›
›

Bài giảng Thực hành kỹ thuật di truyền

pdf 44 trang vanle 4691
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng Thực hành kỹ thuật di truyền", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfbai_giang_thuc_hanh_ky_thuat_di_truyen.pdf

Nội dung text: Bài giảng Thực hành kỹ thuật di truyền

  1. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền LỜI MỞ ĐẦU Đây là tài liệu hướng dẫn kỹ thuật, giáo trình này đương nhiên giới thiệu các bước kỹ thuật thường được thực hiện trong di truyền và sinh học phân tử. Nhưng quan trọng hơn vẫn là thơng qua các bước kỹ thuật cụ thể giúp người học nắm được những điểm cơ bản về nghiên cứu phát triển sinh học phân tử được các nhà nghiên cứu nhiều thế hệ sáng tạo và thực hiện trong quá khứ. Nhờ những kết quả nghiên cứu đĩ, chúng tơi đã vẽ lại bức tranh tồn cảnh về thế giới như đã được khái quát hĩa trong nhiều tài liệu sinh học và các thí nghiệm thực hành. Mong muốn của người biên soạn là người học nắm được những điểm cốt yếu của kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử. Trên cơ sở đĩ phát triển những kỹ thuật sẽ cải tiến những bước hoặc quy trình cho phù hợp với thực tiễn nghiên cứu. Với những yêu cầu cao bao quát cả lịch sử phát triển lẫn cập nhật hĩa kiến thức, việc biên soạn một giáo trình thực hành về lĩnh vực này gặp rất nhiều khĩ khăn. Tuy vậy, chúng tơi cố gắng đưa vào tài liệu này những vấn đề liên quan đến thực hành sinh học phân tử chọn lọc từ những thành quả mà nhiều nhà nghiên cứu đã mơ tả trong nhiều bài báo chuyên ngành liên quan sinh học, một số thuyết trình hướng dẫn của một số hướng cung cấp thiết bị nghiên cứu sinh học cũng như từ kinh nghiệm cá nhân. Nhiều kỹ thuật và "thực đơn" cụ thể giới thiệu trong tài liệu này rất cũ nhằm giúp người học tránh những quan niệm đơn giản hĩa con đường nghiên cứu khoa học. Những "thực đơn" mới liên quan được giới thiệu nhiều khi ở dưới dạng khái quát. Người học cần lưu ý rằng hầu như tất cả những "thực đơn" được đưa ra đều là kết quả của kinh nghiệm nghiên cứu và suy luận khoa học của cá nhân trong quá trình "tối ưu hĩa". Vì vậy, người làm thí nghiệm cĩ thể cải tiến để cĩ kết quả tốt hơn phù hợp điều kiện của mình. Khĩ khăn khác mà việc biên soạn gặp phải là yêu cầu dung lượng giáo trình trong 60 tiết hạn chế số lượng trang in cũng như các kỹ thuật được chọn lọc. Để bù lại, học viên cần tìm nhiều nội dung bổ trợ trong các giáo trình lý thuyết liên quan trong bộ sách này, như "Nhập mơn sinh học phân tử", "Cơng nghệ sinh học", "Cơng nghệ DNA tái tổ hợp", "Cơng nghệ chuyển gen động vật, thực vật" và "Cơng nghệ protein" Tuy nhiên, các kỹ thuật được giới thiệu cũng khơng thể tránh khỏi sự buồn tẻ của các thử nghiệm, tuyển chọn kết quả thử nghiệm, sàng lọc sản phẩm, dùng sản phẩm này làm nguyên liệu cho các thử nghiệm tiếp theo Bên cạnh đĩ, dù được chuẩn bị khá kỹ càng, chúng tơi khơng tránh khỏi sai sĩt, rất mong được nhận sự gĩp ý xây dựng của các đồng nghiệp và người đọc. BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC - KHOA CNSH & KTMT Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 1
  2. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 1: MỘT SỐ THIẾT BỊ THƠNG DỤNG VÀ CÁC THAO TÁC CƠ BẢN I – MƠ TẢ VÀ CÁCH SỬ DỤNG MỘT SỐ DỤNG CỤ THÍ NGHIỆM Ngồi các dụng cụ thường dùng cho các thao tác vi sinh, sinh hố như dụng cụ thuỷ tinh (Ống nghiệm, ống hút, becher, đĩa petri ), que cấy, giá đỡ ống nghiệm , trong thao tác sinh học phân tử, người ta cịn sử dụng một số dụng cụ đặc trưng sau: - Ống eppendorf: là loại ống nghiệm bằng nhựa polythylene hay polypropylene, dùng để chứa những thể tích dung dịch nhỏ. Cĩ nhiều cỡ thể tích 0,2ml; 0,5ml; 1,5ml; 2ml. Các eppendorf cĩ thể được hấp khử trùng ở điều kiện thơng thường (1atm, 1200C, 20 phút), chịu được nhiệt độ thấp (-200C) và các dung mơi hữu cơ như chloroform Trong những thí nghiệm cần độ an tồn cao, tránh sự thất thốt mẫu chứa, người ta sử dụng eppendorf cĩ ngấn an tồn. - Micropipette (pipetman): là dụng cụ dùng để thu nhận những thể tích nhỏ, cần độ chính xác cao; thường đựơc chia thành 4 cỡ tuỳ theo thể tích dung dịch tối đa cho mỗi lần hút: + Cỡ nhỏ: thể tích tối đa 10l - 20l - 50l (0,5 -10l hoặc 5 – 50l) + Cỡ trung bình: thể tích tối đa 100l - 200l (10-100 l hoặc 20-200l) + Cỡ lớn: thể tích tối đa 1000l (100-1000l) + Cỡ rất lớn: thể tích tối đa 5000l (ít sử dụng) * Lưu ý: Cần thận trọng khi hút các dung mơi hữu cơ, khơng để gần nguồn nhiệt (đèn cồn), khơng hấp khử trùng (trừ khi cĩ chỉ định cảu hãng sản xuất), tuyệt đối khơng điều chỉnh dưới ngưỡng tối thiểu và trên ngưỡng tối đa cho phép. - Các micropipette luơn luơn được sử dụng với các đầu tip. Các típ này thường chỉ được sử dụng 1 lần và cũng gồm 4 loại tương ứng với 4 kích cỡ đã nêu. Các típ được tiệt trùng bằng hấp khử trùng ở điều kiện thơng thường. II – MỘT SỐ NGUYÊN TẮC PHA HĨA CHẤT Hố chất được pha với nước cất hai lần và khử trùng ở điều kiện thơng thường. Đối với một số hố chất khơng thể thanh trùng bằng nhiệt, việc thanh trùng được tiến hành với những phin lọc cĩ đường kính lỗ lọc là 0,2l hoặc 0,45l Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 2
  3. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Các dung dịch thường được pha và bảo quản dưới dạng đậm đặc (dung dịch mẹ). Dung dịch mẹ được lỗng với nước cất hai lần khử trùng để đạt nồng độ cần mỗi lần sử dụng. Dung dịch đã pha cĩ thể bảo quản ở nhiệt độ phịng thí nghiệm, ở nhiệt độ 40C hoặc nhiệt độ lạnh sâu -200C theo khuyến cáo cho từng loại hố chất. Dung dịch bảo quản ở -200C thường đựơc phân thành những phân đoạn nhỏ. Mỗi lần sử dụng chỉ cần giải đơng một phân đoạn. Lưu ý: Các loại hố chất dùng trong thao tác với acide ribonucleic thường được để riêng, khơng lẫn lộn với loại hố chất dùng cho các mục khác. Người thao tác phải mang găng tay khi tiếp xúc với các bình chứa hố chất. Trong lúc thực hiện thao tác cân, tuyệt đối khơng dùng dụng cụ múc mà trút trực tiếp vào bình chứa hoặc giấy bạc Chuẩn bị các dung dịch gốc Dung dịch đệm khác nhau trong đĩ cĩ dung dịch đệm sử dụng cho điện di nên chế thành dung dịch gốc cĩ nồng độ cao để khi cần thì pha lỗng hay hỗn hợp rất tiện lợi. Dưới đây là một số dung dịch nên pha sẵn ở dạng dung dịch gốc. 1) Tris-HCl 2M (pH 7,5): 121,1 g/500 ml, hoặc 1M: 121,1 g/1.000 ml. Trizma- base (của Sigma ) khi cần điều chỉnh pH cần phải thêm lượng lớn HCl, vì vậy khi đĩ nhiệt độ dung dịch tăng lên. Khi nhiệt độ tăng pH của dung dịch giảm, khi nhiệt độ giảm pH dung dịch tăng. Cho nên cần điều chỉnh pH đến gần mức cần thiết (pH 7,5), để nguội đến nhiệt độ phịng rồi điều chỉnh pH cho đúng. Sau đĩ cần hấp cao áp tiệt trùng. 2) NaCl 5M: 146,1 g/500 ml nước cất. Hấp cao áp tiệt trùng. 3) EDTA 0,5M (pH 8,0): pha 93,05 g Na2EDTA.2H2O vào trong khoảng 400 ml nước cất, vừa khuấy vừa thêm NaOH tinh thể để đạt đến pH 8,0 rồi thêm nước cho đủ 500 ml. Nếu pH khơng đạt đến gần 8,0 th. ở nhiệt độ ph.ng EDTA khơng tan. Hấp cao áp tiệt trùng. 4) SDS 10% hoặc SDS 20%: h.a tan SDS trong nước cất ở 65oC sau 1 giờ xử lý, lọc qua lọc vi khuẩn tiệt trùng. 5) SSC 20× (standard saline citrate đậm 20 lần): NaCl 175,3 g, sodium citrate 88,2 g, pha nước cho đủ 1 lít, chỉnh bằng NaOH 0,1N hoặc HCl 0,1N đến pH 7,0. Hấp cao áp tiệt trùng. (SSC 1× là dung dịch NaCl 0,15M với sodium citrate 0,015M). 6) MgCl2 1M: h.a tan 20,3 g MgCl2.6H2O vào 100 ml nước. Lọc khử trùng. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 3
