mắt. Chỉ sử dụng cồn khơ khi tạo dung dịch natri alcoholate, cho vào từ từ. Tránh tạo tinh thể cứng khi hồ tan. Tương tự khi hồ tan với nước, đồng thời phải làm lạnh nhanh. Oxit canxi rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước, cần bảo vệ da mắt, đường hơ hấp do dễ nhiểm bụi oxit. 5
  6. Natri và kali hydroxyt: rất ăn da, phản ứng cực mạnh với nước. Các biện pháp an tồn như trên, cho từng viên hoặc ít bột vào nước chứ khơng được làm ngược lại. II. Quy tắc làm việc với hĩa chất thí nghiệm 1. Hố chất thí nghiệm: Các hố chất dùng để phân tích, làm tiêu bản, tiến hành phản ứng, trong phịng thí nghiệm được gọi là hĩa chất thí nghiệm. Hố chất cĩ thể ở dạng rắn (Na, MgO, NaOH, KCl, (CH3COO)2 ; lỏng (H2SO4, aceton, ethanon, chloroform, ) hoặc khí (Cl2, NH3, N2, C2H2 ) và mức độ tinh khiết khác nhau: - Sạch kỹ thuật (P): độ sạch > 90% - Sạch phân tích (PA): độ sạch 99% Hĩa chất cĩ độ tinh khiết khác nhau được sử dụng phù hợp theo những yêu cầu khác nhau và chỉ nên sử dụng hĩa chất cịn nhãn hiệu. 2. Nhãn hiệu hố chất: Hĩa chất được bảo quản trong chai lọ thủy tinh hoặc nhựa đĩng kín cĩ nhãn ghi tên hố chất, cơng thức hĩa học, mức độ sạch, tạp chất, khối lượng tịnh, khối lượng phân tử, nơi sản xuất, điều kiện bảo quản. 3. Cách sử dụng và bảo quản hố chất: Khi làm việc với hĩa chất, nhân viên phịng thí nghiệm cũng như sinh viên cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc cho mình và cho mọi người. Những điều cần nhớ khi sử dụng và bảo quản hĩa chất được tĩm tắt như sau: - Hĩa chất phải được sắp xếp trong kho hay tủ theo từng loại (hữu ơ, vơ cơ, muối, acid, bazơ, kim loại, ) hay theo một thứ tự a, b, c để khi cần dễ tìm. - Tất cả các chai lọ đều phải cĩ nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hĩa chất trước khi dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu. - Chai lọ hĩa chất phải cĩ nắp. Trước khi mở chai hĩa chất phải lau sạch nắp, cổ chai, tránh bụi bẩn lọt vào làm hỏng hĩa chất đựng trong chai. - Các loại hĩa chất dễ bị thay đổi ngồi ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chổ tối. 6
  7. - Dụng cụ dùng để lấy hĩa chất phải thật sạch và dùng xong phải rửa ngay, khơng dùng lẫn nắp đậy và dụng cụ lấy hĩa chất. - Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy khơng được để gần nơi dễ bắt lửa. Khi cần sử dụng các hĩa chất dễ bốc hơi, cĩ mùi, phải đưa vào tủ hút, chú ý đậy kín nắp sau khi lấy hĩa chất xong. - Khơng hút bằng pipette khi chỉ cịn ít hĩa chất trong lọ, khơng ngửi hay nếm thử hĩa chất. - Khi làm việc với acid hay base mạnh: Bao giờ cũng đổ acid hay base vào nước khi pha lỗng (khơng được đổ nước vào acid hay base); Khơng hút acid hay base bằng miệng mà phải dùng các dụng cụ riêng như ống bĩp cao su. Trường hợp bị bỏng với acid hay base rửa ngay với nước lạnh rồi bơi lên vết bỏng NaHCO3 1% (trường hợp bỏng acid) hoặc CH3COOH 1% (nếu bỏng base). Nếu bị bắn vào mắt, dội mạnh với nước lạnh hoặc NaCl 1%. Trường hợp bị hĩa chất vào miệng hay dạ dày, nếu là acid phải súc miệng và uống nước lạnh cĩ MgO, nếu là base phải súc miệng và uống nước lạnh cĩ CH3COOH 1%. Lưu ý các kí hiệu cảnh báo nguy hiểm: 7
  8. BÀI 1: CÁCH PHA CHẾ CÁC DUNG DỊCH DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM HĨA SINH I. Lý thuyết 1.1. Dung dịch Dung dịch là hỗn hợp của hai hay nhiều chất tác động tương hỗ với nhau về mặt vật lý và hĩa học. Trong dung dịch gồm cĩ chất hịa tan và dung mơi. Nếu chất hịa tan ở dạng rắn thì gọi là chất tan, nếu là chất lỏng thì gọi là dung chất. Tùy theo tính chất của dung mơi mà phân thành dung dịch nước và dung dịch khan. Phần lớn các dung dịch acid, base, muối trong phịng thí nghiệm là dung dịch nước, dùng dung mơi là nước. Một số chất khác tan trong dung mơi hữu cơ. Hàm lượng chất hịa tan trong dung dịch thể hiện ở nồng độ dung dịch. Cĩ nhiều cách biểu thị nồng độ khác nhau. Mỗi cách sẽ tiện dụng trong chuẩn bị, phân tích và tính tốn khác nhau. 1.1.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch a) Nồng độ phần trăm, (%) i) Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan cĩ trong 100g dung dịch. Ví dụ: dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch cĩ chứa 5g NH4Cl ii) Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan cĩ trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4 iii) Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất cĩ trong 100ml dung dịch. Ví dụ: dung dịch glycerine 10% (v/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10ml glycerine. b) Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan cĩ trong 1 lít dung dịch. c) Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số mol) chất tan trong 1 lít dung dịch. Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam KH2PO4. 8
  9. d) Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan cĩ trong 1 lit dung dịch. Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z) Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đĩ và phản ứng mà chất đĩ tham gia. i) Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H+ hay OH- mà 1 phân tử, ion của chất đĩ tác dụng vừa đủ. Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH H2SO4 + 2 NaOH ¡ Na2SO4 + 2 H2O + H2SO4 ¡ 2 H z = 2 NaOH ¡ 1 OH- z = 1 ii) Nếu phản ứng là phản ứng ơxy – hĩa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion của chất đĩ cho hay nhận. Ví dụ: 2 Na2S2O3 + I2 ¡ Na2S4O6 + 2 NaI I + 1e ¡ I- z = 1 S2+ - 1e ¡ S+ z = 1 e) Nồng độ dung dịch bão hịa: là nồng độ dung dịch khi tối đa chất hịa tan cĩ mặt trong dung dịch. f) Đơn vị nồng độ dùng trong các phép phân tích vi lượng : - Nồng độ mg/mL: số mg chất tan trong 1mL dung dịch - Miligam phần trăm, mg%: mg chất hịa tan trong 100g dung dịch. - Microgam phần trăm, µg%: là số µg chất hịa tan trong 100g dung dịch. 0 - Phần nghìn, /00: số g chất hịa tan trong 1000g dung dịch. - Phần triệu, ppm: số mg chất hịa tan trong 1kg hay 1 lít dung dịch. - Phần tỷ, ppb: số µg chất hịa tan cĩ trong 1kg hay 1 lít dung dịch. 1.1.2. Cách pha dung dịch cĩ nồng độ xác định a) Pha dung dịch cĩ nồng độ phần trăm theo khối lượng, % (w/w) i) Chất tan là chất rắn khan: Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 40% (w/w) 100g dung dịch cần 40g NaOH 500g dung dịch cần X g? 9
