Công nghệ enzim - Chương 4: Sản xuất enzim từ thực vật

Nội dung text: Công nghệ enzim - Chương 4: Sản xuất enzim từ thực vật

1. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 4: SҦN XUҨT ENZIM TӮ THӴC VҰT Enzim tӯ thӵc vұt cNJng chiӃm mӝt tӹ lӋ thích ÿáng trong công nghӋ sҧn xuҩt và sӱ Gөng enzim nói chung. Mӝt sӕ loҥi enzim ÿã ÿѭӧc sӱ dөng nhiӅu trong y hӑc, thӵc phҭm và công nghiӋp. Ĉһc biӋt trong nghiên cӭu khoa hӑc ngѭӡi ta rҩt chú trӑng chiӃt tách và xác ÿӏnh cѫ chӃ tác dөng cӫa các enzim trong các mô thӵc vұt nhѭ nhóm enzim glycoxydaza, nhóm enzim oxy hoá khӱ polyphenoloxydaza (EPPO) ÿã mang lҥi nhӳng giá trӏ lý thuyӃt và thӵc tiӉn rҩt cao trong thӡi gian gҫn ÿây. 4.1. 6ҧn xuҩt ureaza tӯÿұu rӵa: Chi hӑÿұu Canavalia ӣ châu phi, ӣ ViӋt Nam có loài Canavalia ensifomis - ÿѭӧc gӑi là cây ÿұu rӵa, ÿұu tҩc; hҥt dùng chӳa bӋnh lui hàn, nҩc cөt, yӃu thұn. Trong hҥt ÿұu rӵa, hàm lѭӧng ureaza có thӇ ÿҥt ÿӃn 20% chҩt khô do ÿó ÿay là nguӗn nguyên liӋu quan trӑng ÿӇ thu nhұn ureaza. - VӅ mһt ӭng dөng: ureaza ÿѭӧc sӱ dөng trong y tӃÿӇ xác ÿӏnh hàm lѭӧng urê trong huyӃt, bàng quan, có trong thành phҫn cӫa thuӕc chһng thұn nhân tҥo. Trong chӃ biӃn Pӝt sӕ loҥi cá có mùi khai (ÿXӕi, nhám, mұp) thì dùng ureaza ÿӇ khӱ mùi khai rҩt hiӋu quҧ.Ureaza có thӇ xúc tác thuӹ phân urê cҧ trong và ngoài tӃ bào (có thӇ). (NH2)2CO + H2O ureaza 2NH3 + CO2 + ChiӃt xuҩt lҩy enzim: NghiӅn kӻ bӝt ÿұu trong dung dӏch HCl 0,4% có thêm EDTA (trilon B, complexon III) 5.10-3 M và L.cystein 5.10-3 M. Sau ÿó ly tâm tách bã lҩy dӏch chiӃt. + Xӱ lý nhiӋt: Nâng nhiӋt nhanh ÿӃn 600C, giӳ trong 30 phút ÿem ly tâm tách bӓ cһn NӃt tӫa. + Siêu lӑc: dӏch ly tâm ÿѭӧc lӑc qua màng siêu lӑc ÿӇ loҥi bӓ peptit và polypeptit có trӑng lѭӧng phân tӱ bé (M>500) + KӃt tӫa bҵng axeton: 'ӏch lӑc ÿѭӧc xӱ lý bҵng axeton lҥnh (tӹ lӋ 1:1), ly tâm tách kӃt tӫa. Phҫn kӃt tӫa ÿem hoà tan trong trisbuffer 0,1M, pH = 7 chӭa EDTA và L.cystein 5.10-3 M. +Sҳc ký trao ÿәi ion 'ӏch enzim ÿѭӧc chҥy sҳc ký trao ÿәi ion trên cӝt chӭa DEAE – xenluloza vӟi gradien Qӗng ÿӝ NaCl tӯ 0 – 1M. Phân ÿRҥn chӭa enzim ÿѭӧc sҩy thăng hoa (ÿông khô) vӟi chҩt sacaroza làm chҩt әn ÿӏnh vӟi tӹ lӋ 2,5mg/1mg enzim. ChӃ phҭm thu ÿѭӧc có hoҥt tính tăng 25 lҫn so vӟi ban ÿҫu và hiӋu suҩt thu hӗi 43%. Xem bҧng 8 cӫa giáo trình (trang 186). Mӝt sӕ thông sӕ cӫa quá trình thu nhұn ureza Wӯÿұu rӵa. 4.2. Thu nhұn bromelain tӯ dӭa: - Giӟi thiӋu quҧ dӭa: tên latinh: Bromelia ananas-L: thuӝc chi dӭa ăn quҧ. Ngoài ra còn có chi dӭa dҥi (ÿӇ lҩy sӧi ). Trang: 40
2. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Bromelain có nhiӅu trong phӃ liӋu dӭa nhѭ vӓ, lõi, chӗi, lӛi ÿҫu. Giӟi thiӋu ÿһc ÿLӇm chӃ phҭm Bromelain (Xem quá trình trang 187-189). Nguyên tҳc chung ÿӇ thu nhұn Bromelain. PhӃ liӋu dӭa làm dұp chiӃt lӑc ly tâm kӃt tӫa ly tâm lӑc chӃ phҭm kӻ thuұt Sҳc ký trao ÿәi ion sҩy thăng hoa sҧn phҭm tinh khiӃt . Ghi chú: kӃt tӫa bҵng (NH4)2SO2 lҥnh hay axeton lҥnh tӍ lӋ 1:1. - Thu nhұn Bromelain bҵng phѭѫng pháp nhanh sӱ dөng CMC. Thu nhұn Bromelain bҵng phѭѫng pháp mô tҧ nhѭӣ trên ÿòi hӓi thӡi gian lâu, khó Oӑc, lѭӧng dӏch lӟn, khó bҧo quҧn. HiӋn nay mӝt sӕ nhà nghiên cӭu ÿã dùng phѭѫng pháp nhanh tách Bromelain bҵng CMC. Cho phép thu ÿѭӧc Bromelain bӝt trҳng có hoҥt tính cao, thӡi gian nhanh, ÿѫn giҧn nhѭ sau: + Công nghӋ chӃ tҥo CMC (xem giáo trình trang 191). Chú ý : có thӇ thay vҧi màn (hay gҥt) bҵng bông nón ( Xenluloxa ~ 100%). + Tách chiӃt Bromelain tӯ dӏch chiӃt dӭa bҵng CMC. CMC ÿѭӧc tҭm ѭӟt bҵng dung dӏch ÿӋm photphat 0,05 M, pH= 6,1. Cho dӏch chӗi dӭa ( chӗi dӭa ĺ nghiӅn ĺ ép lӑc ĺQѭӟc dӏch) vào, thӍnh thoҧng khuҩy trӝn. Emzim Bromelain sӁ hҩp thө lên bӅ mһt cӫa CMC. Sau 2 giӡ lҩy ra vҳt nѭӟc loҥi bӓ cһn bҭn bám vào CMC, rӱa trôi các prôtêin không phҧi enzim bҵng ÿӋm photphat ӣ pH=6,5. Sau ÿó cho phҫn hҩp thө lҫn 1. Dung dӏch phҫn hҩp thө là ÿӋm photphat pH=7,1, NaCl 0,5 N khuҩy trӝn. Sau 2 giӡ lҩy ra vҳt ÿѭӧc dung dӏch ÿұm dһc chӭa bromelain. TiӃp tөc phҫn Kҩp thө nhѭ lҫn thӭ hai rӗi gӝp chung dӏch chiӃt cӫa cҧ hai lҫn kӃt tӫa enzim bҵng axeton hay còn lҥnh. 9ӟi phѭѫng pháp này hiӋu xuҩt thu hӗi ÿҥt 0,1% so vӟi chӗi dӭa tѭѫi, chӃ phҭm có hoҥt tính 24 ÿѫn vӏ (mg chӃ phҭm enzim. So vӟi phѭѫng pháp kӃt tӫa tӯ ban ÿҫu bҵng (NH4)2SO4 thì ÿӝ sҥch cao hѫn hai lҫn, thӡi gian nhanh hѫn, tiӃn hành thuұn lӧi hѫn. - Mӝt sӕӭng dөng cӫa chӃ phҭm bromelain: + Thuӹ phân gan bò: Gan bò ÿѭӧc xӱ lý bҵng chӃ phҭm bromelain trong10 giӡӣ 1-55 0C, sau ÿó vô hoҥt enzim ӣ 100 0C trong 3-4 phút. Dӏch ÿӵoc lӑc và ÿông khô thành dҥng bӝt là chӃ phҭm hӛn hӧp axit amin y tӃ (sҧn xuҩt các dӏch truyӅn ÿҥm y tӃ). Thành phҫn axit amin Fӫa chӃ phҭm thuӹ phân gan bò bӣi bromelain ÿѭӧc trình bày ӣ bҧng 12 (trang 193 cӫa giáo trình). +Sӱ dөng bromelain làm ÿông sӳa: ĈӇ làm ÿông sӳa trong phѭѫng pháp truyӅn thӕng (trong CN-SX photphat) ngѭӡi ta sӱ Gөng renin thu ÿѭӧc tӯ ngăn thӭ 4 cӫa dҥ dày bê. HiӋn nay, lѭӧng renin chѭa ÿáp xӭng ÿӫ nhu cҫu cӫa công nghӋ. Trong nhӳng năm gҫn ÿây xu hѭӟng sӱ dөng proteaza thӵc Yұt ÿӇ thay thӃ mӝt phҫn renin trong chӃ biӃn phomat ÿang ÿѭӧc phát triӇn. Trong ÿó Trang: 41
3. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch ÿáng kӇ nhҩt là 2 loҥi chӃ phҭm: ficin tӯ cây cӑ ficus và bromelain tӯ dӭa. KӃt quҧӭng Gөng xem bҧng 13 (trang 194 cӫa giáo trình) + Sӱ dөng bromelain ÿӇ thu nhұn các chҩt ӭc chӃ proteaza. Trong mӝt sӕ loҥi cѫ quan ÿӝng vұt, thӵc vұt tӗn tҥi các chҩt ӭc chӃ enzim, trong ÿó có chҩt ӭc chӃ proteaza, chúng có bҧn chҩt protein nhѭ enzim. ĈLӇn hình nhѭ trong các hҥt hӑÿұu: ÿұu tѭѫng, ÿұu xanh, ÿұu ván, hҥt mít, nӝi tҥng cӫa mӵc nang, ÿӍa, trong Gӭa (tӗn tҥi song song vӟi bromelain). Các chҩt ӭc chӃ thѭѫng tác ÿӝng mҥnh lên mӝt sӕ enzim, trong ÿó có cҧ enzim trong ÿѭӡng tiêu hoá (cӫa ngѭӡi và ÿӝng vұt) nhѭ: ficin, bromelain, tripxin. ĈӇ thu hӗi ÿѭӧc các chҩt ӭc chӃ này, ngѭӡi ta dùng phѭѫng pháp hiӋn ÿҥi, hiӋn nay là dùng enzim cӕÿӏnh. Bromelain sau khi thu nhұn bҵng CMC nhѭ trên ÿѭӧc cӕÿӏnh trong gel sepharoza rӗi nhӗi vào tҥo ra cӝt phҧn ӭng. Dӏch nghiӅn, lӑc phӃ liӋu dӭa ÿѭӧc cho chҥy qua cӝt này: ÿҫu tiên ӣ pH photphat 4,6, sau ÿó pH = 7,6 – 7,8, tiӃp ÿó xҧy ra quá trình liên kӃt giӳa bromelain vӟi các chҩt ӭc chӃ. Thu hӗi chҩt ӭc chӃ Eҵng NaOH 0,01N + NaCl 0,1N vӟi pH = 11,5 – 12; có ÿӑtinh sҥch, hoҥt tính cao (xem Eҧng 14 trang 195 cӫa giáo trình). Ngoài ra bromelain có sӱ dөng trong quá trình làm PӅm thӏt, sҧn xuҩt nѭӟc mҳm ngҳn ngày, bӝt cá. - Thu nhұn papain tӯ nhӵa ÿu ÿӫ: Cây ÿu ÿӫ (carica papaya.L), quҧ dùng làm thӵc phҭm. nhӵa quҧ ÿu ÿӫ làm thuӕc giun, chai chân, mөn cѫm, sѭng khӟp, eczema. RӉ làm thuӕc cҫm máu, sӓi thұn. Hoa 0 chӳa ho, viêm cuӕng phәi, lá chӳa ung thѭ phәi. Papain có M = 20.700, top = 80 C, pHop = 5 – 5,5. Bӏӭc chӃ và mҩt hoҥt tính bӣi H2O2, Iodoaxetat, I2, fericianua. Ĉѭӧc hoҥt hóa Eӣi -CN, cystein, H2S và glutation. + Thu nhұn papain thô: Dùng các loҥi quҧÿu ÿӫ còn non, ÿu ÿӫ già (chѭa chín), dùng khăn lau sҥch vӓ, lҩy dao cҥo sҥch nhӳng ÿѭӡng không quá sâu, hӭng nhӵa (catex) vào cӕc rӗi làm khô bҵng các phѭѫng pháp khác nhau, ta thu ÿѭӧc chӃ phҭm papain thô có hoҥt tính nhѭ bҧng 15 (trang 196 cӫa giáo trình). .Ӄt quҧ cho thҩy hoҥt tính papain sau khi chiӃt tách cao hѫn khi ÿã ÿӇ 3 tháng. Phѭѫng pháp phѫi nҳng cho kӃt quҧ hoҥt ÿӝ enzim thҩp nhҩt, sҩy chân không dung môi (axeton hay rѭӧu etylic lҥnh) cho hoҥt tính cao nhҩt. ChӃ phҭm cҫn bҧo quҧn lҥnh 6 – 100C mӟi duy trì hoҥt tính. + Thu nhұn papain thѭѫng phҭm: Ngâm papain thô hoà tan nhӵa tѭѫi (catex) trong nѭӟc cҩt có bә sung glyxerin ÿӇ tăng ÿӝ hoà tan, lӑc qua vҧi màn. KӃt tӫa bҵng axeton lҥnh vӟi tӹ lӋ 2:1 so vӟi thӇ tích dӏch Oӑc. Ly tâm lҥnh lҩy kӃt tӫa, sҩy 45 – 500C (sҩy chân không hay phѫi khô), ÿem nghiӅn thành bӝt. Ӣ nѭӟc ta hiӋn nay viӋn công nghӋ sinh hӑc ÿã sҧn xuҩt thành công chӃ phҭm papain thѭѫng mҥi dҥng ÿông khô. Bҧng 16 so sánh hoҥt tính (trang197) cӫa papain thѭѫng mҥi quӕc tӃ vӟi papain tѭѫi và ÿông khô ViӋt Nam. KӃt quҧ ÿLӋn di ÿó (trên gel Trang: 42
4. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch polyacrilamit), thӇ hiӋn trên hình 56 (trang 198). Hoҥt tính thành phҫn các enzim trong chӃ phҭm papain ÿѭӧc trình bày ӣ bҧng 17 (trang 199). + Ӭng dөng cӫa papain: làm ÿông sӳa, thuӹ phân protein nhѭ sҧn xuҩt bӝt cá thӵc phҭm, sҧn xuҩt nѭӟc mҳm ngҳn ngày, làm mӅm thӏt. - Giӟi thiӋu kӃt quҧ nghiên cӭu chӃ phҭm EPPO (bӝt axeton) trong lá chè và hҥt ca cao Trang: 43
5. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 5: ENZIM CӔĈӎNH 5.1. Giӟi thiӋu chung: Enzim cӕÿӏnh (hay enzim không tan) là enzim có sӵ tham gia hoҥt ÿӝng trong mӝt không gian bӏ giӟi hҥn. Sӵ giӟi hҥn hoҥt ÿӝng vӕn linh hoҥt cӫa enzim bҵng cách gҳn nó vào mӝt pha cách ly tách rӡi khӓi pha lӓng tӵ do và ӣÿó nó vүn có khҧ năng tiӃp xúc ÿѭӧc vӟi các phҫn tӱ cѫ chҩt, effector hay inhibitor (chҩt ӭc chӃ ). Pha gҳn enzim thѭӡng không tan trong nѭӟc nhѭng cNJng có thӇ là các polyme ѭa nѭӟc. Enzim không tan ÿѭӧc nghiên cӭu và ӭng dөng tӯ nhӳng năm 1950. ĈӇ chӃ tҥo enzim Fӕÿӏnh có thӇ dùng các phѭѫng pháp hҩp phө, liên kӃt hoá trӏÿӇ gҳn kӃt enzim. Chҩt dùng ÿӇ gҳn kӃt enzim gӑi là chҩt mang (enzim), hiӋn nay ngѭӡi ta thѭӡng dùng xenluloza, tinh bӝt, rephadex, agaroza, alghinat canxi, gel polyacylamit, bӝt thuӹ tinh, nilon ChӃ phҭm enzim không tan có thӇӣ dҥng bӝt, hҥt, phiӃn, màng mӓng. Trong mӝt sӕ trѭӡng hӧp không cҫn thiӃt phҧi gҳn enzim vào chҩt mang mà có thӇ giӳ nó ӣ bên trong mҥng lѭӟi polyme bao quanh lҩy phҫn tӱ enzim. Mҥng lѭӟi ÿó có mһt nhӡ không cho phép enzim thoát ra khӓi mҥng nhѭng vүn ÿӫ lӟn ÿӇ cѫ chҩt và sҧn phҭm tҥo ra qua lҥi dӉ dàng. Theo thӕng kê, ÿҫu năm 1995 ngѭӡi ta ÿã chӃ tҥo ÿѭӧc trên 100 chӃ phҭm enzim cӕ ÿӏnh . /ӧi ích cӫa viӋc sӱ dөng enzim cӕÿӏnh: - Giҧm giá thành do enzim ÿѭӧc sӱ dөng lһp lҥi nhiӅu lҫn vӟi cùng mӝt kiӇu phҧn ӭng xúc tác, chӃ phҭm bӅn hѫn trong các ÿLӅu kiӋn pH, nhiӋt ÿӝ, áp xuҩt thҭm thҩu tӕi ѭu, tӕc ÿӝ phҧn ӭng lӟn, dӉ tә chӭc sҧn xuҩt ӣ mӭc ÿӝ tӵÿӝng hoá cao. - ChӃ tҥo enzim tѭѫng ÿӕi dӉ, ÿҫu tѭ xây dӵng và sҧn xuҩt tѭѫng ÿӕi ít, sҧn phҭm phҧn ӭng không lүn lӝn vӟi enzim (chӍ mӝt sӕ ít bӏ rӱa trôi theo dòng chҧy cӫa tác nhân), có thӇ dӉ dàng tә chӭc sҧn xuҩt các sҧn phҭm lên men bҵng enzim ngoҥi bào nhѭ: rѭӧu etylic, axit hӳu cѫ, axit amin, vitamin. 5.2. 0ӝt sӕ phѭѫng pháp chӫ yӃu chӃ tҥo enzim cӕÿӏnh : 5.2.1. Microencapsulation ( gói enzim trong bao cӵc nhӓ ) Ĉѭӧc nghiên cӭu bӣi Chang et al(1967-1968) Cái màng polymer thҭm thҩu dày 200A0 (xenluloza, polysacarit, phi tinh bӝt ) tҥo thành hҥt ÿӭng vӳng 10-12M chӭa các phҫn tӱ enzim bên trong. Lӟp màng này cho phép Fѫ chҩt và sҧn phҭm phҧn ӭng enzim ÿѭӧc qua lҥi tӵ do nhѭng các phҫn tӱ enzim không thӇ qua lҥi ÿѭӧc vì các phҫn tӱ quá lӟn. Nhѭ vұy nӃu cѫ chҩt có phân tӱ lѭӧng quá lӟn nhѭ: poly saccarit, protein cNJng không thӇ qua lҥi màng ÿѭӧc do ÿó không thӇ thӵc hiӋn phҧn ӭng enzim ÿѭӧc. 5.2.2. Liên kӃt enzim vào chҩt mang không tan (silman và katchalski-1966) Các chҩt mang nay thѭӡng là: CMC, silicagen. Lúc ÿó enzim ÿѭӧc gҳn vào chҩt mang Wҥo mӝt sӕ vӏ trí xa vӟi trung tâm hoҥt ÿӝng cӫa nó. Nhѭ vұy ÿһc tính cӫa enzim phҫn nào Eӏ thay ÿәi không còn nhѭ khi nó ӣ trҥng thái hoà tan tӵ do trong hӋ nhѭ: ÿӝ pHop, top Gүn ÿӃn sӵ thay ÿәi các trӏ sӕ Km, Vm Trang: 44
6. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 5.2.3. Ĉӏnh vӏ enzim trong pha lӓng cӫa hӋ thӕng 2 pha (Reese and Mandels.1958) Enzim ÿѭӧc hoà tan trong pha lӓng và ÿѭӧc giӳ lҥi trên cӝt cӫa chҩt rҳn không tan nhѭ xenluloza. Cѫ chҩt nҵm trong pha lӓng khác (pha dung môi) khuӃch tán vào pha lӓng chӭa enzim và xҧy ra phҧn ӭng vӟi enzim. Các sҧn phҭm phҧn ӭng khuӃch tán ngѭӧc lҥi ÿi ra ngoài cӝt. HӋ thӕng này gҳn giӕng vӟi phѭѫng pháp microen capsule mà pha dung môi ÿóng vai trò nhѭ mӝt màng bán thҩm. 5.2.4. Giӳ enzim bҵng màng siêu lӑc: Enzim ÿѭӧc hoà tan tӵ do trong dung dӏch và tiӃn hành phҧn ӭng enzim ngay trong dung dӏch này. Sҧn phҭm phҧn ӭng ÿѭӧc tách ra nhӡ màng siêu lӑc chӑn lӑc còn cѫ chҩt và enzim ÿѭӧc giӳ lҥi ӣ phía bên kia cӫa màng. (Xem hình vӁ trang 204 và giҧi thích trang 205 cӫa giáo trình) 5.3. 0ӝt sӕ liên kӃt trong viӋc cӕÿӏnh enzim. 5.3.1. Liên kӃt hoá trӏ: (cӝng hoá trӏ) Chҩt mang trong phѭѫng pháp này là các polyme tӵ nhiên và các sҧn xuҩt cӫa chúng nhѭ: xenluloza, agaroza, alginic acid, chitin, collagen, keratin, các polyme tәng hӧp: axit acrylic, polyme tan, N – Vinylpyrolidon %ҧn chҩt cӫa phѭѫng pháp cӕÿӏnh enzim bҵng kiên kӃt cӝng hoá trӏ là enzim ÿѭӧc nӕi Yӟi chҩt mang thông qua “cҫu nӕi có cӵc” nào ÿó. Cҫu nӕi này có kích thѭӟc vӯa phҧi, Pӝt ÿҫu gҳn vӟi chҩt mang polyme, ÿҫu kia gҳn vӟi enzim. Ví dө: cyanuric chloride (tricloro triazin) có 3 nhóm có khҧ năng tҥo liên NӃt ÿáp ӭng ÿѭӧc yêu cҫu trên, trong ÿó có mӝt nhóm sӁ liên kӃt mҥnh vӟi polyme, nhóm thӭ 2 vӟi enzim, nhóm thӭ 3 có thӇ liên kӃt vӟi cҧ 2 ѭu thӃÿһc biӋt cӫa chҩt này là ӣ chӛ diӋn tích cӫa nó quyӃt ÿӏnh các tính chҩt ion cӫa phӭc enzim – xenluloza. Phӭc này có thӇ trung tính, âm (anion), dѭѫng (cation) phө thuӝc vào bҧn chҩt cӫa chҩt gҳn vӟi thӭ 3 Trong khi ÿó mӝt sӕ các phѭѫng pháp cӕÿӏnh enzim khác chӍ do phӭc mono – ion (cation hoһc anion). - Glutaraldehyt cNJng hay ÿѭӧc sӱ dөng làm cҫu nӕi ÿӇ gҳn enzim vì nó chӭa 2 nhóm – CHO ӣ hai ÿҫu, ӣ pH trung tính sӁ kiên kӃt ÿѭӧc vӟi các nhóm amin – NH2 tӵ do. Nhѭ vұy mӝt ÿҫu sӁ gҳn vào chҩt mang, còn ÿҫu kia gҳn vào enzim. 5.3.2. +ҩp phө vұt lý: Chҩt hҩp phө và enzim ÿѭӧc trӝn lүn vӟi nhau trong mӝt khoҧng thӡi gian nhҩt ÿӏnh ÿӇ sӵ hҩp phө xҧy ra nhӡ tѭѫng tác bӅ mһt nhѭ: liên kӃt ion, liên kӃt ѭa béo (kӏ nѭӟc), liên kӃt hidro, lӵc Vandewaals. Nhѭӧc ÿLӇm cӫa phѭѫng pháp này chính là quá trình hҩp phө enzim có thӇ xҧy ra do sӵ thay ÿәi pH, nhiӋt ÿӝ, thành phҫn ion. - Các chҩt mang hӳu cѫ dùng cho hҩp phө vұt lý: dүn xuҩt polyme tӵ nhiên, DEAE – xenluloza, DEAF – sephadex. Ĉây là các amonit (mang ÿLӋn (-)) - Chҩt sҳt ký xotein - kӷ nѭӟc nhѭ: agaroza cҧi biӃn có gҳn các nhóm mang ÿLӋn ӣ ÿҫu chuӛi cacbon hydrat cӫa nó (hai loҥi lӵc hҩp phө là lӵc tƭnh ÿLӋn và lӵc kӷ nѭӟc gҳn Trang: 45
7. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch NӃt không thuұn nghӏch vӟi nhiӅu enzim). Nhóm enzim thích hӧp nhҩt cho cѫ chҩt loҥi này là lipaza (cѫ chҩt kӏ nѭӟc, không tan trong nѭӟc (ѭa béo). - Các chҩt mang vô cѫ: kim loҥi kiӅm thә, Al2O3, TiO2 nhѭ: thuӹ tinh xӕp, silicagel, silochrom. Ѭu ÿLӇm cӫa loҥi chҩt mang này là ÿӝ xӕp lӟn, tính hҩp phө cao, chӃ tҥo ӣ Gҥng hҥt ÿӇ tҥo reactor cӝt (cӝt phҧn ӭng). 5.3.3. Nhӳng ÿLӅu cҫn lѭu ý khi thӵc hiӋn viӋc cӕÿӏnh enzim: Khi lӵa chӑn phѭѫng pháp và thӱ nghiӋm cӕÿӏnh enzim cҫn lѭu ý các ÿLӅu sau: - Enzim phҧi әn ÿӏnh trong nhӳng ÿLӅu kiӋn xҧy ra phҧn ӭng: quan trӑng nhҩt là hoҥt lӵc enzim và ÿӝ bӅn cӫa nó theo thӡi gian phҧn ӭng, ÿLӅu này quyӃt ÿӏnh hiӋu suҩt phҧn ӭng, hiӋu suҩt tәng thu hӗi và hiӋu quҧ cӫa toàn bӝ quá trình (giá thành, giá trӏ khoa Kӑc và thӵc tiӉn, giá trӏ kinh tӃ - xã hӝi) - 1Ӄu có thӇÿѭӧc thì các hӧp chҩt tham gia phҧn ӭng tҥo liên kӃt ngang (giӳa chҩt mang và enzim) sӁ chӫ yӃu chӍ tѭѫng tác vӟi nhӳng nhóm chӭc năng nҵm ngoài tâm hoҥt ÿӝng cӫa enzim. NӃu ÿLӅu kiӋn này không thӵc hiӋn ÿѭӧc hoàn toàn thì chҩt tham gia phҧn ӭng tҥo liên kӃt ngang phҧi có kích thѭӟc lӟn không cho phép nó xâm nhұp, ҧnh Kѭӣng ÿӃn trung tâm hoҥt ÿӝng cӫa enzim. - Trung tâm hoҥt ÿӝng cӫa enzim phҧi luôn luôn ÿѭӧc bҧo vӋ (nӃu thӵc hiӋn ÿѭӧc) Eҵng các phѭѫng pháp khác nhau. Chҷng hҥn nӃu enzim vӟi tâm hoҥt ÿӝng có nhóm – SH thì cҫn phҧi xӱ lý sѫ bӝ bҵng glutation hay systein và chӍ tái hoҥt hoá enzim sau khi ÿã gҳn nó vào chҩt mang. Hoһc có thӇ che chҳn tâm hoҥt ÿӝng bҵng cách bә sung vào Kӛn hӧp phҧn ӭng cѫ chҩt ÿã ÿѭӧc bão hoà bӣi enzim (nӗng ÿӝ cѫ chҩt cao nhҩt mà enzim có thӇ thӵc hiӋn ÿѭӧc phҧn ӭng xúc tác) - Khi rӱa thiӃt bӏ phҧn ӭng ÿӇ phөc hӗi enzim, không ÿѭӧc làm ҧnh hѭӣng xҩu ÿӃn hoҥt tính enzim ÿã ÿѭӧc gҳn vào chҩt mang. - Khi lӵa chӑn chҩt mang (hӋ cӕ ÿӏnh) cҫn phҧi ÿӇ ý ÿӃn phҧn ӭng enzim sӁ diӉn ra Fө thӇ sao cho không làm ҧnh hѭӣng thұm chí huӹ hoҥi ngay bҧn thân chҩt mang và sҧn phҭm phҧn ӭng không ÿѭӧc ӭc chӃ hoҥt ÿӝng cӫa enzim. Chҷng hҥn không thӇ gҳn enzim xenluloza vào chính chҩt mang là xenluloza và các dүn xuҩt cӫa nó cNJng không thӇ tiӃn hành phҧn ӭng thuӹ phân xenluloza trên chính chҩt mang này. - ĈӇ ý ÿӃn ÿӝ bӅn cӫa chҩt mang (bӅn cѫ hӑc, thuӹ lӵc hӑc (rӱa trôi), bӅn nhiӋt, bӅn gel) nhҩt là khi phҧn ӭng trong nhӳng cӝt công suҩt lӟn. 5.4. Ҧnh hѭӣng cӫa sӵ cӕÿӏnh ÿӃn hoҥttính cӫa enzim. Khi gҳn vào chҩt mang, enzim sӁ bӏ giӟi hҥn hoҥt ÿӝng trong mӝt pҥhm vi môi trѭӡng xác ÿӏnh, lúc ÿó cҩu trúc không gian cӫa phân tӱ enzim (và cӫa cҧ tә hӧp) có thӇ bӏ thay ÿәi do ÿó có thӇ làm biӃn ÿәi mӝt sӕ tính chҩt cӫa enzim ban ÿҫu. Ví dө có thӇ thay ÿәi khoҧng pH hoҥt ÿӝng, nhiӋt ÿӝ hoҥt ÿӝng (và do ÿó có thӇ thay ÿәi pHop, top), tính ÿҥc Trang: 46
8. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch hiӋu cӫa enzim cNJng nhѭ hҵng sӕ Michoelis. Tҩt nhiên nhӳng thay ÿәi này phө thuӝc nhiӅu vào bҧn chҩt cӫa chҩt mang, nói chung enzim cӕÿӏnh thѭӡng troҿ nên bӅn vӟi các \Ӄu tӕ gây biӃn tính hѫn (vì nó ÿã ÿѭӧc “làm bӅn” phҫn nào bӣi chҩt mang) nhѭng ÿӝ hoҥt ÿӝng riêng thѭӡng thҩp hѫn enzim ban ÿҫu. 5.4.1. Hoҥt tính cӫa enzim cӕÿӏnh phө thuӝc vào bҧn chҩt cӫa chҩt mang: Khi enzim ÿѭӧc giӟi hҥn trong phҥm vi môi trѭӡng chҩt mang xác ÿӏnh sӁ xҧy ra mӝt Vӕ kiӇu tѭѫng tác khác nhau cӫa chҩt mang lên môi trѭӡng hoҥt ÿӝng vi mô bao xung quanh phân tӱ enzim cӕÿӏnh - KiӇu thӭ nhҩt ÿѭӧc gӑi là “hiӋu ӭng phân phӕi” (hay “hiӋu ӭng ÿҭy – kéo”) trong ÿó chҩt mang polyme nhӡ nhӳng tính chҩt ÿһc trѭng sӁ lôi kéo tӟi bӅ mһt cӫa nó, hoһc ÿҭy khӓi có cѫ chҩt,sҧn phҭm phҧn ӭng và các chҩt khác làm tăng hay giҧm tѭѫng ÿӕi Qӗng ÿӝ cӫa chúng trong phҥm vi môi trѭӡng vi mô nҵm sát cҥnh enzim. - KiӇu thӭ hai ÿѭӧc gӑi là “hiӋu ӭng ngăn chһn” tӭc là bҧn thân chҩt mang polyme ngăn cҧn sӵ khuӃch tán tӵ do cӫa các phân tӱ hѭӟng tӟi enzim (trong ÿó có cѫ chҩt) cNJng nhѭÿi khӓi enzim (trong ÿó có sҧn phҭm phҧn ӭng). Tӯÿó ҧnh hѭӣng trӵc tiӃp hay gián tiӃp ÿӃn hiӋu quҧ xúc tác cӫa enzim. Ví dөÿLӇn hình là trѭӡng hӧp enzim ÿѭӧc cӕÿӏnh bҵng chҩt mang polyanion (poly ion mang ÿLӋn (-)), lúc ÿó chҩt mang sӁ tác ÿӝng mҥnh ÿӃn cѫ chҩt cation (mang ÿLӋn (+)). Khi ÿó cѫ chҩt kiӇu này sӁ tұp trung xung quanh trѭӡng tác dөng vi mô cӫa chҩt mang làm cho mұt ÿӝ (nӗng ÿӝ) cӫa nó sӁ cao hѫn so vӟi mұt ÿӝ trung bình trong toàn hӋ. + Ĉӗng thӡi chҩt mang cNJng sӁ lôi kéo bҩt kǤ cation2H2 nào khác,H3O ch ҷ+ng OH hҥn nhѭ các proton + + H hay hidroxoni H3O (do nѭӟc có tính ÿLӋnO ly yӃu ). Nghƭa là Qӗng ÿӝ H+ tăng lên xung quanh trѭӡng tác dөng cӫa chҩt mang (và cNJng là cӫa enzim) làm cho pH giҧm xuӕng thҩp hѫn so vӟi pH trung binh trong toàn hӋ. Trong trѭӡng hӧp polyme chҩt mang và cѫ chҩt mang ÿLӋn giӕng nhau thì quá trình trên lҥi xҧy ra hoàn toàn ngѭӧc lҥi. Nghƭa là nӗng ÿӝ H+ lҥi giҧm ÿi xung quanh trѭӡng tác dөng cӫa chҩt mang (và cNJng là cӫa enzim) làm cho pH tăng lên cao hѫn so vӟi pH trung bình trong toàn hӋ. Nhѭ vұy ta nhұn thҩy là khi sӱ dөng polyme dҥng polyion làm chҩt mang sӁ không có Vӵ phân bӕÿӅu các ion trong hӋ, lúc ÿó nӗng ÿӝ ion trong môi trѭӡng vi mô xung quanh enzim sӁ khác vӟi nӗng ÿӝ cӫa chúng trong hӋ. ĈLӅu ÿó làm cho quá trình ÿӝng hӑc cӫa enzim sӁ rҩt phӭc tҥp, sӁ có sӵ sai khác (nhiӅu khi là ÿáng kӇ) các thông sӕ liên quan nhѭ: nӗng ÿӝ cѫ chҩt, sҧn phҭm phҧn ӭng, pH, t0 0ӝt ví dө khi khҧo sát sӵ cӕ ÿӏnh papain trên màng xenluloza nitrat ÿӇ thuӹ phân gelatin cho kӃt quҧ tӕn hѫn so vӟi khi enzim ӣ dung dӏch tӵ do (hoҥt ÿӝ enzim cӕÿӏnh thҩp hѫn hoҥt ÿӝ enzim tӵ do). Ĉó là do có chҩt mang xenluloza nitrat ÿã hҩp thө gelatin, biӃn tính sѫ bӝ nó ÿӇ tҥo ÿLӅu kiӋn thuұn lӧi cho sӵ thuӹ phân cӫa enzim ÿính kèm. Ĉӗ thӏ mô tҧ hiӋu ӭng phân bӕ lҥi proton làm giҧm pH xung quanh enzim cӕ ÿӏnh (chҩt mang là polyanion) nhѭ sau: Giҧ sӱ pHop cӫa enzim tӵ do trong dung dӏch phҧn dӭng là 8 và ÿѭӡng cong 1 mô tҧ Yұn tӕc phҧn ӭng phө thuӝc vào pH có dҥng hình chuông nhѭ trên. Ĉѭӡng cong 2 mô tҧ Yұn tӕc phҧn ӭng phө thuӝc vào pH khi enzim cӕÿӏnh tӃ bào trên poly polianion. Trong Trang: 47
9. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch khi ӣ pH = 8 ta có vұn tӕc phҧn ӭng bҵng 50%Vmax, ÿӇÿҥt ÿѭӧc giá trӏ này giá trӏ pH bên trong (pH xung quanh môi trѭӡng vi mô cӫa enzim) chӍ cҫn là 7. Nhѭ vұy mһc dù ÿӝ pH KӋ thӕng bҵng 8 nhѭng thӵc tӃ enzim ÿã hoҥt ÿӝng ӣÿôh pH thҩp hѫn (=7) mà ӣÿó hoҥt tính cӫa nó bҵng 50% giá trӏ cӵc ÿҥi (ÿLӇm A). Do vұy phҧi tăng giá trӏ pHe (pH of effect) Wӟi 9 ÿӇ khi ÿó pHi = 8 thì enzim sӁ thӇ hiӋn hoҥt tính tӕi ÿa cӫa nó (ÿLӇm B) Nhѭ vұy ta ÿã thҩy có hiӋn tѭӧng xê dӏch (sai khác) giá trӏ trong hӋ. ĈӇ khҳc phөc ngѭӡi ta thêm vào hӋ nhӳng phҧn ӭng trao ÿәi ion ÿLӇn hình (lӵc ion, ÿӝ phân ly cao) ÿӇ ngăn cҧn ҧnh hѭӣng cӫa các nhóm ion ҧnh hѭӣng ÿӃn chҩt mang và làm dӏch chuyӇn pH hoҥt ÿӝng cNJng nhѭ pHop. CNJng có thӇ dùng dung dӏch ÿӋm nӗng ÿӝ cao ÿӇ khҳc phөc ÿѭӧc hiӋn tѭӧng này. Chҩt mang phân tӱ lѭӧng càng lӟn thì càng giҧm ÿáng kӇ hoҥt tính enzim gҳn voà ÿó so vӟi chҩt mang có phân tӱ lѭӧng càng nhӓ. ĈLӅu này ÿѭӧc giҧi thích bӣi sӵ cҧn trӣ không gian cӫa phân tӱ chҩt mang ÿӕi vӟi phân tӱ cѫ chҩt trong vùng trung tâm hoҥt ÿӝng cӫa enzim. 5.4.2. Hoҥt tính enzim cӕ ÿӏnh phө thuӝc vào sӵ khuӃch tán cӫa cѫ chҩt, sҧn phҭm và các phân tӱ khác: 7ӕc ÿӝ khuӃch tán cӫa cѫ chҩt, sҧn phҭm và các chҩt khác phө thuӝc vào các yӃu tӕ: kích thѭӟc lӛ gel cӫa chҩt mang polyme; trӑng lѭӧng phân tӱ cӫa cѫ chҩt; sӵ sai khác do “hiӋu ӭng phân phӕi” (sai khác vӅ nӗng ÿӝ, pH, t0 hoҥt ÿӝng ). Trong ÿó ÿѭӡng kính lӛ gel cӫa chҩt mang polyme và trӑng lѭӧng phân tӱ cӫa cѫ chҩt ÿóng vai trò quan trӑng nhҩt. HiӋu ӭng phân phӕi làm xuҩt hiӋn gradien nӗng ÿӝ cѫ chҩt và sҧn phҭm trong khi tiӃn hành phҧn ӭng, có thӇÿo ÿҥc và viӃt các phѭѫng trình ÿӝng hӑc cho chúng. Nhӳng giӟi Kҥn khuӃch tán có thӇ ÿѭӧc thӇ hiӋn hai dҥng hàng rào khuӃch tán bên ngoài và bên trong. Hàng rào khuӃch tán bên ngoài có ÿѭӧc do có sӵ tӗn tҥi cӫa lӟp mӓng dung môi không Eӏ pha trӝn bao xung quanh hҥt polyme. Sӵ hình thành nó nhӯ có sӵ kӃt hӧp cӫa khuӃch tán phân tӱ thөÿӝng (chuyӇn ÿӝng Brown) và sӵÿӕi lѭu (do sӵ xuҩt hiӋn gradien nӗng ÿӝ hay gradien nhiӋt ÿӝ). Ĉӝ dày cӫa lӟp khuӃch tán bên ngoài phө thuӝc rҩt nhiӅu vào Wӕc ÿӝ khuҩy trӝn dung môi, ÿây là yӃu tӕ hӃt sӭc quan trӑng khi tiӃn hành phҧn ӭng enzim cӕÿӏnh. Hàng rào khuӃch tán bên trong do chính chҩt mang tҥo ra và chӍ có sӵ khuӃch tán phân Wӱ thөÿӝng (chuyӇn ÿӝng Brown), không bӏҧnh hѭӣng bӣi tӕc ÿӝ pha trӝn. Hàng rào này VӁ tӓ ra có ҧnh hѭӣng to lӟn hѫn nӃu enim ÿѭӧc cӕÿӏnh vào trong lòng chҩt mang chӭ không phҧi gҳn nó vào bӅ mһt cӫa chҩt mang. Nhӳng giӟi hҥn khuӃch tán này cùng vӟi hiӋu ӭng phân phӕi làm cho các thông sӕ công nghӋ thay ÿәi (có khi là khá lӟn) so vӟi khi tiӃn hành vӟi enzim tӵ do, ÿây là ÿLӅu Fҫn chú ý khi mô hình hoá, thiӃt lұp quy trình công nghӋ. 5.5. Các reactor chӭa enzim cӕÿӏnh: Reactor (cӝt phҧn ӭng) chӭa enzim ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ tҥo tiӃp xúc giӳa enzim và cѫ chҩt trong mӝt khoҧng thӡi gian ÿӫ lӟn ÿӇ tiӃn hành phҧn ӭng xúc tác, ÿӗng thӡi tách sҧn phҭm phҧn ӭng - ÿӇ lҥi enzim. Trang: 48
10. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 5.5.1. Reactor hoҥt dӝng theo chu kǤ. Thӵc tӃÿó là nhӳng bӇ lӟn hay bӗn chӭa enzim và cѫ chҩt có trang bӏ máng khuҩy. Nhѭ vұy dung tích làm viӋc, hiӋu suҩt chuyӇn hoá ÿѭӧc cӕÿӏnh và ngѭӡi ta cho phҧn ӭng tiӃn hành triӋt ÿӇ theo tính toán. Sau ÿó tháo cҥn toàn bӝÿӇ tách sҧn phҭm khӓi enzim (nhѭ vұy là xong 1 chu kǤ làm viӋc) rӗi lҥi chuҭn bӏ tiӃn hành mҿ khác. Trong trѭӡng hӧp enzim tan (lүn lӝn cѫ chҩt còn dѭ, sҧn phҭm phҧn ӭng vӟi enzim) thì ÿӇ tách sҧn phҭm ngѭӡi ta thѭӡng làm biӃn tính enzim (ví dө bҵng cách xӱ lý nhiӋt). Phѭѫng cách sӱ dөng này có hiӋu quҧ kinh tӃ nӃu dùng enzim rҿ tiӅn mà sҧn phҭm phҧn ӭng lҥi có giá trӏ, enzim dùng xong không thu hӗi lҥi ÿѭӧc. ĈӇ reactor kiӇu này có thӇ dùng enzim ÿҳt tiӅn có thӇ thu hӗi ÿê dùng lҥi trѭӟc hӃt cҫn phҧi cӕÿӏnh nó thành enzim không tan. Sau chu NǤ phҧn ӭng, chӃ phҭm enzim không tan ÿѭӧc tách ra bҵng ly tâm hay lӑc. Mà trong thӵc WӃ quy trình thu hӗi enzim này có thӇ làm phá huӹ cҩu trúc cӫa chӃ phҭm enzim không tan, nghƭa là phá huӹ enzim. Vì vұy reactor hoҥt ÿӝng theo chu kǤ thѭӡng ÿѭӧc sӱ dөng Yӟi enzim tan rҿ tiӅn, không cҫn thu hӗi enzim, chi phí sҧn xuҩt thҩp hѫn so vӟi các phѭѫng pháp khác. 5.5.2. Reactor hoҥt ÿӝng theo kiӇu dòng chҧy: Nguyên tҳc hoҥt ÿӝng cӫa reactor dòng chҧy là sӵ bә sung cѫ chҩt (liên tөc hay gián ÿRҥn, theo chu kǤ) theo dòng nhҩt ÿӏnh (tӕc ÿӝ nҥp, dung tích nҥp) và sҧn phҭm phҧn ӭng FNJng ÿѭӧc lҩy ra theo hình thӭc tѭѫng tӵ vӟi quá trình nҥp cѫ chҩt.Ngѭӡi ta chia ra 2 nhóm reactor dòng chҧy: nhóm có khuҩy trӝn và nhóm không khuҩy trӝn khi hoҥt ÿӝng. - Reactor dòng chҧy có khuҩy trӝn là mӝt bӇ (bӗn hay thiӃt bӏ) có máng khuҩy, có ÿѭӡng dүn nҥp cѫ chҩt và ÿѭӡng lҩy hӛn hӧp hay sҧn phҭm phҧn ӭng ra khӓi bӇ (nguyên Wҳc chemistat trong nuôi cҩy vi sinh vұt). Các thông sӕ hoҥt ÿӝng cӫa thiӃt bӏ nhѭ: dung tích, tӕc ÿӝ bә sung cѫ chҩt, hoҥt tính enzim, tӕc ÿӝ tháo sҧn phҭm, thӡi gian duy trì phҧn ӭng và chu kǤ làm viӋc thѭӡng ÿѭӧc tӕi ѭu hoá theo nhӳng mөc tiêu ÿã ÿӏnh. Tuy nhiên do sӵ khuҩy trӝn nên các hҥt enzim cӕÿӏnh phân bӕ trong toàn dung tích làm viӋc cӫa thiӃt bӏ và ÿѭӧc tháo ra ngoài cùng vӟi sҧn phҭm phҧn ӭng. ĈӇ duy trì enzim cӕÿӏnh cҫn phҧi liên tөc hay ÿӏnh kǤ bә sung mӝt lѭӧng chӃ phҭm enzim cӕÿӏnh Eҵng cách: tách enzim ra khӓi sҧn phҭm bҵng cách lӑc, hoҥt hoá trӣ lҥi rӗi ÿѭa vào thiӃt Eӏ; hoһc cӕÿӏnh enzim trӵc tiӃp trên cánh khuҩy, ÿӏnh kǤ bә sung, thay thӃ mӟi. Reactor dòng chҧy có khuҩy trӝn có thӇ kӃt hӧp vӟi quá trình siêu lӑc, ÿLӅu này cho phép sӱ dөng enzim cӕÿӏnh ӣ dҥng tan trong các reactor, ÿһc biӋt thích hӧp vӟi cѫ chҩt không tan hay ӣ dҥng keo. - Reactor dòng chҧy không khuҩy trӝn (xem hình 63 trang 218 cӫa giáo trình). Enzim cӕÿӏnh ÿѭӧc nhӗi vào cӝt, dӏch cѫ chҩt chҧy tӯ trên xuӕng ngҩm qua lӟp enzim và ÿҫu dѭӟi sӁ nhұn ÿѭӧc dӏch sҧn phҭm xúc tác. Mӝt reactor dòng chҧy lý tѭӣng khi lӟp Fѫ chҩt chҧy qua toàn bӝ diӋn tích mһt cҳt ngang cӫa cӝt vӟi tӕc ÿӝ không ÿәi - ÿây là hӋ thӕng reactor tách - ÿҫy lý tѭӣng. Trong thӵc tӃ dӏch cѫ chҩt cNJng có thӇÿѭa tӯ dѭӟi lên, chҧy trên qua cӝt còn sҧn phҭm lҩy ra tӯ trên. Sѫÿӗ và nguyên tҳc làm viӋc xem hình 63. Trang: 49
11. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 5.6. . Sӱ dөng enzim cӕÿӏnh trong y hӑc và trong công nghiӋp: ViӋc ӭng dөng enzim cӕÿӏnh ÿã cho phép tҥo ra môt sӕ công nghӋ hoàn toàn trong y Kӑc và công nghiӋp. - Trong y hӑc + Sӱ dөng enzim cӕÿӏnh ÿӇ làm các nӝi quan giҧ nhѭ: bàng quan, niêm mҥc. + Sӱ dөng enzim dѭӟi dҥng micro capsul ÿӇÿѭa enzim vào chӳa bӋnh thiӃu enzim nhѭng không gây nên các phҧn ӭng phө. + Ngiên cӭu cҩu trúc phân tӱ enzim, cҩu tҥo màng tӃ bào, mô hình hoá hӋ thӕng enzim trong tӃ bào. - Trong côncg nghiӋp + Sӱ dөng reactor dòng chҧy không khuҩy trӝn: Nakhapetian (1976) ÿã cho dung dӏch tinh bӝt hӗ hoá 35% liên tөc qua cӝt chӭa glucoamylaza không tan ÿӇÿѭӡng hoá. Sau 22,6 ngày phҧn ӭng ӣ t = 450C, hoҥt ÿӝ enzim trong cӝt vүn còn 50%. HiӋn nay là thoҧ mãn nhu cҫu vӅ mҥch nha cӫa cҧ nѭӟc. + Các chӃ phҭm enzim không tan dùng trong công nghӋ thӵc phҭm: catalaza ÿӇ khӱ trùng sӳa, glucoizomeraza ÿӇÿӗng phân hoá sҧn xuҩt fructoza, glucooxydaza ÿӇ sҧn xuҩt axit glutamic, pectinaza ÿӇ làm trong nѭӟc quҧ, sҧn xuҩt hӛn hӧp ÿѭӡng khӱ glucoza – fructoza dùng glucoizomeraza cӕÿӏnh. 5.6.1. 6ӱ dөng aminoacylaza cӕÿӏnh ÿӇ sҧn xuҩt axit amin. Trong quá trình tәng hӧp hoá hӑc hay lên men (sinh tәng hӧp) ÿӇ sҧn xuҩt các axit amin nhѭng nhѭӧc ÿLӇm lӟn nhҩt cӫa phѭѫng pháp này cho ra các sҧn phҭm raxemic, tӭc là hӛn hӧp cӫa 2 dҥng ÿӗng phân quang hӑc D và L trong ÿó chӍ có dҥng L mӟi có hoҥt tính sinh hӑc cao, có ý nghƭa trong khoa hӑc hoá sinh. NӃu sӱ dөng phѭѫng pháp hoá hӑc hay kӃt hӧp vӟi sinh tәng hӧp (lên men 2 pha) sӁ rҩt tӕn kém, không khҧ thi. 7ӯ năm 1969 hãng Tanabe Seizaku (Nhұt Bҧn) sӱ dөng enzim cӕÿӏnh amino acylaza (AACD: enzim ÿӗng phân hoá chuyӇn tӯ dҥng D sang dҥng L cӫa axit amin) ÿӇ chuyӇn hoá hӛn hӧp D,L axit amin. Trong ÿó enzim aminoacylaza ÿѭӧc cӕ ÿӏnh trên DEAE. Sephadex bҵng liên kӃt ion vӟi thӡi gian bán huӹ là 65 ngày ӣ 500C. - Phѭѫng pháp cӕÿӏnh: 1000-1700 lít dӏch enzim lҳc ÿӅu vӟi DEAE. Sephadex trong Oӑ ӣ 350C, pH=7.0 sau ÿó lӑc và rӱa sҥch, enzim sau khi gҳn vào chҩt mang có hoҥt tính 50-60% hoҥt tính enzim tӵ do. ChӃ phҭm enzim cӕÿӏnh sau ÿó ÿѭӧc nhӗivào cӝt phҧn ӭng (bioreactor) sau 65 ngày làm viӋc sӁÿѭӧc tái sinh vӟi dӏch enzim mӟi, cӭ nhѭ vұy sau 8 năm mӟi phҧi thay chҩt mang mӟi. 6ѫÿӗ công nghӋ sҧn xuҩt L axit amin cӫa hãng TANABE SEIZAKY. Raxemat hoá Acyl-D-axitamin Kӛn hӧp acyl- L,D-axit amin L, axit amin tinh Ly tâm thӇ [ӱ lý nhiӋt Oӑc Eӕc NӃt Kѫi tinh Trang: 50
12. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Phҧn ӭng trong bioreactor xҧy ra ӣ pH=7.0, t=500C, bә sung 5.10-4 M Co2+. Vұn tӕc dòng chҧy 2000 lít /h vӟi dung tích cӫa bioreactor là 1000 lit. Ví dө: quá trình sҧn xuҩt L_ metionin: nӗng ÿӝ ban ÿҫu cӫa hӛn hӧp acetyl D,L metionin là 0,2mol. Sau khi chҥy qua cӝt phҧn ӭng thu ÿѭӧc 2000 lit dung dӏch. Sau khi cho bay hѫi và kӃt tinh thu ÿѭӧc 27Kg L_metionin (hiӋu suҩt thu hӗi 91%). Dӏch acetyl D metionin ÿѭӧc xӱ lý ӣ 600C vӟi axetaldehyt (raxemet hoá), ÿLӅu chӍnh pH=1,8 ÿӇ chuyӇn vӅ hәn hӧp D,L-metionin. %ҧng 19 - Mӝt sӕ loҥi axit amin sҧn xuҩt bӣi enzim cӕÿӏnh aminvacylaza trên PEAE- Sephadex (cӝt dung tích 1m3) cӫa hãng TANABE SEIZAKU. Axit amin vұn tӕc nҥp 1000lit/h Vҧn phҭm axit amin/24h-Kg L-Alanin 1,0 214 L-metionin 2,0 715 L- 1,5 594 phenylalanin 0,9 441 L-triptofan 1,8 505 L-valin HiӋn nay hãng này sҧn xuҩt 700-1000 Kg axit amin/ngày vӟi chi phí 60% so vӟi qui trình cNJ sӱ dөng enzim hoà tan. Qui trình tѭѫng tӵ ÿѭӧc hãng SNAM-Progetti(Italy) ӭng dөng trên cѫ sӣ cӕ ÿӏnh enzim aminoacylaza trong sӧi triaxetat xenluloza. ChӃ phҭm hoҥt ÿӝng liên tөc 50 ngày chӍ mҩt tӕi ÿa 30% hoҥt tính. Cӭ 1Kg enzim cӕÿӏnh cho phép sҧn xuҩt ÿѭӧc 400Kg L- triptofan. 5.6.2. 6ҧn xuҩt L-axit aspartic bҵng enzim asparza cӕÿӏnh. HOOC – CH2 – CH – COOH Axit L-aspatic NH2 Là cѫ chҩt trung gian cӫa rҩt nhiӅu quá trình chuyӇn hoá hoá sinh tәng hӧp các axit amin khác rҩt quan trӑng trong dinh dѭӥng ÿӝng vұt và chӃ biӃn thӵc phҭm (sҧn xuҩt axit L-valin, tәng hӧp axit a-xetoglutaric (tiӅn chҩt ÿӇ chuyӇn hoá thành axit L-glutamic)). &ѫ chӃ hoá sinh cӫa sӵ tҥo thành axit aspartic là quá trình tҥo liên kӃt ÿӗng hoá trӏ giӳa NH3 vӟi axit fumaric bӣi enzim aspartaza: E.aspartaza HOOC – CH = CH – COOH + NH3 HOOC – CH2 – CH – COOH NH2 Trang: 51
13. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Tӯ năm 1973, hãng TANABE SEIZAKY ÿã sӱ dөng tӃ bào có chӭa enzim aspartaza (nòi vi khuҭn Brevibacterium flavum nuôi cҩy trên môi trѭӡng rӍÿѭӡng giàu biotin) và gói nó trong gel polyacrylamit vӟi bán chu kǤ hoҥt ÿӝng là 120 ngày ӣ 370C. Phѭѫng pháp cӕÿӏnh nhѭ sau: 10 Kg tӃ bào hoà tan 40lit dung dӏch sinh lý (saccaroza +NaCl tәng cӝng 1%). Thêm 7,5 Kg acryamit, 0,4 Kg bis-acryamit. 5lit dimetyl aminopronitri) 5%. 5 lit amonium persulfat 2,5 % Kӛn hӧp ÿӇӣ 400C trong 10 – 12 phút, gel tҥo thành ÿѭӧc cҩt thành muӕng nhѭ hình vuông 2 – 3 mm. Nguyên liӋu ban ÿҫu ÿӇ sҧn xuҩt là hӛn hӧp axit fumaric-amonisulfat hòa tan trong MgCl2 0,1N vӟi nӗng ÿӝ 1mol/lit dung dӏch MgCl2. Phҧn ӭng thӵc hiӋn ӣ pH = 8,5, t0 = 370C, vұn tӕc dòng chҧy là 0,6V bioreactor/h. Dӏch sau khi qua cӝt ÿѭӧc 0 0 chuyӇn vӅ pH = 2,8 bҵng H2SO4 60% ӣ 90 C. Sau ÿó làm nguӝi xuӕng 15 C trong 2h. Tinh thӇ axit aspartichinhf thành ÿѭӧc lҳng, ly tâm và rӱa bҵng nѭӟc. 9ӟi cӝt bioreactor dung tích 1m3 trên ÿã sҧn xuҩt ÿѭӧc 1700 kg axit L-aspartic/ngày Yӟi chi phí bҵng <60% so vӟi công nghӋ cNJ (chuyӇn hoá bҵng phѭѫng pháp hoá hӑc) 5.6.3. 6ҧn xuҩt axit L-malic bҵng enzim fumaraza cӕÿӏnh: OH (HOOC – CH2 – CH – COOH ) Axit malic ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ thay thӃ axit xitric OH (HOOC – CH2 – C – CH2 – COOH ) trong công nghiӋp thӵc phҭm và COO Gѭӧc phҭm. H 'ѭӟi tác dөng cӫa enzim fumaraza, axit fumaric ÿѭӧc chuyӇn hoá thành axit malic (phҧn ӭng phө tҥo thành axit sucxinic): OH E. HOOC – CH = CH – COOH HOOC – CH2 – CH – COOH: axit malic fumaraza+ H2O Sѭ phө: hӛ biӃn + HOOC–CH –CH –COOH: axit sucxinic HE. sucxinatdehydrogenaza 2 2 Phҧn ӭng sӁ cân bҵng khi chuyӇn hoá ÿѭӧc khoҧng 80% axit fumaric. Qui trình ÿѭGӧc thӵc hiӋn năm 1984 bӣi hãng TANABE SEIZAKU. Enzim fumaraza ÿѭӧc cӕÿӏnh trong gel polyacriamit, ÿӇӭc chӃ phҧn ӭng phө tҥo axit suxinic, tӃ bào cӕÿӏnh ÿѭӧc xӱ lý bҵng axit uric 0,2% ӣ 370C, pH = 7,5 trong 20h. ChӃ phҭm có bán chu kǤ hoҥt ÿӝng là 55 ngày ӣ 370C. Cѫ chҩt ÿѭӧc sӱ dөng là muӕi Na. fumarar nӗng ÿӝ 1mol/lit, pH = 7, t=370C, vұn tӕc dòng chҧy 0,2 thӇ tích bioreactor/h. Trang: 52
14. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Hãng SNAM Progetti lҥi sӱ dөng trӵc tiӃp enzim fumaraza cӕÿӏnh trong sӧi triaxetat xenluloza. Sau khi chҥy qua cӝt axit malic ÿѭӧc thu hӗi bҵng cách kӃt tӫa vӟi CaCO3. 5.6.4. 6ҧn xuҩt nhóm penixilin-axit 6 amino penicillinic (6-APA) bҵng enzim cӕ ÿӏnh penicillinamidaza. Penicillin là mӝt nhóm chҩt có tính kháng sinh, cҩu tҥo chung là: Vӟi R là gӕc axyl thì ta có penicillin G – là penicillin thѭѫng mҥi và sinh hoҥt phә biӃn nhҩt hiӋn nay. Enzim penicillinamidaza xúc tác thuӹ phân benzyl penicllin (penicillin G) ÿӇ tҥo thành nhóm penicillin 6-APA và axit phenyl axetic. 6 – APA ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi trong công nghiӋp dѭӧc phҭm ÿӇ sҧn xuҩt các loҥi kháng sinh hӑ penicillin. HiӋn nay toàn bӝ 6 – APA cӫa thӃ giӟi ÿӅu ÿѭӧc sҧn xuҩt bҵng phѭѫng pháp sӱ dөng enzim penicillinamidaza cӕÿӏnh. Ĉây là enzim nӝi bào khi sinh tәng hӧp bӣi vi khuҭn Esterichia-Coli, Bacterium faecalic, alacaligus vӟi môi trѭӡng cazein thuӹ phân, cao ngô, glucoza, axit phelnylaxetic làm chҩt cҧm ӭng. Phѭѫng pháp gói enzim cӫa hãng SNAM Progetti (Italy) nhѭ sau: 10 lit dung dӏch penicillinamidaza pH=8 trӝn vӟi 5kg triaxetic xenluloza trong 71,4kg clorimetylin ӣ 40C, lҳc kӻ cho ÿén khi tҥo gel cà các sӧi. Mӛi kg sӧi thành phҭm ÿѭӧc nhӗi trong các cӝt kích thѭӟc 43 x 14 cm. 26lit penicillin G (muӕi kali) cho chҧy liên tөc qua cӝt ӣ pH = 8,2 cho ÿӃn khi ÿҥt mӭc chuyӇn hoá 97% 6-APA. Công nghӋ cӫa hãng TANABE SEIZAKU: sӱ dөng bioreactor tӃ bào cӕ ÿӏnh chӭa penicillinamidaza trong gel polyacriamit nhѭ sau: dung dӏch penicillin G 0,65M ӣ pH=8,5 cho chҧy qua cӝt vӟi tӕc ÿӝ 0,12 – 0,14 thӇ tích cӝt/h. HiӋu suҩt phҧn ӭng ÿҥt 80%. 5.6.5. Thuӹ phân lactoza bҵng enzim lactaza cӕÿӏnh: Lactoza là disaccarit có trong sӳa nên ÿѭӧc gӑi là ÿѭӡng sӳa. Loҥi ÿѭӡng nàu có ÿӝ ngӑt thҩp (bҵng 30% vӟi ÿѭӡng saccaroza ӣ cùng nӗng ÿӝ), ÿӝ hoà tan kém (gây nên hiӋn tѭӧng sҥn ÿѭӡng trong sӳa), mӝt bӝ phұn ngѭӡi sӱ dөng sӳa không có khҧ năng tiêu hoá hҩp thөÿѭӧc sӳa này. Mһt khác ÿѭӡng sӳa hҫu nhѭÿѭӧc thҧi cùng vӟi sӳa nӃu ÿem chӃ biӃn các sҧn phҭm sӳa chua, phomat sӁ gây ô nhiӉm môi trѭӡng. Nhѭ vұy nӃu thuӹ phân lactoza ÿӇ tҥo thành 2 monosaccarit cҩu thành nó là glucoza và galactoza sӁ mang Oҥi hiӋu quҧ to lӟn. Lúc ÿó sӳa sӁ có chҩt lѭӧng cao hѫn, loҥi bӓ hiӋn tѭӧng sҥn sӳa, nâng cao ÿӝ tiêu hoá, các monosaccarit sӁÿѭӧc vi sinh vұt sӱ dөng khi lên men sӳa (các sҧn phҭm sӳa chua và phomat) Enzim lactaza ÿѭӧc sinh tәng hӧp tӯ mӝt sӕ nòi nҩm mӕc và nҩm men. Nòi ÿѭӧc sҧn xuҩt dѭӟi dҥng chӃ phҭm cӕÿӏnh thѭѫng mҥi (xem bҧng 22 trang 228 cӫa giáo trình). Hãng SNAM Progetti (Italy) sӱ dөng bioreactor dung tích 10 lit chӭa 4kg lataza cӕ ÿӏnh trong sӧi axetat xenluloza. Trѭӟc hӃt sӳa ÿѭӧc tiӋt trùng cӵc nhanh (1420C, 3s), làm Oҥnh nhanh ÿӃn 4 – 70C rӗi cho chҧy qua bioreactor vӟi vұn tӕc 7lit/phút. Sҧn phҭm sӳa Eҧo quҧn tӕt trong 3 – 4 tháng ӣ 40C. HiӋn nay hãng sҧn xuҩt hàng ngày 10 tҩn sӳa không Trang: 53
15. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch có lactoza. Hãng Corning Glass tӯ năm 1978 sӱ dөng enzim lataza liên kӃt ÿӗng hoá trӏ Yӟi silicagel ÿӇ xӱ lý dӏch trong sӳa vӟi công suҩt 30 tҩn/ngày. Trang: 54
16. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 6: GIӞI THIӊU MӜT SӔ LOҤI ENZIM CHӪ YӂU VÀ KHҦ 1ĂNG ӬNG DӨNG 6.1. Amylaza. +Ӌ enzim amylaza là mӝt trong sӕ các hӋ enzim ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi nhiӅu trong công nghiӋp,y hӑc và nhiӅu lƭnh vӵc khác. Ӣ các nѭӟc phѭѫng Ĉông, nhҩt là ӣ Trung Quӕc, ViӋt Nam, Nhұt Bҧn ngѭӡi ta ÿã biӃt ÿӃn amylaza có trong mӕc tѭѫng , misô (ÿұu tѭѫng lên men) tӯ rҩt lâu. Ӣ Trung Cұn Ĉông và phѭѫng Tây ngѭӡi ta cNJng biӃt nҩu bia, rѭӧu uyt.xki. Enzim amylaza có trong nѭӟc bӑt, dӏch tiêu hoá cӫa ngѭӡi và ÿӝng vұt, trong hҥt, cӫ Qҧy mҫm, nҩm mӕc, vi khuҭn và mӝt sӕ nòi nҩm men. HiӋn nay ngѭӡi thu nhұn enzim amylaza thѭѫng mҥi và công nghӋ tӯ canh trѭӡng vi khuҭn, nҩm mӕc theo phѭѫng pháp nuôi cҩy bӅ mһt và bӅ sâu. HiӋn nay ngѭӡi ta biӃt rõ có 6 loҥi enzim amylaza (3 loҥi thuӹ phân liên kӃt Į1-4, 3 loҥi thuӹ phân liên kӃt Į1,6 glucozit). Các enzim amylaza tӯ các nguӗn, các giӕng vi sinh vұt Wәng hӧp khác nhau thì khác nhau vӅ tính chҩt, cѫ chӃ, ÿLӅu kiӋn, sҧn phҭm thuӹ phân. 6.1.1. X-amilaza ( tên hӋ thӕng Į-1,4 glucan-hidrolaza; mã sӕ 3.2.1.1.EC). - Xúc tác thuӹ phân liên kӃt Į1-4 glucozit nҵm ӣ bên trong phân tӱ có chҩt (tinh bӝt, glycogen) – vì thӃÿѭӧc gӑi là enzim amylaza nӝi phân (endoamylaza). Dѭӟi tác dөng Fӫa Į-amylaza, amiloza (Am) khá nhanh thành oligosaccarit gӗm 6 – 7 gӕc glucoza. Sau ÿó các oligosaccarit này lҥ tiӃp tөc bӏ phân cҳt thành maltotetroza, mantotrioza và mantoza (hình 64 trang 234). Qua mӝt thӡi gian tác dөng dài bӣi enzim, amiloza sӁ bӏ thuӹ phân thành 23% glucoza và 87% maltoza. Tác dөng cӫa Į-amylaza làm amylopectin (AP) cNJng xҧy ra tѭѫng tӵ nhѭng vì nó không phân cҳt ÿѭӧc liên kӃt Į1-6 glucozit ӣ mҥch nhánh cӫa AP nên sau mӝt thӡi gian lâu thì sҧn phҭm sӁ lҫ 72% maltoza, 19% glucoza, dextrin thҩp phân tӱ và izomaltoza (8%). - Tuy nhiên thông thѭӡng trong mӝt thӡi gian ngҳn 30 – 60 phút (thӡi gian nҩu sѫ bӝ nguyên liӋu tinh bӝt hay ÿѭӡng hoá sѫ bӝ khӕi nҩu trong sҧn xuҩt rѭӧu elylic). Į-amylaza chӍ thuӹ phân tinh bӝt chӫ yӃu thành dextrin phân tӱ thҩp và mӝt ít ÿѭӡng maltoza, khҧ Qăng dextrin hoá cao này là tính chҩt cӫa enzim ÿһc trѭng cӫa enzim này. Vì vұy ngѭӡi ta còn gӑi loҥi enzim này là amylaza dextrin hay amylaza dӏch hoá. - Į-amylaza là mӝt metaloenzim (enzim cѫ kim), trong phân tӱ enzim có tӯ 1 – 6 nguyên tӱ C, chúng tham gia vào sӵ hình thành và әn ÿӏnh cҩu trúc bұc 3 cӫa enzim, duy trì cҩu hình hoҥt ÿӝng cӫa enzim, quyӃt ÿӏnh tính bӅn nhiӋt cӫa enzim. - Į-amylaza cӫa vi sinh vұt có nhӳng ÿһc tính rҩt ÿһc trѭng vӅ cѫ chӃ tácdөng, khҧ Qăng chuyӇn hoá tinh bӝt và khҧ năng chӏu nhiӋt: + ThӇ hiӋn hoҥt tính trong vùng axit yӃu: Į-amylaza nҩm mӕc có pHop = 4,5 – 4,9, Fӫa vi khuҭn pHop = 5,9 – 6,1. Ӣ pH<3 enzim bӏ vô hoҥt hoàn toàn trӯĮ-amylaza cӫa Trang: 55
17. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Asp. Niger có thӇ chӏu ÿѭӧc pH = 2,5 – 2,8 (trong môi trѭӡng sinh tәng hӧp axit xitric Eҵng phѭѫng pháp lên men bӅ mһt). + Į-amylaza cӫa nҩm mӕc có khҧ năng dextrin hoá (dӏch hoá) cao lҥi vӯa tҥo ra Pӝt lѭӧng lӟn glucoza và maltoza. Į-amylaza cӫa vi khuҭn lҥi có hai loҥi: Į-amylaza Gӏch hoá và Į-amylaza ÿѭӡng hoá. + NhiӋt ÿӝ hoҥt ÿӝng cӫa Į-amylaza tӯ các nguӗn khác nhau là khác nhau. (bҧng III-4 trang 108 – Enzim VSV - Tұp I). Trong ÿó ÿáng chú ý hѫn cҧ là Į-amylaza cӫa vi khuҭn có thӇ chiu ÿѭӧc ӣ nhiӋt ÿӝ cao, có thӇ giӳÿѭӧc hoҥt lӵc ngay cҧ khi ÿun sôi trong Qѭӟc mӝt thӡi gian ngҳn. Tính bӅn nhiӋt này là mӝt ѭu ÿLӇm lӟn ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ xӱ lý nguyên liӋu ӣ các công ÿRҥn phҧi dùng nhiӋt ÿӝ cao, hoһc môi trѭӡng nhiӋt ÿӟi nhѭӣ Qѭӟc ta. Ĉa sӕ các chӃ phҭm enzim thѭѫng mҥi thuӝc nhóm amylaza ÿӅu có tính chӏu nhiӋt cao. Nhӳng chӫng vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp Į-amylaza ÿѭӧc sӱ dөng trong công nghӋ: Asp. Oryzae, Asp. Awamori, Asp. Usami, Asp. Batatae, Asp. Niger, Bacillus subtilic, B. lichemiformis, Endomycopsis fibuliger 6.1.2. ȕ-amylaza (tên hӋ thӕng Į-1,4-glucan-maltohidrrolaza mã sӕ 3.2.1.2 EC) - Xúc tác thuӹ phân liên kӃt Į1-4 glucozit (hinh 65 trang 235 – giáo trình). Tuҫn tӵ Wӯng gӕc maltoza mӝt tӯÿҫu không khӱ cӫa mҥch và do maltoza tҥo ra cҩu hìnhȕ vì thӃ enzim này ÿѭӧc gӑi là ȕ-amylaza. - Hҫu nhѭ không thuӹ phân hҥt tinh bӝt nguyên mà chӍ thuӹ phân tinh bӝt hӗ hoá, có khҧ năng thuӹ phân 100% amylaza thành maltoza và 54 – 58 % amylopectin thành maltoza. Quá trình thuӹ phân AP bҳt ÿҫu tӯÿҫu không khӱ cӫa nhánh ngoài cùnh, mӛi nhánh này có 20 – 26 gӕc glucoza nên sӁ tҥo ra ÿѭӧc 10 -13 phân tӱ maltoza. Khi gһp liên kӃt Į1-4ÿӭng kӃ cұn liên kӃt Į1-6 thì ȕ-amylaza ngӯng tác dөng. Phҫn còn lҥi không Eӏ tác dөng này gӑi là ȕ-dextrin chӭa tҩt cҧ các liên kӃt Į1-6 : cho màu tím ÿӓ vӟi Iôt. - NӃu cho cҧĮ và ȕ-amylaza cùng ÿӗng thӡi thuӹ phân tinh bӝt thì hiӋu suҩt thuӹ phân ÿҥt tӟi 95%. - ȕ-amylaza là mӝt albumin, enzim ngoҥi phân (exoenzym), chӍ có trong malt, vүn giӳÿѭӧc hoҥt tính khi không có C, kém bӅn ӣ nhiӋt ÿӝ cao, bӏ vô hoҥt hoàn toàn ӣ 700C. pHop+ trong dӏch tinh bӝt thuҫn khiӃt là 4,6 , còn trong dӏch nâú tinih bӝt là 5,6. top trong Gӏch tinh bӝt thuҫn khiӃt là 40-500C, còn trong dӏch nҩu tinh bӝt là 60-650C. 6.1.3. Glucoamilaza (tên hӋ thӕng Į-1,4-glucan-glucohidrolaza, mã sӕ 3.2.1.3.EC) còn gӑi là amyloglucozidaza. - Thuӹ phân liên kӃt Į1-4 và Į1-6, vì thӃ các nhà nghiên cӭu Nhұt (Onoetal, 1964) ÿӅ nghӏÿһt tên hӋ thӕng là Į1-4 :1,6-glucan-4:6-glucohidrolaza. Enzim này ÿѭӧc các nàh khoa hӑc Nhұt tách ra lҫn ÿҫu tiên tӯ Asp. Awamori (katihara, karushima, 1956). Sau ÿó ÿѭӧc tìm thҩy ӣ Rhizopus delemar, Asp. Niger, Asp. Oryzae, các vi sinh vұt khác, mô ÿӝng vұt. - Glucoamylaza là enzim ngoҥi bào (exoenzim), có khҧ năng thuӹ phân liên kӃt Į1- 2, Į1-3 glucozit (Sawasaki, 1960; Ueyamaetal, 1965; Watanabe Fukimbara, 1960). Nó có khҧ năng thuӹ phân hoàn toàn tinh bӝt, glicogen, Am, Ap, dextrin cuӕi, izomaltoza, mantoza ÿӃn sҧn phҭm cuӕi cùng là glucoza. Trang: 56
18. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 0 - Ĉa sӕ glucoamylaza ÿӅu thuӝc loҥi “chӏu axit”, pHop=3,5 – 5, top= 50 – 60 C, mҩt hoҥt tính ӣ t>700C. HiӋn nay enzim này ӣ vӏ trí hàng ÿҫu vӅ hiӋu lӵc thuӹ phân tinh bӝt và các sҧn phҭm trung gian. Vì thӃ viӋc sӱ dөng các chӃ phҭm glucoamylaza tách tӯ các chӫng vi sinh vұt hoҥt ÿӝng trong sҧn xuҩt rѭӧu, bia, mҥch nha, glucoza có mӝt triӇn Yӑng, ý nghƭa vô cùng to lӟn. Nhӳng chӫng vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp glucoamylaza ÿѭӧc sӱ dөng trong công nghӋ là: Asp. Awamori , Asp. Niger, Asp. Usami, Asp. Oryzae, Endomyces sp, Endomycopsis Cápularis, Endomycopsis fibuliger, Rhizopus delemar, Rhizopus Javanicus, Rhizopus niveus, Rhizopus peka, Rhizopus tonkinensis. 6.1.4. Oligo-1,6-glucozidaza hay dextrinaza tӟi hҥn (dextrin-6-glucanhidrolaza. 3.1.1.10. EC) - Thuӹ phân các liên kӃt Į1-6 glucozit trong izomaltoza, panoza, các dextrin tӟi hҥn và có thӇ chuyӇn hoá chúng ÿӃn các loҥi ÿѭӡng có thӇ lên men ÿѭӧc. Các nòi nҩm mӕc Asp. Awamori, Asp. Usami, Asp. Oryzae sinh tәng hӧp rҩt mҥnh mӁ loҥi enzim này cho nên QӃu ÿѭӡng hoá tinh bӝt ÿã nҩu chín (trong sҧn xuҩt rѭӧu etylic) bҵng chӃ phҭm enzim nuôi cҩy tӯ các nòi vi sinh vұt này sӁ thu ÿѭӧc dӏch ÿѭӡng có khҧ năng lên men cuӕi (lên men dai) rҩt triӋt ÿӇ, góp phҫn nâng cao hiӋu suҩt gây men và hiӋu suҩt tәng thu hӗi rѭӧu. Ngoài ra enzim này cNJng có trong malt, trong mô ÿӝng vұt và cҧ nҩm men, ÿһc biӋt chúng còn có các enzim khác cùng hӑ hàng vӟi enzim này là: amylopectin-1,6- glucozidaza (amylopectin-1,6-glucanhidrolaza 3.2.1.9) và dextrin-1,6-glucozidaza (dextrin-1,6-glucanhidrolaza 3.2.1.33). Cҧ 2 enzim này thuӹ phân dextrin sâu sҳc hѫn cҧ Į và ȕ-amylaza 0 &ҧ 3 enzim kӇ trên (dextrinaza) ÿӅu hoҥt ÿӝng ӣ top= 40 C, pHop= 5,1. 6.1.5. Į-glucozidaza hay maltaza (Į-D-glucozit-glucohidrolaza 3.2.1.20 EC) Có nhiӅu loài nҩm mӕc sinh tәng hӧp ra enzim này, tác dөng thuӹ phân ÿѭӡng maltoza thành glucoza nhѭng không thuӹ phân ÿѭӧc tinh bӝt. Nhѭ vұy giӕng nhѭ dextrinaza, enzim này giúp cho quá trình lên men cuӕi chuyӇn ÿѭӡng thành rѭӧu etylic góp phҫn nâng cao hiӋu suҩt lên men. 6.1.6. Transglucozilaza (Į-1,4-glucan: D-glucoza-4-glucozil transferaza 2.4.1.3.EC) Enzim này thѭӡng tӗn tҥi song song vӟi glucoamylaza (trong chӃ phҭm nҩm mӕc Aspergillus), nó có hoҥt tính thuӹ phân và hoҥt tính vұn chuyӇn nhóm. Nghƭa là nó không nhӳng chӍ thuӹ phân maltoza thành glucoza mà còn tәng hӧp nên izomaltoza, izotrioza và panoza, tӭc là có khҧ năng chuyӇn gӕc glucoza ÿӃn gҳn nó vào phân tӱ maltoza hoһc phân tӱ glucoza bӣi liên kӃt Į1-6 glucozit ÿӇ tҥo thành các glucozit nói trên. 6ӵ có mһt cӫa enzim này trong các chӃ phҭm enzim amylaza dùng ÿӇ biӃn hình tinh Eӝt (mҥch nha, ÿѭӡng glucoza, rѭӧu etylic) là ÿLӅu không mong muӕn vì nó xúc tác sӵ Wәng hӧp lҥi các izosaccarit tӯ chính các sҧn phҭm thuӹ phân tinh bӝt, làm giҧm hiӋu suҩt ÿѭӡng hoá, dӏch thuӹ phân có vӏÿҳng không mong muӕn. Trang: 57
19. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 6.2. Proteaza. Nhóm enzim proteaza (peptit – hidrolaza 3.4) xúc tác quá trình thuӹ phân liên kӃt peptit (-CO-NH-)n trong phân tӱ protein, polypeptit ÿӃn sҧn phҭm cuӕi cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiӅu proteaza cNJng có khҧ năng thuӹ phân liên kӃt este và vұn chuyӇn axit amin. Theo hӋ thӕng phân loҥi quӕc tӃ thì nhóm enzim này ÿѭӧc chia làm 4 phân nhóm 1/ Aminopeptidaza: thuӹ phân liên kӃt peptit ӣ ÿҫu nitѫ amin ( – NH2 ) cӫa mҥch polypeptit. 2/ Cacboxypeptidaza: xúc tác thuӹ phân liên kӃt peptit ӣ ÿҫu cacbon cӫa mҥch polypeptit. Hai phân nhóm này thuӝc toҥi exo-peptitdaza (enzim ngoҥi phân) 3/ Dipeptit hidrolaza: thuӹ phân các liên kӃt peptit 4/ Proteinaza: xúc tác sӵ thuӹ phân liên kӃt peptit nӝi mҥch (endo-peptitdaza) Các proteaza khá phә biӃn ӣÿӝng, thӵc vұt và vi sinh vұt, trong ÿó ÿáng chú ý hѫn cҧ là có nhiӅu vi sinh vұt có khҧ năng sinh tәng hӧp mҥnh mӁ proteaza. Các enzim này có thӇӣ trong tӃ bào (proteaza nӝi bào) hay ÿѭӧc tiӃn vào môi trѭӡng nuôi cҩy (proteaza ngoҥi bào). Giӕng nhѭ amylaza, mӝt sӕ loҥi proteaza ÿã ÿѭӧc dân tӝc các nѭӟc châu Á, trong ÿó có ViӋt Nam sӱ dөng trong mӝt sӕ ngành sҧn xuҩt các sҧn phҭm thӵc phҭm truyӅn thӕng nhѭ: sҧn xuҩt nѭӟc mҳm và các loҥi mҳm, sҧn xuҩt tѭѫng và chao, mӝt sӕ loҥi nem, tré. Bҧng II-3 trang 131, 132 (Enzim VSV- tұp I) giӟi thiӋu mӝt sӕ loҥi VSVcó khҧ năng nuôi cҩy sinh tәng hӧp và thu nhұn enzim proteaza. Theo bҧng này ta thҩy mӝt Vӕ nòi vi khuҭn thuӝc giӕng Bacillus, xҥ khuҭn thuӝc giӕng Streptomyces, nҩm mӕc thuӝc giӕng Aspergillus, Penicillium, Rhizopus là có khҧ năng sinh tәng hӧp enzim proteaza mҥnh nhҩt. Căn cӭ vào cѫ chӃ phҧn ӭng, ÿӝ pHop, Hartley (1960) ÿã phân loҥi các proteinaza vi sinh vұt thành 4 nhóm: proteinaza-serin, P.tiol, P.kim loҥi và P.axit (Bҧng II-6 trang 156, 157 – Enzim VSV- Tұp I). Trӑng lѭӧng phân tӱ cӫa 4 nhóm này Wѭѫng ÿӕi bé: chҷng hҥn MP-serin=20000 – 27000, tuy nhiên nhóm này có mӝt sӕ có M lӟn Kѫn nhѭ enzim cӫa penicillium M = 44000. Asp. Oryzae 5038 và M = 52000, MP.kim loҥi = 33800 – 48400, MP.tiol và axit = 30000 – 40000. 9Ӆÿӝ bӅn thì P.serin bӅn trong giӟi hҥn pH rӝng, tӯ 5 – 10 ӣÿLӅu kiӋn nhiӋt ÿӝ thҩp. P.serin cӫa Bacillus.pumilus khá bӅn trong môi trѭӡng kiӅm ӣ pH=11 vүn giӳÿѭӧc 80% hoҥt ÿӝ ban ÿҫu. Ӣ nhiӋt ÿӝ 3600C nhóm này bӏ mҩt hoҥt tính nhanh chóng. Tuy nhiên các P.serin cӫa Streptomyces fradiae và Stre.reatus Oҥi bӅn nhiӋt ӣ 700C trong 30 phút chӍ Eӏ mҩt 10 -15% hoҥt tính. Các proteinaza kim loҥi kém bӅn nhҩt trong sӕ 4 nhóm này, EӅn trong phҥm vi pH = 6 – 9, nhanh chóng bӏ mҩt hoҥt tính ngoài khoҧng pH này. Ca làm tăng ÿӝ bӅn cӫa nhóm enzim này. Các proteaza-axit bӅn trong phҥm vi pHaxit = 2 – 6, trong môi trѭӡng axit chúng khá EӅn nhiӋt. Các proteaza nói chung ÿѭӧc ӭng dөng rҩt rӝng rãi trong nhiӅu lƭnh vӵc: - Trong chӃ biӃn thuӹ sҧn: khi sҧn xuҩt nѭӟc mҳm (và mӝt sӕ loҥi mҳm) thѭӡng thӡi gian chӃ biӃn thѭӡng là dài nhҩt, hiӋu suҩt thuӹ phân (ÿӝÿҥm) lҥi phө thuӝc rҩt nhiӅu vào ÿӏa phѭѫng, phѭѫng pháp gài nén, nguyên liӋu cá. Nên hiӋn nay quy trình sҧn xuҩt nѭӟc mҳm ngҳn ngày ÿã ÿѭӧc hoàn thiӋn trong ÿó sӱ dөng chӃ phҭm enzim thӵc vұt Trang: 58
20. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch (bromelain và papain) và vi sinh vұt ÿê rút ngҳn thӡi gian làm và cҧi thiӋn hѭѫng vӏ cӫa Qѭӟc mҳm. Tuy nhiên vүn còn mӝt sӕ tӗn tҥi cҫn phҧi hoàn thiӋn thêm vӅ công nghӋ. - Trong chӃ biӃn thӏt, proteaza ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ làm mӅm thӏt và tăng hѭѫng vӏ thӏt. (ngâm thӏt vào dinh dѭӥng preteinaza ӣ pH và nhiӋt ÿӝ xác ÿӏnh – phѭѫng pháp này phә biӃn và thuұn lӧi nhҩt; Tҭm hӛn hӧp làm mӅm thӏt (enzim, muӕi, bӝt ngӑt). Tiêm dung Gӏch enzim vào thӏt; tiêm dung dӏch enzim vào con vұt trѭӟc khi giӃt mә). Sӱ dөng proteinaza ÿӇ sҧn xuҩt dӏch ÿҥm: tӯ Streptomyces fradiae tách ÿѭӧc chӃ phҭm keratineza thuӹ phân ÿѭӧc keratin rҩt có giá trӏÿӇ sҧn xuҩt dӏch ÿҥm tӯ da, lông vNJ. NӃu dùng axit ÿӇ thuӹ phân sӁ mҩt ÿi hoàn toàn các axit amin chӭa lѭu huǤnh, nӃu dùng kiӅm ÿӇ thuӹ phân sӁ bӏ raxemic hoá (chuyӇn dҥng L sang D làm giҧm giá trӏ sinh hӑc cӫa axit amin). Ĉê thuӹ phân sâu sҳc và triӋt ÿӇ protein (trong nghiên cӭu, chӃ tҥo dӏch truyӅn ÿҥm y tӃ) Fҫn dùng các proteinaza có tính ÿһc hiӋu cao và tác dөng rӝng, muӕn vұy ngѭӡi ta thѭӡng dùng phӕi hӧp cҧ 3 loҥi proteinaza cӫa 3 loҥi: vi khuҭn, nҩm mӕc, thӵc vұt vӟi tӍ lӋ tәng Fӝng 1 – 2% khӕi lѭӧng protein cҫn thuӹ phân. Ѭu ÿLӇm cӫa viӋc thuӹ phân protein bӣi enzim là bҧo toàn ÿѭӧc các vitamin cӫa nguyên liӋu, không tҥo ra các sҧn phҭm phө, không làm sүm màu dӏch thuӹ phân. - Trong chӃ biӃn sӳa: ngѭӡi ta chӍ sӱ dөng các proteaza cӫa vi sinh vұt có tính chҩt Wѭѫng tӵ renin hoһc chӍ thay thӃ 25 – 50% renin. (renin là enzim làm ÿong tө sӳa ÿѭӧc Vҧn xuҩt tӯ dҥ dày bê) nhѭ các giӕng liên kӃt Aspergillus Candidus, Penicillium roqueforti, Bacillus mesentericus ÿѭӧc ӭng dөng ÿӇ sҧn xuҩt phomat. Ngoài ra có thӇ Vӱ dөng proteinaza ÿӇ thu cazein kӻ thuұt (tӯ sӳa) ÿӇ sҧn xuҩt vectri, chҩt màu, keo dán, Kѭѫng liӋu. - Trong chӃ biӃn bia và nѭӟc giҧi khát: proteinaza ÿѭӧc dùng ÿӇ làm trong bia và Qѭӟc quҧ. - Trong công nghiӋp dӋt: papain và proteinaza vi sinh vұt ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ làm sҥch Wѫ tҵm, tҭy tѫ nhân tҥo (các sӧi nhân tҥo ÿѭӧc bҵng các dung dӏch cazein, gelatin) ÿӇ sӧi ÿѭӧc bóng, dӉ nhuӝm. - Trong công nghiӋp da: proteinaza ÿѭӧc dùng ÿӇ làm mӅm, làm sҥch và tҭy lông da, làm tăng tính ÿàn hӗi, cҧi thiӋn ÿLӅu kiӋn làm viӋc, tránh ô nhiӉm môi trѭӡng. - Trong công nghiӋp xà phòng, các chҩt tҭy rӱa, mӻ phҭm: thêm enzim proteinaza trong các loҥi xà phòng diӋt khuҭn, kem dѭӥng da, xà phòng có tính tҭy rӱa cao. - Trong y hӑc: sӱ dөng nhiӅu enzim proteinaza ÿӇ sҧn xuҩt thuӕc hӛ trӧ tiêu hoá, Qҩu cao ÿӝng vұt, chӳa bӋnh nghӁn mҥch máu, tiêu viêm vӃt thѭѫng. Trang: 59
21. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 6.3. Pectinaza - Pectin là cѫ chҩt cӫa enzim pectinaza. Pectin rҩt phә biӃn trong thӵc vұt, là hӧp chҩt polime tӵ nhiên tӗn tҥi có 3 dҥng: protopectin, pectin và axit pectinic. Protopectin không tan có dҥng thӵc vұt xanh, tҥo cho rau quҧ xanh có ÿӝ cӭng nhҩt ÿӏnh, bӏ thuӹ phân bӣi axit hay nhiӋt ÿӝ, enzim sӁ chuyӇn thành pectin hoà tan (quá trình chín cӫa quҧ có thӇ gӑi là quá trình chuyӇn hoá này). Pectin là este metila cӫa axit polygalacturonic. Tính chҩt quan trӑng nhҩt cӫa pectin là dӉ tҥo gel ӣ nӗng ÿӝ dӏch ÿѭӡng cao 65% trong môi trѭӡng 1% axit. Axit pectinic là mӝt axit polygalacturonic nhѭng chӍÿѭӧc este hoá mӝt phҫn nhӓ bӣi metanol. Còn axit putic hay polypectic là axit ÿã ÿѭӧc giҧi phóng khӓi nhóm metõy (– OCH3). Muӕi tѭѫng ӭng có tên là pectinat và pectat. Liên kӃt chính trong pectin là Į1-4 glucozit. - HiӋn nay, hӋ thӕng enzim pectinaza ÿѭӧc chia thành 2 nhóm chính: hydrolaza và transeliminaza vӟi ÿһc ÿLӇm chung nhҩt là làm giҧm ÿӝ nhӟt cӫa dung dӏch pectin và làm giҧm phân tӱ lѭӧng cӫa các sҧn phҭm tҥo thành. 6.3.1. Hydrolaza: (pectihydrolaza) Thuӝc nhóm này có 2 enzim chӫ yӃu là: pectinesteraza và polygalacturonaza. - Pectinesteraza: (3.1.1.11.EC) - gӑi tҳt PE: enzim xúc tác thuӹ phân liên kӃt este trong phân tӱ pectin hoá axit pectinic ÿӇ giҧi phóng sҧn phҭm là metanol và axit polygalacturonic. PE chӍ phân cҳt các nhóm metoxy ÿӭng cҥnh nhóm – COOH tӵ do. COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 9ӏ trí tҩn công nhóm metoxy ӣ vӏ trí 5 dӉ hѫn ӣ vӏ trí 3 và 7 (2 gӕc – COOH ). Ĉӝ pHop cӫa PE thu ÿѭӧc tӯ các nguӗn khác nhau: Tӯ vi sinh vұt : 4,5 – 5,5 Tӯ thӵc vұt : 5,0 – 8,0 0 0 PE cӫa nҩm mӕc có top = 30 – 45 C, bӏ vô hoҥt ӣ t = 55 – 62 C, PE ÿѭӧc hoҥt hoá bӣi Ca2+ và Mg2+. - Polygalacturonaza (PG. 3.2.1.15.EC; poly – Į1,4 – galacturonit glucanhidrolaza) Enzim này ít gһp trong thӵc vұt, chӫ yӃu có trong vi khuҭn và nҩm mӕc. Ĉây là mӝt phӭc hӋ enzim và thѭӡng có tính ÿһc hiӋu cao ÿӕi vӟi cѫ chҩt. Dӵa vào ÿó ngѭӡi ta chia ra 4 kiӇu sau: + Polymetyl-galacturonaza (PMG - poly – Į1,4 – galacturonit – metyl este glucanhidrolaza. 3.2.1.41EC). PMG lҥi ÿѭӧc phân thành 2 nhóm nhӓ phө thuӝc vào vӏ trí phân cҳt liên kӃt Į1,4ӣ trong hay ӓ cuӕi và ÿҫu mҥch. · Endo glucozidaza polymetyl galacturonaza kiӇu I (endo – PMG – I). Ĉây là enzim có tính chҩt dӏch hoá, pectin có mӭc ÿӝ metyl hoá càng cao (nhiӅu gӕc metoxy – OCH3) Trang: 60
22. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch thì bӏ thuӹ phân càng nhanh và triӋt ÿӇ. Trong môi trѭӡng khi có mһt pectinesteraza (PE) thì enzim này thѭӡng bӏ giҧm hoҥt lӵc. Endo – PMG – I rҩt phә biӃn trong các nòi nҩm mӕc: Asp. Niger, Asp. Awamori, Botrytis cinezea, Neurispora crassa. &ѫ chӃ tác dөng nhѭ hình vӁ: COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 1 2 3 4 5 6 7 · Exo - glucozidaza polymetyl galacturonaza kiӇu III (exo – PMG – III). Ĉây là enzim có tính chҩt ÿѭӡng hoá, có khҧ năng cҳt tӯng gӕc monome axit galacturonic ra khӓi mҥch bҳt ÿҫu tӯÿҫu không khӱ có nhóm metoxy (– OCH3) &ѫ chӃ tác dөng nhѭ hình vӁ: COOCH COOCH COOCH COOH COOH COOCH COOCH 3 3 3 3 3 1 2 3 4 5 6 7 + Enzim tác dөng lên axit pectinic hay axit pectit - gӑi là polygalacturonaza (PG) FNJng ÿѭӧc phân thành 2 nhóm nhӓ: · Endo glucozidaza polygalacturonaza kiӇu II (endo – PG – II). Ĉây là enzim có tính chҩt dӏch hoá, chӍ thuӹ phân cѫ chҩt khi có mһt nhóm – COOH tӵ do. Hoҥt ÿӝ cӫa endo – PG – II tăng lên nhiӅu khi cѫ chҩt ÿѭӧc xӱ lý trѭӟc bҵng pectinesteraza (ÿӇ tҥo ra nhiӅu gӕc – COOH tӵ do). Nҩm mӕc và vi khuҭn tәng hӧp ÿѭӧc enzim này. &ѫ chӃ tác dөng nhѭ hình vӁ: COOCH3 COOH COOH COOCH3 COOCH3 COOCH3 COOH 1 2 3 4 5 6 7 · Exo - glucozidaza polygalacturonaza kiӇu IV (exo – PG – IV). Thuӹ phân các liên kӃt gҳn vӟi nhóm – COOH tӵ do ӣÿҫu hay mӕi mҥch COOH COOH COOCH3 COOH COOH COOCH3 COOH COOH Trang: 61 1 2 3 4 5 6 7 8
23. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 6.3.2. Transeliminaza (TE) Ĉây là nhóm enzim ÿѭӧc tìm ra cách ÿây chѭa lâu lҳm (khoҧng năm 1960 – 1961) bao Jӗm protopectinaza xúc tác sӵ phân cҳt araban, galactan khӓi protopectin ÿӇ tҥo thành pectin hoà tan và enzim transeliminaza phân cҳt phi thuӹ phân (không có sӵ tham gia cӫa phân tӱ H2O) pectin ÿӇ tҥo ra các gӕc galacturonic có nӕi kép giӳa nguyên tӱ C4 và C5. Phҧn ӭng xҧy ra dӉ dàng ӣ môi trѭӡng trung tính hay kiӅm yӃu. CH O CH3 O O 3 O C C O O O H H H H OH H O OH H O H H H OH H OH CH O CH3 O O 3 O C C O O O H H + H OH H OH H H H OH H OH H OH 6.3.3. 0ӝt sӕӭng dөng cӫa chӃ phҭm pectinaza. Các chӃ phҭm enzim pectinaza thѭӡng ÿѭӧc sӱ dөng trong sҧn xuҩt nѭӟc quҧ, sҧn xuҩt Uѭӧu vang, trích ly ÿông dѭӧc (sҳc thuӕc) và trong chăn nuôi. - Ӭng dөng chӃ phҭm pectinaza trong sҧn xuҩt nѭӟc quҧ: Có các mһt hàng nѭӟc quҧ trong, nѭӟc quҧÿөc, nѭӟc quҧ có thӏt quҧ, tҩt cҧÿӅu ÿѭӧc Vҧn xuҩt tӯ nѭӟc ép (chiӃt rút) cӫa quҧ. Do ÿó hiӋu quҧ thu dӏch quҧ cӫa phө thuӝc vào Trang: 62
24. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch tính chҩt cӫa nguyên liӋu quҧ (cҩu tҥo, ÿӝ chín, thành phҫn ÿӏnh tính và ÿӏnh lѭӧng cӫa pectin trong quҧ, phѭѫng pháp ép, chiӃt rút) + Khi chӃ biӃn nѭӟc quҧ trong thì chӃ phҭm pectinaza phҧi có endo và exo polygalacturonaza (endo – PGII và exo – PGIV). Enzim pectinesteraza và proteinaza. Hai loҥi enzim ÿӅu làm giҧm ÿӝ nhӟt dӏch quҧ, còn PE góp phҫn vào tác dөng cӫa enzim này, còn protein thuӹ phân protein cӫa vӓ tӃ bào thӵc vұt làm cho dӏch quҧ dӉ thoát ra, cһn và bã dӉ lҳng hѫn. Vӟi các loҥi quҧ có nhiӅu protopectin nhѭ táo, lê, әi thì chӃ phҭm không ÿѭӧc có enzim protopectinaza vì nӃu có sӁ phân huӹ protopectin làm mӅm hoá mô quҧ, Wăng ÿӝ nhӟt cӫa dӏch quҧ nên làm giҧm hiӋu suҩt lҩy nѭӟc quҧ trong. Ngoài ra, nѭӟc quҧ không ÿѭӧc phép chӭa các enzim oxy hoá (ascobatoxydaza, polyphenoloxydaza, peroxydaza) làm hao tәn vitamin C và sүm màu, biӋn pháp sӱ dөng nhiӋt (ÿun nóng) sӁ vô hoҥt hӋ enzim này. + ĈӇ thu ÿѭӧc nѭӟc quҧ vӟi hiӋu suҩt cao, ngѭӡi ta thѭӡng nghiӅn thӏt quҧ, xӱ lý bҵng chӃ phҭm enzim pectinaza, sau ÿó mӟi ÿem vҳt, ly tâm hay ép. Chҷng hҥn: nӃu xӱ lý táo nghiӅn bҵng 0,03% chӃ phҭm pectinaza (200 ÿѫn vӏ hoҥt ÿӝ) PMG (gam) sau 2 – 4 h sӁ Wăng hiӋu suҩt thu dӏch quҧ 20 – 25%. Khi ép nho mà không sӱ dөng chӃ phҭm pectinaza thì hiӋu suҩt ép là 65% nhѭng nӃu sau khi nghiӅn chà quҧ và xӱ lý bҵng 0,2% chӃ phҭm pectinaza trong 3h ӣ 450C sӁ nâng cao hiӋu suҩt ép lên 77 – 82%. Dùng pectinaza còn có tác dөng làm trong do sӵ phá huӹ hӋ keo trong nѭӟc quҧ, vӏ Fӫa quҧ tӕt hѫn và ít bӏÿөc trӣ lҥi. - Ӭng dөng chӃ phҭm pectinaza trong sҧn xuҩt rѭӧu vang: 5ѭӧu vang ÿѭӧc sҧn xuҩt tӯ các loҥi quҧ ngӑt (quҧ có ÿѭӡng): nho, táo, dâu, chuӕi, Gӭa, mѫ, mұn, anh ÿào, sѫn tra (táo mèo) bao gӗm các giai ÿRҥn chӫ yӃu: ÿLӅu chӃ dӏch quҧ lên men, lên men dӏch quҧ , xӱ lý và tàng trӳ vang. ChӃ phҭm pectinaza dùng trong công nghӋ vang ÿӇ làm tăng hiӋu suҩt thu dӏch quҧ và ÿӇ làm trong. Muӕn vұy, chӃ phҭm phҧi bҧo toàn ÿѭӧc hoҥt ÿӝ trong ÿLӅu kiӋn nӗng ÿӝ rѭӧu trung bình 10 – 12% và ÿӝ pH Kѫi axit (4 – 5). Khi xӱ lý bã nho bҵng pectinaza sӁ làm tăng hàm lѭӧng catechin trong Uѭӧu (chҩt chát). Catechin có hoҥt tính cӫa vitamin P nhѭ vұy ÿã làm tăng giá trӏ sinh hӑc Fӫa vang. Ngoài ra vang còn có ÿӝ thuҫn thөc (thành trѭӣng – ageing) nhanh hѫn, hѭѫng thѫm mҥnh hѫn, vӏ dӏu hѫn do có nhiӅu glyxezin và este. - Ӭng dөng pectinaza trong trích ly các dѭӧc liӋu ÿông y (thuӕc bҳc, thuӕc nam). Các Gѭӧc liӋu có nguӗn gӕc thӵc vұt, trong thành phҫn cӫa chúng ngoài các hoҥt chҩt thì luôn luôn có pectin. Tӯ trѭӟc ÿӃn nay ÿӇ thu nhұn ÿѭӧc các thành phҫn hoҥt chҩt trong dѭӧc liӋu (ÿӇ trӏ bӋnh cҩp thӡi (ngay lúc ÿó), ÿӇ ÿLӅu chӃ dҥng cӗn (rѭӧu), thuӕc (uӕng và xoa bóp), ÿӇÿLӅu chӃ dung dӏch thuӕc, viên nén, vien nang, ÿһc biӋt hiӋn nay ÿӇ sҧn xuҩt thuӕc tiêm và dӏch truyӅn tӯ chính các vӏ thuӕc ÿông y, các thӵc phҭm chӭc năng (fuctional food)) ngѭӡi ta dùng các phѭѫng pháp: chiӃt rút bҵng nѭӟc nhiӋt (còn gӑi là sҳc thuӕc – và ÿây là phѭѫng pháp phә biӃn nhҩt),bҵng cӗn (ngâm rѭӧu thuӕc), trích ly bҵng dung môi thích hӧp (axeton, ete, nitѫ lӓng, axeton lҥnh). Do có thành phҫn pectin nên quá trình sҳc thuӕc khó khăn, không trích ly ÿѭӧc triӋt ÿӇ hoҥt chҩt, dӏch thuӕc bӏ biӃn chҩt sau mӝt thӡi gian ngҳn. ĈӇ khҳc phөc nhӳng khó khăn này, ngѭӡi ta dùng chӃ phҭm enzim pectinaza ÿӇ phân giҧi các mô thӵc vұt ÿӇ các hoҥt chҩt ÿѭӧc giҧi phóng ra dӉ dàng và triӋt ÿӇ Trang: 63
25. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Kѫn khi sҳc thuӕc. Tuy nhiên, vì sӱ dөng cho mөc ÿích sҧn xuҩt thuӕc chӳa bӋnh nên khi dùng chӃ phҭm enzim phҧi có ÿӝ tinh khiӃt rҩt cao ÿӇ không mang theo nhӳng hoҥt chҩt lҥ vào thuӕc, phҧi có hoҥt ÿӝ cao ÿӇ chӍ dùng vӟi mӝt lѭӧng tӕi thiӇu. Có thӇ tiӃn hành theo sѫ bӝ sѫÿӗ công nghӋ sau: 'ѭӧc liӋu Làm nhӓ Trӝn enzim Thuӹ phân lҫn 1 Hãm Trӝn enzim Thuӹ phân lҫn 2 Hãm chiӃt Ĉun nóng /ӑc Cô ÿһc ĈLӅu chӍnh và pha chӃ Ĉóng chai Thanh trùng - Ӭng dөng chӃ phҭm pectinaza trong chăn nuôi: Khҭu phҫn ăn cӫa gia súc, gia cҫm thѭӡng chӭa mӝt lѭӧng thӭc ăn thô, thӭc ăn xanh nhҩt ÿӏnh (rѫm rҥ, cӓ, thân cây, cám ) trong khi ÿó ӣÿѭӡng tiêu hoá cӫa chúng lҥi thiӃu các enzim phân giҧi xenluloza, hemixenluloza, pectin. ChӍ có nhӳng ÿӝng vұt nhai lҥi có Gҥ cӓ phát triӇn ÿҫy ÿӫ (trên 6 tháng tuәi) hay gia cҫm có manh trnàg dài (ngӛng, ÿà ÿLӇu) Pӟi có hӋ vi sinh vұt sӕng cӝng sinh trong dҥ cӓ là có khҧ năng sinh ra các hӋ enzim ÿӇ giúp ÿӝng vұt tiêu hoá mӝt phҫn các chҩt dinh dѭӥng này, tuy vұy khoҧng 1/3 nhóm chҩt này không ÿѭӧc ÿӗng hoá. ĈӇ nâng cao khҧ năng tiêu hóa hҩp thө, ngѭӡi ta có thӇ thêm vào thӭc ăn chăn nuôi các chӃ phҭm enzim phân giҧi nhóm gluxit này - ÿӅu là chӃ phҭm có hoҥt tính pectinaza, xenluloza và hemixenluloza cao. + Ĉӕi vӟi các ÿӝng vұt nhai lҥi (trâu, bò, dê, cӯu, ngӵa): do có hӋ vi sinh vұt sӕng trong dҥ cӓ tham gia tích cӵc vào quá trình tiêu hoá thӭc ăn. Khi thêm chӃ phҭm enzim pectinaza và xenluloza cao ӣÿӝ pH = 6 – 7 (axit tính) sӁ có lӧi làm tăng ÿӝ tiêu hoá cӫa thӭc ăn. + Ĉӕi vӟi ngӛng và ngan (vӏt xiêm): ÿây là 2 loài gia cҫm nuôi lҩy thӏt, ÿăc biӋt là có loài ÿӇ sҧn xuҩt ra gan béo (gan nguyên liӋu sҧn xuҩt ra mһt hàng pete gan rҩt nәi tiӃng). Hai loài này có năng lӵc sinh trѭӣng rҩt cao, ngѭӡi ta cӕ gҳng nuôi ÿӇÿҥt ÿӝ tăng trӑng cao và thӡi gian ngҳn (ӣÿӝ tuәi gia cҫm non tuәi có giá trӏ thѭѫng phҭm cao). Muӕn vұy ngѭӡi ta nuôi vӛ béo bҵng cách nhӗi thӭc ăn có sӱ dөng các chӃ phҭm pectawamorin 0,04% so vӟi khҭu phҫn. 6.4. Xenluloza: - Hҵng năm có khoҧng 230 tӍ tҩn chҩt hӳu cѫÿѭӧc tәng hӧp bҵng quá trình quang hӧp ӣ thӵc vұt, trong ÿó có tӕi ÿa 70 tӍ tҩn (30%) xenluloza. Ĉây là polyme tӵ nhiên ȕ-D- glucoza ÿѭӧc nӕi vӟi nhau qua liên kӃt ȕ-D-1,4-glucan, mӭc ÿӝ polyme hoá cӫa phân tӱ xenluloza: 200 – 15000, trung bình 3000, trӑng lѭӧng phân tӱ 50.000 – 2.500.000. Xenluloza là hӧp chҩt tӵ nhiên khá bӅn, không tan trong nѭӟc, chӍ bӏ trѭѫng phӗng do hút nѭӟc, bӏ phân huӹ khi ÿun nóng vӟi kiӅm hay axit hoһc do các enzim ÿѭӧc gӑi chung là xenluloza. Trang: 64
26. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch - Theo nhӳng hiӇu biӃt hiӋn nay thì quá trình phân huӹ xenluloza nhӡ enzim ÿѭӧc thӵc hiӋn nhӡ phӭc hӋ xenluloza, bao gӗm các enzim C1, Cx và ȕ-glucosidoza. Enzim C1 có tính chҩt không ÿһc hiӋu. Dѭӟi tác dөng cӫa C1, các loҥi xenluloza bӏ hҩp thө nѭӟc, trѭѫng lên và chuҭn bӏ cho sӵ tác ÿӝng cӫa các enzim khác. NӃu tách riêng C1 cho hoҥt ÿӝng ÿӝc lұp thì tác dөng này lҥi không thҩy rõ ràng. Vì vұy ngѭӡi ta cho rҵng ÿó chӍ là Pӝt yӃu (factor), không phҧi là enzim Cx còn gӑi là enzim ȕ-1,4 glucanaza, thuӹ phân các xenluloza ngұm nѭӟc bӣi C1 nói trên (polyanhydroglucoza hydrat hoá) thành xenluloza. Chӳ x có nghƭa là enzim gӗm nhiӅu thành phҫn khác nhau và ngѭӡi ta thѭӡng chia làm 2 loҥi chính là: exo-ȕ-1,4 glucanaza và endo-ȕ-1,4 glucanaza. Exo-ȕ-1,4 glucanaza xúc tác viӋc tách liên kӃt các ÿѫn vӏ glucoza tӯ ÿҫu không khӱ (non-reducing end) cӫa chuӛi xenluloza (hình trang 122 – VSV tұp II). Endo-ȕ-1,4 glucanaza phân cҳt liên kӃt ȕ-1,4 glucozit ӣ bҩt kǤ vӏ trí nào cӫa chuӛi xenluloza. Có tác giҧ (Ogawa và Toyama, 1967) cho rҵng còn có mӝt enzim trung gian C2 giӳa C1 và Cx. Enzim này trѭӟc hӃt tác ÿӝng vào xenluloza ÿã bӏ làm trѭѫng nѭӟc bӣi C1 rӗi thuӹ phân thành các dextrin xenluloza hoà tan. Sau ÿó Cx sӁ tiӃp tөc thuӹ phân các xenlo dextrin này thành xenlobioza. ȕ-glucosidoza là enzim rҩt ÿһc hiӋu, thuӹ phân xenlobioza tthành xenlohexoza (D- glucoza) mã sӕ enzim này là: 3.2.1.21 EC. - Nguӗn enzim xenluloza: Có thӇ nói quá trình phân giҧi xenluloza bӣi vi sinh vұt là mӝt trong nhӳng chu trình quan trӑng nhҩt cӫa tӵ nhiên. Ngѭӡi ÿҫu tiên nghiên cӭu khҧ năng phân giҧi xenluloza Fӫa các vi sinh vұt kӷ khí là popov vào năm 1875, tiӃp ÿó là omelianxki. Các môi trѭӡng nghiên cӭu phân lұp vi sinh vұt loҥi này trӣ thành kinh ÿLӇn. Còn ngѭӡi ÿҫu tiên phát hiӋn khҧ năng phân giҧi xenluloza bӣi vi khuҭn hiӃu khí là G.Van Iterson vào năm 1903. Trѭӟc ÿó, hoҥt ÿӝng phân giҧi xenluloza bӣi vi sinh vұt sӕng trong dҥ cӓ cӫa các ÿӝng Yұt nhai lҥi ÿã ÿѭӧc chӭng minh (1955). ĈӃn năm 1971, ngѭӡi ta ÿã phân lұp ÿѭӧc mӝt Vӕ loài vi sinh vұt có khҧ năng phân giҧi xenluloza trong dҥ cӓ (trang 126, VSV, tұp II). Trong ÿó có 2 giai ÿRҥn nghiên cӭu kӻ hѫn cҧ là Ruminococus và R.flavefacicus. 9Ӆ sau này, rҩt nhiӅu vi sinh vұt phân giҧi xenluloza ÿѭӧc tìm thҩy trong ÿҩt, nѭӟc, phân bón hӳu cѫ. Ĉáng chú ý hѫn cҧ là viӋc ӭng dөng vi khuҭn thuӝc nhóm celludomonas vào viӋc lên men phân giҧi bã mía và rác thҧi thӵc vұt. Sѭu tұp giӕng QM (QM collection) cӫa HHTH Massachusetts cNJng có khoҧng 14000 chӫng nҩm có khҧ Qăng phân giҧi xenluloza, trong ÿó các chӫng nәi tiӃng nhѭ trichoderma viride, Sporotrichum P.ruinosum, penicllium pusillum, Aspergillus fumigatú, Asp.terreus - Ӭng dөng cӫa xenluloza: + Phá vӥ thành tӃ bào (cellwall) thӵc vұt ÿӇ nuôi cҩy các tӃ bào trên (tӃ bào không có màng) ÿӇ lai tҥo chúng vӟi nhau nhҵm tҥo giӕng thӵc vұt + Sҧn xuҩt trѭӡng glucoza thӵc phҭm, nguyên liӋu công nghiӋp hoһc nuôi cҩy nҩm men gia súc. Ӣ Nhұt, hãng Megiseika ÿã sӱ dөng Trichoderma.Konigii và hãng Kinkiyakylt ÿã sӱ Gөng T.viride nuôi cҩy theo phѭѫng pháp bӅ mһt ÿӇ sҧn xuҩt xenlulaza. Sѫ ÿӗ phân [ѭӣng thí ÿLӇm (pilot) sҧn xuҩt siro glucoza tӯ các nguӗn xenluloza phӃ liӋu nhӡ xenluloza cӫa T.viride nhѭ sau. (hình V-13 trang 164 – VSV hӑc - tұp II) Trang: 65
27. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch + Lên men ÿѭӡng chuyӇn hoá (tҥo thành bӣi sӵ thuӹ phân xenluloza do enzim) thành etanol nhiên liӋu ÿӝng cѫÿӕt trong (xe hѫi, xe máy) + Tách tinh bӝt ra khӓi hҥt và cӫ bҵng cách dùng các enzim tách tӃ bào (cell separating enzyme – CSE). Ĉây là hӋ thӕng enzim tác ÿӝng vào phҫn protopectin cӫa vӓ (hҥt, cӫ) ÿӇ giҧi phóng tinh bӝt, mӝt sӕ chӫng nҩm Rhizopus sinh tәng hӧp loҥi enzim này. + Sҧn xuҩt tә hӧp EM (Effect Microbiology – vi sinh vұt hӳu hiӋu) trong xӱ lý rác thҧi. 6.5. Saccaraza và glucooxydaza. - Saccaraza: ÿây là mӝt nhóm enzim bao gӗm: invertaza, dextranaza, levansaccaraza xúc tác thuӹ phân các liên kӃt glucozit cӫa saccaroza và mӝt vài loҥi ÿѭӡng khác. Trong Vӕ các enzim này thì invertaza (B-D-fructofaranozit – fructohidrolaza, mã sӕ 3.2.1.26 EC) là có ý nghƭa khoa hӑc và thӵc tiӉn hѫn cҧ. Enzim này rҩt phә biӃn trong nҩm men và Qҩm mӕc: Saccharomyces cerevisiae, Sach. Carlsbergensis, Sach. Pastenriabus, Aspergillus Oyae, Asp. Niger 0 Invertaza là enzim nӝi bào (endoenzyme), pHop = 4,5, top = 65 – 70 C. Invertaza ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi trong công nghӋ thӵc phҭm ÿӇ nghӏch ÿҧo ÿѭӡng chӕng hiӋn tѭӧng kӃt tinh ÿѭӡng (lҥi ÿѭӡng) trong sҧn xuҩt bánh kҽo (dung dӏch ÿѭӡng Qӗng ÿӝ 65% thì kӃt tinh nhѭng có invertaza thì ӣ nӗng ÿӝ 80% vүn không kӃt tinh), tăng ÿӝ ngӑt khi thuӹ phân ÿѭӡng saccaroza thành glucoza và fructoza, sҧn xuҩt bӝt mǤ nhân Wҥo, sҧn xuҩt dӏch ÿѭӡng y tӃ (dӏch truyӅn glucoza). - Enzim oxy hoá: glucooxydaza – catalaza. + Glucooxydaza (B-D-glucoza: O2 oxydoreductaza; 1.1.3.4 EC) là enzim oxy hoá - khӱ, chӍ tác dөng lên B-D glucoza khi có mһt oxy, oxy hoá glucoza thành gluconic và H2O2: C6H12O6 + O2 + H2O Glucooxydaza C6H12O7 + H2O2 (1) + Catalaza: mӝt enzim oxy hoá – khӱ hay ÿi cùng enzim glucooxydaza ÿӇ khӱ hoá H2O2 tiӃp tөc: H2O2 catalaza H2O + 1/2O2 (2) 7әng hӧp cҧ (1) và (2) ta có: C6H12O6 + 1/2O2 C6H12O7 (3) Trang: 66
28. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 7ӭc là cӭ 1 phân tӱ gam glucoza cҫn 0,5 ptg O2. Tính chҩt này cӫa enzim có mӝt ý nghƭa thӵc tӃ rҩt lӟn là phӭc hӋ enzim này có thӇ loҥi bӓ oxy trong môi trѭӡng phҧn ӭng, tránh ÿѭӧc sӵ oxy hoá bӣi chính oxy không khí (môi trѭӡng). Nhѭ vұy có thӇ kéo dài thӡi gian bҧo quҧn mà không cҫn phҧi tác ÿӝng cӫa biӋn pháp hút chân không (ÿóng gói chân không). Glucooxydaza có nhiӅu ӣ các loài nҩm mӕc Penicilium notatun, Pen.chrysogenum, Pen.vitale, Aspergillus.Niger. + ChӃ phҭm enzim glucooxydaza và ÿһc biӋt là nӃu dùng kӃt hӧp vӟi chӃ phҭm Catalaza có rҩt nhiӅu ӭng dөng trong thӵc tiӉn: 1) Chӕng rӍ mһt trong các bao bì kim loҥi 2) Nâng cao giá trӏ cӫa bӝt lòng trҳng trӭng (albumin): Trong albumin có mӝt Oѭӧng ÿѭӡng glucoza tӵ do 0,5%, lѭӧng ÿѭӡng này là tác nhân tham gia phҧn ӭng Maillard làm sүm màu bӝt trӭng trong thӡi gian bҧo quҧn. Có thӇ loҥi trӯ tác ÿӝng này Eҵng chӃ phҭm enzim glucooxydaza nhѭ trên. 3) Bҧo quҧn bӝt sӳa, ÿӗ cӭng không có rѭӧu, cà phê, dҫu mӥ, phomat, ÿӗ hӝp. 4) Giӳ tѭѫi rau quҧ trѭӟc khi dҩm chín nhѭ: chuӕi, cà chua, táo, Muӕn vұy ngѭӡi ta gói enzim cùng vӟi glucoza, chҩt ÿӝn rӗi cho vào giӳa khӕi quҧ tѭѫi ÿang bҧo quҧn kín. Enzim sӁ loҥi trӯ oxy trong môi trѭӡng bҧo quҧn ÿӇ giӳ cho quҧ tѭѫi lâu. 5) TiӃn hành các phân tích hoá sinh chҭn ÿoán bӋnh nhѭ: phân tích ÿѭӡng trong huyӃt, nѭӟc tiӇu (bӋnh tiӇu ÿѭӡng, tăng, hҥÿѭӡng huyӃt). Trang: 67
29. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Chѭѫng 7: PHѬѪNG PHÁP XÁC ĈӎNH HOҤT ĈӜ MӜT SÔ LOҤI ENZIM (Copfacto: chҩt phӕi hӧp hay chҩt cӝng tác cӫa enzim DEAE – celluloza: diethylamino – athylcelulose) 7.1. Ĉѫn vӏÿo hoҥt ÿӝ: 0ӭc ÿӝ hoҥt ÿӝng cӫa enzim trong chӃ phҭm là thông tin quan trӑng vӅ lѭӧng enzim trong ÿӕi tѭӧng nghiên cӭu, vì rҵng trong nhӳng ÿLӅu kiӋn xác ÿӏnh, tӕc ÿӝ phҧn ӭng enzim tӍ lӋ vӟi lѭӧng enzim trong hӛn hӧp phҧn ӭng. Lѭӧng enzim theo quy ѭӟc quӕc tӃ ÿѭӧc biӇu diӉn bҵng ÿѫn vӏ enzim: Ĉѫn vӏ tiêu chuҭn enzim là lѭӧng enzim có khҧ năng xúc tác chuyӇn hóa 1 micro mol Fѫ chҩt sau 1 phút ӣ nhӳng ÿLӅu kiӋn xác ÿӏnh cho trѭӟc - Trong trѭӡng hӧp enzim chӍ phân giҧi mӝt sӕ liên kӃt cӫa phân tӱ cѫ chҩt (ví dө proteinaza vӟi cѫ chҩt protein, amilaza vӟi cѫ chҩt tinh bӝt) thì ÿѫn vӏ hoҥt ÿӝ tiêu chuҭn Fӫa enzim không tính micromol cѫ chҩt bӏ chuyӇn hoá mà tính bҵng micromol ÿѭѫng Oѭӧng cӫa các nhóm tѭѫng ӭng ÿѭӧc tҥo thành. Tӭc là tính theo sӕ liên kӃt (peptit hay glucozit) bӏ phân giҧi. A + B C + D - Trong trѭӡng hӧp phҧn ӭng giӳa 2 loҥi phân tӱ theo kiӇu thì ÿѫn vӏ enzim là lѭӧng enzim xúc tác chuyӇn hóa 1 micromol cѫ chҩt A hoһc B, hoһc 2 micromol cѫ chҩt A (hoһc B) nӃu A=B sau 1 phút. - Khi xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim trong pha lӓng (dӏch thӇ) thì tính sӕÿѫn vӏ enzim trong 100 ml. - &ѫ chҩt dùng các ÿѫn vӏ dүn xuҩt cӫa ÿѫn vӏÿӇ biӇu diӉn: mili ÿѫn vӏ, kilô ÿѫn vӏ. - Trong quá trình tách và làm sҥch (tinh chӃ) enzim thì ÿӇÿánh giá hiӋu quҧ cӫa quá trình này, ngѭӡi ta dùng ÿѫn vӏ hoҥt riêng: ÿó là sӕÿѫn vӏ enzim tính trên 1 mg protein. Ĉѫn vӏ này ÿánh giá mӭc ÿӝ thuҫn khiӃt cӫa enzim. - 1Ӄu biӃt chính xác trӑng lѭӧng phân tӱ cӫa enzim thì có thӇ xác ÿӏnh ÿѭӧc hoҥt ÿӝ phân tӱ cӫa nó: là sӕ phân tӱ cѫ chҩt (hoһc sӕ ÿѭѫng lѭӧng các nhóm tѭѫng ӭng) bӏ chuyӇn hoá dѭӟi tác dөng cӫa 1 phân tӱ enzim sau 1 phút. - 1Ӄu biӃt ÿѭӧc sӕ trung tâm hoҥt ÿӝng trong phân tӱ enzim có thӇ biӃt ÿѭӧc hoҥt ÿӝ cӫa trung tâm xúc tác. Ĉó là sӕ phân tӱ cѫ chҩt bӏ chuyӇn hoá do 1 trung tâm xúc tác cӫa enzim sau 1 phút. Nhѭ vұy nӃu enzim chӍ có mӝt trung tâm xúc tác thì ÿҥi lѭӧng này trùng vӟi hoҥt ÿӝ phân tӱ enzim. - 1ӗng ÿӝ enzim trong dung dӏch ÿѭӧc biӇu diӉn bҵng sӕÿѫn vӏ hoҥt ÿӝng trong 1 ml. - Nhӳng ÿLӅu cҫn lѭu ý khi xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim: + Bҧn chҩt các enzim là protein nên thѭӡng không bӅn vӳng, rҩt nhҥy cҧm vӟi các tác nhân lý, hoá. Vì vұy khi làm thí nghiӋm vӟi enzim cҫn tránh các yӃu tӕ có thӇ gây Trang: 68
30. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch biӃn tính vô hoҥt enzim nhѭ: t0 cao, pH quá axit, quá kiӅm, kim loҥi nһng và muӕi cӫa chúng tránh tҥo bӑt trong dung dӏch vì mӝt sӕ enzim có thӇ bӏ kìm hãm trên bӅ mһt phân chia pha. + Các ÿLӅu kiӋn (thông sӕ) phҧn ӭng (t0, pH, áp suҩt ) phҧi ӣ trong giӟi hҥn enzim có thӇ tӗn tҥi bӅn vӳng và ÿѭӧc giӳ cӕÿӏnh trong suӕt thӡi gian phҧn ӭng. Muӕn Yұy phҧi tiӃn hành phҧn ӭng trong dung dӏch có pH xác ÿӏnh, bình phҧn ӭng phҧi ÿһt trong máy siêu әn nhiӋt, các chҩt phҧn ӭng (cѫ chҩt, cofacto ) phҧi có nhiӋt ÿӝ cӫa bình phҧn ӭng trѭӟc khi nҥp vào. + Phҧn ӭng enzim ÿѭӧc tiӃn hành trong ÿLӅu kiӋn dѭ cѫ chҩt và cofacto. Cҫn tính trѭӟc ÿӇ sao cho khi kӃt thúc phҧn ӭng chӍ cô ÿӝ 20% cѫ chҩt ban ÿҫu bӏ chuyӇn hoá. trѭӟc ÿó cҫn xác ÿӏnh nӗng ÿӝ cѫ chҩt thích hӧp cho phҧn ӭng bҵng các thí nghiӋm qui hoҥch ÿӝng. + Thӡi gian xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ không nên quá lâu, thѭӡng trong khoҧng 5 – 30 phút. 7ӕt nhҩt là xác ÿӏnh tӕc ÿӝ phҧn ӭng ӣ phút ÿҫu tiên (30 – 60s) vì tӕc ÿӝ phҧn ӭng әn ÿӏnh enzim chѭa bӏ các tác ÿӝng ҧnh hѭӣng nhiӅu ÿӃn hoҥt ÿӝ. Trong mӝt sӕ trѭӡng hӧp QӃu hoҥt ÿӝ enzim quá thҩp hay cҫn nghiên cӭu ҧnh hѭӣng cӫa mӝt sӕ yӃu tӕ hoá hӑc, hoá sinh (kim loҥi, gӕc axit, bazѫ ) cҫn phҧi ӫ enzim vӟi cѫ chҩt có yӃu tӕ khҧo sát trong thӡi gian ÿӫ lâu (>1h). + Khi xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim, bên cҥnh mүu thí nghiӋm (enzim tác dөng vӟi cѫ chҩt) cҫn làm mүu kiӇm tra (kiӇm chӭng, mүu trҳng) trong ÿó enzim ÿã bӏ mҩt hoҥt ÿӝng (hoһc không có enzim) trѭӟc khi tiӃp xúc vӟi cѫ chҩt. Mүu này cNJng thӵc hiӋn giӕng mүu thí nghiӋm nhѭng chӍ khác là phҧi vô hoҥt (ÿình chӍ hoҥt ÿӝ) enzim hoһc là không thêm enzim. Hoҥt ÿӝ enzim ÿѭӧc tính bҵng hiӋu sӕ lѭӧng cѫ chҩt (hay sҧn phҭm phҧn ӭng) giӳa mүu thí nghiӋm và kiӇm tra. 7.2. Các phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim: Có thӇ phân chia thành 2 loҥi phѭѫng pháp: liên tөc và gián ÿRҥn. - Phѭѫng pháp liên tөc: sӱ dөng máy móc, thiӃt bӏÿһc biӋt hoҥt ÿӝng tӵÿӝng liên tөc (chuҭn ÿӝ, so sánh, ÿo ÿҥc) vӟi cѫ cҩu tӵÿӝng ghi lҥi liên tөc sӵ biӃn ÿәi cӫa các chҩt và các thông sӕ phҧn ӭng (hiӇn thӏ bҵng bҧng, biӇu, ÿӗ thӏ, biӇu ÿӗ, enzim ÿӗ ) trong suӕt thӡi gian tác dөng cӫa enzim. Nhѭ vұy phѭѫng pháp này có nhiӅu ѭu ÿLӇm, hoàn toàn tӵÿӝng, có kӃt quҧ ngay, cùng Pӝt lúc có thӇ có nhiӅu mүu theo mӝt chѭѫng trình ÿӏnh sҹn. Ĉây là xu hѭӟng và thӵc tiӉn hiӋn nay vӟi công nghӋ cao (high – tech) - Phѭѫng pháp gián ÿRҥn: cho enzim tác dөng vӟi cѫ chҩt, sau nhӳng khoҧng thӡi gian nhҩt ÿӏnh thì lҩy mүu phҧn ӭng ÿӇ phân tích kӃt quҧ. Trang: 69
31. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch Có thӇ gӑi phѭѫng pháp này là phѭѫng pháp cәÿLӇn nhѭng hiӋn nay vүn còn ÿѭӧc sӱ Gөng phә biӃn trѭѫng nghiên cӭu thăm dò, sѫ bӝ, thí nghiӋm ÿҥi cѭѫng, ÿӏnh tính. ChӍ có Pӝt sӕ ít thao tác vӟi enzim tinh khiӃt ÿѭӧc xem là hiӋn ÿҥi. Sau ÿây ta xem xét mӝt sӕ phѭѫng pháp cө thӇ. 7.2.1. Phѭѫng pháp ÿo ÿӝ nhӟt: Thѭӡng dùng cѫ chҩt cӫa enzim có ÿӝ nhӟt lӟn hѫn (hoһc nhӓ hѫn) sҧn phҭm phân huӹ cӫa nó. Sӵ biӃn ÿәi ÿӝ nhӟt này là thѭӟc ÿo hoҥt ÿӝ enzim. Phѭѫng pháp này thѭӡng dùng ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim thuӹ phân cho amylaza, proteinaza. 7.2.2. Phѭѫng pháp phân cӵc kӃ: Thѭӡng dùng khi cѫ chҩt cӫa enzim hoһc sҧn phҭm phân giҧi cӫa nó có khҧ năng làm quay mһt phҷng ánh sáng phân cӵc và góc quay riêng cӫa chúng có khác nhau. Ngѭӡi ta thѭӡng dùng phѭѫng pháp này ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ cӫa saccaraza. Cѫ chҩt cӫa enzim này là ÿѭӡng saccaroza có góc quay riêng là +66,50 (phía phҧi). Sҧn phҭm thuӹ phân cӫa nó là glucoza (góc quay riêng +52,50) và fructoza (góc quay riêng là -92,40 - phía trái). Khi enzim tác dөng lên saccaroza theo mӭc ÿӝ thuӹ phân mà góc quay tәng cӝng giҧm dҫn và chuyӇn tӯ phҧi sang trái. Ĉây là phҧn ӭng nghӏch ÿҧo ÿѭӡng rҩt kinh ÿLӇn trong nghiên Fӭu ÿӝng hӑc phҧn ӭng, ÿѭӡng tҥo ra gӑi là ÿѭѫng nghӏch ÿҧo (tӯ phҧi sang trái mһt phҷng ánh sáng phân cӵc). Tác nhân xúc tác thông thѭӡng (không phҧi enzim) là axit vô Fѫ (HCl, H2SO4). 7.2.3. Phѭѫng pháp áp kӃ: Ĉѭӧc dùng khi phҧn ӭng enzim tҥo thành hay hҩp thө khí, chҷng hҥn các loҥi phҧn ӭng oxy hoá có sӵ tham gia cӫa phân tӱ oxy (oxy hoá hiӃu khí), decacboxy hoá, deamin hoá (loҥi CO2, NH3). Ngoài ra có thӇ dùng phѭѫng pháp này ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ cӫa enzim trong quá trình phҧn ӭng không trӵc tiӃp làm biӃn ÿәi thӇ tích nhѭng kho thông qua các phҧn ӭng trung gian tiӃp theo (thӇ hiӋn gián tiӃp hoҥt ÿӝng cӫa enzim và do ÿó thӇ hiӋn hoҥt ÿӝ cӫa nó) lҥi tҥo thành hoһc hҩp thө khí. Ví dө: - Các phҧn ӭng tҥo axit hӳu cѫ do enzim oxy hoá khӱ lipaza xúc tác có thӇ dung dӏch ÿӋm bicacbonat (HCO -) ÿӇ tҥo thành+ CO -(theo phҧn ӭng 3 H + HCO23 H2O + CO2) - Các phҧn ӭng deamin hoá dѭӟi tác dөng cӫa enzim peptithydrolaza, sau phҧn ӭng cho tác dөng vӟi axit nitѫUѫÿӇ tҥo thành N 2 (NH3 + HNO3 + - Các phҧn ӭng lên men cәÿLӇn (yӃm khíHNO và hiӃu khí) có N)thӇ thӵc hiӋn trong bình Enron, hҩp thө CO2 bҵng dung dӏch BaSO4. 7.2.4. Phѭѫng pháp phә quang kӃ: Thѭӡng dùng ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ các enzim mà cѫ chҩt, coenzim hoһc sҧn phҭm phҧn ӭng có khҧ năng hҩp thө ánh sáng khác nhau ӣ nhӳng bѭӟc sóng xác ÿӏnh. Sӵ biӃn ÿәi ÿӝ Kҩp thөӣ bѭӟc sóng ҩy trong quá trình phҧn ӭnh là ÿo hoҥt ÿӝ enzim. Phѭѫng pháp này ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi ÿӇ nghiên cӭu các enzim thuӝc nhóm oxy hoá khӱ oxydoreductaza, chҷng hҥn: - Các ÿehydrogenaza vӟi coenzim NAD+ hoһc NADP+. Tӕc ÿӝ phҧn ӭng enzim ÿѭӧc xác ÿӏnh theo mӭc ÿӝ khӱ hoһc oxy hoá coenzim cӫa chúng. Dҥng khӱ NADH, NADPH và dҥng oxy hoá cӫa các coenzim này khác nhau rõ rӋt vӅ khҧ năng hҩp thөӣ bѭӟc sóng Trang: 70
32. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 340 nm, sӵ biӃn ÿәi này phҧn ánh mӭc ÿӝ chuyӇn hoá giӳa 2 dҥng và cNJng chính là tӕc ÿӝ và hoҥt ÿӝ phҧn ӭng enzim. - Enzim tyrosunaza xúc tác sӵ oxy hoá các hӧp chҩt phenol thành các quinon. Phҧn ӭng này làm tăng ÿӝ hҩp thө ӣ bѭӟc sóng 280 nm. Ĉây là phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ tyrosinaza (gӑi là phѭѫng pháp A hay phѭѫng pháp tyrosin 280). Tѭѫng tӵ nhѭ trên, EPPO xúc tác oxy hoá cѫ chҩt pyrpcatechin. Phѭѫng pháp này chӍ cҫn lѭӧng nguyên liӋu nghiên cӭu rҩt ít, lҥi có ÿӝ nhҥy cao, cho phép xác ÿӏnh nhanh chóng, chính xác hoҥt ÿӝ enzim. Vì vұy ÿây là mӝt trong nhӳng phѭѫng pháp ÿѭӧc sӱ dөng phә biӃn nhҩt ÿӇ nghiên cӭu enzim hӑc. Thұm chí có trѭӡng Kӧp phҧn ӭng enzim không làm biӃn ÿәi rõ rӋt quang phә hҩp thө thì mӝt tác nhân khác (enzim hay mӝt tác nhân khác) tác dөng làm sҧn phҭm pҧhm ӭng ÿӇ thay ÿәi sӵ hҩp thө. 7.2.5. Phѭѫng pháp chuҭn ÿӝ liên tөc: Ĉѭӧc dùng ÿӇ nghiên cӭu các phҧn ӭng enzim mà kӃt quҧ cӫa nó tҥo thành axit hoһc bazѫ. Lúc ÿó dùng thiӃt bӏ tӵÿӝng thêm kiӅm hoһc axit vào ÿӇ giӳ pH môi trѭӡng phҧn ӭng cӕÿӏnh, ÿӗng thӡi tӵÿӝng ghi ÿѭӡng biӇu diӉn lѭӧng kiӅm hoһc axit ÿã tiêu tӕn vào phҧn ӭng trung hoà. Lѭu lѭӧng kiӅm hoһc axit này phҧn ánh tӕc ÿӝ phҧn ӭng enzim. Phѭѫng pháp này có thӇÿѭӧc mô tҧ mӣ rӝng ra ÿӇ nghiên cӭu các ÿӕi tѭӧng khác nhѭng trên nguyên tҳc liên tөc ÿӏnh lѭӧng (sҧn phҭm tҥo thành hay lѭӧng cѫ chҩt tiêu hao), chҷng hҥn gián tiӃp ÿo thӃ oxy hoá khӱ vӟi ÿLӋn cӵc tiêu chuҭn khi nghiên cӭu các enzim oxy hoá. 7.2.6. Phѭѫng pháp sҳc ký: Ĉây là phѭѫng pháp hiӋn ÿҥi, hiӋn nay ÿѭӧc sӱ dөng rҩt nhiӅu và trong nhiӅu trѭӡng Kӧp dùng ÿӇ tinh chӃ enzim. Tҩt cҧ các phѭѫng pháp sҳc ký ÿӅu có thӇ áp dөng ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim. Tӯ phѭѫng pháp lâu ÿӡi nhҩt nhѭ sҳc ký giҩy, sҳc ký trao ÿәi ion cho ÿӃn các phѭѫng pháp hiӋn ÿҥi nhѭ sҳc ký lӓng cao áp, sҳc ký khí kӃt hӧp vӟi các phѭѫng pháp phân tích hiӋn ÿҥi khác (phân tích axit ami tӵÿӝng, cӝng hѭӣng tӯ hҥt nhân, cӵc phә). Lѭӧng enzim và cѫ chҩt cNJng nhѭ sҧn phҭm phҧn ánh rҩt ít cNJng cho kӃt quҧ chính xác, nhanh chóng. 7.2.7. Phѭѫng pháp hoá hӑc: Dùng các phҧn ӭng hoá hӑc khác nhau ÿӇ ÿӏnh lѭӧng cѫ chҩt bӏ hao hөt hoһc sҧn phҭm phҧn ӭng tҥo thành dѭӟi tác dөng cӫa enzim. Các phҧn ӭng này thuӝc loҥi atӑ màu ÿһc trѭng, tҥo màu vӟi thuӕc thӱÿһc trѭng, nói chung là mӝt dҩu hiӋu ÿӇ nói lên mӭc ÿӝ hay thӡi ÿLӇm kӃt thúc phҧn ӭng. (ví dөÿLӇm tѭѫng ÿѭѫng khi ÿӏnh phân axit – bazѫ ÿѭӧc xác ÿӏnh bӣi sӵÿәi màu fenolftalein, quì tím ) Trong tҩt cҧ các phѭѫng pháp vӯa nêu, tuǤ theo ÿLӅu kiӋn, yêu ccҫu nghiên cӭu thӵc tӃ mà quyӃt ÿӏnh phѭѫng thӭc tiӃn hành (chҷng hҥn tiӃn hành trong ÿLӅu kiӋn thӡi gian nhѭ nhau, hay nӗng ÿӝ enzim, nӗng ÿӝ cѫ chҩt không ÿәi ) qui hoҥch thӵc nghiӋm ÿӇ xác ÿӏnh các thông sӕ tӕi ѭu. 7.3. Chuҭn bӏ dӏch chiӃt enzim ÿӇ xác ÿӏnh hoҥWÿӝ. ChӃ phҭm enzim có thӇӣ dҥng rҳn, lӓng, bao gӗm giá thӇ (cѫ chҩt, chҩt ÿӝn, hҥt cӕc) các bӝ phұn khác nhau cӫa cѫ thӇ sinh vұt sinh enzim (mô, tӃ bào, khuҭn ty, bào tӱ ) và Trang: 71
33. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch môi trѭӡng sinh tәng hӧp enzim (chӫ yӃu là nѭӟc) có thӇ chӭa cҧ enzim trong ÿó. Trong quá trình nuôi cҩy, nҭy mҫm, enzim có thӇ tiӃn hành vào môi trѭӡng (enzim ngoҥi bào) hoһc enzim tӗn tҥi trong tә chӭc cѫ thӇ sinh vұt (mô, tӃ bào), vì vұy phҧi cҫn xӱ lý nhҵm Oҩy enzim ÿӇ xác ÿӏnh. -9ӟi enzim ngoҥi bào: + NӃu quá trình nuôi cҩy hay tích luӻ enzim bҵng phѭѫng pháp bӅ sâu trong môi trѭӡng lӓng. Sau khi lҩy mүu xong cҫn làm sҥch nhanh chóng xuӕng 00C rӗi ly tâm tӕc ÿӝ cao 5000 – 6000 vòng/phút ÿӇ thu ÿѭӧc dung dӏch trong suӕt. + NӃu quá trình nuôi cҩy hay tích luӻ enzim bҵng phѭѫng pháp bӅ mһt trên môi trѭӡng Uҳn (hay hҥt cӕc) thì lҩy mүu 10 – 20 gam, chiӃt rút bҵng dung dӏch ÿӋm tѭѫng ӭng vӟi pH xác ÿӏnh trong ÿLӅu kiӋn lҥnh (00C) ÿӇ enzim khkông bӏ biӃn tính hay giҧm hoҥt tính, Oѭӧng dung dӏch này khoҧng 200 ml (gҩp 10 – 20 lҫn chӃ phҭm). Lӑc qua phӉu hay ly tâm vҳt ÿӇ thu ÿѭӧc dung dӏch trong suӕt. -9ӟi enzim nӝi bào: Phҧi phá vӥ tӃ bào ÿӇ giҧi phóng enzim tӵ do bҵng nhiӅu phѭѫng pháp: + Phѭѫng pháp cѫ hӑc: phә biӃn nhҩt là nghiӅn thông thѭӡng (trong cӕi sӭ, thuӹ tinh, máy nghiӅn quay tay, máy nghiӅn có ÿӝng cѫ), nghiӅn vӟi cát, vөn thuӹ tinh. + Phѭѫng pháp vұt lý: dùng sóng siêu âm ÿӇ phá vӥ cҩu trúc tӃ bào, mô. + Phѭѫng pháp hoá sinh: dùng enzim thích hӧp (xenluloza, pectinaza) ÿӇ phân huӹ màng tӃ bào, mô ÿӇ giҧi phóng enzim (trѭӟc hӃt có thӇ nhұn ÿѭӧc tӃ bào trҫn rҩt có giá trӏ trong nghiên cӭu tӃ bào hӑc, enzim hӑc). TiӃp ÿó có thӇ dùng các phѭѫng pháp chiӃt rút thích hӧp (dùng dung dӏch ÿӋm, dùng (NH4)2SO4, axeton ) và hӑc ÿӇ nhұn ÿѭӧc dung dӏch trong suӕt Trong trѭӡng hӧp sau khi xác ÿӏnh xong hoҥt ÿӝ cӫa dӏch chiӃt cҫn tính toán hoҥt ÿӝ Fӫa chӃ phҭm ban ÿҫu (qui vӅ hàm lѭӧng chҩt khô tuyӋt ÿӕi) Trang: 72
34. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch TÀI LIӊU THAM KHҦO 1- NguyӉn Trӑng Cҭn (chӫ biên), NguyӉn Thӏ HiӅn, Ĉӛ Thӏ Giang, Trҫn Thӏ HuyӅn, Công nghӋ emzim, NXB Nông NghiӋp TPHCM, 1998. 2- NguyӉn Lân DNJng, Phҥm Thӏ Trân Châu, NguyӉn Thanh HiӅn, Lê Ĉình Lѭѫng, Ĉoàn Xuân Mѭӧn, Phҥm Văn Ty - Mӝt sӕ phѭѫng pháp nghiên cӭu vi sinh vұt Kӑc, tұp III – NXBKH và kӻ thuұt, Hà Nӝi 1987. 3- Lê ngӑc tú (chӫ biên) và các tác giҧ - hoá sinh công nghiӋp NXBĈH và THCN 1977. 4- Lê ngӑc tú (chӫ biên) và các tác giҧ - enzym vi sinh vұt, tұp I, II - NXBKH và kӻ thuұt, Hà Nӝi 1982. Trang: 73
35. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 0өc lөc Chѭѫng 1: NGUYÊN LIӊU THU ENZIM VÀ PHÂN BӔ 3 1.1. Nguӗn ÿӝng vұt: 3 1.2. Nguӗn gӕc thӵc vұt: 4 1.3. Nguӗn vi sinh vұt: 4 Chѭѫng 2: 6ҦN XUҨT CÁC CHӂ PHҬM ENZIM TӮ VI SINH VҰT 5 2.1. ĈLӅu hoà quá trình sinh tәng hӧp enzim trong môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt 5 2.2. TuyӇn chӑn và cҧi tҥo giӕng vi sinh vұt cho enzim có hoҥt lӵc cao: 11 2.3. Phѭѫng pháp bҧ o quҧn giӕng vi sinh vұt : 12 2.4. Môi trѭӡng nuôi cҩy vi sinh vұt sinh tәng hӧp enzim: 13 2.5. Các phѭѫng pháp nuôi cҩy vi sinh vұt: 17 2.6. Tách và làm sҥch chӃ phҭm enzym : 22 Chѭѫng 3: .Ӻ THUҰT SҦN XUҨT CHӂ PHҬM TӮ HҤT CӔC NҬY MҪM (MALT) 24 3.1. Nguyên liӋu ÿҥi mҥch: 24 3.2. Làm sҥch và phân loҥi hҥt: 25 3.3. 5ӱa, sát trùng và ngâm hҥt: 26 3.4. 1ҭy mҫm: 28 3.5. 6ҩy malt: 34 3.6. Tách mҫm, rӉ, bҧo quҧn malt: 37 3.7. .ӻ thuұt sҧn xuҩt mӝt sӕ loҥi malt ÿһc biӋt: 38 Chѭѫng 4: 6ҦN XUҨT ENZIM TӮ THӴC VҰT 40 4.1. 6ҧn xuҩt ureaza tӯÿұu rӵa: 40 4.2. Thu nhұn bromelain tӯ dӭa: 40 Chѭѫng 5: ENZIM CӔĈӎNH 44 5.1. Giӟi thiӋu chung: 44 5.2. 0ӝt sӕ phѭѫng pháp chӫ yӃu chӃ tҥo enzim cӕÿӏnh : 44 5.3. 0ӝt sӕ liên kӃt trong viӋc cӕÿӏnh enzim. 45 5.4. Ҧnh hѭӣng cӫa sӵ cӕÿӏnh ÿӃn hoҥttính cӫa enzim 46 5.5. Các reactor chӭa enzim cӕÿӏnh: 48 5.6. . Sӱ dөng enzim cӕÿӏnh trong y hӑc và trong công nghiӋp: 50 Chѭѫng 6: GIӞI THIӊU MӜT SӔ LOҤI ENZIM CHӪ YӂU VÀ KHҦ NĂNG ӬNG 'ӨNG 55 6.1. Amylaza 55 6.2. Proteaza. 58 6.3. Pectinaza 60 6.4. Xenluloza: 64 6.5. Saccaraza và glucooxydaza. 66 Chѭѫng 7: PHѬѪNG PHÁP XÁC ĈӎNH HOҤT ĈӜ MӜT SÔ LOҤI ENZIM 68 7.1. Ĉѫn vӏÿo hoҥt ÿӝ: 68 Trang: 74
36. CÔNG NGHӊ ENZIM GVC: Ths. Trҫn Xuân Ngҥch 7.2. Các phѭѫng pháp xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ enzim: 69 7.3. Chuҭn bӏ dӏch chiӃt enzim ÿӇ xác ÿӏnh hoҥWÿӝ 71 Trang: 75