  4. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 7) NaOH 10N: 200 g/500 ml. Bảo quản trong lọ chất dẻo. 8) DTT (dithiothreitol) 1M: 3,09 g/20 ml hoặc DTT 0,5M: 3,09 g/40 ml. Lọc khử trùng. Chia nhỏ ra ống 0,5 ~ 1 ml bảo quản ở −20 ºC. 9) Nucleotide triphosphate: chế thành dung dịch bảo tồn 10 ~ 100 mM, pha nước để thành dung dịch cĩ lượng nhiều hơn lượng cần dùng chút ít. Dung dịch này cĩ tính acid nên cần thêm bột Tris-base cho đến pH trung tính bằng cách kiểm tra giấy đo pH. Lấy một phần kiểm tra OD ở bước sĩng cĩ độ hấp thụ cực đại để điều chỉnh nồng độ chính xác. Các nucleotide cĩ bước sĩng hấp thụ cực đại như bảng sau: Bảo quản ở −20 ºC. 10) TBE 20×: Tris 121,1 g, Na3EDTA.3H2O 8,2 g, boric acid 60 g, pha nước cho đủ 1 lít, pH sẽ khoảng 8,2. Khơng cần điều chỉnh pH. Lượng trên tương ứng với: 1 M Tris, 20 mM Na3EDTA và 0,97 M boric acid. Dung dịch này dùng cho điện di gel polyacrylamide. 11) Howly 20×: Tris 96,9 g, trisodium acetate 54,4 g, Na3EDTA.3H2O 3,7 g. Điều chỉnh pH bằng acetic acid. Hấp cao áp diệt trùng. (Tương đương: 0,8 M Tris- acetate (pH 7,8), 0,4 M sodium acetate, 20 mM EDTA). 12) Sodium acetate 3M (pH 5,2): trisodium acetate 81,62 g, pha vào 200 ml nước. Dung dịch sẽ cĩ độ pH 5,2. III- MỘT SỐ THIỆT BỊ THƠNG DỤNG 1 – Máy lắc ổn nhiệt: được sử dụng cho các phản ứng cần nhiện độ ổn định (phản ứng enzyme, lai ). Máy bao gồm một bể nước cĩ nhiệt độ điều chỉnh được đi kèm với bộ phận lắc 2 – Tủ cấy vơ trùng: được sử dụng khi cần thao tác trong điều kiện vơ trùng. Tủ cấy phải luơn được giữ sạch, giữ cho bề mặt khu vực thí nghiệm bằng cách khử trùng bằng cồn 70o. Trước và sau khi sử dụng, phải thanh trùng bên trong tủ bằng cách bật đèn tử ngoại trong ít nhất 15 phút. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 4
  5. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 3- Máy li tâm: dùng để phân tách và thu nhận các phần tử khác nhau trong một dung dịch và được điều chỉnh ở các mức độ ly tâm khác nhau tùy theo mong muốn của người sử dụng. Nguyên tắc: Sự phân tách các phần tử khác nhau trong một dung dịch được thực hiện dựa trên vận tốc lắng khác nhau của chúng dưới tác động của một lực li tâm. Tuỳ thuộc vào đặc điểm dùng để phân tách (khối lượng hay tỉ trọng của các phần tử vật chất) mà người ta chia làm hai loại: Li tâm phân đoạn và li tâm đẳng tỉ trọng. Li tâm phân đoạn (li tâm vùng) Phương pháp này cho phép phân tách các phần tử vật chất dựa vàokhối lượng của chúng. Các phần tử vật chất sẽ di chuyển về phía đáy ống li tâm với vận tốc tuỳ thuộc lực li tâm và sự ma sát giữa chúng với dung dịch li tâm tức tuỳ thuộc vào hình dạng các phần tử). Như vậy trong li tâm vùng, để thu nhận một loại phần tử vật chất nhất định cần sử dụng một lực li tâm và thời gian li tâm nhất định phù hợp Li tâm đẳng tỉ trọng Đây là phương pháp phân tách các phần tử vật chất dựa vào tỉ trọng giữa chúng. Phương pháp này cho hiệu quả phân tách ất cao, các phân đoạn được phân tách rất thuần khiết. Ống li tâm chứa một dung dịch cĩtỉtrọng tăng dần từ miệng đến ống tạo nên một gradient tỉ trọng. Tỉ trọng của các phần tử cần phân tách phải nằm trong vùng gradient tỉ trọng này. Trong quá trình li tâm, các phần tử vật chất sẽ lắng xuống đáy ống, khi đến vùng dung dịch cĩ tỉ trọng tương đương, phân tử sẽ dừng lại do đã đạt trạng thái cân bằng. Trạng thái này khơng thay đổi dù tăng thời gian hay lực li tâm. Các loại phân tử thường được dùng để thiết lập gradient tỉ trọng là Saccharose hay Glycerol khi cần phân đoạn các bào qua, Cesium chloride (CsCl) khi cần phân tách protein và nucleic acide. IV- THỰC HÀNH Sinh viên quan sát các thiết bị, tập cách sử dụng micropipette, các thiết bị cần thiết cho việc thí nghiệm và ghi nhớ các cơng thức pha chế dung dịch mẹ. V – YÊU CẦU Sinh viên cĩ khả năng sử dụng thành thạo, đúng quy cách, yêu cầu và mục đích từng loại hố chất, dụng cụ, thiết bị trong các quá trình thực hành sau này. Chụp hình các dụng cụ, thiết bị dùng trong thực hành các kỹ thuật di truyền và vận dụng thành thạo từng dụng cụ & thiết bị trong kỹ thuật di truyền. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 5
  6. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 2 : TÁCH CHIẾT DNA THEO PHƢƠNG PHÁP BOOM I –NGUYÊN TẮC: Việc thu nhận DNA từ mơ gan được tiến hành thơng qua nhiều bước. Phân đoạn nhân được cơ lập trong bước thứ nhất và DNA được tách chiếttrong bước thứ hai chủ yếu dựa trên kỹ thuật li tâm vùng. Các giai đoạn cơ bản của tách chiết DNA bao gồm: (1) Phá màng tế bào và màng nhân (2) Loại protein (3) Tủa DNA Phá màng tế bào và màng nhân Mơ gan thường được sử dụng làm vật liệu để cơ lập nhân và tách chiết DNA vì tế bào gan tương đối đồng nhất về kích thước, thích hợp cho việc phân đoạn kỹ thuật li tâm. Người tacĩ thể phá màng tế bào bằng phương pháp hố học, cơ học hay siêu âm. Để đảm bảo sự tồn vẹn cấu trúc của các bào quan, tế bào được phá vỡ trong những điều kiện gần với điều kiện sinh lý bình thường (dung dịch đẳng trưởng, pH sinh lý, sự hiện diện của một số Ion ). Huyền phù tế bào trong mơi trường vừa kể cĩ tên là dịch đồng nhất (homogenate). Dịch đồng nhất được phân đoạn qua li tâm, các bào qua sẽ được phân tách dựa vào khối lượng của chúng. Loại protein Để thu nhận DNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ những thành phần nhiễm, mà quan trọngnhất là Protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hồ tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acide / protein) trong hai pha khơng hồ tan Phenol, chloroform). Một số tác nhân tách chiết thơng dụng là: (1) Phenol: một chất biến tính protein mạnh, khơng hồ tan nucleic acid (2) Chloroform: thường đi kèm với phenol, cĩ tác dụng bổ sung và loại bỏ hồn tồn dấu vết phenol, chloroform cũng làm tan biến tính protein nhưng yếu hơnphennol; isoamylaclohol làm giảm bọt , ổn định hai pha nước và chloroform sau li tâm (3) Isobutanol: cĩ hai cơng dụng là tách các phân tử hữu cơ như ethidium bromide và làm đậm dung dịch nucleic acid Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 6