  10. Lượng NaOH cần để pha dung dịch : X= (40*500)/100= 200g Lượng nước cần thiết: 500-200=300g (hay 300ml) Vậy, cân 200g NaOH và đong 300 ml nước cất, hịa tan ta được 500g dung dịch NaOH 40% ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O; ) Khi pha dung dịch cần phải tính thêm lượng nước kết tinh cĩ sẵn. Ví dụ: Pha 320g dung dịch CuSO4 10% (w/w) từ CuSO4.5H2O M(CuSO4) = 160 và M(CuSO4.5H2O) = 250 Lượng CuSO4 khan để pha dung dịch là: X = (10*320)/100 = 32g Lượng CuSO4.5H2O cần dùng: Y = (250*32)/160 = 50g Lượng nước cất thêm vào: 320 -50 = 270g (hay ml) Vậy, cân 50g CuSO4.5H2O, đong 270ml nước cất, hịa tan ta được 320g dung dịch CuSO4 10%. b) Pha dung dịch lỗng từ một dung dịch đậm đặc hơn: Ví dụ: Pha 500g dung dịch NaOH 5% từ dung dịch NaOH 10% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 5% là: X = (5*500)/100 = 25g Lượng dung dịch NaOH 10% cần dùng là: Y = (100*25)/10 = 250g Lượng nước cất thêm vào: 500-250 = 250g Vậy, đong 250ml nước cất và 250g dd NaOH 10%, hịa tan ta được 500g NaOH 5% c) Pha dung dịch bão hồ: Lấy chất tan cần pha vào becher, thêm một ít nước cất và khuấy cho tan. Nếu sau khi khuấy, chất tan khơng tan hết lắng xuống thì phần dung dịch phía trên là dung dịch bão hịa. Nếu chất tan tan hết, thêm chất tan và tiếp tục khuấy, cứ như thế cho đến khi chất tan khơng cịn tan được nữa. d) Pha dung dịch cĩ nồng độ % theo thể tích i) Chất tan là chất rắn khan Cân lượng chất tan cần thiết, chuyển sang bình định mức, dùng nước cất hịa tan và định mức đến thể tích đúng. Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch NaCL 5% (w/v) Lượng NaCl cần để pha dung dịch: X = (5*1000)/100 = 50g 10
  11. Vậy, cân 50g NaCl, hịa tan và định mức thành 1 lít bằng nước cất, ta được 1 lít dung dịch NaCl 5%. ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước (CuSO4.5H2O; Na2HPO4. 12H2O; ) Khi pha dung dịch ta cần phải tính đến lượng nước kết tinh cĩ sẵn giống như ở phần a. iii) Chất tan dạng lỏng: Một số chất tan ở dạng lỏng như HCl, H2SO4 Việc cân khơng thuận lợi, cĩ thể đưa về đơn vị thể tích theo cơng thức V = M/d V: Thể tích chất lỏng; M: khối lượng chất lỏng cần cân; d: tỷ trọng chất lịng Chú ý: Các hĩa chất lỏng bán trên thị trường thường khơng ở dạng nguyên chất mà là các dung dịch đậm đặc. Giới hạn hịa tan tối đa được tính bằng % thể tích và thay đổi tùy theo loại hĩa chất. Ví dụ như H2SO4: 95-98%; HCl: 37%; H3PO4: 65- 85%; NH4OH: 25%. Do đĩ khi pha các dung dịch từ các loại hĩa chất này ta phải chú ý đến nồng độ của dung dịch đậm đặc. Ví dụ: Pha 440ml dung dịch HCl 1% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 1% là: X= (1*440)/100 = 4,4g Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = (100*4,4)/37 = 11,9g = 11,9/1,19 = 10 ml Lượng nước cất thêm vào:440-10 = 430ml Vậy, dùng ống đong lấy 10ml dung dịch HCl37%, và 430ml nước cất ta được 440 ml HCl 1% Do việc sử dụng các loại bình định mức làm cho việc pha chế dung dịch thí nghiệm trở nên đơn giản và chính xác vì vậy ngày nay đa số các dung dịch thí nghiệm được pha chế theo nồng độ khối lượng - thể tích (w/v). e) Pha dung dịch nồng độ phân tử gam i) Chất tan là chất rắn khan Muốn pha dung dịch nồng độ 1M của một chất nào đĩ, ta tính khối lượng phân tử chất đĩ (hoặc tra bảng) theo đơn vị gam. Cân chính xác lượng chất tan, qua phễu cho vào bình định mức cĩ dung tích 1 lít. Cho vào từng lượng nước cất nhỏ, lắc để hịa tan hồn tồn và đưa nước cất tới mức. Chuyển dung dịch sang bình chứa, lắc để trộn đều đồng nhất. 11
  12. Khi phải đun nĩng dung dịch để hịa tan, hoặc quá trình hịa tan cĩ toả nhiệt thì phải chờ nhiệt độ trở lại bình thường (nhiệt độ khơng khí) rồi mới thêm nước tới vạch định mức. Ví dụ: Pha 1 lít dung dịch KOH 1M Phân tử lượng của KOH: MKOH = 39 +16 +1 =56 Lượng KOH để pha 1 lít dung dịch 1M là: 56g Vậy, cân 56g KOH, hịa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 1000. Đây là phản ứng tỏa nhiệt, cần làm nguội dung dịch trước khi định mức thành 1 lít. Nếu muốn pha dung dịch 2M; 3M hay 0,1M; 0,05M ta cũng tiến hành tương tự với lượng cân tương ứng. Ví dụ: Pha 500ml dung dịch KCl 3M Phân tử lượng của KCl: MKCl = 39 +35,5 = 74,5 Lượng KCl để pha 500ml dung dịch 3M là: X= (74,5 *3*500)/1000 = 111,75g Vậy, cân 111,75g KCl, hịa tan trong 1 ít nước, cho vào bình định mức 500, định mức đến vạch. ii) Chất tan là chất rắn ngậm nước: khi tính lượng chất tan cần cân phải tính luơn cả khối lượng các phân tử nước. iii) Chất tan dạng lỏng: nếu chất tan là dung dịch, ta phải tính tốn dựa vào nồng độ dung dịch đĩ. Ví dụ: 8) Pha 1 lít dung dịch HCl 1M từ HCl 37% Phân tử lượng HCl: MHCl = 1+35,5 = 36,5 Lượng HCl 37% để pha dung dịch 1M là: X = (36,5*100)/37 = 98,65g Hay 98,65/1,19 = 83ml Vậy, đong 83ml HCl 37% cho vào bình định mức 1000 cĩ sẵn 1 ít nước. Định mứ c thành 1 lít. Tiến hành pha trong tủ Hotte vì hơi acid bay lên rất độc hại. f) Pha nồng độ đương lượng (N) Việc pha dung dịch nồng độ đương lượng gam (N) cũng tương tự với cách pha dung dịch nồng độ phân tử gam (M). 1.1.3. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch 12
