›
›

Báo cáo Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

docx 61 trang vanle 6300
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Báo cáo Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • docxbao_cao_thi_nghiem_vi_sinh_vat_hoc_thuc_pham.docx

Nội dung text: Báo cáo Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm

  1. Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh Khoa Kỹ Thuật Hoá Học Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm BÁO CÁO THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT HỌC THỰC PHẨM GVHD: NGUYỄN THỊ THANH HƯƠNG SV: NGUYỄN THỊ KIM TIẾN_61103601  Tp HCM, 11/2013 
  2. MỤC LỤC DANH MỤC HÌNH ii DANH MỤC BẢNG iii BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT 1 BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP 5 BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT 11 BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT NÓI CHUNG TRÊN 15 BÀI 5: QUAN SÁT NẤM MEN 24 BÀI 6: QUAN SÁT VI KHUẨN 31 BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC 40 BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HOÁ CARBONHYDRATE 49 BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG 55
  3. DANH MỤC HÌNH Hình 1. Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn 5 Hình 2. Mẫu cấy ziczac và cấy song song 6 Hình 3. Cấy gạc trên môi trường đĩa petri 6 Hình 4. Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch 7 Hình 5. Các kiểu cấy trên đĩa thạch 7 Hình 6. Trình tự cấy truyền 8 Hình 7. Qui trình pha loãng mẫu 9 Hình 8. Trình tự pha loãng mẫu 12 Hình 9. Các kiểu cấy ria 13 Hình 10. Cấu tạo kính hiển vi quang học 17 Hình 11. Cách làm tiêu bản giọt ép 19 Hình 12, cách làm tiêu bản giọt treo 19 Hình 13. Nấm men (trái) Bacillus Subtilis (phải) dưới kính hiển vi 21 Hình 14. Vi khuẩn Lactose Bacillus 21 Hình 15. Dưa cải muối chua, nem chua 23 Hình 16.chế phẩm vi sinh từ Bacillus Subtilis 23 Hình 17.Hình vẽ nấm men 24 Hình 18. Cách pha loãng mẫu và hình ảnh buồng đếm 27 Hình 19: Cấu tạo buồng đếm và các vùng đếm 28 Hình 20. ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia 30 Hình 21. Các bước nhuộm Gram VSV 33 Hình 22. Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic 34 Hình 23. Mẫu nhuộm Gram Bacillus Subtilis, E.coli, Lactic 35 Hình 24. Hình ảnh quan sát được 36 Hình 25. Sản phẩm thạch dừa 37 Hình 26. Probiotic với vai trò hang rào phòng ngự bảo vệ niêm mạc ruột 39 Hình 27. Chao từ nấm Mucor 43 Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | ii
  4. Hình 28. Phomat Camembert 44 Hình 29. Tempeh và món ăn làm từ nó 45 Hình 30. Nước tương lên men tự nhiên 46 Hình 31. Nấm mốc tân công nông sản, trái cây 49 Hình 32. Mẫu nấm men hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) so với mẫu chuẩn 52 Hình 33. Mẫu hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) 52 Hình 34. Mẫu Lacto bacillus hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) 53 Hình 35. Mẫu A.oryzae hô hấp hiếu khí (bện trái) và yếm khí (bên phải) 54 Hình 36. Mẫu trước và sau khi nhỏ luygol 54 Hình 37. Nấm men trong môi trường Sacarose-lactose-maltose-glucose (trái). 56 Hình 38. L.acidophillus trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L 57 Hình 39. Acetobacterxylium trong trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L 57 DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Kết quả thí nghiệm tìm số tế bào/1ml mẫu 14 Bảng 2. Nhóm các phương pháp định lượng vi sinh vật 14 Bảng 3. Cấu tạo kính hiển vi quang học 16 Bảng 4. So sánh tiêu bản giọt ép và giọt treo 18 Bảng 5. Kết quả quan sát nấm men, vi khuẩn 20 Bảng 6.Tỷ lệ nảy chồi của nấm men 26 Bảng 7. Tỷ lệ chết của nấm men 27 Bảng 8. Số VSV trong ba vùng quan sát và tổng số VSV TB trong 1ml mẫu 29 Bảng 9. So sánh vi sinh vật Gram (-) và (+) 31 Bảng 10. Kết quả quan sát sống các mẫu VSV 34 Bảng 11. Kết quả quan sát sau khi nhuộm Gram 35 Bảng 12. Kết quả quan sát nhuộm màng nhày 35 Bảng 13. So sánh hô hấp và lên men 50 Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | iii
  5. BÀI 1: MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT I. Mục đích thí nghiệm - Tạo môi trường thuần khiết để nuôi cấy vi sinh vật. - Biết cách chuẩn bị dụng cụ cần cho quá trình nuôi cấy - Biết cách bao gói đĩa petri, pipet, ống nghiệm và vô khuẩn chúng để đảm bảo môi trường đủ sách cho việc nuôi cấy. II. Sơ lược lí thuyết 1. Định nghĩa Môi trường dinh dưỡng là 1 hỗn hợp các chất dinh dưỡng (những chất tham gia vào quá trình nội bào), và những chất này có thể duy trì thế oxi hóa khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định pH của môi trường. 2. Phân loại Phân loại theo trạng thái lý hóa: Môi trường lỏng: lên men, nhân giống, nghiên cứu một số đặc tính. Môi trường rắn(môi trường đặc): môi trường lỏng kết hợp với chất tạo đặc agar (2-2.5%), gelatin (10-15%)-để phân lặp, định lượng, gieo giống và giữ giống vi sinh vật. Môi trường bán rắn: hàm lượng chất tạo độ đặc ít hơn môi trường rắn thường dùng (0.3-0.7% agar) – dùng để quan sát khả năng chuyển động của một số vi sinh vật ( tạo nên đường đi trên bề mặt môi trường). Phân loại theo thành phần: Môi trường tổng hợp: Môi trường tự nhiên: Môi trường hòa tan chuẩn bị sẵn 3. Yêu cầu môi trường dinh dưỡng Có đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết. Có pH thích hợp. Không chứa các yếu tố độc hại. Có độ nhớt nhất định. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 1
  6. Tuyệt đối vô trùng. III. Cách tiến hành thi nghiệm Th Dd đường óc Xay nhuyễn Hấp tiệt trùng trong m nồi autoclave Cân 60g maltalt Lọc tinh Kết tủa Đun cách thuỷ (1) H O protei 2 Đo độ đường, Vdd 300ml n Nâng nhiệt (2) Chỉnh độ đường (3) Thử liugon Bổ sung agar 2-2,5% Lọc thô bã Đun cách thuỷ Dd đường Đồng hoá Phân phối (4) ống nghiệm Hấp tiệt trùng (5) Định hình Mẫu môi Ghi chú: trường (1) Đun cách thuỷ: nhiệt độ: 42-450C, thời gian 30 phút (2) Nâng nhiệt: 68-700C, thời gian 1h (3) Chỉnh độ đường: dùng balling kế đưa về dung dịch đường 70 (4) Phân phối: 3 ống nghiệm 1/4, 2 ống nghiệm ½ (5) Hấp tiệt trùng: 15-20p Môi trường thạch nghiêng: cho vào 1/4 ống nghiệm sau đó để nghiêng định hình Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 2
  7. Môi trường thạch đứng: cho vào ½ ống nghiệm sau đó để thẳng đứng Thao tác phân phối phải nhanh, khéo léo để môi trường không dính vào miệng ống nghiệm, đĩa petri hay nút bông và cần thực hiện trước khi môi trường bị đông đặc. Môi trường thạch phải phẳng, nhẵn. IV. Kết quả Ta có công thức V1 . N1 = V2 . N2 V2= V1 . N1 / N2 Trong đó V 1 Thể tích môi trường sau khi lọc tinh. N 1 Độ đường sau khi lọc tinh. 0 N 2 Độ đường cần điều chỉnh là = 7 Balling. Thể tích nước cần thêm vào = V2 – V1 0 0 N1( ) V1(ml) N2 ( ) V2(ml) VH2O thêm vào 11 127 7 200 73 V. Một số chú ý trong tiến trình thí nghiệm: - Dụng cụ bao gói phải đảm bảo sạch và khô. - Bao gói phải thật kín và cẩn thận để dụng cụ sau khi khử trùng vẫn đảm bảo sự vô trùng trong lớp giấy gói và lấy ra sử dụng dễ dàng. - Đầu nút tròn, độ chặt vừa phải. - Lấy nút ra hay đóng vào dễ dàng. - Phần giấy bao gói phải chặt kín. VI. Bàn luận và mở rộng 1. Đánh giá chất tạo đặc cho môi trường: Gelatin tuy làm đông môi trường nhưng môi trường tan chảy ở 37 0C, một nhiệt độ tối ưu của vi khuẩn gây bệnh cho động vật, ngoài ra thì nhiều vi sinh vật phân hủy gelatin làm lỏng môi trường. Agar không chỉ đông đặc tốt ở nhiệt độ dưới 40 0C mà còn không bị vi sinh vật phân giải làm biến tính. 2. Giữ giống trên môi trường thạch nghiêng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 3