  7. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền (4) Cũng cĩ thể tĩm bắt Nucleic Acid bằng các hạt Celite mà khơng cần bắt các protein biến tính Kết tủa DNA (DNA precipitation) Sau cơng đoạn tách chiết, nucleic acid được tinh sạch nằm trong một thể tích dung dịch lớn. Sự tủa kết hợp với li tâm cho phép thu nhận nucleic acid dưới dạng cặn tủa dễ bảo quản và khi cần cĩ thể hồ lại trong nước tho nồgn độ mong muốn. Cĩ các kiểu chính: - Tủa bằng ethanol: được thực hiện ở nồng độ muối cao, nồng độ ethanol cao (2-2,5 thể tích ethanol/thể tích dung dịch cần tủa). Nhiệt độ thấp thúc đẩy sự tủa - Tủa bằng isopropanol: khác với kiểu tủa trên là khơng cần muối, cĩ thể sử dụng 0,8 – 1 thể tích isopropanol/thể tích dung dịch cần tủa. Những đoạn DNA thật ngắn dù ở nồng độ cao cũng khơng tủa bằng cách này nên cĩ thể dễ dàng loại chúng II- DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT 1 – Hố chất Dung dịch Diatom - Nước cất - HCl đđ - Hạt celite (diatom) Dung dịch đệm li giải L6 - Guanidine thyocynate - Tris HCl - EDTA - Triton X-100 (hoac SDS 10%) Dung dịch đệm rửa L2 - Guanidine thyocynate - Tris HCl Triton X -100 SDS 10% Chloroform: isoamylalchohol (24:1) Dung dịch TE 10X (Tris 0,1M – EDTA 0,001M) Ethanol tuyệt đối Ethanol 70% Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 7
  8. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Dung dịch acétol 2 – Vật liệu và dụng cụ Mơ động vật Eppendorf 1,5ml Eppendorf 2ml Pipetman các loại 20l – 100l, 200l - 1000l đầu típ tương ứng Pipette pasteur Que thuỷ tinh đầu uốn cong Ống nghiệm thuỷ tinh Cốc đựng đá Cốc đựng típ và chất thải Vải lược, dao cắt Máy nghiền Máy li tâm Mỗi nhĩm chuẩn bị 2 Eppendorf 1.5ml chứa: - Dung dịch L6 900l - Dung dịch diatom 20 l - Huyết thanh hoặc mẫu mơ 100l III – PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tiến hành theo các bước sau Bƣớc 1 Nhĩm trực cân 30g mẫu mơ động vật bổ sung 70ml nước cất, nghiền nhỏ và làm lạnh trong đá. Dùng vải lọc để lọc phần nghiền để thu dịch đồng nhất và tiếp tục được giữ lạnh trong đá Bƣớc 2 Mỗi nhĩm bổ sung vào eppendorf 1.5 (chứa L6 và Diatom) 100l dịch đồng nhất, tiến hành vortex trong 10 phút sau đĩ ly tâm 13.000vịng/phút trong 20 giây Bƣớc 3 Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 8
  9. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Hút bỏ phần dịch nổi và chừa khoảng 100l phần dịch cặn. Bổ sung 1ml dd L2, đem ly tâm 13.000vịng/phút trong 10 giây. Tiếp tục lặp lại bước 3 thêm hai lần nữa. Bƣớc 4 Rửa bằng 1ml ethanol 70% (thao tác tương tự bước 3) 2 lần. Rửa 1 lần bằng 1ml acétone. Sau đĩ hút bỏ acétone và để khơ tự nhiên. Bƣớc 5 Bổ sung 60l dd TE 1X đem Vortex 10 phút; sau đĩ ly tâm tiếp 13.000vịng/phút trong 20 giây. Hút 200l phần dịch nổi (chứa ADN) qua 1eppendorf khác và bảo quản lạnh. IV – YÊU CẦU Mỗi nhĩm thu nhận DNA vào một eppendorf sạch cĩ ghi tên nhĩm, lưu trữ để làm nguyên liệu cho bài sau V - TRẢ LỜI CÂU HỎI 1. Nêu các vai trị và cấu tạo của các hĩa chất dùng trong bài như dung dịch L2, L6 hay Diatom? 2. Giải thích tại sao lại sử dụng L2, L6 hay Diatom trong việc tách chiết DNA? 3. Cĩ thể thay thế mẫu gan bị thành các mẫu nguyên liệu khác khơng như mẫu tĩc, mẫu da hay mẫu máu ở người? 4. Mục đích của việc ly tâm hay vortex nhiều lần là gì? 5. Nêu vai trị và tác dụng của ethanol và acetone trong tách chiết DNA. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 9
  10. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 3 : TÁCH CHIẾT RNA TỒN PHẦN CỦA VI KHUẨN I –NGUYÊN TẮC: Việc tách chiết RNA cũng gồm những bước cơ bản như tách chiết DNA : (1) Phá màng tế bào (2) Loại protein (3) Tủa RNA Nhưng RNA là phân tử dễ bị thuỷ giải bởi RNase, khĩ bảo quản nguyên vẹn trong quá trình tách chiết nên trong thao tác cần tuân thủmột số nguyên tắc chung : - Sử dụng một số chất cĩ kả năng biến tính Rnase, thơng dụng nhất là guanidinium thiocyanate. Nước được sử dụng thường được xử lý với DEPC (Diethlpyrocarbonate) để loại Rnase - Sử dụng phenol pH 4.0 để ức chế RNase, loại protein và DNA - Thao tác trong điều kiện nghiêm ngặt tối đa: lạnh, mang găng tay, thao tác trong tủ cấy vơ trùng Trong bài này, phenol và guanidinium thiocyanate cĩ trong thành phần dd Trizol là những chất biến tính protein mạnh. Khi xử lý với hai hố chất này, tế bào vi khuẩn sẽ phá vỡ và giải phĩng các thành phần nội bào: DNA, RNA, protein Sau khi li tâm, dung dịch vi khuẩn xử lý với Trizol sẽ phân tách thành hai lớp: lớp dưới là phenol chứa DNA, lớp trên là nứơc chứa RNA. Phần protein bị biến tính sẽ nằm ở mặt phân cách hai lớp này và bị loại bỏ cùng với DNA trong pha phenol. Ngồi tác dụng biến tính protein, phenol ở pH 4.0 cịn cĩ tác dụng hấp thụ DNA vào pha phenol. Vì vậy, phần dịch nổi ở trên chỉ cịn chứa RNA. RNA sẽ thu nhận bằng cách tủa với isopropanol lạnh. Phương pháp tách chiết RNA này cho phép thu nhận RNA tồn phần cĩ chất lượng đủ đảm bảo cho các thao tác sinh học phân tử tiếp theo. II- DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT 1 – Hố chất Dung dịch phenol 4 pH Ethanol 70% bảo quản lạnh Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 10
  11. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Potasium acétate 5% 2 – Vật liệu và dụng cụ Vi khuẩn E.Coli hoặc nấm men Eppendorf 1,5ml Eppendorf 2ml Pipetman các loại 20l – 100l, 200l - 1000l đầu típ tương ứng Pipette pasteur Ống nghiệm thuỷ tinh Cốc đựng đá Cốc đựng típ và chất thải Vải lược, dao cắt Máy nghiền Máy li tâm Mỗi nhĩm chuẩn bị 2 Eppendorf 1.5ml chứa: - Dung dịch phenol 600l III – PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tiến hành theo các bước sau: Bƣớc 1 Nhĩm trực cân 30g mẫu men, bổ sung 70ml nước cất, nghiền nhỏ. Dùng vải lọc để lọc phần nghiền để thu dịch đồng nhất. Bƣớc 2 Mỗi nhĩm bổ sung vào eppendorf 1.5 thêm 100l dịch đồng nhất, tiến hành vortex trong 10 phút sau đĩ ly tâm 5.000vịng/phút trong 10phút. Bƣớc 3 Hút phần dịch nổi khoảng 500l. Đem ly tâm 7.000vịng/phút trong 10 phút. Bƣớc 4 Thu 400l dịch nổi vào Eppendorf khác, bổ sung 100l potassium acétat 5% và 500l ethanol lạnh.Vortex 10 phút (ủ lạnh và vortex gián đoạn). Ly tâm 7000vịng/phút trong 15 phút. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 11