  13. Khi pha hĩa chất, cĩ nhiều nguyên nhân làm cho nồng độ dung dịch khơng chính xác như việc cân đong khơng chính xác, các hĩa chất khơng tinh khiết hay bị hút ẩm. Thời gian tàng trữ lâu nên chất tan bị thăng hoa, bị oxy hĩa, dung mơi bay hơi, vì vậy phải kiểm tra nồng độ thực của các dung dịch pha sẵn dựa vào các dung dịch cĩ nồng độ chính xác được gọi là dung dịch chuẩn (fixanal) a) Dung dịch chuẩn Dung dịch chuẩn là các dung dịch được chuẩn bị sẵn, đảm bảo chính xác và được dùng để định chuẩn các dung dịch tự pha chế khi làm thí nghiệm. Các chất dùng trong dung dịch chuẩn phải khá bền vững sao cho nồng độ của chúng khơng thay đổi nhanh chĩng theo thời gian. Pha dung dịch chuẩn, ta phải dùng ống chuẩn. Ống chuẩn là một ống ampun thủy tinh hay nhựa đĩng kín. Bên trong chứa một lượng cân chính xác chất tan hoặc dung dịch chất tan. Khi chuyển hết lượng chất tan trong ống vào bình định mức và pha thành 1 lít ta được dung dịch chuẩn cĩ nồng độ đã ghi trên nhãn ngồi ống. Cách pha dung dịch chuẩn từ ống chuẩn : - Dùng đinh thủy tinh chọc thủng ampun, hứng lên phểu vào bình định mức, dùng bình tia rửa sạch chất tan cĩ trong ampun vào bình định mức 1 lit, vừa thêm nước cất vừa lắc và đưa nước cất tới vạch mức. - Đối với các hợp chất bền vững, cĩ thành phần khơng thay đổi như NaCl, AgNO3, acid oxalic, cĩ thể pha dung dịch chuẩn trực tiếp bằng cách cân chính xác chất cần pha, pha lỗng và định mức tới thể tích đúng. - Đối với các chất như NaOH, HCl, Na2S2O3, khơng thể pha ngay được dung dịch chuẩn, do các chất này thường khơng bền vững và dễ thay đổi thành phần, vì vậy sau khi pha phải hiệu chỉnh lại nồng độ. Ví dụ: NaOH thường nhiễm một lượng Na2CO3 rất dễ chảy nước, HCl dễ bay hơi, Na2S2O3 dễ bị mất nước tinh thể khi để ngồi khơng khí. b) Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch cĩ nồng độ chính xác, ta pha dung dịch cĩ nồng độ gần đúng, sau đĩ hiệu chỉnh nồng độ của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp. 13
  14. Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1 N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N để chuẩn độ lại. Đối với các dung dịch dễ thay đổi trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch Xét một phản ứng trung hịa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-. Do đĩ: C1V1 = C2V2 Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta cĩ hệ số hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N. Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt chỉ thị màu phenolphtalien, dùng burette chuẩn độ bằng NaOH được 11 ml NaOH Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91 1.2. Dung dịch đệm: 1.2.1. Định nghĩa dung dịch đệm pH mơi trường làm thay đổi cấu trúc khơng gian protein vì một số amino acid - + cĩ mạch nhánh phân ly (COO và NH4 tạo liên kết ion). Họat động tối ưu của protein phụ thuộc vào cấu trúc khơng gian nhất định trong mơi trường, nghĩa là phụ thuộc vào tỉ lệ phân ly của mạch nhánh thành ion, hay nĩi tĩm lại là phụ thuộc vào pH mơi trường. Dung dịch đệm là dung dịch cĩ pH khơng thay đổi nhiều lắm khi một lượng nhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một cặp acid base liên hợp (acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của base này) và tỉ lệ của chúng sẽ quyết định pH của dung dịch. Việc pha dung dịch đệm tuân theo nguyên tắc chọn cặp acid – base cĩ hằng số phân ly pK A/B gần với pH đệm muốn pha và phối trộn chúng với số mol bằng nhau. Thí dụ, để cĩ đệm pH ở giá trị 4.75, chọn cặp acid - base CH3COOH (0,1M)/CH3COONa (0,1M). Nếu thêm vào dung dịch 0.001 mol HCl thì pH của hệ vẫn chỉ ở mức 4.748 gần bằng 4.75. Nghĩa là pH thay đổi rất ít. 14
  15. Trong cơ thể sống, dung dịch đệm đĩng vai trị quan trọng, ví dụ như ổn định pH của máu bằng các hệ đệm carbonate và phosphate. Về nguyên tắc thì phối hợp các loại đệm cĩ các khoảng đệm khác nhau thành 1 dung dịch là khơng cĩ vấn đề gì. Tuy nhiên sử dụng các đệm nào cịn tùy thuộc vào ứng dụng sao cho thành phần của đệm khơng phản ứng với các cấu tử trong hệ phản ứng khảo sát theo chiều hướng cĩ hại. Các phản ứng thường thấy là phản ứng tạo kết tủa hay tạo phức hoặc oxy hĩa khử. Cĩ dung dịch chứa hỗn hợp 1 acid yếu (Ví dụ: acid acetic) với muối của nĩ (Ví dụ: muối natri acetate), dung dịch sẽ cân bằng dạng như sau: - + CH3COOH + H2O > CH3COO + H3O Cĩ dung dịch khác chẳng hạn, chứa hỗn hợp base yếu (Ví dụ: ammoniac) với muối của nĩ (Ví dụ: muối amoni clorua),trong dung dịch cân bằng cĩ dạng sau: + - NH3 + H2O > NH4 + OH Dung dịch đệm cĩ pH thay đổi rất ít khi thêm một lượng acid hoặc base. + Khi thêm một lượng acid mạnh (H3O ), base liên hợp kết hợp với nĩ cho acid yếu (cân bằng chuyển dịch theo chiều nghịch) pH của dung dịch giảm khơng đáng kể. - + Trái lại, khi thêm một lượng base mạnh (OH ), acid điện li cho H3O (cân bằng + - chuyển dịch theo chiều thuận), ion hidroni H3O trung hịa OH cho base yếu H2O. Kết quả pH của dung dịch tăng khơng đáng kể. Khả năng đệm của hỗn hợp đệm phụ thuộc vào hàm lượng acid và base liên hợp cĩ trong hỗn hợp. 1.2.2. Cách pha một số dung dịch đệm thường dùng a) Dung dịch đệm borat: - Dung dịch acid boric (a): 12,404 g H3BO3 hịa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch borat (b): 19,108 g Na2B4O7.10H2O hịa tan và định mức đến 1000 ml Dung dịch đệm borat cĩ pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và dung dịch (b) theo bảng dưới đây: A b pH a b pH 15
  16. 9,80 0,2 6,60 6,50 3,50 8,20 9,70 0,6 6,77 6,00 4,00 8,31 9,40 0,6 7,09 5,50 4,50 8,41 9,00 1,0 7,36 5,00 5,00 8,51 8,75 1,25 7,50 4,50 5,50 8,60 8,50 1,50 7,60 4,00 6,00 8,69 8,00 2,0 7,78 3,00 7,00 8,84 7,70 2,30 7,88 2,00 8,00 8,98 7,50 2,50 7,94 1,00 9,00 9,11 7,00 3,00 8,08 0,00 10,0 9,24 b) Dung dịch đệm citrate (pH = 3,0 – 6,2) - Dung dịch acid citric 0,1M (a): 21,01 g C6H8O7.H2O hịa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch trinatri citrate 0,1M (b): 29,41 g C6H5O7Na3.2H2O hịa tan và dẫn nước đến 1000 ml. Dung dịch đệm citrate cĩ giá trị pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) theo bảng sau: A b pH A b pH 46,5 3,50 3,0 23,0 27,0 4,8 43,8 6,20 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8 31,0 19,0 4,2 9,5 40,5 6,0 28,0 22,0 4,4 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 - - - 16