  8. Phương pháp này khá phổ biến vì rất đơn giản và tiện lợi, tuy nhiên thời gian giữ giống chỉ nên kéo dài trong 1 tháng , sau đó phẩi cấy truyền lại trên môi trường mới. Do đó tốn nhiều công sức và dễ bị mất các đặc tính di truyền ban đầu. Phương pháp này được tiến hành như sau: Thuần khiết chủng vsv trên môi trường agar ở đĩa petri, chọn các khuẩn lạc điển hình và cấy lên môi trường thạch nghiêng thích hợp, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm để vsv phát triển bình thường, lấy các ống giống ra và cho vào tủ lạnh giữ ở 4oC, hàng tháng cấy truyền lại vào môi trường mới. Nên cho thêm vào môi trường 0,1 M citrat natri hoặc 0,3M Oxalat để chống nhiễm Bacteriophage. 3. Hấp tiệt trùng Ngoài cách tiệt trùng sử dụng hơi nước bão hoà (nồi autoclave) thì tuỳ từng loại môi trường mà có thêm một số phương pháp khác như: Phương pháp pasture: đun cách thuỷ ở nhiệt độ thấp 65-700C, thời gian 15-30p. Phương pháp Tyndal: Nhiệt độ tiệt khuẩn của phương pháp này từ 70-80 0C/1 giờ làm như vậy 3 lần, mỗi lần cách nhau 24giờ hoặc dùng nhiệt độ 60-650C/1 giờ làm 5 lần. Thời gian nghĩ để ở nhiệt độ 37 0C. Phương pháp này thường được áp dụng tiệt khuẩn các sản phẩm dễ bị hỏng ở nhiệt độ cao. Tyndall cho rằng ở nhiệt độ 60-65 0C hay ở 70-80 0C, vi khuẩn thể ding dưỡng sẽ bị chết nhưng nha bào vẫn sống, khi để nguội đến 370C, nha bào chuyển sang thể hoạt động (thể dinh dưỡng) và lại bị tiêu diệt ở lần hấp sau đó. Nhược điểm: kéo dài thời gian tiệt khuẩn, độ tiệt khuẩn không chắc chắn. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 4
  9. BÀI 2: KỸ THUẬT GIEO CẤY VÀ PHÂN LẬP I. Gieo cấy 1. Định nghĩa Gieo cấy là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang môi trường khác với mục đích nhân giống và giữ giống. Môi trường mới đảm bảo thích hợp cho sinh vật sinh trưởng và phát triển. Canh trường: môi trường đã có vi sinh vật. 2. Yêu cầu gieo cấy Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối khu vực xung quanh, gieo cấy phải thực hiện trên ngọn lửa đèn cồn hay tủ cấy. Dụng cụ: Que cấy nhọn, móc hoặc vòng, pipet, que trang, Hình 1. Một số dung cụ và kỹ thuật gieo cấy vi khuẩn 3. Kỹ thuật gieo cấy - Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang ống chứa môi trường lỏng: nhân giống cấp 1-2-3 để lên men. - Cấy chuyền từ canh trường lỏng sang môi trường đặc: phân lập, tạo khuẩn lạc. - Cấy chuyền từ canh trường đặc sang môi trường đặc: giữ giống. 4. Các cách cấy truyền Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 5
  10. Phương pháp cấy trên thạch nghiêng: Hình 2. Mẫu cấy ziczac và cấy song song Hiếu khí: cấy điểm, cấy ziczac, cấy song song. Yếm khí: đuổi khí, cấy đâm sâu vào trong ống nghiệm. Nếu cấy chuyền vi khuẩn hay nấm men thì di que cấy trên bề mặt thạch theo hình chữ chi hoặc vạch song song. Cấy chuyển nấm mốc thì chỉ cần chạm que cấy lên bề mặt thạch. - Cấy trên mặt thạch đứng. - Cấy trên đĩa petri. - Cấy gạt: cho một ít mẫu vào môi trường thạch trong petri sau đó dùng que trang dàn đều vi sinh vật trên bề mặt thạch trong hộp. Hình 3. Cấy gạc trên môi trường đĩa petri - Cấy trộn: phối trộn dịch cấy với thạch (50 0C) sau đó lắc đều và đổ vào hộp petri đã khử trùng. Xoay tròn đĩa để thạch phân bố đều, để yên cho môi trường đặc lại và cuối cùng là bao gói và nuôi trong tủ ấm. (có thể cho dịch cấy vào petri trước và tiếp theo đổ thạch vào đĩa petri). - Cấy ria: là việc sử dụng que cấy có chứa mẫu sau đó lướt que cấy lên mặt thạch theo hình chữ chi hay đường song song hoặc theo 4 góc. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 6
  11. Hình 4. Cách cấy truyền trên môi trường đĩa thạch Hình 5. Các kiểu cấy trên đĩa thạch 5. Tiến hành thí nghiệm (gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng ống nghiệm) Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 7
  12. Hình 6. Trình tự cấy truyền Mô tả qui trình: a) Một tay cầm 2 ống nghiệm: một ống canh trường và một ống môi trường (ống canh trường nằm bên ngoài, ống môi trường nằm bên trong) Tay còn lại cầm que cấy và đốt đỏ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng ngón út và áp út rút nút bông của ống canh trường ra. b) Hơ nóng khử trùng miệng ống nghiệm. c) Đợi que cấy nguội, lấy vi sinh vật từ ống canh trường đưa sang ống môi trường. d) Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo kiểu hình chữ chi. e) Rút que cấy ra và đốt nóng que cấy Khử trùng lại phần không khí nơi miệng ống nghiệm rồi đậy nút bong II. Phân lập 1. Định nghĩa Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 8
  13. Phân lập là quá trình phân tách vi sinh vật từ quần thể ban đầu tạo thành các khuẩn lạc riêng lẻ, có hoạt tính cao. 2. Các phương pháp phân lập vi sinh vật Phương pháp trực tiếp Phương pháp gián tiếp Mẫu Mẫu Pha loãng Pha loãng Tạo khuẩn lạc trên mt Làm tiêu bản mới Soi dưới kính tb có hình Làm tiêu bản hiển vi dạng khác Một tế bào riêng rẻ nhau Soi dưới kính Chọn chủng thuần khiết hiển vi Một tế bào riêng rẻ đinh danh Định danh Giống (giữ) Giống (giữ) 3. Tiến hành thí nghiệm a. Pha loãng mẫu Hình 7. Qui trình pha loãng mẫu Mô tả qui trình: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 9
  14. o Chuẩn bị sẵn 95ml nước vô khuẩn trong bình tam giác và 5 ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn o Dùng pipet 10ml hút 5ml vi sinh vật cho vào bình tam giác có chứa sẵn 95ml nước vô khuẩn và lắc đều (bình mẫu). o Dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ bình mẫu cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 10-1) o Tiếp tục dùng pipet 1ml hút 1ml vi sinh vật từ ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm thứ 2 có chứa sẵn 9ml nước vô khuẩn (độ pha loãng 10-2) o Lần lượt ta làm tương tự đối với ống thứ 3, thứ 4 và thứ 5(độ pha loãng 10-3, độ pha loãng 10-4, độ pha loãng 10-5) b. Phân lập: đối với mẫu có độ pha loãng: 1 ống 10-3, 1 ống 10-4, 1 ống 10-5 Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½ . Tháo bao gói petri đã vô khuẩn, hơ quanh hộp petri trên ngọn lửa đèn cồn. Tay trái cầm hộp petri, dùng ngón tay hé mở nắp và rồi dùng tay phải đổ thạch đã rã đông vào trong hộp petri. Xoay đều để thạch phân bố đều trong hộp và bề mặt phẳng, nhẵn. Để nguội cho thạch đông lại. Dùng pipet lấy mẫu ở ống nghiệm có độ pha loãng 10-3 và cho vào hộp petri (vẫn dùng tay để hé nắp hộp petri). Vô khuẩn que trang bằng cồn và hơ nóng, sau đó để nguội rồi dàn đều mẫu trên bề mặt thạch để nấm men phát triển đều trên khắp bề mặt thạch. Để ổn định trong 5 phút, lật ngược hộp petri lại và tiến hành bao gói. Để nguội trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp (28-300C), trong vòng 48-72 giờ. III. Bàn luận và mở rộng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 10
  15. BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG – TÁCH VI SINH VẬT I. Sơ lược lược lý thuyết 1. Khái niệm Định lượng vi sinh vật là quá trình pha loãng mẫu sau đó cấy chuyền mẫu qua một môi trường mới nhằm mục đích tạo ra các tế bào riêng lẻ và đếm tổng số tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu. 2. Phương pháp định lượng: Định lượng trực tiếp: là phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có trên tiêu bản làm từ mẫu. o Ưu điểm: cho kết quả nhanh chóng. o Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. o Phương pháp định lượng trực tiếp: Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu (thường dùng nhất). Định lượng gián tiếp: là phương pháp định lượng thông qua môi trường mới bằng cách gieo cấy một lượng nhất định mẫu lên một môi trường dinh dưỡng thích hợp, nuôi cấy trong tủ ấm, sau đó đếm tổng số khuẩn lạc và dựa vào công thức để tính số tế bào có trong 1g hay 1ml mẫu ban đầu. o Ưu điểm: kết quả chính xác hơn. o Nhược điểm: - Mất nhiều kinh phí để làm môi trường - Mất nhiều thời gian 3. Nguyên lý: o Phương pháp đổ đĩa: một ít vi sinh vật đã pha loãng được trộn đều với môi trường agar nóng chảy và được đổ vào hộp petri vô khuẩn. Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật sẽ mọc thành những khuẩn lạc riêng lẽ. o Phương pháp cấy ria: que cấy được sử dụng để cấy ria nhiều lần hỗn hợp vi sinh vật phân lập trên khắp bề mặt môi trường đặc trong petri. Sau mỗi lần vi sinh vật sẽ tách dần ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng lẽ. II. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị dụng cụ: o Erlen chứa 95ml nước vô khuẩn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 11