  12. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bƣớc 5 Hút bỏ dịch nổi, bảo quản lạnh âm. IV – YÊU CẦU Mỗi nhĩm thu nhận RNA vào một eppendorf sạch cĩ ghi tên nhĩm, lưu trữ để làm nguyên liệu cho bài sau. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 12
  13. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 4 ĐỊNH LƢỢNG NUCLEIC ACID BẰNG KỸ THUẬT ĐO MẬT ĐỘ QUANG I - NGUYÊN TẮC Ánh sáng khi đi qua mơi trường lỏng sẽ bị các phần tử vật chất trong mơi trường đĩ hấp thu một phần. sự hấp thu ánh sáng gia tăng khi nồng độ các phần tử vật chất trong mơi trường đĩ gia tăng. Dựa vào nguyên lý trên người ta cĩ thể đo nồng độ các phần tử vật chất trong mơi trường lỏng thơng qua mối quan hệ giữa cường độ ánh sáng trước và sau khi đi qua mơi trường. Mỗi loại phân tử cĩ một đỉnh hấp thụ (tức là nơi chúng hấp thụ ánh sáng mạnh nhất) ở một độ dài sĩng nhất định tuỳ thuộc vào cấu trúc của chúng. Ví dụ : đỉnh hấp thụ các nucleic acid là ở 260nm trong vùng tử ngoại. sự hấp thụ này là do sự tương tác giữa các photon với các electron của vịng purine và pyrimidine. Sự hấp thụ ở dây được tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Một đơn vị đơn vị hệ số chuyển đổi OD tương ứng với : - 50g/ml DNA sợi đơi - 40g/ml DNA sợi đơn hay RNA Từ giá trị OD đo được, người ta cĩ thể suy ra nồng độ nucleic acid của dung dịch. C (mg/ml) = A260. k .n C: nồng độ ADN, ARN A260: trị số OD đo được k: đơn vị hệ số chuyển đổi n: số lần pha lỗng Bên cạnh đĩ, người ta cịn tính tỷ lệ OD260/OD280 để ước lượng độ tinh sạch của dung dịch nucleic acid. Nếu tỉ lệ này nằm trong khoảng 1,8 – 2 dung dịch nucleic acid được xem là tinh sạch. Nếu nhiễm protein hay phenol, tỉ lệ này sẽ thấp hơn nhiều khi đĩ việc định lương nucleic acid bằng mật độ quang sẽ khơng cịn chính xác. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 13
  14. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Đối với dung dịch DNA sợi đơi, sự hấp thụ bước sĩng 260nm tăng lên khi phân tử DNA bị biến tính tức là khi hai sợi đơn tách rời nhau. Người ta gọi đĩ là hiệu quả siêu sắc. II- DỤNG CỤ VÀ HỐ CHẤT 1- Hố chất: Nước cất vơ trùng 2- Vật liệu và dụng cụ: - Dung dịch DNA, RNA - Curvet - Eppendorf 1,5ml - Pipetman các loại 0,5l – 10l; 20l – 100l; 200 l – 1000l, đầu típ tương ứng - Cốc chứa nước thải, giấy thấm - Máy đo mật độ quang III – PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Tiến hành tương tự như nhau ở cả hai loại dd DNA và RNA theo các bước sau Bƣớc 1 Pha lỗng 10 lần bằng cách trộn chung 100l dịch acid nucleic với 0.9ml nước cất, trộn kỹ bằng pipetman và xen lẫn vortex. Lưu giữ lạnh và đậy nắp kỹ. Bƣớc 2 Pha lỗng tiếp 2 lần bằng cách hút bổ sung 1ml nước cất Bƣớc 3 Chuẩn OD bằng nước cất và tiến hành đo ở 2 bước sĩng 260 nm và 280 nm Bƣớc 4 Ghi nhận kết quả và tính tốn kết quả IV – YÊU CẦU Sinh viên tiến hành thí nghiệm, ghi nhận kết quả, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. V – CÂU HỎI 1. Nêu mục đích của việc đo mật độ quang (OD) của sợi DNA hay RNA ở bước sĩng 260 và 280? Tại sao phải quan tâm đến tỷ lệ OD260/OD280? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 14
  15. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2. Nếu tỷ lệ OD260/OD280 vượt quá tỷ lệ cho phép hoặc chưa đạt tỷ lệ cho phép thì chúng ta cĩ thể kết luận như thế nào về mẫu DNA/RNA vừa tinh sạch được? 3. Nêu các cách định lượng DNA/RNA theo quan điểm của anh/chị? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 15
  16. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 5 : PHÂN TÍCH DNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS) I. NGUYÊN TẮC Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào cĩ diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein. Bài này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid. Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn là các gel. Các gel này là mơi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua, phân tử cĩ kích thước càng lớn thì di chuyển trong gel càng chậm. Tùy theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide. Hình 1: Cấu tạo của một bể điện di nằm ngang. Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di cĩ thể quan sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu qua đối với UV) - Gel agarose với lỗ cĩ đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đơi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleotide (cặp base – bp). Các Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 16
  17. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhĩm phân tử cĩ kích thước khác nhau. - Gel polyacrylamide cĩ lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn cĩ kích thước dưới 500 bp. Với gel polyacrylamide người ta cĩ thể phân tách hai phân tử DNA chỉ sai khác nhau một nucleotide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta sử dụng một số phương pháp làm hiện hình như sau: - Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Hoặc cĩ thể hiện hình các Nu AgNO3 1% tạo muối bạc trong mơi trường kiềm. - Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng vị phĩng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phĩng xạ tự ghi. Chúng cịn cĩ thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Hình 2: Sơ đồ một mẫu khuơn bản gel polyacrylamide đơn giản. Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy. - Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder). Đĩ là hỗn hợp của nhiều đoạn DNA cĩ kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn. Một số thang DNA thơng dụng: X174-Hae III, -Hind III II. DỤNG CỤ VÀ HĨA CHẤT 1. Hĩa chất - Agarose nĩng chảy ở nhiệt độ thấp Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 17
  18. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền - Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X) - Dung dịch nập mẫu - Ethidium bromide (10mg/ml) - AgNO3 1% 2. Vật liệu và dụng cụ - Dung dịch DNA, RNA - Pipetman 0,5l - 10l, đầu tip - Bộ điện di, bàn đèn UV - Lị viba III. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Đổ gel agarose 1. Cân 0,5g agarose, cho vào erlen 100ml, bổ sung 25ml dung dịch TAE 1X 2. Đun chảy, để nguội đến 35-40oC, thêm vào 2l Ethidium bromide (hoặc AgNO3 1%), lắc đều 3. Trong lúc chờ nguội, chuẩn bị bản điện di, lắp lược vào khuơn 4. Đổ agarose lỏng vào khuơn 5. Đợi khi gel đơng, đặt bản điện di vào bồn điện di và tháo lược ra. Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu 1. Chuẩn bị một miếng parafilm, hút 5l dung dịch DNA ở mẫu điện di đặt lên miếng parafilm, (Đối với sản phẩm cắt giới hạn, sử dụng hết lượng mẫu cĩ 10l). 2. Thay đầu tip, hút 3l dung dịch nạp mẫu, trộn đều với dung dịch DNA ở trên 3. Dùng pipetman hút tồn bộ dịch vừa trộn nạp vào giếng 4. Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực 5. Điện di với hiệu điện thế 120V, trong 20-120 phút 6. Xem kết quả bằng đèn UV. Phân tích kết quả IV. YÊU CẦU Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. V. CÂU HỎI 1. So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide trong kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 18