  17. c) Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,7 – 8,0) - Dung dịch mononatri orthophosphate 0,2M (a): 27,8 g NaH2PO4 hịa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch dinatri hydrophosphate 0,2M (b): 53,05 g Na2HPO4.7H2O hoặc 71,7 g Na2HPO4.12H2O hịa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm phosphate cĩ pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b) định mức đến 200 ml. a b pH A b pH 93,5 6,50 5,6 45,0 55,0 6,9 92,0 8,00 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 77,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 7,4 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 7,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 7,6 68,5 31,5 6,5 10,5 89,5 7,7 62,5 37,5 6,6 8,50 91,5 7,8 56,5 53,5 6,7 7,00 93,0 7,9 51,0 49,0 6,8 5,30 94,7 8,0 d) Dung dịch đệm Na2HPO4 – KH2PO4 (pH = 5,0 – 8,0) - Dung dịch dinatri hydrophosphate 1/15M (a): 23,9 g Na2HPO4.12H2O hịa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch kali dihydrophosphate 1/15M (b): 9,07 g KH2PO4 hịa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm cĩ pH khác nhau phụ thuộc vào số ml dung dịch (a) và số ml dung dịch (b). 17
  18. a b pH a b pH 10 990 5,0 372 628 6,6 18 982 5,2 492 508 6,8 30 970 5,4 612 388 7,0 49 951 5,6 726 274 7,2 79 921 5,8 818 182 7,4 121 879 6,0 885 115 7,6 184 816 6,2 936 64 7,8 264 736 6,4 969 31 8,0 e) Dung dịch đệm Glycine – HCl (pH = 2,2 – 3,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hịa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch HCl 0,2 M (b): 16,8 ml HCl đặc (37%) pha thành 1000 ml. Dung dịch đệm Glycine cĩ pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. X pH X pH 5,0 3,6 16,8 2,8 6,4 3,4 24,2 2,6 8,2 3,2 32,4 2,4 11,4 3,0 44,0 2,2 f) Dung dịch đệm Glycine – NaOH (pH = 8,6 – 10,6) - Dung dịch glycine 0,2 M (a): 15,01g glycine hịa tan và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch NaOH 0,2 M (b): 8 g NaOH hịa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm Glycine cĩ pH khác nhau khi lấy 50 ml dung dịch (a) và X ml dung dịch (b) rồi định mức đến 200 ml. 18
  19. X pH X pH 4,0 8,6 22,4 9,6 6,0 8,8 72,2 9,8 8,8 9,0 32,0 10,0 12,0 9,2 38,6 10,4 16,8 9,4 45,5 10,6 g) Dung dịch đệm acetate (pH = 3,6 – 5,6) - Dung dịch acid acetic 0,2M (a): 11,55 ml CH3COOH đặc và định mức đến 1000 ml. - Dung dịch natri acetate 0,2M (b): 16,4 g CH3COONa hoặc 27,2 g CH3COONa.3H2O được hịa tan và định mức đến 1000 ml. Dung dịch đệm cĩ pH khác nhau phụ thuộc vào X ml dung dịch (a) và Y ml dung dịch (b) và định mức đến 100 ml. a b pH A b pH 46,3 3,7 3,6 20,0 30,0 4,8 44,0 6,0 3,8 14,8 35,2 5,0 41,0 9,0 4,0 10,5 39,5 5,2 36,8 13,2 4,2 8,8 41,2 5,4 30,5 19,5 4,4 4,8 45,2 5,6 25,5 24,5 4,6 h)Dung dịch đệm vạn năng 0,1M - Dung dịch acid acetic 0,1M (a): 5,7 ml CH3COOH đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml. - Dung dịch acid phosphoric 0,1M (b): 6,45 ml H3PO4 đậm đặc và định mức bằng nước cất đến 1000 ml. - Dung dịch acid ortho-boric 0,1M (c): hịa tan 6,18 g acid ortho-boric trong nước cất và định mức đến 1000 ml. 19
  20. - Dung dịch natri hydroxide 1N (d): hịa tan 40 g NaOH trong nước cất và định mức đến 1000 ml. Trộn lẫn các dung dịch (a), (b), (c) với thể tích bằng nhau nhận được dung dịch đệm 0,1M cĩ pH = 1,8. Điều chỉnh giá trị pH của dung dịch đệm trong khoảng pH = 1,8 đến pH = 12,0 bằng cách bổ sung dung dịch NaOH 1N (d). Các dung dịch đệm vạn năng nồng độ khác được chuẩn bị tương tự. II. Thực hành Sinh viên pha dung dịch đệm và một số dung dịch sử dụng trong các bài thí nghiệm sau theo hướng dẫn của giảng viên. III. Bài nộp 1. Ghi chép phương pháp pha các dung dịch thực chuẩn bị. 2. Làm các bài tập sau: 1. Pha 1 L dung dịch NaOH 40% (w/v): cân g NaOH khơ 2. Pha 0,5 L dung dịch H2SO4 2M cần bao nhiêu ml H2SO4 đậm đặc, biết rằng H2SO4 đđ là acid 97% cĩ M=98 g/mol, tỉ trọng d=1,84 g/ml. Nồng độ mol của H2SO4 đđ là: Thể tích H2SO4 cần sử dụng là: Lượng nước cần bổ sung là : 3. Pha 250 ml dung dịch CuSO 4 1 M, cân .g CuSO4.5H2O 4. Pha 1 L dung dịch H2SO4 0.1N từ dung dịch H2SO4 2M: 5. Pha 500 g dung dịch NaOH 10% từ dung dịch NaOH 40% Lượng NaOH cần để pha dung dịch 10% là: X = Lượng dung dịch NaOH 40% cần dùng là: Y = Lượng nước cất thêm vào: 6. Pha 500 ml dung dịch HCl 2% từ dung dịch HCl 37% (d=1,19g/ml) Lượng HCl cần để pha dung dịch 2% là: X= Lượng dung dịch HCl 37% cần dùng là : Y = Lượng nước cất thêm vào: 20
  21. BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG PHƯƠNG PHÁP ACID DINITRO - SALICYLIC (DNS) I. Lý thuyết 1. Định nghĩa Đường khử là các đường chứa nhĩm aldehyde (-CHO) hoặc ketone (-CO) như glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đĩ saccharose, trehalose khơng phải đường khử. 2. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sĩng 540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid: Acid dinitrosalicylic 3-amino, 5- dinitrosalicylic acid 3. Xử lý mẫu Tùy vào đối tượng nghiên cứu (hạt, quả, ) mà cách chuẩn bị dung dịch nghiên cứu dùng để định lượng đường cĩ khác nhau đơi chút, nhưng nguyên tắc chung như sau: - Trường hợp nguyên liệu thí nghiệm khơng chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin, cĩ thể chiết đường từ nguyên liệu bằng nước. Cân và cho vào cối sứ 1 g nguyên liệu hạt hay các mẫu thí nghiệm thực vật khơ như cây, lá hoặc quả khơ, đã được nghiền nhỏ (và sấy khơ đến khối lượng khơng đổi). Nếu là nguyên liệu tươi (như hoa, quả tươi) thì cân 5 – 10 g. Nghiền cẩn thận với bột thủy tinh hay cát sạch và 30 21