  16. o 5 ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn o 1 pipet 10ml và 5 pipet 1ml đã hấp tiệt trùng o Chuẩn bị các ống thạch, đun chảy cách thủy, giữ ở 450C-500C. 1. Pha loãng mẫu: o Chuẩn bị mẫu: lấy 5ml dịch mẫu chứa VSV cho vào erlen chứa 95ml nước vô khuẩn được 100ml dịch mẫu. o Pha loãng: Hình 8. Trình tự pha loãng mẫu - Lưu ý: o Sử dụng ống nghiệm chứa 9ml nước vô khuẩn. o Giữa những lần pha loãng nên đánh đều bằng máy Vortex. o Pipet nào thì dùng riêng cho ống nghiệm ứng với độ pha loãng đó. o Thao tác nên thực hiện gần đèn cồn để đảm bảo vô khuẩn. o Không nên mở nắp hộp petri quá lớn để tránh nhiễm khuẩn. o Thao tác thực hiện phải nhanh. o Dùng nút bông đậy các ống nghiệm để tránh nhiễm khuẩn. 2. Phương pháp đổ hộp (phương pháp trộn) o Hấp cách thủy, rã đông môi trường ½ giữ môi trường ở nhiệt độ 500C o Cho 0.2ml mẫu với độ pha loãng tương ứng vào petri và đổ ống nghiệm chứa môi trường vào. o Xoay đều hộp petri cho mặt thạch đều và phẳng. Để môi trường đặc lại. o Lật ngược petri, bao gói, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp. o Sau 2-3 ngày, lấy ra, đếm số khuẩn lạc và tính toán kết quả. 3. Phương pháp cấy ria (phương pháp tách) Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 12
  17. o Hơ đỏ que cấy, làm nguội và lấy một ít vi sinh vật cần phân lập o Nghiêng hé mở hộp petri, dùng que cấy cấy đường dích dắc trên ¼ hộp petri. o Lấy que cấy ra đốt nóng để nguội và tiếp tục kéo vi sinh vật ở ¼ đã cấy và cấy tương tự như trên tại ¼ của phần thứ 2 o Tiếp tục thao tác trên với phần thứ ba và thứ tư. o Lật ngược, bao gói hộp petri và nuôi trong tủ ấm trong 48 giờ.Lưu ý: o Thao tác phải thực hiện gần đèn cồn. o Hơ nóng que cấy sau mỗi lần kéo di ở những phần tư khác nhau. Hình 9. Các kiểu cấy ria III. Tính toán và kết quả Hộp bị nhiễm không tính Xét điều kiện nếu không thỏa sẽ không tính. Công thức tính ⅀ X=(푛1 + 0.1푛2 + 0.01푛3). 푛 (tế bào/1ml mẫu) Trong đó: ⅀C : tổng số khuẩn lạc của tất cả hộp petri đã chọn. n1, n2, n3: số hộp petri gieo cấy ở các nồng độ khác nhau dn: hệ số pha loãng gieo cấy đậm đặc. Kết quả thu được: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 13
  18. Bảng 1. Kết quả thí nghiệm tìm số tế bào/1ml mẫu n ⅀ n1 n2 n3 d X 118 0 2 1 10-4 5 619 048 Vậy số tế bào/1ml mẫu: X= 5.619.048 ≈ 5,6×106 tế bào. Số tế bào/ 1ml mẫu ban đầu = X.100/5 = 112.380.960 ≈ 1,1×108 tế bào IV. Bàn luận và mở rộng Một số phương pháp khác để định lượng vi sinh vật hoặc đánh giá sự sinh trưởng của chúng Bảng 2. Nhóm các phương pháp định lượng vi sinh vật Nhóm phương pháp Tên phương pháp Phạm vi áp dụng Phương pháp xác định Kỹ thuật đếm tế bào trên Khảo sát sự sinh trưởng VSV số lượng tế bào buồng đếm trong canh trường lên men Kỹ thuật Breed Phương pháp nuôi cấy Định lượng VSV trong thực trên môi trường đặc phẩm Khảo sát sự sinh trưởng của VSV trong canh trường lên men Phương pháp xác định Phương pháp đo độ đục Khảo sát sự sinh trưởng của VSV sinh khối Phương pháp xác định trong canh trường lên men hàm lượng chất khô của sinh khối Phương pháp xác định Hàm lượng ATP nội bào Định lượng VSV trong thực hàm lượng các chất nội phẩm bào Khảo sát sự sinh trưởng của VSV trong canh trường lên men Hàm lượng NAD, Khảo sát sự sinh trưởng của VSV NADH, trong canh trường lên men Hàm lượng nitơ tổng Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 14
  19. Phương pháp xác định Động học quá trình sử Khảo sát sự sinh trưởng của hoạt tính của sinh khối dụng cơ chất VSV trong canh trường lên Động học quá trình tạo men sản phẩm Ở đây xin cung cấp thêm một số thông tin về 2 phương pháp định lượng VSV trực tiếp thường dùng sau phương pháp dùng buồng đếm hình cầu: phương pháp đo độ đục và MPN Phương pháp đo độ đục: o Cơ sở: khi pha lỏng chứa nhiều phần tử không tan sẽ tạo thành hệ huyền phù và có độ đục bởi các thành phần trong môi trường lỏng cản ánh sang, làm phân tán chùm sáng tới. Tế bào VSV là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cũng làm đục môi trường o Phương pháp: xác lập quan hệ tỉ lệ tuyến tính giữa mật độ tế bào VSV và độ đục. o Xây dựng phương trình đường chuẩn o Định lượng gián tiếp thông qua độ đục OD dựa vảo đường chuẩn. Phương pháp MPN: o Là phương pháp pha loãng tới hạn hay còn gọi phương pháp sử dụng chỉ số xác suất cao nhất. o Cơ sở: phân tích thống kê số liệu. BÀI 4: QUAN SÁT VI SINH VẬT NÓI CHUNG TRÊN Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 15
  20. KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC I. Giới thiệu sơ lược kính hiển vi Kính hiển vi là một hệ thống quang học dùng để phóng đại ảnh của vật cần quan sát. Phân loại: kính hiển vi quang học, kính hiển vi huỳnh quang, kính hiển vi điện tử Cấu tạo của kính hiển vi quang học( gồm 2 bộ phận: cơ học và quang học): Bảng 3. Cấu tạo kính hiển vi quang học Bộ phận cơ học Bộ phận quang học Ống kính Bộ tụ quang: một hệ thống thấu kính Đế kính ghép lại, có tác dụng tập trung ánh Bàn kính sáng để chiếu vào tiêu bản. Ốc di chuyển Vật kính: gồm nhiều thấu kính ghép Nút chỉnh (thô-tinh) lại. (soi khô: vật kính 10x, 40x hay soi dầu: vật kính 90x, 100x) Thị kính: lắp ở đầu ống kính, có cấu tạo gồm hai thấu kính (thị kính 7x, 10x, 15x ) Đèn chiếu sáng. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 16
  21. Hình 10. Cấu tạo kính hiển vi quang học II. Các sử dụng kính hiển vi quang học Làm tiêu bản, sau đó 1. Bật đèn sang 2. Đặt tiêu bản lên bàn kính 3. Xoay vật kính nhỏ nhất về phía tiêu bản (10x) 4. Dùng các ốc di chuyển ngang về phía có lá kính 5. Dùng ốc di chuyển thô (nhanh, ngược chiều kim đồng hồ) để tìm thấy ảnh. 6. Xoay vật kính sang 40x 7. Dùng ốc di chuyển tinh (chậm) để tìm thấy ảnh rõ nhất. 8. Dùng ốc di chuyển tinh (chậm) xoay để nhìn thấy ảnh rõ nét nhất. Độ phóng đại = thị kính * vật kính III. Phương pháp làm tiêu bản tạm thời Có hai phương pháp phổ biến Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 17
  22. Bảng 4. So sánh tiêu bản giọt ép và giọt treo Tiêu bản giọt ép Tiêu bản giọt treo Cách Dùng que cấy hoặc đũa thủy tinh Dùng một phiến kính đặc biệt làm lấy một ít vi sinh vật để làm vết có lõm hình tròn ở giữa, bôi bôi. Ép lam men lên giọt canh vasellin quanh phần lõm của trường từ từ hạ lam men lên mặt lam kính, cho 1 giọt canh lam kính. Tránh đặt lam nhanh và trường lên giữa lam men, Cẩn mạnh quá, giọt canh trường bắn ra thận xoay ngược lam kính cho ngoài hoặc lớp không khí giữa lá giọt canh trường xuống phía kính và phiến kính không kịp dưới rồi đặt lam men lên lam thoát ra sẽ tạo thành bọt khí. kính sao cho giọt canh trường “treo” trong không gian lõm của phiến kính. Không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào đáy của phần lõm của lam kính. Mục sát hình dạng, xác định kích thước dùng để theo dõi sự sinh sản, đích của tế bào vi sinh vật sự hình thành bào tử và khả năng di động. Ưu nhanh, gọn, dễ quan sát. tiêu bản giữ được lâu hơn, điểm quan sát dễ dàng hơn. Nhược không quan sát được trong Khó làm điểm thời gian lâu Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 18
  23. Hình 11. Cách làm tiêu bản giọt ép Hình 12, cách làm tiêu bản giọt treo IV. Tiến hành thí nghiệm Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 19
  24. Ngâm lam kính và lam men trong cồn 700 để tiệt trùng Dùng kéo kẹp lam kính và hơ trên đèn cồn. Đặt lam kính lên giá đỡ. Đánh đều mẫu. Làm tiêu bản giọt ép Đặt lam kính lên bàn kính quan sát. Quan sát, vẽ hình V. Kết quả-bàn luận- mở rộng Bảng 5. Kết quả quan sát nấm men, vi khuẩn Số 12 14 8 Nấm men Vi khuẩn Bacillus Vi khuẩn Lactose Subtilic Bacillus KíKích thước Rất lớn Rất bé: 0.5-1 µm Rất bé Dài:10-12µm Rộng:2-7 µm Hình dạng Hình cầu Trực khuẩn ngắn, trực khuẩn dài Oval Ellipse Khuẩn ty giả Sinh sản Nảy chồi Bào tử hình hạt mè, có Bào tử chấm tròn. Nhân Nhân thực Không có nhân (nhân Không có nhân giả) Di chuyển Không di Chuyển động Chuyển động chuyển Do điều kiện kính hiển vi không tốt lắm nên việc quan sát gặp nhiều khó khăn. Nên hình ảnh của nấm men thì tương đối riêng vi khuẩn thì khó quan sát. Hình ảnh mẫu quan sát được Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 20