  19. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2. Hãy cho biết ứng dụng 1 số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và polyacrylamide mà em biết trong thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật di truyền ? (3 ứng dụng). Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 19
  20. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Bài 6: PHÂN TÍCH RNA BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI (GEL ELECTROPHORESIS) VI. NGUYÊN TẮC Trong một điện trường, các phân tử nằm trong pha lỏng sẽ di chuyển với vận tốc phụ thuộc tỉ lệ giữa điện tích và khối lượng của chúng, nếu hai phân tử cùng khối lượng, phân tử nào cĩ diện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn. Kỹ thuật này thường được sử dụng để phân tách các nucleic acid và protein. Bài này chỉ đề cập đến kĩ thuật điện di nucleic acid. Ở lĩnh vực này, điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn là các gel. Các gel này là mơi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử nucleic acid đi qua, phân tử cĩ kích thước càng lớn thì di chuyển trong gel càng chậm. Tùy theo kích thước các phân tử cần phân tách và mức độ phân tách, người ta sẽ sử dụng một trong hai loại gel là agarose hay polyacrylamide. Hình 1: Cấu tạo của một bể điện di nằm ngang. Bản gel agarose đã được bổ sung ethidium bromide, sau khi điện di cĩ thể quan sát được các băng DNA nếu đặt chậu trên nguồn UV (chất liệu chế đáy bể thấu qua đối với UV) - Gel agarose với lỗ cĩ đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA sợi đơi, kích thước 300 – 10.000 cặp nucleotide (cặp base – bp). Các Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 20
  21. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân tách các nhĩm phân tử cĩ kích thước khác nhau. - Gel polyacrylamide cĩ lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn DNA sợi đơn cĩ kích thước dưới 500 bp. Với gel polyacrylamide người ta cĩ thể phân tách hai phân tử DNA chỉ sai khác nhau một nucleotide. Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, người ta sử dụng một số phương pháp làm hiện hình như sau: - Đối với gel agarose, người ta nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào giữa các base của phân tử DNA và phát huỳnh quang dưới tia tử ngoại. Điều này cho phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel. Hoặc cĩ thể hiện hình các Nu AgNO3 1% tạo muối bạc trong mơi trường kiềm. - Đối với gel polyacrylamide, các phân tử DNA thường được đánh dấu bằng đồng vị phĩng xạ và vị trí của chúng sẽ được phát hiện bằng kỹ thuật phĩng xạ tự ghi. Chúng cịn cĩ thể được đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt. Hình 2: Sơ đồ một mẫu khuơn bản gel polyacrylamide đơn giản. Trước khi đổ dịch tạo gel cần dán các mép bằng băng keo dán và kẹp chặt (hoặc kẹp trong giá chuyên dụng) cho kín các mép hai bên và đáy. - Trong điện di, người ta sử dụng thang DNA chuẩn (DNA ladder). Đĩ là hỗn hợp của nhiều đoạn DNA cĩ kích thước đã biết, khi cho điện di cùng khúc với mẫu sẽ cho phép xác định kích thước các đoạn DNA mẫu dựa vào sự so sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn. Một số thang DNA thơng dụng: X174-Hae III, -Hind III VII. DỤNG CỤ VÀ HĨA CHẤT 1. Hĩa chất - Agarose nĩng chảy ở nhiệt độ thấp Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 21
  22. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền - Dung dịch điện di TAE 1X (pha từ dung dịch TAE 50X) - Dung dịch nập mẫu - Ethidium bromide (10mg/ml) - AgNO3 1% 2. Vật liệu và dụng cụ - Dung dịch DNA, RNA - Pipetman 0,5l - 10l, đầu tip - Bộ điện di, bàn đèn UV - Lị viba VIII. PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Đổ gel agarose 6. Cân 0,5g agarose, cho vào erlen 100ml, bổ sung 25ml dung dịch TAE 1X 7. Đun chảy, để nguội đến 35-40oC, thêm vào 2l Ethidium bromide (hoặc AgNO3 1%), lắc đều 8. Trong lúc chờ nguội, chuẩn bị bản điện di, lắp lược vào khuơn 9. Đổ agarose lỏng vào khuơn 10. Đợi khi gel đơng, đặt bản điện di vào bồn điện di và tháo lược ra. Chuẩn bị mẫu và nạp mẫu 7. Chuẩn bị một miếng parafilm, hút 5l dung dịch DNA ở mẫu điện di đặt lên miếng parafilm, (Đối với sản phẩm cắt giới hạn, sử dụng hết lượng mẫu cĩ 10l). 8. Thay đầu tip, hút 3l dung dịch nạp mẫu, trộn đều với dung dịch DNA ở trên 9. Dùng pipetman hút tồn bộ dịch vừa trộn nạp vào giếng 10. Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực 11. Điện di với hiệu điện thế 120V, trong 20-120 phút 12. Xem kết quả bằng đèn UV. Phân tích kết quả IX. YÊU CẦU Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. X. CÂU HỎI 1. So sánh sự khác biệt trong việc sử dụng gel agarose và polyacrylamide trong kỹ thuật điện di ? Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 22
  23. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Hãy cho biết ứng dụng 1 số kỹ thuật điện di sử dụng gel agarose và polyacrylamide mà em biết trong thực tiễn nghiên cứu các kỹ thuật di truyền ? (3 ứng dụng). Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 23
  24. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 7: TÁCH CHIẾT PLASMID TỪ VI KHUẨN E.COLI BẰNG DUNG DỊCH PHENOL I. NGUYÊN TẮC Trong các phương pháp chiết xuất và tinh chế DNA thì phương pháp chiết xuất bằng phenol và chloroform là những phương pháp cơ bản. Nguyên lý của việc sử dụng phenol trong chiết xuất DNA như sau: Tuy ở nhiệt độ thường phenol ở dạng tinh thể rắn (tan chảy ở 80 °C) nhưng khi lẫn với khoảng 20% nước (v/v) thì phenol ở dạng nhũ tương gồm các phân tử phenol ở giữa với các phân tử nước vây quanh. Khi pha hỗn hợp này vào dịch tế bào, các phân tử phenol cĩ tính kị thủy nên cĩ khuynh hướng liên kết vào vùng kị thủy của protein ở bên trong cấu trúc của các phân tử này, kết cục làm protein trương phồng lên và lộ xuất nhĩm bên kị thủy (của gốc amino acid) ra ngồi. Các nhĩm kị thủy này của protein khi đĩ kết hợp với nhau tạo thành búi kết tủa gồm nhiều phân tử protein khác nhau. Trong khi đĩ DNA vẫn tiếp tục là chất tan trong nước và cĩ thể hút sang ống chứa khác. Thao tác loại bỏ protein, lipid và các chất khác tan trong dung dịch DNA là chiết xuất bằng phenol rồi bằng phenol-chloroform sau đĩ bằng chloroform hoặc chloroform-isoamyl alcohol (24:1). Sử dụng cả hai loại dung mơi hữu cơ thường cho hiệu quả cao nhưng cũng cĩ thể dùng chỉ một loại. Tuy nhiên, nhiều khi cần phải loại bỏ hồn tồn phenol khỏi dung dịch, khi đĩ cần phải lặp lại việc chiết xuất bằng chloroform hoặc ether. Phenol cĩ ưu điểm cĩ thể tan trong nước (ở mức độ nhất định) nên khơng cần khuấy trộn nhiều cũng cĩ thể làm biến tính protein tan trong nước, trong khi đĩ sử dụng chloroform hay chloroform- isoamyl alcohol thì phải trộn đảo kỹ vì các chất này khơng tan trong nước. Pha thêm chloroform vào phenol làm tính kị thủy của phenol tăng nên làm tăng hiệu quả biến tính protein. II. THAO TÁC TIẾN HÀNH 1. Chế phenol 1) Đun nĩng (cách thủy) phenol tinh thể đơng cứng (loại đặc biệt) ở 68 - 80°C để làm tan chảy. Thêm oxine (8-hydroxyquinoline) ở 0,05 - 0,1% (cĩ tác dụng phịng ngừa ơxy hĩa phenol). Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 24