  22. ml nước cất nĩng 70 – 80oC. Chuyển tồn bộ hỗn hợp vào bình định mức dung tích 1000 ml. Đun cách thủy 70 – 80oC trong 35 – 40 phút, kết tủa protein và các tạp chất bằng dung dịch chì acetate [Pb(C2H2O2)2.3H2O] hoặc chì nitrate [Pb(NO3)2] 10%. Tránh dùng quá dư chì acetate (dùng 2 – 5 ml chì acetate). Sau đĩ loại bỏ lượng chì acetate dư bằng dung dịch Na2SO4 bão hịa, để yên hỗn hợp 10 phút. Tiếp đĩ thêm nước cất tới vạch mức và đem lọc qua giấy lọc vào cốc hay bình khơ. Nước lọc dùng làm dung dịch thí nghiệm. - Trường hợp nguyên liệu chứa quá nhiều tinh bột hoặc inulin như khoai lang, sắn, khoai tây, cần chiết đường bằng rượu 70 – 80oC, đun hỗn hợp cách thủy trong bình cách thủy cĩ lắp ống làm lạnh khơng khí. Trong trường hợp này khơng cần kết tủa protein bằng chì acetate vì lượng protein chuyển vào dung dịch khơng nhiều. - Trường hợp các nguyên liệu chứa nhiều acid hữu cơ như cà chua, dứa, chanh, khế, cần chú ý là trong quá tình đun khi chiết, đường saccharose cĩ thể bị thủy phân một phần. Do đĩ cần xác định riêng đường khử và riêng saccharose. Trước khi đun cách thủy hỗn hợp phải trung hịa acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hịa tới pH 6,4 – 7,0. II. Thực hành 1. Dụng cụ - hĩa chất: a) Dụng cụ, thiết bị - Máy so màu hoặc quang phổ kế - Cuvette d= 1 cm, V = 4 ml - Ống nghiệm cĩ nắp và các dụng cụ thủy tinh thơng thường khác - Bếp điện b) Hĩa chất - nguyên liệu - Mẫu rau quả chứa đường (rau cải ngọt, dứa) - Thuốc thử DNS Cân 5g DNS và 300 ml nước cất vào cốc, hòa tan ở 500C, sau đó cho thêm 5ml dung dịch NaOH 4M. Cuối cùng cho thêm 150g muối tartrat kép hòa tan rồi cho vào bình định mức và thêm nước cất đủ 500ml, đựng trong lọ thủy tinh sẫm màu. Chuẩn 3 ml thuốc thử DNS bằng HCl 0.1N với chỉ thị là phenolphtalein, nếu hết 5 - 6 ml HCl là được. 22
  23. - Dung dịch glucose chuẩn: pha sẵn dung dịch glucose chuẩn 10 mg/ ml (bảo quản tủ lạnh vài ngày). 2. Tiến hành a) Chiết xuất đường trong thực vật - 5g rau cải ngọt ¡ nghiền nhỏ ¡ cho vào becher 100ml + 10ml cồn 900 ¡ đun cách thủy (sơi 3 lần) ¡ khuấy đều bằng đũa thủy tinh ¡ để nguội ¡ lọc (chỉ gạn lấy phần trong). - Cho tiếp 10ml cồn 800 vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun sơi 2 lần trên nồi đun cách thủy¡ Để nguội ¡ lọc (lặp lại 2 lần) - Đưa phần bã lên lọc và rửa bằng rượu nĩng (800) - Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong phịng hoặc trên nồi cách thủy đun nhẹ. Sau khi cho bay hơi rượu, mẫu cĩ thể để lâu trong bình hút ẩm. - Cặn khơ trong cốc được pha lỗng thành thể tích V = 50ml với nước cất ta được dung dịch đường gốc. Pha lõang dung dịch đường gốc với một hệ số pha lõang n thích hợp. b) Dựng đường chuẩn và xác định hàm lượng đường - Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các chất cĩ thể tích như bảng sau: Hố chất Ống Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 ĐC Glucose 10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 mg/ml (ml) Nước cất (ml) 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9.0 Nồng độ (mg/ml) OD540nm (Sinh viên điền nồng độ glucose chuẩn vào bảng trên) - Từ các ống nghiệm trên lấy 1ml ở mỗi ống vào 6 ống nghiệm khác và thêm vào mỗi ống 3ml thuốc thử DNS. - Đun sơi đúng 5 phút (cĩ đậy nút). 23
  24. - Làm lạnh đến nhiệt độ phịng. - Đo mật độ quang ở bước sĩng 540 nm với mẫu trắng pha từ ống đối chứng. Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hồnh là nồng độ glucose. Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y = 2 OD540nm; x = [glucose] (mg/ml) và hệ số tương quan R nhờ phần mềm Excel. - Tương tự hút 1 ml dung dịch đường pha lõang X cho vào ống nghiệm, thêm 3 ml DNS, đun sơi 5 phút. Sau khi để nguội đo mật độ quang (OD), sử dụng mẫu trắng ở trên. Chú ý: tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và mẫu thí nghiệm đồng thời. 3. Tính kết quả: - Từ phương trình đồ thị đường cong chuẩn tính được X mg/ml đường khử trong dung dịch đường pha lõang. - Nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc. - Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn. - Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = V = thể tích dịch đường gốc (ml) m = khối lượng mẫu cân (g) III. Bài nộp: 1. Vẽ đường chuẩn glucose 2. Viết phương trình đường chuẩn y = ax + b 3. Tính R2 = 4. Biện luận các hệ số pha lõang. 24
  25. BÀI 3. ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL I. Lý thuyết 1. Định nghĩa Tất cả các dạng nitơ cĩ trong cơ thể hay trong các mơ được gọi là nitơ tổng số. Nitơ cĩ trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ khơng cĩ trong thành phần protein như của các muối vơ cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptide, urea và các dẫn xuất của urea, các alkaloid, các base purine và pyrimidine, là nitơ phi protein. Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein Đạm tổng số hay protein tổng số là nitơ tổng số nhân với hệ số chuyển đổi. Hệ số này phụ thuộc vào hàm lượng nitơ trong protein. Thơng thường nitơ chiếm 16% protein nên hệ số chuyển đổi thường được sử dụng là 100/16 = 6.25. Đạm tổng số = Nitơ tổng số x hệ số chuyển đổi Bảng dưới đây biểu diễn hệ số chuyển đổi cụ thể cho nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Mẫu Hệ số chuyển đổi Nguồn gốc động vật 6.25 Hạt bơng 5.30 Đậu phộng 5.46 Đậu nành 5.71 Hạt hướng dương 5.3 Cơm dừa 5.3 Hạt mè 5.3 Bắp 6.25 Gạo 5.95 Lúa mì 5.83 25
  26. 2. Nguyên tắc a) Vơ cơ hĩa mẫu - Trước tiên mẫu được vơ cơ hĩa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và cĩ chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vơ cơ hĩa xảy ra như sau: 2H2SO4 ¡ 2H2O +2SO2↑+ O2 - Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hĩa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dưới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amine; carbon và hidro của acid amine tạo thành CO2 và H2O; cịn nitơ được giải phĩng dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 ¡ (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg, chuyển thành dạng oxide: P2O5, K2O, CaO, MgO, b) Chưng cất đạm: - Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH (NH4)2SO4 + 2 NaOH = Na2SO4 +H2O + 2NH3↑ - NH3 bay ra được làm lạnh biến đổi thành NH4OH rơi vào bình hứng, bình hứng chứa H2SO4 0.1N 2NH4OH + H2SO4 ¡ (NH4)2SO4 + 2H2O + H2SO4 dư c) Chuẩn độ H2SO4 dư - Chuẩn độ H2SO4 dư bằng NaOH 0.1N H2SO4 dư + NaOH ¡ Na2SO4 + H2O II. Thực hành 1. Dụng cụ - hĩa chất a) Dụng cụ - Bình phá mẫu - Bếp đun - Bộ chưng cất Kjeldahl định lượng Nitơ gồm: Bình cất đạm (bình Kjeldahl) Ống dẫn khí Ống sinh hàn 26