  25. Hình 13. Nấm men (trên) Bacillus Subtilis (dưới) dưới kính hiển vi Hình 14. Vi khuẩn Lactose Bacillus Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 21
  26. o Mở rộng Ứng dụng của nấm men: Sản xuất bành mì Lên men rượu Sản xuất bia Ứng dụng của lactobacillus: Lactobacillus có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả, làm yaourt, cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính khác của Lactobacillus đã trở nên được xem trọng là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn) như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin, có tác dụng ức chế một số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm (Batt, 1999; Dubernet et al., 2002). Vì các chủng lactobacillus thường cư trú trong đường ruột của người và động vật với một lượng sẵn có sẽ giúp kích thích tiêu hoá thức ăn và tiêu diệt một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác nên hiện nay trên thị trường có nhiều thực phẩm, dược phẩm có bổ sung các chủng probiotic còn sống. Vi khuẩn Lactobacillus được sử dụng trong nhiều sản phẩm probiotic, các chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic ở đường dạ dày – ruột người. Ngoài ra, các chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic ở trên cũng thể hiện một số ích lợi đối vớisức khỏe con người như: kháng với các vi khuẩn gây bệnh, tạo ra bacteriocin và các chất kháng khuẩnkhác. Đồng thời, chúng cũng kháng với một số loại kháng sinh. Tùy theo khả năng kháng kháng sinh của mỗi chủng, chúng có thể được đưa vào cơ thể của các bệnh nhân sử dụng các loại kháng sinh (như: amikacin, kanamycin, gentamicin, streptomycin, vancomycin và co-trimoxazole) mà không bị tiêu diệt bởi các loại kháng sinh mà chúng kháng lại, từ đó tạo nên những hiệu quả có lợi cho bệnh nhân. Hơn nữa, các chủng Lactobacillus này cũng an toàn đối với người sử dụng khi nhạy cảm vớ một số loại kháng sinh. Đặc biệt, 11 chủng Lactobacillus (gồm: L. paracasei/ Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 22
  27. casei B5, L. salivarius B6, L. gasseri B8a, L. fermentum B8b, L. fermentum B9a, L. gasseri B9b, L. rhamnosus B11, L.paracasei/ casei B17, L. rhamnosus M3, L. salivarius M5 và L. fermentum T16) có khả năng khử mức cholesterol huyết thanh đáng kể 10% – 33,34%. Các chủng Lactobacillus này cần được tiếp tục nghiên cứu sâu hơn để ứng dụng sản xuất các sản phẩm probiotic có tác dụng làm giảm cholesterol huyết thanh, nhằm ngăn chặn bệnh tim mạch ở người. Có khả năng sinh axit lactic Ứng dụng trong sản phẩm thực phẩm lên men như salad cà chua, nem chua, Hình 15. Dưa cải muối chua, nem chua Ngoài ra Lactobacillus rhamnosus: Vi khuẩn giúp phòng và trị nhiễm xạ Ứng dụng của Bacillus subtilis Tính ổn định cao của B. subtilis trong điều kiện môi trường khắc nghiệt làm cho vi sinh vật trở thành một trong những ứng cử viên hoàn hảo cho các ứng dụng chế phẩm sinh học hoặc trong thực phẩm, đồ uống , khử trùng. Hình 16.chế phẩm vi sinh từ Bacillus Subtilis Cụ thể: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 23
  28. B. subtilis có khả năng sản sinh nhiều enzyme, nhưng quan trọng nhất là amylase và protease, 2 loại enzyme thuộc hệ thống men tiêu hóa. B.subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram(-), Gram(+) và nấm gây bệnh. B. subtilis thường tồn tại trong sản phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi uống vào dạ dày, nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Ở ruột, bào tử nẩy mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa, nhất là sau khi sử dụng kháng sinh kéo dài. BÀI 5: QUAN SÁT NẤM MEN I. Nấm men và mục đích quan sát nấm men 1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men: Hình 17.Hình vẽ nấm men - Hình dạng: có hình bầu dục, hình trứng, (tùy điều kiện môi trường). - Cấu tạo tế bào: thành tế bào, màng tế bào, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân, không bào và các hạt dự trữ. - Những thay đổi của tế bào nấm men trong quá trình phát triển: o Nấm men trẻ (qua 12-16 giờ nuôi cấy): màng mỏng, tế bào chất đồng nhất, không bào chưa có hoặc mới bắt đầu xuất hiện, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 24
  29. o Nấm men trưởng thành (24-48 giờ): không bào lớn, số không bào có thể đến hai, lượng glycogen tăng, tế bào sinh sản chiếm tỷ lệ cao 10-15%. o Nấm men đã già (72 giờ trở lên): màng dày, nhẵn, nguyên sinh chất không đồng nhất, không bào lớn, lượng chất béo tăng, tế bào hầu như không sinh sản nữa, không có glycogen, tế bào chết chiếm tỷ lệ lớn. 2. Đặc điểm sinh lý: - Dinh dưỡng. - Hô hấp tùy tiện. - Hình thức sinh sản: có 3 hình thức o Sinh sản sinh dưỡng. o Sinh sản đơn tính. o Sinh sản hữu tính. - Nấm men không chuyển động. - Khả năng tạo bào tử. 3. Mục đích quan sát canh trường nấm men Để biết được, ước tính lượng dịch cho vào nuôi cấy Đánh giá canh trường đã nuôi đang ở giao đoạn nào, thời gian bao lâu (trẻ, trưởng thành hay già). Biết được số nấm men sống chết. Thao tác lại cách làm tiêu bản giọt ép. II. Cách đánh gía canh trường Có nhiễm VSV lạ hay không Tỷ lệ nảy chồi Tỷ lệ sống chết (thường phải <4%) Đếm số tế bào nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm 0.1mm III. Tiến hành thí nghiệm và kết quả 1. Đánh giá sự nhiễm VSV của canh trương o Chuẩn bị mẫu o Làm tiêu bản giọt ép o Quan sát kính hiển vi ở 5 điểm khác nhau o Ghi kết quả, đánh giá canh trường Kết quả: canh trường không bị nhiễm khuẩn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 25
  30. 2. Quan sát tỉ lệ nảy chồi Làm tiêu bản giọt ép Đếm số tế bào nảy chồi vs tế bào không nảy chồi Tính tỷ lệ nảy chồi Lưu ý: tế bào được xem là đang nảy chồi là những tế bào có tế bào con bé hơn hoặc bằng ½ tế bào mẹ, nếu tế bào con lớn hơn ½ tế bào mẹ thì phải tính là 2 tế bào. Bảng 6.Tỷ lệ nảy chồi của nấm men % tỷ lệ không nảy Vùng Nảy chồi Tổng nấm % tỷ lệ nảy chồi chồi 1 5 33 15.2% 84.8% 2 5 37 13.5% 86.5% 3 3 23 21.7% 78.3% 4 17 71 23.5% 76.5% 5 12 82 14.6% 85.4% Tổng 42 246 17.1% 82.9% Kết luận: tỷ lệ tế bào nảy chồi chiếm trung bình 17% tức là tế bào nấm men đang ở cuối giai đoạn trường thành (tỷ lệ nảy chồi 10 – 15%) đầu giai đoạn già. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 26
  31. 3. Quan sát tỷ lệ sống chết: Cơ sở của việc nhuộm màu nấm men o Thuốc nhuộm đi qua màng tế bào chết dễ hơn tế bào sống. o Nguyên sinh chất tế bào chết dễ bắt màu. → Vì vậy ta dùng xanh metylen (pha loãng 10 lần) để nhuộm màu, phân biệt tế bào sống và tế bào chết. Chờ khoảng 1-2 phút đủ thời gian để màu thấm vào tế bào nấm men. Chuẩn bị mẫu Làm tiêu bản Nhuộm màu mẫu trước khi ép lamen mỏng lên lam kính Quan sát tại 5 điểm khác nhau Bảng 7. Tỷ lệ chết của nấm men Tổng số tế % tỷ lệ chết vùng Tế bào chết Tế bào sống bào 1 20 107 127 15.7% 2 5 59 64 7.8% 3 10 65 75 13.3% 4 17 117 134 12.7% 5 22 110 132 16.7% Kết luận: tỷ lệ tế bào chết >> 4%, số tế bào chết quá lớn. Việc này không thích hợp cho việc chuyển canh trường này để nuôi cấy. 4. Đếm tế bào nấm men trong 1ml canh trường: (dùng buồng đếm Thomas) o Pha loãng mẫu với độ pha loãng 10-2. 0 o Tiệt trùng buồng đếm bằng cách ngâm trong cồn 70 . Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 27
  32. Hình 18. Cách pha loãng mẫu và hình ảnh buồng đếm Đậy lá kính lên trên buồng đếm và nhỏ mẫu vào khe hẹp phía trên buồng đếm, dùng giấy thấm , sau đó tiến hành quan sát bằng kính hiển vi trên 3 trong 5 vùng của buồng đếm. (lưu ý: khi vi sinh vật nằm ở biên giới thì chỉ đếm trên 2 cạnh liên tiếp). 1 4 2 3 Hình 19: Cấu tạo buồng đếm và các vùng đếm Tính kết quả thí nghiệm: Công thức Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 28