  25. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2) Thêm lượng khoảng 1/2 ~ 1/3 dung dịch Tris 1M (pH 8,0), trộn đều rồi để yên, loại bỏ lớp nước mặt rồi lặp lại thao tác một lần nữa. Tris cĩ tác dụng làm phenol bão hịa trở nên trung tính. Khi đĩ, dưới lớp dung dịch đệm là lớp phenol, mỗi lần cần sử dụng phenol thì cho pipet (bịt đầu trên) xuống lớp phenol và hút lượng phenol cần dùng. 3) Bảo quản ở 4 ºC, cĩ thể để đến vài tháng. 2. Chiết xuất phenol và chloroform 1) Thêm vào dung dịch DNA một lượng tương đương phenol hoặc phenolchloroform. 2) Trộn đều để tạo dạng huyền dịch. Nếu cần chiết xuất DNA phân tử lượng lớn cần tránh trộn mạnh, cần thêm thời gian chiết xuất. 3) Li tâm ở nhiệt độ phịng khoảng 3 phút ở 2.000 v/ph (1.600 ×g) hoặc ít phút với ống Eppendorf ở tốc độ cao. 4) Hút lấy lớp nước (lớp trên nếu nồng độ muối NaCl của dung dịch thấp hơn 1,5M) chuyển sang lọ mới. 5) Nếu cần thì chiết xuất lặp lại với phenol-chloroform và chloroform. Chú ý: Với DNA phân tử lượng thấp nên dùng phương pháp chiết xuất phenol chloroform và chloroform với NaCl lớn hơn 0,1M v. DNA nhỏ cĩ thể hịa tan trong phenol. III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 25
  26. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 8 ĐIỀU CHẾ DNA PHAGE BẰNG VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI I. NGUYÊN TẮC Bằng vector cosmid hoặc plasmid cĩ thể sàng lọc và tạo dựng được thư viện bộ gen, hay thư viện genome (genomic liabrary), và thư viện DNA bổ sung (cDNA liabrary), nhưng nhiều trường hợp sử dụng phage vector hệ lambda () đối với các thư viện genome và cDNA mới. Việc nghiên cứu so sánh cấu tạo bộ gen đích cũng như việc tái tạo dựng thuần (subcloning) địi hỏi phải điều chế DNA phage. Để điều chế DNA phage với ít tạp chất nhất thiết phải sử dụng phage phát triển tốt (để cĩ phage với hiệu giá (titre) cao). Kết quả việc nuơi cấy phage kém phát triển là do sự phát triển phage và của E. coli k. chủ khơng nhất trí. Lượng phage thu hồi được phụ thuộc nhiều vào tỷ lệ giữa lượng vi khuẩn k. chủ và lượng phage được đưa vào mơi trường. Để thu được phage với hiệu giá cao cần bồi dưỡng trong điều kiện tốt nhất. II. THAO TÁC TIẾN HÀNH 1. Chuẩn bị giống VSV nuơi cấy Để nuơi cấy thu phage với hiệu giá cao nhất cần biết titre của phage trong dịch dung khuẩn và chuẩn bị giống vi sinh vật thực hiện việc điều chế DNA 1) Trộn 0,1 ml vi khuẩn E. coli được chuẩn bị trước với 0,1 ml dịch dung khuẩn của phage đ. được pha lỗng trong dung dịch SM để cĩ nồng độ 100 pfu (plaque-forming unit). Ủ ở 37oC trong 10 phút. Dung dịch SM chứa 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 25 ml Tris-HCl 2M (pH 7,5), 5 ml gelatin 2%, thêm nước cất cho đủ 1 lít rồi hấp cao áp tiệt trùng. 2) Sau đĩ, rĩt 2,5 ml dịch agar phủ (agar nửa lỏng, top agar) để làm nguội đến 50ºC. Đổ ra đĩa petri chứa mơi trường LB. 3) Để ở nhiệt độ phịng 15 phút, khi agar phủ hồn tồn hĩa rắn thì ủ ở 4) Đếm số plaque, tính tốn hiệu giá phage của dịch dung khuẩn. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 26
  27. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2. Điều chế lƣợng nhỏ DNA phage Đối với các thí nghiệm như làm bản đồ enzyme hạn chế các d.ng thuần của phage đã được sàng lọc thư viện cũng như lai phân tử th. lượng DNA phage cần thiết khơng nhiều, thường dùng lượng DNA chế từ 5 ml mơi trường lỏng. Nếu cần điều chế lượng phage lớn hơn thì tăng số lượng ống nuơi cấy. 2.1. Phƣơng pháp điều chế dịch phage dung khuẩn 1) Dùng tăm (hoặc đầu pipet) vơ trùng lấy một plaque duy nhất đ. sàng lọc được genomic liabrary hoặc cDNA liabrary khuấy vào 100 ml mơi trường SM. Mơi trƣờng SM chứa 5,8 g NaCl, 2,0 g MgSO4.7H2O, 25 ml Tris-HCl 2M (pH 7,5), 5 ml gelatin 2%, thêm nước cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng. 2) Để một giờ ở nhiệt độ ph.ng. 3) Cho vào 20 ml vi khuẩn đ. bồi dưỡng qua đêm, để 15 phút ở 37 ºC. 4) Thêm 5 ml mơi trường NZYM, bồi dưỡng qua đêm ở 37 ºC. Cuối cùng mơi trường trở nên trong mặc dù khơng hồn tồn và quan sát thấy các mẫu cặn phân giải của vi khuẩn. Mơi trƣờng NZYM chứa 10,0 g NZ amine, 5,0 g NaCl, 5,0 g cao nấm men (yeast extract), 2,0 g MgSO4.7H2O, chế thêm nước cất cho đủ 1 lít, hấp cao áp tiệt trùng. 5) Thêm 100 ml chloroform, trộn đảo 15 phút. 6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong v.ng 10 phút, hút lấy nước mặt (dịch phage dung khuẩn) chuyển qua ống khác. 7) Với phương pháp này cĩ thể thu được phage với hiệu giá cao đến 1010 pfu/ml. 1. Điều chế lƣợng lớn DNA phage Sau khi cĩ dịng thuần đoạn DNA được xác nhận nhờ lượng nhỏ DNA phage, việc phân tích dịng thuần tiếp sau đĩ thường cần điều chế lượng lớn DNA phage. Để thu lượng lớn dịch phage dung khuẩn cĩ phương pháp dung giải dịch thể và dung giải trên đĩa (plate lysation). Phương pháp dung giải dịch thể đơn giản và cĩ thể thu được DNA với lượng lớn nhưng nhiều clone khơng thu được dịch phage dung khuẩn với hiệu giá cao. Phương pháp dung giải trên đĩa mất thời gian nhưng là phương pháp khơng bị ảnh hưởng bởi tính cá thể của từng clone của phage. 3.1. Phƣơng pháp chế dịch phage dung khuẩn 3.1.1. Phương pháp nuơi cấy lỏng Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 27