  27. Bình hứng (becher 250ml) Bi thủy tinh - Pipet 20ml; pipet 10ml - Erlen 250ml Bộ chưng cất Kjeldahl b) Hĩa chất + nguyên liệu - Bột đậu nành (0.1g), nước tương 1-2 ml - H2SO4 đậm đặc - NaOH 40% - H2SO4 0.1N chuẩn - NaOH 0.1N chuẩn - Thuốc thử Tashiro - Chất xúc tác: hỗn hợp K2SO4 : CuSO4 (3:1) 2. Tiến hành a) Vơ cơ hĩa mẫu - Cân 100mg bột đậu nành đã sấy khơ tuyệt đối cho vào bình Kjeldahl, cho tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen (do nguyên liệu đã bị oxi hĩa). Cho thêm vào 200mg chất xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín để khoảng 3 phút. Đặt bình Kjeldahl lên bếp đun, đậy miệng bình bằng một phễu thủy tinh. Lưu ý giai đoạn này phải thực hiện trong tủ Hotte, đặt bình hơi nghiêng trên bếp, tránh trường hợp khi sơi mạnh hĩa chất bắn ra ngồi, khi đã sơi giữ nhiệt độ bếp đun vừa phải để tránh hĩa chất trào ra ngồi và khơng bị bay mất ammoniac. 27
  28. - Trong khi đun, theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch gần như trong suốt thì cĩ thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình cịn chưa bị oxi hố vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hồn tồn. Để nguội bình rồi chuyển tồn bộ dung dịch sang bình định mức 100 ml, dùng nước cất vơ đạm tráng lại bình Kjeldahl và định mức đến vạch. b) Cất đạm - Chuyển 50ml dung dịch trong bình định mức ở trên vào bình cất đạm cĩ sẵn 50ml nước cất và 3 giọt thuốc thử Tashiro lúc này trong bình cĩ màu tím hồng. Tiếp tục cho vào bình cất 20ml NaOH 40% cho đến khi tồn bộ dung dịch chuyển sang màu xanh lá mạ (thêm 5ml NaOH 40% nếu dung dịch trong bình chưa chuyển hết sang màu xanh lá mạ). - Tiến hành lắp hệ thống cất đạm, cho vào bình hứng 20ml H2SO4 0.1N và 3 giọt thuốc thử Tashiro (dung dịch cĩ màu tím hồng). Đặt bình hứng sao cho ngập đầu ống sinh hàn. Bật cơng tắc cất đạm. Kiểm tra xem hơi ra từ đầu ống sinh hàn cĩ làm xanh giấy quỳ khơng, nếu khơng thêm NaOH 40%. - Sau khi cất đạm 20-25 phút để kiểm tra xem NH4OH cịn được tạo ra khơng, dùng giấy qùy thử ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy qùy khơng đổi sang màu xanh là được. Ngưng cất đạm, đợi hệ thống nguội mới tháo hệ thống đem đi rửa. c) Chuẩn độ: - Chuẩn độ H2SO4 dư trong bình hứng bằng NaOH 0.1N cho đến khi mất màu tím hồng và chuyển sang màu xanh lá mạ. Ghi nhận thể tích NaOH 0.1 N sử dụng. 3. Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số được tính theo cơng thức N (mg%) = {1,42 * (V1-V2)*100/a}*2 V1: số ml H2SO4 cho vào bình hứng V2: số ml NaOH 0.1N đã chuẩn độ a số miligam nguyên liệu 1,42: hệ số, cứ 1 ml H2SO4 dùng để trung hịa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg Nitơ III. Bài nộp 1. Giải thích ý nghĩa các bứơc trong thí nghiệm. 28
  29. 2. Thảo luận các yếu tố dẫn đến sai số. 3. Nếu thay H2SO4 trong bình hứng bằng acid boric thì kết quả cĩ gì thay đổi khơng ? 29
  30. BÀI 4. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP BRADFORD I. Lý thuyết 1. Định nghĩa Protein được định lượng bằng phương pháp Bradford là protein tan trong dung dịch. Vì vậy, muốn xác định hàm lượng protein một mẫu ta phải trích ly protein. Hàm lượng protein xác định sẽ phụ thuộc vào hiệu quả trích ly (khả năng hịa tan của protein trong dung mơi trích ly). 2. Nguyên tắc Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sĩng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid, khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm cĩ bước sĩng hấp thu cực đại 465 nm; khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm hấp thu cực đại ở bước sĩng 595 nm. Độ hấp thụ ở bước sĩng 595 nm cĩ liên hệ một cách trực tiếp tới nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết trước nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là bovine serum albumin (BSA). Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo mật độ quang hỗn hợp dung dịch bằng máy quang phổ kế. Cơng thức phân tử của Coomasie Brilliant Blue G-250 30
  31. II. Thực hành 1. Dụng cụ - hĩa chất a) Dụng cụ - Máy đo quang phổ - Ống nghiệm (14) - Pipette 5ml, 1ml (cĩ thể thay bằng pipetteman) - Đồng hồ bấm giây - Giấy thấm - Giá để ống nghiệm - Bình tia đựng cồn b) Hĩa chất - Cồn 900 - Dung dịch protein chuẩn: cân 10 mg albumin bằng cân phân tích, pha trong 1 ml nước cất, lắc đều cho tan. Giữ ở -200C. Khi dùng pha lỗng ra 100 lần, được dung dịch cĩ nồng độ 0,1 mg/ml. - Dung dịch thuốc thử Bradford: dung dịch thuốc thử cĩ thành phần trong 1 l như sau: Coomassie Brilliant Blue: 0,05g Methanol: 50 ml Phosphoric acid 85%: 100 ml Phẩm màu Coomasie Brilliant Blue 0,1 g được làm tan trong 50 ml methanol, pha lõang với nước cất thành 500 ml để dược dung dịch (1)đựng trong chai màu tối cĩ nắp, 100 ml H3PO4 85% pha lõang thành 500 ml được dung dịch (2). Khi cần sử dụng hịa 1 V (1) và 1V (2) rồi lọc lấy dịch trong. 2. Tiến hành - Thu dịch trích ly protein như trong bài enzyme (10 g malt trích ly bằng nước thu được V = 100 ml). Pha lõang mẫu với hệ số pha lõang n lần để được mẫu phân tích (mẫu X) (n=1, 2 đối với malt). - Lập một loạt 6 ống theo số thứ tự 0, 1, 2, 3, 4, 5 và 1 ống nghiệm chứa mẫu cần phân tích X 31