  33. o Tổng số tế bào nấm men có trong 1ml mẫu ban đầu: . .103 = . Với a: tổng số tế bào trong 5 ô b: hệ số pha loãng (100 lần) 1000 (đổi 1ml ≈ 1000 mm3) c: số ô nhỏ trong 5 ô lớn (trong trường hợp này c=16.5=80) V= S.h= 1/400.0,1=1/4000 (mm3) Bảng 8. Số VSV trong ba vùng quan sát và tổng số VSV TB trong 1ml mẫu Vùng 1 Vùng 2 Vùng 3 Ô 1 1 4 1 Ô 2 2 7 5 Ô 3 4 7 9 Ô 4 2 3 4 Ô 5 3 5 6 Tổng 12 26 25 (tb/1ml) 6x107 13x107 12.5x107 = 10.5x107 (tb/ml) IV. Kết luận - Mẫu không bị nhiễm vi sinh vật khác. - Tế bào nấm men đang ở giai đoạn cuối của trưởng thành số tế bào nảy chồi rất lớn - Hình thái nấm men: nhân lớn, rõ, thành tế bào dày lên Mở rộng ứng dụng của nấm men trong công nghiệp và đời sống: - Sản xuất bánh mì, lên men rượu, bia Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 29
  34. - Saccharomyces là một chi nấm men được sử dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh mì, sản xuất cồn, rượu, bia. Saccharomyces có nghĩa là nấm đường và là loại vi sinh vật duy nhất đuợc sản xuất với quy mô rất lớn trên thế giới. - Trong đó,loại được con người sử dụng phổ biến nhất là Saccharomyces Cerevisiae. Hình 20. ứng dụng của nấm men trong sản xuất bánh mì, rượu, bia Nấm men là tác nhân cơ bản gây nên quá trình lên men rượu, tuy nhiên không phải loài nào cũng lên men đường thành rượu được mà chỉ có một số loài có khả năng này. Trong sản xuất hiện nay người ta thường dùng một số loài thuộc họ Saccharomycesaceae. Theo đặc tính lên men người ta chia nấm men thành hai nhóm: nấm men lên men nổi và nấm men lên men chìm (Tiêu biểu là loài Saccharomyces ellipsoideus. Nấm men chìm thường dung trong sản xuất bia, rượu vang, sampan). Nấm men nổi ít được sản xuất bia vì tạo đục gây mất cảm quan cho sản phẩm. BÀI 6: QUAN SÁT VI KHUẨN Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 30
  35. I. Sơ lược lí thuyết 1. Quan sát vi khuẩn ở trạng thái sống o Làm tiêu bản o Quan sát trên kính hiển vi: chủ yếu là quan sát hình dạng từng loại 2. Quan sát vi khuẩn ở trạng thái chết a. Ưu điểm o Tránh bị lây nhiễm o Quan sát hình dạng của chúng rõ rang hơn o Thuận lợi cho việc đếm tổng số vi khẩn b. Các cách nhuộm Nhuộm màu đơn: chỉ sử dụng một màu làm thuốc nhuộm. Nhuộm phức: sử dụng từ 2 thuốc nhuộm màu trở lên (nhuộm Gram, nhuộm nha bào, nhuộm tiêm mao) c. Nhuộm Gram Vi khuẩn Gram (+) có thành peptidoglycan dày, bắt màu tốt. Còn vi khuẩn Gram (-) có thành peptidoglycan mỏng và có cả lớp lipopolysaccaride. Bảng 9. So sánh vi sinh vật Gram (-) và (+) Phức của VSV Gram (+) Phức của VSV Gram (-) Loại phức chất có khả năng giữ Loại phức chất không còn giữ được màu của thuốc nguyên màu của thuốc nhuộm nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu nên không bị rửa trôi khi xử lý của thuốc nhuộm bổ sung bằng cồn Mẫu vi khuẩn quan sát: (1) VK Bacillus Subsilic (trực khuẩn) (2) VK Acetobater Xylium (Gram-) (3) VK E.coli (Gram - ) (4) VK Lactic: Lactobacillus Thermophilus Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 31
  36. Treptococus II. Cách tiến hành thí nghiệm 1. Quan sát vi khuẩn ở trạng thái sống o Không nhuộm màu: Làm tiêu bản giọt ép, quan sát o Nhuộm màu: Cho 1 giọt canh trường + thuốc nhuộm xanh metylen 0.001% - làm tiêu bản giọt ép quan sát. 2. Quan sát vi khuẩn ở trạng thái chết Công việc thực hiện Làm vết bôi Dùng Cồn 70o để vô khuẩn phiến kính và lá kính sau đó lau khô Lấy một lượng nhỏ vi sinh vật để lên phiến kính Hơ đỏ que cấy, để nguội dùng que cấy dàn mỏng giọt canh trường ra Làm khô vết bôi Để ngoài không khí cho phiến kính tự khô, hoặc hơ nhẹ trên đèn cồn Cố định vết bôi nhằm giết chết vi sinh vật, đồng thời làm cho vi sinh vật bám chặt lên phiến kính nhỏ vài giọt cồn 96o lên chỗ có vết bôi dùng kẹp kẹp lấy phiến kính hơ trên ngọn lửa sau đó thổi tắt (làm nhanh) thực hiện 3 lần như vậy d. Nhuộm Gram Các bước thực hiện: Nhuộm màu Nhỏ vài giọt Gantialviolet lên vết bôi (chờ 1p) Cẩn màu: gắn chặt màu lên tế bào VK Nhỏ tiếp Lugol 0,02N để từ 1-2 phút sau đó đổ đi Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 32
  37. Tẩy màu: (30s) - Dùng cồn 96o Nhuộm màu Nhỏ fuchshin bazơ để từ 1-2 phút Rửa, lau khô ( tránh lau chà mạnh trên vết VK) Ép lá kính lại, quan sát trên KHV Sau mỗi bước phải rửa nước, rồi dùng giấy thấm khô. e. Nhuộm Hình 21. Các bước nhuộm Gram VSV màng nhày Cố định mẫu như đã nói Các bước nhuộm: Nhuộm màu Nhỏ vài giọt Crital violet lên vết bôi (chờ 1p) Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 33
  38. Rửa nước, thấm khô Nhuộm tiếp CuSO4 (chờ 1p) Rửa nước => thấm khô nước => quan sát trên KHV III. Kết quả Quan sát VK sống Bảng 10. Kết quả quan sát sống các mẫu VSV Hình dạng Di chuyển Bacillus Subsilic Trực khuẩn, 2 đầu tròn Có Acetobater Xylium Trực khuẩn hình que Có ( nhưng rất khó thấy) E.coli Trực khuẩn Có (rất nhanh) Lactic Lactobacillus Thermophilus: Có trực khuẩn hình que Treptococus: hình cầu Không Hình ảnh Hình 22. Hình VSV dưới kính hiển vi: bacillus subtilis, E.coli, Lactic Quan sát mẫu nhuộm Gram Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 34
  39. Bảng 11. Kết quả quan sát sau khi nhuộm Gram Hình dạng Di Màu sắc sau nhuộm chuyển Bacillus Subsilic Trực khuẩn Gram (+), 2 Xanh tím đầu tròn E.coli Trực khuẩn Gram (-) Không Đỏ hồng Lactic Lactobacillus Tím hơi ngả hồng Thermophilus: trực khuẩn hình que Gram (+) Treptococus: cầu khuẩn Tím hơi ngả hồng Gram (+) Hình ảnh Hình 23. Mẫu nhuộm Gram Bacillus Subtilis, E.coli, Lactic Quan sát mẫu nhuộm màng nhày Bảng 12. Kết quả quan sát nhuộm màng nhày Hình dạng Di chuyển Màng nhày Bacillus Trực khuẩn , 2 đầu tròn Có Không- VK một màu Subsilic đồng nhất Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 35
  40. Acetobater Trực khuẩn hình que Có ( nhưng rất khó Có –màng bao bọc màu Xylium thấy) sáng ngoài, giữa màu đậm hơn. Hình ảnh Hình 24. Hình ảnh quan sát được B.subtilis vs A.Xylium IV. Bàn luận – mở rộng Ứng dụng của vi khuẩn B.Subsilis B. subtilis có khả năng sản sinh nhiều enzyme, nhưng quan trọng nhất là amylase và protease, 2 loại enzyme thuộc hệ thống men tiêu hóa. B.subtilis có khả năng sinh tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn Gram(-), Gram(+) và nấm gây bệnh. B. subtilis thường tồn tại trong sản phẩm ở trạng thái bào tử, nhờ vậy khi uống vào dạ dày, nó không bị acid cũng như các men tiêu hóa ở dịch vị phá hủy. Ở ruột, bào tử nẩy mầm và phát triển thành thể hoạt động giúp cân bằng hệ vi sinh có ích trong đường ruột, cải thiện hệ thống tiêu hóa, nhất là sau khi sử dụng kháng sinh kéo dài. Ứng dụng của vi khuẩn Acetobacter xylium o Sản xuất thách dừa o Cơ sở khoa học: A. xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy. Trong tế bào vi khuẩn, glucose sẽ kết hợp với axit béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tế bào cùng với một enzyme. Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme. Enzyme này có thể polymer hoá glucose thành cellulose. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 36
  41. o Thạch dừa thực chất là sinh khối của vi khuẩn Acetobacter xylinum nuôi trên môi trường nước dừa già, có thành phần chủ yếu là cellulose nên được gọi là cellulose Vi khuẩn (bacterial cellulose - BC). Thuận lợi của việc sản xuất thạch dừa theo phương pháp lên men truyền thống chính là ưu điểm của công nghệ sản xuất vi sinh: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, ít tốn mặt bằng và nhân công, tương ứng giá thành rẻ Tuy nhiên, điểm hạn chế của nó lại là phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu, dẫn đến khó ứng dụng sản xuất ở quy mô công nghiệp. Môi trường nước dừa già là nguyên liệu thường dùng để sản xuấtthạch dừa nhưng chỉ có sẵn ở một số vùng (mang tính địa phương), còn những vùng khác lại rất khan hiếm do các yếu tố địa lí. Công tác vận chuyển nước dừa đến các vùng này cũng gặp rất nhiều khó khăn. Do đó, vấn đề đặt ra cần phải giải quyết là môi trường lên men phải xuất phát từ những nguồn nguyên liệu sẵn có, đa dạng, rẻ, có số lượng lớn, dễ vận chuyển và mang quy mô công nghiệp,không mang tính cục bộ, điạ phương, có thể tận dụng được phế phụ liệu từ các quá trình sản xuất thực phẩm khác.Xuất phát từ những yêu cầu trên, đã có nhiều nghiên cứu về đề tài “Đa dạng hóa các môi trường sản xuất bacterial cellulose từ vi khuẩn Acetobacter xylinum”. Hình 25. Sản phẩm thạch dừa Bàn luận về E.coli Ứng dụng: E. coli thuộc họ vi khuẩn Enterobacteriaceae và thường được sử dụng làm sinh vật mô hình cho các nghiên cứu về vi khuẩn. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 37