  28. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 1) Cho vào 5 ml E. coli đã bồi dưỡng chuẩn bị trước 5 ml dịch phage dung khuẩn đã pha lỗng bằng SM nồng độ 1 - 5×109 pfu/ml, ủ ở 37 °C trong 10 phút. 2) Thêm 1 lít mơi trường NZYM, ủ 1 đêm ở 37 °C. 3) Khi xác nhận sự dung khuẩn thì thêm 5 ml chloroform, đảo trộn 10 phút. 4) Quay li tâm 5.000 v/ph trong 10 phút, lấy nước mặt. 5) Đo hiệu giá của dịch dung khuẩn. Lượng phage 1013 pfu chứa khoảng 500 μg DNA. 3.1.2. Phương pháp dung giải trên đĩa 1) Thêm 0,1 ml SM chứa 105 - 106 pfu phage vào 0,1 ml E. coli đ. bồi dưỡng qua đêm, ủ 10 phút ở 37 °C. Để cĩ lượng phage lớn cần khoảng 10 - 50 đĩa Petri. 2) Thêm 2,5 ml top agar (agar mềm) ở 50 °C, trộn rồi san ra các đĩa LB (cĩ mặt ẩm thì tốt hơn). 3) Chờ top agar rắn, lật đĩa lại, cho vào túi chất dẻo và ủ ở 37 °C. 4) Sau 6 - 7 giờ bắt đầu xuất hiện dung khuẩn. Khi đã thấy dung khuẩn thì cho vào mặt mơi trường 5 ml SM, rồi nhỏ lên một số giọt chloroform. 5) Khi SM lan hết mặt thạch, đặt đĩa thạch ở 4 °C qua đêm. 6) Dùng pipet Pasteur hút hết SM trên mặt thạch. Từ mỗi đĩa cĩ thể thu 1011 pfu phage. Cĩ thể thu được nhiều hơn nếu lấy cả top agar nhưng DNA này thường lẫn tạp chất khĩ thực hiện một số phản ứng như cắt bằng enzyme hạn chế. 3.2. Điều chế DNA 1) Thêm dung dịch NaCl 1M - PEG 6000 10% vào dịch phage dung khuẩn cho đến lượng 10%, làm cho hịa đều. 2) Để 1 giờ ở 0 °C. 3) Quay li tâm 5.000 v/ph ở 4 °C trong v.ng 20 phút. Bỏ nước mặt. 4) Thêm vào cặn của 1 lít dịch phage dung khuẩn 5 ml dung dịch chứa Tris-HCl 20mM (pH 7,5) và MgSO4 10mM, sau đĩ thêm 50 ml DNase I (10 mg/ml), trộn đều. 5) Thêm 5 ml chloroform, trộn đảo đều. 6) Quay li tâm 8.000 v/ph trong 15 phút ở 15 ºC. Hút lấy nước mặt. Từ đây cĩ thể vận dụng một số phương pháp tinh chế DNA. Dưới đây là biến thể cĩ sử dụng máy li tâm siêu tốc (đương nhiên, cĩ thể thay thế bằng các phương pháp khác điều chế DNA mơ tả ở trên). Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 28
  29. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 7) Cho vào ống li tâm siêu tốc bằng chất dẻo (như Hitachi 13 CN) ba lớp CsCl cĩ nồng độ khác nhau: lớp dưới cùng 1,5 ml chứa 95 g CsCl trong 75 ml SM, lớp tiếp theo 2 ml chứa 67 g CsCl trong 82 ml SM và lớp thứ ba (trên cùng) 2 ml chứa 60 g CsCl trong 85 g SM. Tỷ trọng tương ứng là 1,45, 1,5 và 1,7). Cho 2 ml mẫu DNA phage lên trên lớp thứ ba. 8) Quay li tâm 36.000 v/ph trong 60 phút ở 15 °C (với máy Hitachi RPS 40 T chẳng hạn). 9) Băng DNA hình thành giữa ống được thấy r. khi soi dưới UV. Lấy kim và bơm tiêm hút lớp này. 10) Thẩm tích đối 1 lít dung dịch Tris 10mM (pH 7,5) và MgSO4 10mM trong 3 giờ. 11) Nếu tổng lượng là 1 ml th. cho vào đĩ 10 ml SDS 10%, 100 ml NaCl 5M, 500 ml phenol và 500 ml chloroform, trộn đảo từ từ trong 30 phút. 12) Li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút. Lấy nước mặt. 13) Thêm 1 ml chloroform, trộn đảo nhẹ trong 30 phút. 14) Li tâm 5 phút 3.000 v/ph. 15) Thêm sodium acetate 3 M với lượng 10% so với mẫu và ethanol gấp hai lần mẫu, để lạnh trên nước đá 10 - 30 phút, quay li tâm thu cặn DNA. 16) Rửa cặn DNA bằng ethanol 70%, để khơ. 17) Pha TE hoặc nước cất theo nồng độ mong muốn. III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 29
  30. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 9 ĐIỀU CHẾ DNA TẾ BÀO ĐỘNG - THỰC VẬT I. NGUYÊN TẮC Để tạo dựng bộ gen (genome) và thực hiện lai (Southern hybridization) DNA động vật cần điều chế DNA động vật cĩ phân tử lượng lớn và ít tạp nhiễm. Nhưng do DNA dài thường dễ bị đứt bởi enzyme phân giải cũng như các tác động cơ giới - vật lý nên khi điều chế phải sử dụng dụng cụ để tiệt trùng và tránh hút DNA bằng ống hút cĩ đầu lỗ nhỏ cũng như tránh lắc trộn mạnh. Cĩ thể điều chế DNA từ mẫu vật đã được bảo quản nhưng nếu điều chế từ vật liệu tổ chức tươi mới thì tốt hơn. Lượng DNA thu được thường phụ thuộc vào loại tổ chức nhưng thơng thường từ mỗi gam tổ chức cĩ thể thu được khoảng 10 mg DNA. II. THAO TÁC TIẾN HÀNH 1) Cắt nhỏ tổ chức nguyên liệu bằng kéo đến độ 0,1 g. Nếu tổ chức lẫn máu hoặc lơng th. rửa trước bằng dung dịch TNM. Trong trường hợp mơ ung thư thường lẫn nhiều mơ hoại tử thì làm sạch trước là cần thiết. Chú ý: thực hiện trên nước đá hoặc trong ph.ng lạnh để tránh DNA bị phân giải (kể cả các bước tiếp theo). Dung dịch TNM chứa Tris-HCl (pH 7,5) 20mM, NaCl 0,1M và MgCl2 1,5mM. 2) Cho vào mỗi gam tổ chức 20 ml dung dịch TNM, nghiền nhuyễn (bằng homogenizer, như Porter), quay li tâm 2.000 v/ph trong 5 phút ở 4 ºC, thu cặn. 3) Tráng cặn bằng dung dịch TNE, đổ bỏ nước mặt. Lại cho 5 ml TNE vào trộn đều thành huyền dịch rồi bổ sung thêm TNE cho đủ 20 ml, trộn đảo đều. Dung dịch TNE chứa Tris-HCl (pH 7,5) 10mM, NaCl 0,1M và EDTA 1mM. 4) Thêm từ từ SDS 10% vừa thêm vừa trộn đảo nhẹ cho đạt mức 0,3% so tổng lượng. Thêm dung dịch proteinase 10 mg/ml cho đạt đến mức 1% so tổng lượng. Ủ 4 giờ đến qua đêm ở 60 °C. 5) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ khoảng 5 giờ đến 1 đêm. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 30
  31. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 6) Quay li tâm 3.000 v/ph trong 10 phút, dùng pipet cĩ lỗ to hút phần nước, tránh khuấy động phần phenol. Lại chiết xuất bằng phenol một lần và bằng chloroform một lần nữa. 7) Thẩm tích đối 2 lít TE qua một ngày đêm cĩ thay TE một lần. 8) Thêm RNase (DNase-free) 1 mg/ml đến mức 1/50 thể tích, ủ 37 °C trong 1 giờ. 9) Thêm lượng tương đương phenol, trộn đảo nhẹ trong 1 giờ. 10) Li tâm 3.000 v/ph trong 1 phút, hút lấy lớp nước bằng pipet cĩ lỗ miệng lớn. 11) Thẩm tích đối TE qua đêm cĩ thay ngoại dịch như trên. 12) Cho DNA thu được vào ống chất dẻo, bảo quản ở 4 ºC. Với DNA động vật cĩ thể bảo quản 4 - 5 năm trong điều kiện này. III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 31
  32. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 10: KỸ THUẬT PHÂN TÍCH PLADMID BẰNG PHƢƠNG PHÁP CẮT GIỚI HẠN I- MỤC ĐÍCH Enzyme cắt giới hạn thường được sử dụng trong sinh học phân tử và kỹ thuật di truyền là các enzyme cắt giới hạn thuộc nhĩm II. Các enzyme này cĩ khả năng nhận biết một trình tự nucleotide xác định và cắt DNA ngay tại trình tự nhận biết đĩ. Cơng dụng của các enzyme cắt giới hạn là cắt phân tử DNA thành những đoạn DNA ngắn hơn. Do vậy, với sự hỗ trợ của một số kỹ thuật sinh học phân tử khác, các nhà nghiên cứu đã sử dụng cắt giới hạn cho nhiều mục đích thao tác, phân tích DNA khác nhau như: cắt nối DNA tạo DNA tái tổ hợp, phân tích tái tổ hợp, đột biến, đa dạng di truyền. Trong phạm vi bài thực hanh này, enzyme cắt giới hạn được sử dụng nhằm để phân tích plasmid. Plasmid được cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra dung dịch plasmid thu được là plasmid cần thu nhận hay khơng. Phương pháp phân tích DNA và vector tái tổ hợp chứa DNA bằng phản ứng cắt giới hạn cĩ thể được ứng dụng cho các trường hợp sau: - Kiểm tra dung dịch vector, plasmid thu được sau khi nhân bản in vivo trong tế bào chủ - Kiểm tra vector tái tổ hợp thu được sau khi được thao tác cắt nối bằng enzyme cắt giới hạn đĩ. II- NGUYÊN TẮC Trong sự phân tích plasmid bằng phương pháp cắt giới hạn, đầu tiên, plasmid được cắt bằng một hay một số enzyme cắt giới hạn thích hợp. Sản phẩm cắt được điện di gel agarose. Việc phân tích số lượng và độ dài các đoạn DNA thu được sau phản ứng cắt sẽ cho thơng tin cần thiết về plasmid cần kiểm tra. Để phân tích plasmid bằng phản ứng cắt giới hạn cần phải cĩ thơng tin về bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid quan tâm. Dựa vào bản đồ enzyme cắt giới hạn, số lượng và loại enzyme thích hợp được chọn lựa cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid III- PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 32