  32. - Dùng đồng hồ bấm giây, canh thời gian 0 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 0, lắc đều để yên. Ở thời điểm 1 phút cho 5ml thuốc thử vào ống nghiệm 1, lắc đều để yên, cứ tiếp tục cho đến hết. Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 X Nước cất, ml 1 0.9 0.9 0.7 0.6 0.5 - Albumin chuẩn (0,1mg/ml), 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 - ml TT Bradford, ml 5 5 5 5 5 5 5 Nồng độ Albumin (µg/ml) ? OD595nm (Sinh viên điền nồng độ albumin (µg/ml) vào bảng trên) - Tính thời gian ống 0 được 20 phút, tiến hành đo độ hấp thu của dung dịch ở bước sĩng 595 nm. Ta cĩ giá trị OD0, ở thời điểm 21 phút đo ống 1 (OD1), tương tự cứ cách một phút đo cho hết các ống. Ghi lại giá trị OD. 3. Tính kết quả: - Vẽ đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 - Dựa vào phương trình đường tuyến tính giữa nồng độ protein (µg/ml) với mật độ quang OD595 ở trên ta tính được hàm lượng protein P ở trong mẫu phân tích X. P = X*n Để tính tĩan hàm lượng protein trong 1g mẫu cân: Protein (mg/g) = P x V/m V = thể tích dung dịch trích ly, ml m = khối lượng mẫu, g. III. Bài nộp 1. Vẽ đường chuẩn protein theo Bradford 2. Tìm phương trình đường chuẩn y = ax +b 3. Tính R2 = 4. Tính tĩan kết quả thí nghiệm, chọn hệ số pha lõang nào? 32
  33. BÀI 5. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME I. Lý thuyết 1.1. Enzyme và đơn vị đo hoạt tính enzyme a) Định nghĩa Enzyme là chất xúc tác sinh học cĩ bản chất là protein và cĩ tính đặc hiệu cao. Mỗi enzyme cĩ khả năng xúc tác cho một hoặc một số phản ứng nhất định. Hoạt động hay hoạt tính của enzyme càng mạnh thì lượng cơ chất được chuyển hĩa hoặc lượng sản phẩm tạo thành trên một đơn vị thời gian càng lớn. Vì vậy cĩ thể đánh giá hoạt tính xúc tác của enzyme bằng cách xác định tốc độ chuyển hĩa cơ chất hoặc tốc độ tích lũy sản phẩm phản ứng. Về nguyên tắc cĩ thể hai nhĩm phương pháp chính sau: - Đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành trong một thời gian nhất định ứng với một nồng độ enzyme xác định. - Đo thời gian cần thiết để thu được một lượng biến thiên nhất định của cơ chất hay sản phẩm tương ứng với một nồng độ enzyme xác định. Để thực hiện được mục đích trên, nhiều phương pháp phân tích khác nhau được sử dụng: phương pháp đo quang phổ, đo độ phân cực, áp suất, độ nhớt, phương pháp sắc ký và phương pháp hĩa học. b) Đơn vị hoạt tính enzyme Mục đích xác định hoạt tính enzyme là xác định số đơn vị hoạt tính. Một đơn vị họat tính enzyme được định nghĩa theo nhiều phương pháp. i) Đơn vị đơn vị quốc tế (Enzyme Unit, viết tắt U) do Hiệp hội Hĩa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB) định nghĩa: Một đơn vị chuẩn của enzyme (1 U) là lượng enzyme xúc tác chuyển hĩa được 1 mol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 U = 1 mol sản phẩm = 1 mol cơ chất (10-6 mol)/phút ii) Katal: Năm 1979, Hội đồng Danh pháp của IUB khuyến cáo nên sử dụng Katal làm đơn vị cơ bản của hoạt tính enzyme. 33
  34. Một Katal là lượng enzyme xúc tác chuyển hĩa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn. 1 Kat = 1 mol cơ chất/ giây = 60 mol/ phút = 60 x 106 mol/ phút = 6 x 107 U 1 U = 1/60 x 10-6 Kat = 16,67 nKat (nanokatal) Đơn vị Katal được khuyến cáo vì nằm trong hệ đơn vị đo lường Quốc tế (SI). iii) Đơn vị tự đặt: đơn vị hoạt tính dựa vào sự thay đổi đặc tính hỗn hợp phản ứng, ví dụ sự thay đổi độ đục, độ nhớt trong một đơn vị thời gian. Trường hợp cơ chất và sản phẩm là một hỗn hợp phức tạp thì áp dụng đơn vị hoạt tính này. N h ư vậ y , cĩ n h iề u đơ n vị hoạt tính enzyme. Điều quan trọng nhất l à cần đ ịn h n g hĩa rõ ràn g đ ơ n vị hoạt tính. c) Hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme Hoạt tính riêng của một chế phẩm enzyme đặc trưng cho độ tinh sạch của chế phẩm enzyme. Hoạt tính riêng được biểu thị bằng số đơn vị enzyme/mg protein protein (U/mg protein) hoặc Kat/kg protein, trong đĩ hàm lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry hoặc Bradford. 1.2. Phương pháp xác định họat tính enzyme Khi tiến hành thí nghiệm đo họat tính enzyme cần chú ý những điểm sau: - C ần tránh những yếu tố cĩ thể biến tính protein enzyme. - Các thơng s ố nhiệt độ, pH, nồng độ ion v à th à n h p h ần dung dịch đệm ảnh h ưở n g lên h oạt tính enzyme. Th ử hoạt tính enzyme phải đ ượ c tiế n h ành trong điều kiện thích hợ p n hư đ iều kiện sinh lý, điều kiện tồn trữ thực phẩm hoặc điều kiện m à h oạ t lự c cĩ thể đ ạ t tố i ư u . - V ới những enzyme cần cĩ chất hoạt hĩa hoặc chất ổn định th ì p hải cho các chất này vào enzyme trước khi cho c ơ chất và o hỗn hợp phản ứng. - N ồ n g đ ộ c ơ chất trong phản ứng enzyme phải ở trong giới hạn thích hợp, đủ thừ a đ ể b ão enzyme, nh ưng khơng quá cao để kìm hãm enzyme. Sau khi d ừ n g p h ả n ứ n g lượ n g c ơ chất được chuyển hĩa 20 -3 0 % . - T hời gian xác địn h h oạt tín h th ườ n g 5-3 0 p h ú t. T ố t n h ất là x ác địn h tố c độ b an đầu của phản ứng (30 -60 giây), vì giai đoạn này tố c độ phản ứng lớn nhất, sau đ ĩ bắt đầu g iảm (H ìn h 1 ). 34
  35. - K h i x ác đ ịnh hoạt tính phải l àm m ẫu đối chứng song song với mẫu thí nghiệm. T ro n g m ẫ u đ ối c hứng enzyme phải bị bất hoạt tr ước khi tiếp xúc với c ơ chất. Hình 1. Động học phản ứng enzyme 1.3. Enzyme amylase và phương pháp xác đ ịnh hoạt tính a) K hai quát về enzyme amylase Amylase là các enzyme xúc tác cho các ph ản ứng thủy phân tinh bột, glycogen, và các polysaccharide tương t ự. Amylase chia l àm 3 lo ại ch ín h : - -am y lase (Endo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.1) cĩ trong n ước bọt, hạt h ị a thả o nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn. Enzyme n à y p h â n g iải liên kết 1 ,4 - g ly c o sid e ở giữa chuỗi polysaccharide (hoạt tính endoamylase) tạo th à n h maltose, dextrin phân t ử th ấ p . D ưới tác dụng của enzyme n à y , du n g dịc h tin h bột nhanh chĩng bị mất khả năng tạo m à u với dung dịch iod v à bị giảm độ nhớt. -am y lase b ền với nhiệt, nh ưn g k é m b ền với acid. - -am y lase (Exo -1,4-glucanase; EC 3.2.1.2) cĩ nhiều ở thực vật (hạt, củ), xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4-glycoside từ đầu khơng khử tạo thành maltose và dextrin phân tử lớn. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC, nhưng bền với acid hơn -am y lase. - Glucoamylase (Exo -1,4-g lu ca n ase ; EC 3.2.1.3) xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4- và 1,6-glycoside từ đầu khơng khử của chuỗi polysaccharide. Sản phẩm chủ yếu là glucose và dextrin. Enzyme này mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70oC. Nhiều glucoamylase hoạt động mạnh ở pH 3,5-5,5. b) Các phương pháp đo ho ạt tính enzyme -am ylase 35