  42. Tác hại: Escherichia coli (thường được viết tắt là E. coli) hay còn được gọi là vi khuẩn đại tràng là một trong những loài vi khuẩn chính ký sinh trong đường ruột của động vật máu nóng (bao gồm chim và động vật có vú). Vi khuẩn này cần thiết trong quá trình tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Sự có mặt của E. coli trong nước ngầm là một chỉ thị thường gặp cho ô nhiễm phân. Bệnh do E.Coli là bệnh truyền nhiễm lây truyền qua đường phân – tay – miệng. Chúng ta bị lây nhiễm E.coli từ phân qua các vật trung gian như bàn tay, vật dụng, thức ăn, nước uống và được đưa vào cơ thể qua miệng. E.coli có thể xâm nhập vào thịt gia cầm hay thịt heo trong quá trình làm thịt nên nếu thịt bị nhiễm và không nấu chín thì vi khuẩn có thể sống sót và thịt vẫn bị nhiễm khuẩn. Chúng ta cũng có thể nhiễm E.coli qua tắm sông nếu nước bị nhiễm khuẩn hay nước chưa được khử trùng bằng chlorine Người ngộ độc thấy đau bụng dữ dội, đi phân lỏng nhiều lần trong ngày, ít khi nôn mửa, thân nhiệt có thể hơi sốt. Trường hợp nặng, bệnh nhân có thể sốt cao, mỏi mệt, chân tay co quắp, đổ mồ hôi. Nhiều người bị nhiễm E.coli mà không có triệu chứng và cũng không mắc bệnh. Khi bệnh nhân bị nhiễm E.coli nghiêm trọng (tức có thể làm rối loạn máu và suy thận) thường có thêm các biểu hiện như da xanh, lạnh, yếu cơ, tiểu ít Thời gian ủ bệnh của E.coli từ 2 - 20 giờ. Tùy từng trường hợp mà biểu hiện bệnh khác nhau nhưng phần lớn các trường hợp nhiễm E.coli thường tự hồi phục, điều trị chủ yếu bằng bù nước và điện giải. Ứng dụng Lactobacillus thermophylus và streptococcus o Sản xuất sữa chua quy mô công nghiệp. Ứng dụng trong y học. o Có khả năng thủy phân Protein trong sữa, chuyển Casein thành các hợp chất chứa Nitơ trong giai đọạn đầu của quá trình lên men. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 38
  43. o Không sinh độc tính. o Giảm béo trong Pho-mai, Ngoài ra, nó còn giảm vị cay và đắng thường có của Pho-mai. Hình 26. Probiotic với vai trò hang rào phòng ngự bảo vệ niêm mạc ruột o Tăng trưởng ở trẻ nhỏ.Trẻ được bổ sung Streptococcus thermophilus thường xuyên duy trì tốc độ tăng trưởng ổn định hơn 6 tháng so với trẻ không được bổ sung hay bổ sung không thường xuyên. o Ngăn ngừa tiêu chảy o Kích thích hệ thống miễn dịch o Cân bằng hệ vsv đường ruột o Ức chế sự sinh trưởng các loài vi khuẩn có hại trong ruột và các yếu tố gây bệnh khác (ruột có đến 400 loại VSV) o Kích thích các tế bào bảo vệ, chất kháng virus-interferon BÀI 7: QUAN SÁT NẤM MỐC I. Sơ lược lý thuyết: 1. Đặc điểm hình thái: - Cấu tạo: nấm mốc là loại nấm có cấu tạo sợi. Có hai loại sợi nấm: sợi có vách ngăn(đa bào) và sợi không có vách ngăn (đơn bào). Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 39
  44. - Hình dạng: đa số nấm mốc có hình sợi phân nhánh. Khi phát triển các sợi chằng chịt với nhau làm thành hệ sợi nấm – khuẩn ty. 2. Đặc điểm sinh lý: - Nấm mốc không di chuyển được, chúng hoàn toàn hiếu khí, chúng chỉ phát triển trong điều kiện thoáng khí. - Sinh sản: o Sinh sản sinh dưỡng: o Sinh sản vô tính: o Sinh sản hữu tính: 3. Phân biệt bốn loại nấm mốc điển hình: Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium: - Nhóm Mucor và Rhizopus: o Giống: đều là bào tử kín, đơn bào, có khả năng tạo thành bào tử nang (bào tử nội sinh). Sợi màu trắng, bào tử nang hơi vàng. o Khác nhau: Mucor Rhizopus Cuống bào tử nang phân Cuống bào tử nang không phân nhánh, chỉ mọc lên ở nhánh và mọc lên ở bất kỳ những chỗ sợi nấm ăn sâu vào môi trường, cuống bào vị trí nào của sợi nấm tử mọc thành cụm, cụm này mọc ra nhiều sợi nhỏ ăn sâu vào môi trường trông giống rễ giả. - Nhóm Aspergillus và Penicillium: o Giống : sợi nấm đa bào(có vách bên trong, sợi mảnh, nhỏ), đầu sợi nấm mang bào tử phình to ra, tạo thành các tế bào hình chai (hay thể bình) rồi hình thành chuỗi đính bào tử (bào tử ngoại sinh), bào tử hở. o Khác nhau: Aspergillus Penicillium Cuống đính bào tử đơn bào, các tế bào Cuống đính bào tử đa bào, đầu cuống phân hình chai và đính bào tử tỏa đều trên nhánh nhiều lần thành những đốt song song đầu sợi nấm. rồi mới hình thành đính bào tử. Các tế bào hình chai đính bào tử hướng lên cùng một phía giống như cây chổi. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 40
  45. II. Tiến hành thí nghiệm 1. Quan sát đại thể Cấy điểm vào môi trường thích hợp Nuôi cấy 3-5 ngày ở 30oC để phát triển khuẩn lạc Quan sát màu sắc – dạng mọc của khuẩn lạc. Làm tiêu bản quan sát trên kính hiển vi: Khử trùng lamen => dùng que cấy mốc lấy mẫu đưa len lamen. Nhỏ vài giọt cồn 96o lên lamen sau đó dùng giấy thấm khô. Nhỏ tiếp tục NaOH 10% => ép lam kính lên => quan sát trên kính hiển vi. Kết quả: Mẫu 5 Dạng sợi bong Mẫu 15 Dạng sợi bong Mẫu 24 Dạng thảm Mẫu 32 Dạng thảm 2. Quan sát vi thể Làm tiêu bản trước khi quan sát 3-5 ngày ở 30oC để mẫu tạo bào tử mốc. Mẫu 5 – nấm mốc Mucor: Bào tử kín, đơn bào, cuống bào tử phân nhánh, mọc lên ở vị trí bất kì của sợi nấm. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 41
  46. Mẫu 15 – nấm mốc Rhizopus Bào tử kín, đơn bào, cuống bào tử nang không phân nhánh, cuốn bào tử mọc thành cụm, cụm này mọc nhiều rễ giả. Mẫu 24 – nấm Aspergillus Sợi nấm đa bào, đầu sợi nấm mang bào tử phình to ra tạo thể bình, bào tử hở. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 42
  47. Mẫu 32 – nấm Penicillium Sợi nấm đa bào, đầu cuốn phân nhánh thành những đốt song song rồi hình thành đính bào tử. III. Mở rộng – bàn luận Ứng dụng của các nấm mốc trong đời sống: Sản xuất chao: Đặc tính sinh hoá của nấm mốc Mucor: là loại vi sinh vật có kha năng tiết ra enzyme để chuyển biến protein, chất béo, gluxit, xơ thành những phân tử đơn giản như axit amin, axit béo, các đường đơn giản. Chúng được ứng dụng để sản xuất axit, rượu, oxi hoá và các chế phẩm enzyme. Ứng dụng những đặc tính sinh hoá này vào việc sản xuất chao. Chao là một sản phẩm lên men từ đậu hũ do vi sinh vật tiết ra enzym để chuyển biến protein, chất béo, gluxit, xơ thành những phân tử đơn giản như axit amin, axit béo, các đường đơn giản. Nhờ vậy mà chao có mùi thơm, béo đặc biệt. Hình 27. Chao từ nấm Mucor Có 2 phương pháp sản xuất chao: Theo phương pháp truyền thống: người ta để bánh đậu hũ lên men tự nhiên. Theo qui mô công nghiệp: cấy bột bào tử vào bánh đậu hũ. Việc ứng dụng bột bào tử trong quá trình lên men chao không những vẫn giữ được hương vị và chất lượng như sản phẩm chao truyền thống mà còn mà còn có thể rút ngắn thời gian lên men, góp phần tránh sự tạp nhiễm. Phương pháp mới để sản xuất chao công nghiệp bằng Viên nấm Mucor: Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 43
  48. Viên mốc chứa số lượng lớn bào tử nấm mốc Actinomucor Elegans thuần chủng, thời gian bảo quản dài giúp lên men nhanh, nâng cao năng suất – chất lượng hơn so với những phương pháp trước đó. Phó-mát Camembert Đây là một của nhiều phó-mát bề mặt chín. Có nguồn gốc từ Normandy, Pháp lần đầu tiên nó được làm bởi Marie Harel vào năm 1791. Năm 1890, M. Ridel phát triển hộp gỗ nổi tiếng tạo điều kiện xuất khẩu với lượng lớn. Hình 28. Phomat Camembert Sau khi sữa đông còn rất non (ép thành bánh sữa), nó được chủng giống bởi bào tử của Penicillium camembert bằng cách phun như sương mù. Sau khi ngâm trong nước muối và đưa vào điều kiện thích hợp, sự phát triển của mốc bắt đầu tại bề mặt phó-mát trong suốt giai đoạn ủ. Vỏ cứng của phó-mát Camembert thì mỏng và trắng. Các dòng mốc chủng khác nhau có màu sắc trong khoảng từ xám lục nhạt tới trắng tinh. Bên trong của phó-mát phải là vàng nhạt với trung tâm màu trắng rắn chắc. Trong quá trình chín, các phân hoá tố (enzim) thuỷ phân đạm và chất béo của P. camemberti khuyếch tán vào trong phó-mát. Tempeh Tempeh có nguồn gốc từ Java, Indonesia nhưng cũng được phổ biến ở Hà Lan và nó đã đạt được thị trường tiêu thụ đáng kể ở Mỹ, châu Âu và Úc. Tempeh là một bánh có thể thái (cắt) được, thu được bởi phương pháp lên men bề mặt với nấm của những hạt đậu, ngũ cốc hoặc vật liệu phù hợp khác sau khi đã ngâm rồi nấu. Cơ chất được dùng nhiều và Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 44
  49. phổ biến nhất là đậu nành (Nout and Rombouts, 1990; Wood, 1998). Tempeh cung cấp một nguồn đạm thực vật rẻ tiền giàu dinh dưỡng dễ tiêu hoá và an toàn. Nó thường được ăn chỉ khi sau khi nấu hoặc rán/chiên trong dầu Đậu nành được ngâm và tách vỏ, hoặc tách vỏ khô trước rồi ngâm (cơ giới hoá như ở Hà lan). Trong quá trình ngâm sự lên men lactic tự nhiên diễn ra làm hạ thấp pH của đậu, làm cho chúng phù hợp hơn cho sự phát triển của nấm mốc và chống lại vi khuẩn gây hư hỏng và các mầm bệnh. Hình 29. Tempeh và món ăn làm từ nó Sau khi nấu sôi và làm nguội, làm cơ chất cho quá trình lên men. Mốc chức năng chính yếu là Rhizopus oligosporus và R.oryzae, chúng nảy mầm nhanh ở 37°C và sự phát triển sợi nấm nhanh của chúng đảm bảo sự chiếm ưu thế và lấn át các dòng tạm nhiễm khác như Aspergillus spp. trong vòng 30 giờ các đậu rời rạc đã được kết chặt lại nhau tạo thành khối rắn. R.oligosporus được khảo sát là thâm nhập khoảng 2mm vào sâu bên trong đậu nấu. Hoạt động enzim của Rhizopus spp. bao gồm enzim thuỷ phân protein, enzim thuỷ phân chất béo, enzim thuỷ phân các hơp chất các-bon và phosphatase. Nhờ hoạt động của các enzim này, một phần các cơ chất mạch dài bị thuỷ phân thúc đẩy cho sự tiêu hoá dễ dàng. Qui trình mới cải tiến đã được báo cáo bao gồm tiến trình bán liên tục cho lên men tempeh với nhiệt độ được điều khiển trong thùng lên men xoay vòng. Nước tương đậu nành Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 45
  50. Nó là một chất lỏng nâu xậm trong với thành phần xấp xỉ: 17% NaCl, 1,6% đạm tổng số, 1% đạm formol, 3% đường khử, 2,3% rượu alcohol và pH 4.7. Về cơ bản của quá trình chế biến (Hình 7.4) bao gồm 3 giai đoạn: đậu nành lên men trong nước muối và lọc trong. Nó được chủng giống với bào tử Aspergillus oryzae hoặc A.sojae và được ủ ở 25°C trong 2-3 ngày để thu được sự phát triển dày đặc và sự tạo bào tử xanh vàng chỉ ra rằng mức độ cao của enzim đã được tạo ra. Những enzim này bao gồm peptidases, proteinases, glutaminase, amylase, pectinases và cellulases cần thiết cho sự thuỷ phân từng phần của đạm và các hợp chất carbon của vật liệu thô. Giai đoạn 2 lên men trong nước muối diễn ra trong mẽ nước muối 22-25% NaCl để vi sinh vật gây hư hỏng không thể phát triển nhưng sự phân cắt enzim vẫn diễn ra. Tuy nhiên, trong 2 tháng đầu ở 15-20°C, vi khuẩn axít lactic (Tetragenococcus halophila) và những tháng tiếp theo ở 30°C, nấm men ưa muối (Zygosaccharomyces rouxii) sẽ phát triển, vào khoảng thời gian chín, những sản phẩm trao đổi chất của chúng thêm vào thành phần hương vị thực chất thơm ngon của nước tương. Hình 30. Nước tương lên men tự nhiên Làm giàu thêm đạm cho thực phẩm tinh bột và thức ăn gia súc Do có khả năng phân cắt vật chất các-bon, nấm là hữu dụng trong việc nâng cao giá trị dinh dưỡng của các sản phẩm phụ nông-công nghiệp sau chế biến, chẳng hạn như tinh bột chứa trong chất cặn bã khoai lang (Yang et al., 1993) hoặc bã mía đường cellulose (Moo-Young et al., 1992). Cho mục đích thêm vào các nguồn đạm rẽ tiền như (NH4)2SO4 và urea có thể biến đổi thành đạm vì thế làm giàu dinh dưỡng thêm cho thức ăn. Sản phẩm Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 46
  51. cuối cùng (sau vài ngày lên men) có thể chứa dựng xấp xỉ 30% đạm thô trên trọng lượng khô, khi sử dụng nấm Aspergillus niger, Rhizopus spp. và Neurospora sitophila. Thành phần thức ăn và gia vị có nguồn gốc từ nấm mốc a. Axít hữu cơ Axít hữu cơ được tạo ra bởi sự lên men có thể phân thành hai nhóm: (i) được tạo ra thông qua lộ trình axít carboxylic, (ii) được tạo ra trực tiếp từ đường glucose. Ở nhóm (i), axít citric là axít hữu cơ quan trọng nhất được tạo ra bới sự lên men. Sản lượng hàng năm ước tính khoảng 400.000 tấn được làm chủ yếu với Aspergillus niger nhưng Yarrowia lipolytica cũng được sử dụng. Hệ thống nuôi cấy bề mặt cũng như bề sâu (chìm) được sử dụng cho sự biến đổi những nguồn carbon rẻ tiền (mật đường) và n-alkanes. Axít citric được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, chất hương vị Trong nhóm (ii) axít gluconic (50.000 tấn/năm) được làm ra chủ yếu với vi khuẩn, nhưng A. niger và A. foetidus được sử dụng trong các qui trình nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. Axít lactic (30.000 tấn/năm) đươc làm ra chủ yếu với vi khuẩn lactic, nhưng cũng với Rhizopus oryzae và có những ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm như chất axít, nhân tố bảo quản, bột nướng (Mattey, 1992). b. Chất béo (lipids) Hàm lượng chất béo của nấm đôi khi có thể cao đến 60-80% sinh khối khô. Tuy nhiên, chất dầu và chất béo động và thực vật là rẻ tiền hơn để sản xuất, vì thế chỉ những sản phẩm đặc sản thì việc lên men là sự quan tâm về mặt kinh tế. Nói riêng, khả năng tích luỹ axít béo không no từ nấm là lý thú về quan điểm dinh dưỡng. Nhiều nấm mốc được sử dụng thương mại để tạo ra axít γ–linolenic, trên nguồn đạm và cac-bon rẻ tiền (bã nho, tinh bột, mật rỉ đường), Mucor javanicus và M. rouxii có thể phát triển trong môi trường nuối cấy chìm ở sản lượng axít γ–linolenic 0,33g/l. Những trường hợp như thế hàm lượng lipid là 7-11% của sinh khối khô và axít γ–linolenic chiếm 17-37% trọng lượng lipid (Lindberg and Hansson, 1991). c. Phân hoá tố (enzim) Trong số những phân hoá tố enzim được tạo ra bởi sự lên men, chiếm đa số là enzim thuỷ phân đạm (proteases) và enzim thuỷ phân hợp chất cac-bon (carbonhydrases). Enzime thuỷ phân đạm thu được từ Aspergillus oryzae, Penicillium Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 47
  52. roquefortii và Mucor spp. được ứng dụng trong chất tẩy rửa, và trong chế biến thực phẩm như làm nhanh chín phó-mat, làm bánh mì, sự làm mềm thịt. Enzim thuỷ phân hợp chất carbon bao gồm enzim thuỷ phân tinh bột (α-amylase, glucoamylase) được tạo ra bởi Aspergillus oryzae và A. niger và được ứng dụng trong làm bánh mì, ủ bia rượu, và bánh kẹo. Những carbonhydrases khác là cellulase được tiết ra bởi A. niger, Penicillium spp. và Trichoderma reesei; enzim thuỷ phân pectin (pectinases) được tạo ra bởi Aspergillus spp.; và β–glucanase được tạo ra bởi A. niger, Penicillium spp. những enzim này được ứng dụng để thúc đẩy sự tiêu hoá của thực phẩm có sợi, sự tinh lọc nước trái cây và bia Những enzim quan trọng khác bao gồm enzim thuỷ phân chất béo (lipases) được tạo ra bởi Mucor spp. và A. niger ứng dụng cho sự phát triển hương vị các sản phẩm từ sữa. Glucose oxidase được tạo ra bởi A. niger đã có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và y học Mặt khác, có sự phong phú của những cơ chất có thể được tạo ra bởi nấm, bao gồm axít amin, các hợp chất đường, các sinh tố vitamins, phẩm màu và các thành phần hương vị Tuy nhiên cũng phải nói tới tác hại mà nấm mốc mang lại: Penicillium, Mucor, Rhizopus, Aspergillus phân giải chất đường, bột làm cho thực phẩm bị biến chất, thành phần dinh dưỡng giảm, cảm quan thay đổi. Aspergillus flavus hay có trong lạc, ngô, cùi dừa khô, đỗ tương khô tiết ra độc tố Aflatoxin gây bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh ung thư. Hình 31. Nấm mốc tân công nông sản, trái cây Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 48