  36. N g u y ê n tắc ch u n g d ự a trên c ơ sở thủy phân tinh bột bởi enzyme trong dung dịch enzyme nghiên c ứ u th ành các dextrin cĩ phân t ử lượng khác nhau. Đo c ườ n g đ ộ m à u tạo thà n h g iữa tinh bột v à các sản phẩm thủy phân của nĩ với iod bằng máy so m à u sẽ tín h đ ư ợc hoạt tính en z y m e. Đ ơ n vị am y la se (theo Smith và Roe) là lư ợng enzyme cần thiết để thủy phân hồn tồn 10 mg tinh b ột sau thời gian phản ứng 30 phút trong điều kiện thí nghiệm. II. Thực hành 1. H ĩa chất – Dụng cụ a) H ĩa chất - D u n g d ịc h đ ệm - D u n g d ịc h đệm acetate pH= 4,7 (xác định hoạt tính enzyme nấm mốc): trộn 1 thể tích C H 3 C O O H 1 N v ới 1 thể tích CH 3 COONa 1N. Kiể m tra p H . - D u n g d ịch đệm phosphate pH= 4,9 (xác định hoạt tính enzyme của malt): trộn 10 m l d u n g d ịc h N a 2HPO 4 1 /1 5 M v ới 990 ml dung dịch KH 2PO 4 1 /1 5 M n h ậ n đượ c 1 l d u n g d ịch đệm phosphate pH = 4,94. Kiểm tra pH. - D u n g d ịc h đệm g ly cin e – NaOH 0,1 M pH = 10 (dùng đ ể xác định hoạt tính - am y lase k iề m . - D u n g d ịch HCl 0,1N . - D u n g d ịc h io d : h ịa tan 30 mg KI và 3 mg I2 v ớ i m ộ t lượ n g n h ỏ n ước cất. Lắc nhẹ hỗ n h ợ p để hịa tan hồn tồn, sau đ ĩ c h u yển dung dịch sang b ìn h định mức 1000 ml, bổ su n g n ướ c cất đến vạch mức. Bảo quản dung dịch trong b ình màu nâu để ch ỗ tố i. - D u n g d ịch tinh bột 1%: h ịa tan 1 g tinh b ột (theo chất khơ tuyệt đối) với 50 m l nước cất trong b ìn h định mức 100 ml, lắc đều. Đặt v ào bếp cách thủy đang sơi, lắc li ên tục cho đến khi tinh bột tan ho àn tồn. Sau đĩ làm ngu ộ i và bổ sung 10 ml đệm acetate pH = 4,7 (ho ặc 10 ml dung dịch đệm phosphate pH = 4,9) bổ sung n ước cất đến vạch m ức, lắc đều. Dung dịch đ ược chuẩn bị trong ng ày sử d ụ n g . - D u n g d ịch enzyme gốc 2. Tiến hành: a) Trích ly enzyme: en zy m e đ ư ợc trích ly từ chế phẩm hay tế b à o , m ơ đ ộ n g th ự c vật bằng dung dịch đệm cĩ pH thích hợp. i) Trích ly enzyme từ vi khuẩn: C ân m = 0 ,1 g ch ế phẩm nghiê n cứ u , d ù n g đ ũ a 36
  37. thủ y tin h ch à cẩn thận chế phẩm trong một cốc thủy tinh dung tích 50 ml với một l ượ n g n ư ớc nhỏ. Sau đĩ chuyển to à n bộ hỗn hợp v à o b ìn h định mức dung tích 100 ml, bổ su n g n ư ớc cất tới vạch mức. Lọc v à th u h ồi dịch trích ly enzyme. B ảo quản dung dịch en z y m e g ố c ở 2 – 4 oC tro n g th ời gian 1 ng à y . ii) Trích ly enzyme nấm mốc: Cân m = 5 g ch ế phẩm enzyme thơ đ ã n g h iề n sơ bộ , dù n g đ ũa thủy tinh ch à cẩn thận chế phẩm trong một cốc dung tích 50 ml. Sau đĩ ch u yể n tồ n bộ ch ế p h ẩm vào bình tam giác dung tích 250 ml, b ổ su n g 50 m l n ư ớ c cất v à 1 0 m l dịch đệm acetate pH = 4,7. Giữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30 oC tro n g th ời gian 1 giờ cĩ k h u ấy đảo định kỳ. Lọc , rử a th u h ồi dịch trích ly enzyme sao cho V = 100 ml . B ả o q uản dung dịch enzyme g ố c ở 2 – 4 oC tro n g th ời gian 1 ng à y . iii) Trích ly enzyme từ malt: C ân m = 5 -10 g malt đ ã n g h iền nhỏ, cho v à o b ìn h nĩn dung tích 250 ml, b ổ su n g 50 m l n ư ớ c cất v à 10 ml dung d ịch đệm phosphate pH = 4 ,9 . G iữ hỗn hợp ở nhiệt độ 30 oC tro n g th ời gian 1 giờ c ĩ k h uấy đảo định kỳ. Lọc , rử a th u h ồi dịch trích ly enzyme sao cho V = 100 ml . B ảo quản dung dịch enzyme gốc ở 2 – 4 o C tro n g th ời gian 1 ng à y . b) Pha lõang enzyme Pha lỗng dung d ịch enzyme gốc (hệ số pha lo ã n g n = 25, 50, 100) bằn g d u n g dịch đệm sao cho trong 1 ml dung dịch enzyme phân tích cĩ chứa một l ượ n g en z y m e đủ để thủy phân 20% - 30 % tin h b ột trong dung dịch ở điều kiện xác định. Nh ư vậ y , đ ộ pha lỗng ph ụ th u ộ c v à o h oạt tính chế phẩm enzyme cần phân tích. c) Xác định họat tính C h uẩn bị mẫu thí nghiệm, mẫu đối chứng v à m ẫ u trắn g th e o b ả n g sau : M ẫu thí nghiệm M ẫu đối chứng M ẫ u trắn g D u n g d ịch tinh bột 1% 2 m l 2 m l 0 N ư ớ c cất 0 0 2 m l Đ ệ m 1 m l 1 m l 1 m l D u n g d ịch NaCl 3% 0 ,5 m l 0 ,5 m l 0 ,5 m l Ủ 4 0 oC, 1 0 p h ú t đ ể đạt nhiệt độ D u n g d ịc h en z y m e 1 m l 0 0 Ủ 4 0 oC, 30 phút đ ể xảy ra phản ứng 37
  38. H C l 1 N 1 m l 1 m l 1 m l E n z y m e 0 1 m l 1 m l C h u yể n san g b ìn h định mức 100 ml N ư ớ c cất Đ ế n vạc h Đ ế n v ạc h Đ ế n v ạc h Io d e 0 ,5 m l 0 ,5 m 1 0 ,5 m 1 - D u n g d ịc h đối chứng cĩ màu xanh - D u n g d ịc h th í n g h iệ m cĩ m à u tím v ớ i cườ n g độ khác nhau tù y v à o lượ n g tin h bộ t ch ưa bị thủy phân. - Đ o m ật độ quang (OD) của các dung dịch ở b ướ c sĩ n g =620 nm so v ớ i m ẫ u trắn g . 3. Tính kết quả: Số m g tin h b ột bị thủy phân S = x 2 0 S • n •V Hoạt tính tịan phần (đơn vị họat tính/g)= 10 • m Họat tính riêng (đơn vị họat tính/mg protein) = họat tính tồn phần/mg protein (Bradford). trong đĩ: n = hệ số pha lỗng V = thể tích dịch trích ly, ml m = khối lượng enzyme, g III. Bài nộp 1. Đơn vị họat tính enzyme amylase trong bài là gì ? 2. So sánh các hệ số pha lõang, chọn hệ số pha lõang nào ? 3. Cĩ thể sử dụng phương pháp đo đường khử bằng DNS acid để đo họat tính enzyme amylase khơng ? Tại sao ? 38
  39. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Văn Mùi. Hĩa sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà nội, 2001 2. Holtzhauer M. Basic Methods for the Biochemical Lab. Springer, 2006. 3. Ronald E. Current Protocols in Food Analytical Chemistry. John Wiley & Sons, Inc., 2003 4. Smith B, Roe J. A photometric method for the determination of α-amylase in blood and urine, with the use of the starch-iodine color. J. Biol. Chem. 179, 53 (1949). 39