  53. BÀI 8: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG DỊ HOÁ CARBONHYDRATE I. Sơ lược lý thuyết 1. Carbohydrat Carbohydrate bao gồm: - Đường đơn: glucose, galactose, fructose. - Đường phức gồm: o Đường oligo: sacharose, lactose, maltose. o Đường đa phân tử: tinh bột và cellulose. 2. Quá trình chuyển hoá Carbohydrat Quá trình chuyển hóa từ đường phức thành đường đơn chủ yếu chuyển hóa theo 2 con đường đó là quá trình lên men và quá trình hô hấp. - So sánh lên men và hô hấp: o Giống nhau: . Đều là quá trình dị hóa các hợp chất hữu cơ để cung cấp năng lượng, nguyên liệu cho tế bào vi sinh vật. . Tạo sản phẩm trung gian: acid pyruvic . Có sự tham gia của hệ enzyme oxy hóa khử . Quá trình xảy ra là chuỗi của các phả ứng oxy hóa khử o Khác nhau: Bảng 13. So sánh hô hấp và lên men Hô hấp Lên men Vị trí xảy ra Màng tế bào vi sinh vật Tế bào chất của vi sinh vật Tham gia của O2 Cần O2 Không cần O2 Mức độ oxi hoá Hoàn toàn Không hoàn toàn Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 49
  54. Chất cho nhận e Chất cho là hợp chất hữu cơ Chất cho và nhận electron và chất nhận là hợp chất vô đều là hợp chất hữu cơ. cơ. Năng lượng Nhiều Ít Sản phẩm CO2 + H2O Các acid hữu cơ, ethanol, glycerol - So sánh giữa hô hấp yếm khí và hô hấp hiếu khí: o Giống nhau: . Đều sinh năng lượng . Đều tạo sản phẩm trung gian acid pyruvic . Xảy ra trong quá trình dị hóa o Khác nhau: . Hiếu khí phản ứng oxy hóa xảy ra hoàn toàn, còn yếm khí xảy ra không hoàn toàn . Hiếu khí tạo sản phẩm cuối CO2 + H2O, còn yếm khí sản phẩm cuối H2 II. Tiến hành thí nghiệm 1. Làm môi trường OF (M9) Tiến hành làm môi trường với thành phần các chất như trong hướng dẫn của sách thí nghiệm. Thu được 1l mẫu. Chia đều cho 6 tổ: 150ml/tổ Ống nghiệm: 10 ống/ tổ. Cho vào mỗi ống 10ml mẫu. Ống dầu paraffin: ½ ống. Hấp tiệt trùng Để nguội. Sau đó tiến hành cho vi sinh vật vào: o Mỗi loại VSV (0.2ml) làm thành 2 môi trường (hiếu khí và yếm khí): 2x4 VSV = 8 ống nghiệm. o Hai ống nghiệm còn lại (ống kiểm chứng) thực hiện tương tự như 8 ống trên nhưng không cho vi sinh vật vào. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 50
  55. o Giữ mẫu trong tủ ấm 2-3 ngày. Sau đó quan sát. 2. Làm môi trường yếm khí Sau khi cho môi trường M9 và VSV vào ống nghiệm => Đuổi khí (nghiêng trên ngọn lửa đèn cồn) => Gắn nút bong => Nhỏ đèn cầy kín miệng ống nghiệm => Bao nylong một lần nữa. 3. Làm môi trường tinh bột (M8) o Tiến hành làm môi trường với thành phần các chất như trong hướng dẫn của sách thí nghiệm. o Hấp tiệt trùng o Để nguội => đặc o Hé mở hộp petri o Lấy 1 ít giống A.oryza o Gieo cấy điểm bằng cách lật ngược hộp petri chấm vào giữa hộp Bao gói, nuôi tủ ấm 2 – 3 ngày. Ghi nhận sự phát triển của khuẩn lạc, sau đó nhỏ dung dịch luygol lên trên mặt petri. III. Kết quả - mở rộng Sau 2- 3 ngày nuôi mẫu trong tủ ấm, kết quả: 1. Thí nghiệm khả năng dị hoá các loại đường Nấm men Cả 2 ống hiếu khí và yếm khí đều đổi màu từ xanh sang vàng do xảy ra quá trình dị hoá carbonhydrat. Trong môi trường hiếu khí: sản phẩm tạo ra là CO2 + H2O. Trong môi trường yếm khí: sản phẩm tạo ra là axit. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 51
  56. Hình 32. Mẫu nấm men hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) so với mẫu chuẩn Bacillus Subtilis Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng. Mẫu hô hấp hiếu khí vàng nhiều hơn. Hình 33. Mẫu hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) Lacto bacillus Cả 2 mẫu hiếu khí và yếm khí đều chuyển màu, từ xanh sang vàng xanh. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 52
  57. Theo lý thuyết mẫu yếm khí vàng nhiều hơn do quá trình oxi hoá xảy ra mạnh hơn nhưng do quá trình đuổi khí không hoàn toàn nên màu sắc mẫu yếm khí thực tế khác lý thuyết. Hình 34. Mẫu Lacto bacillus hô hấp hiếu khí (bên trái) và yếm khí (bên phải) Nấm mốc A.Oryzae Mẫu hô hấp hiếu khí đổi màu từ xanh sang vàng đậm Mẫu hô hấp yếm khí cũng đổi màu sang vàng. Điều này sai với lý thuyết do nấm mốc thường hô hấp hiếu khí hoàn toàn, môi trường sẽ không đổi màu. Lý do sai số: quá trình đuổi khí thực hiện chưa nghiêm ngặc hoặc do canh trường vi sinh vật tạp nhiễm VSV khác ngoài nấm mốc. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 53
  58. Hình 35. Mẫu A.oryzae hô hấp hiếu khí (bện trái) và yếm khí (bên phải) 2. Thí nghiệm khả năng thuỷ phân Carbohydrat D = 4cm d = 3.5cm Hình 36. Mẫu trước và sau khi nhỏ luygol Phần nào tinh bột thủy phân môi trường sẽ trong suốt. Không thủy phân môi trường sẽ có màu xanh. Ứng dụng khả năng dị hoá các loại đường của VSV vào trong sản xuất: + Nấm men: ứng dụng hô hấp yếm khí vào quá trình sản xuất thực phẩm như làm cơm rượu, muối chua, . Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 54
  59. + A. Oryzae: ứng dụng sự thuỷ phân cả nó vào việc sản xuất nước tương, hệ enzyme của nó thuỷ phân bã đậu nành tạo môi trường lên men axit xitric tốt nhất. BÀI 9: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG I. Nguyên lý Không phải bất cứ vi sinh vật nào cũng có khả năng lên men, tuỳ từng loại đường. Sản phẩm của quá trình đó: axit hữu cơ, khí, Sự thay đổi Ph: làm đổi màu mẫu thí nghiệm. Sử dụng ống Durham quan sát bọt khí tạo thành. Một số vi khuẩn tạo váng trên bề mặt/ tạo tủa (sinh khối) phía dưới ống nghiệm. II. Tiến hành thí nghiệm 1. Làm môi trường M10 4 erlen chứa 4 loại đường khác nhau với nồng độ 5%: 5g đường mỗi loại (glucose, maltose, lactose, saccharose) pha với 100ml nước cho mỗi erlen. 1 erlen pha môi trường lên men: peptone – 10g, cao nấm men – 2,5g, Bromthymol Blue – 2ml, hòa tan với nước cất. Sau đó dùng máy đo pH và NaOH để đưa pH của dung dịch về pH = 7±0.2. Thêm nước cất đưa về thể tích 900ml. Hút 9ml môi trường phân phối vào 13 ống nghiệm. Cho ống Durham vào (lưu ý cho ống Durham thả thẳng đứng vào để tránh có bọt khí) Đậy nắp ống nghiệm và bao gói cẩn thận. Đem tất cả 4 erlen dung dịch đường và 13 ống nghiệm hấp tiệt trùng. 2. Cấy vi sinh vật vào môi trường: Lần lượt cho 1ml của 4 loại đường vào môi trường, mỗi loại cho vào 3 ống nghiệm. 1 ống nghiệm sẽ được cho một loại đường bất kỳ vào để làm ống chuẩn. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 55
  60. Tiếp tục cho 0,2ml của 3 loại vi sinh vật: nấm men, L.acidophillus, Acetobacterxylium lần lượt vào trong 3 ống nghiệm của mỗi loại đường. Bao gói cẩn thận, nuôi tủ ấm ở nhiệt độ 28-300C trong vòng 24-48 giờ, sau đó quan sát và ghi kết quả. III. Kết quả Sacarose Lactose Maltose Glucose Nấm men -Đổi màu: xanh Không đổi Không đổi -Đổi màu: xanh lá => vàng màu: dd vẫn màu: dd vẫn lá => vàng sậm. giữ màu xanh giữ màu xanh sậm. -Có bọt khí lá. lá. -Có bọt khí trong ống trong ống Durham. Durham. L.acidophillus Màu vàng ánh Màu vàng ánh -Đổi màu Màu vàng ánh xanh (xanh xanh (vàng sang vàng. xanh (vàng nhiều hơn vàng) nhiều hơn nhiều hơn xanh) xanh, nhiều hơn ống với glucose) Aceto Vàng ánh xanh. Vàng ánh Vàng ánh Vàng ánh xanh. bacterxylium xanh. xanh. Hình ảnh Hình 37. Nấm men trong môi trường Sacarose-lactose-maltose-glucose (trái). Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 56
  61. Hình 38. L.acidophillus trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L. Hình 39. Acetobacterxylium trong trong môi trường theo thứ tự S-L-M-L. IV. Mở rộng Việc tìm hiểu xem loại VSV nào có khả năng lên men loại đường nào và loại nào là tốt nhất nhằm mục đích chọn được chủng vi sinh vật tối ưu tuỳ theo mục đích sản phẩm. Ví dụ: + Nấm men có khả năng lên men mạnh Glucose, Sacarose. Ứng dụng lên men nguyên liệu giàu những loại đường này: các dịch quả => tạo rượu. + Acetobacterxylium có khả năng lên men hầu hết các loại đường nên phạm vi ứng dụng rộng. Nguyễn Thị Kim Tiến _ 61103601 | 57