  33. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Sinh viên thực tập phân tích bản đồ enzyme cắt giới hạn của plasmid pBluescript và chọn các enzyme cắt giới hạn thích hợp cho phản ứng cắt kiểm tra plasmid pBluescript trong dung dịch DNA thu được sau khi tách chiết plasmid từ tế bào chủ E.coli DH5α Thực hanh phản ứng cắt giới hạn với enzyme đã chọn. Phân tích sản phẩm của phản ứng cắt bằng điện gi gel agarose. Ghi nhận kết quả. 1. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị Dung dịch DNA thu được ở bài trước 01 eppendorf 1,5ml Pipettman các loại: 0,5-10µl; 2-20 µl, 20-100 µl + đầu típ Nước cất vơ trùng Enzyme cắt giới hạn, dung dịch đệm (buffer) Chậu thủy tinh Cốc thủy tinh 100, 250 ml Agarose Dung dịch TAE 1X, 50X Bộ điện di Tủ ấm 37oC hay Bể ổn nhiệt (Water Bath) 2. Thực hành Dựa vào bản đồ plasmid của pBlueScript, sinh viên thực tập chọn enzyme cắt giới hạn sử dụng cho phản ứng cắt kiểm chứng plasmid. Dự đồn kết quả thu được khi sử dụng enzyme đã chọn cho phản ứng kiểm chứng. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 33
  34. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Sinh viên tiến hành thực hiện các phản ứng cắt giới hạn theo các bước sau: Chuẩn bị hai (2) eppendorf sạch bằng việc rửa cồn ethanol 70o sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 120oC Thiết lập phản ứng cắt với thành phần như sau: DNA plasmid 1µg Dung dịch đệm (10X) 2,0 µl Enzyme cắt giới hạn 0,5 µl Nước cất bổ sung cho đến thể tích 6,5 µl Ử hỗn hợp này trong 2h hoặc qua đêm Bổ sung dung dịch đệm chạy mẫu (loading buffer) Chạy gel điện di agarose, quan sát và thu nhận kết quả Tiến hành các nhĩm DNA đã được tinh sạch và tách chiết với các đối tượng: DNA thực vật, động vật, nấm men, máu IV- KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 34
  35. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 11 CÁC PHƢƠNG PHÁP THU HỒI ĐOẠN DNA TỪ GEL ĐIỆN DI II. NGUYÊN TẮC Nếu cĩ nhu cầu sử dụng các phân đoạn DNA đã được phân li và tinh chế nhờ điện di cho các thí nghiệm tiếp theo, người ta nhận thấy việc thao tác để thu hồi DNA từ gel là cần thiết. Cĩ một số phương pháp thu hồi DNA được trình bày và chúng cĩ những ưu điểm và nhược điểm nhất định như thời gian thao tác, độ phức tạp và tỷ lệ thu hồi, cũng như khả năng lẫn các polymer hịa tan hoặc các chất hỗn tạp cĩ trong gel agarose và gel polyacrylamide làm cản trở đến các phản ứng sẽ thực hiện trong thí nghiệm sau đĩ. Phương pháp dùng giấy DEAE cần thời gian ngắn và lượng chất hỗn tạp tương đối ít nhưng từ gel polyacrylamide tỷ lệ thu hồi các đoạn DNA dài hoặc DNA một sợi thường thấp. Phương pháp thu hồi nhờ điện di cĩ thể thực hiện để thu hồi DNA từ gel agarose cũng như polyacrylamide nhưng lượng thu hồi được dưới dạng dung dịch với lượng tương đối lớn cần phải cơ đặc, cho nên chất hỗn tạp lẫn nhiều. Hơn nữa, từ gel agarose việc thu hồi thường khĩ khăn. Phương pháp hồi thu từ agarose tan chảy nhiệt độ thấp cĩ thể thu hồi DNA trong thời gian ngắn thao tác cũng đơn giản, tỷ lệ thu hồi cao khơng phụ thuộc vào độ lớn của các đoạn DNA nhưng hỗn tạp nhiều. III. CÁC BƢỚC TIẾN HÀNH 1. Phƣơng pháp sử dụng giấy DEAE (DE 81) 1) Trong khi điện di DNA trong gel agarose (cĩ ethidium bromide trong gel hoặc pha trong dịch đệm điện di), quan sát các băng DNA đích dưới UV khi thấy băng đĩ đã phân li hồn tồn thì dùng dao cắt thành rãnh ở trước và sau băng DNA rồi chèn giấy Whatman DE 81 vào đĩ. 2) Tiếp tục điện di cho đến khi băng DNA bám hết vào giấy DE 81 thì cắt điện. 3) Lấy giấy DE 81 ra khỏi gel, cho vào ống Eppendorf 0,5 ml đ. được chọc thủng ở đáy (hoặc ống bơm tiêm 1 ml) rồi lắp vào trong một ống li tâm lớn hơn (như ống Eppendorf 1,5 ml đối với ống 0,5 ml, hoặc ống li tâm 10 ml đối với bơm tiêm 1 ml) rồi cho vào đĩ một lượng dung dịch đệm TAE cĩ 50 mM NaCl, quay li tâm và lặp lại 3 lần như vậy để rửa sạch. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 35
  36. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Dung dịch đệm TAE cĩ 50 mM NaCl chứa Tris-HCl 10mM, EDTA 1mM, NaCl 50mM (khơng hịa tan DNA). 4) Thêm 100 ml TE chứa NaCl 1M, quay li tâm nhẹ rồi để yên cho ngấm đều vào giấy DE khoảng 5 phút, sau đĩ li tâm lại làm cho dung dịch đệm thốt xuống hết. Lặp lại ba lần để cho DNA thốt hết khỏi giấy DE theo dung dịch đệm. 5) Chiết xuất bằng phenol và bằng chloroform mỗi thứ một lần để loại bỏ tạp chất rồi kết tủa bằng ethanol ba lần mỗi lần đều kết tủa ở nhiệt độ −70°C rồi quay li tâm thu hồi. 2. Phƣơng pháp thu hồi bằng điện di 1) Xác nhận các băng DNA (bằng UV với gel đã nhuộm ethidium bromide) rồi cắt băng DNA đích để hồn tồn phân li khỏi gel. Cho mẫu gel đĩ vào túi thẩm tích đã buộc kỹ một đầu, để cho dung dịch đệm ngấm đều rồi kẹp đầu cịn lại. 2) Đặt túi thẩm tích vào chậu điện di nằm ngang sao cho hướng điện di vuơng gĩc với túi thẩm tích. 3) Cứ để vậy mà điện di với điện áp 100 - 200 V, soi dưới UV xác nhận băng DNA đã thốt hết ra khỏi gel. Để tăng độ thu hồi cần điện di ngược chiều vài phút (cho DNA đã bám vào túi thốt ngược trở lại dung dịch) rồi mở túi hút hết dịch ra (nhưng cần tránh hút gel) cho vào ống nghiệm, chiết xuất bằng phenol và chloroform rồi kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA. 3. Phƣơng pháp chiết xuất DNA từ gel nghiền (từ gel polyacrylamide) 1) Xác nhận (bằng UV) vị trí DNA đã phân li cần thu hồi, cắt thu lấy gel. 2) Cho mẫu gel vào ống 1 ml, nghiền nát, hoặc cho vào ống Eppendorf rồi dùng đũa thủy tinh nghiền nát. 3) Cho gel nát vào ống nghiệm rồi cho vào đĩ dung dịch đệm dung xuất (thường là lượng ngập khơng quá 2 lần lượng gel, nhiều hay ít tùy nồng độ của DNA trong gel), ủ mấy giờ cho đến qua đêm ở 37oC (nếu cần, khi lượng nhỏ DNA khĩ tạo kết tủa thì thêm RNA nấm men đến nồng độ 10 µg/ml). Dung dịch đệm dung xuất chứa ammonium acetate ở nồng độ 500mM, MgCl2 10mM, EDTA 1mM và SDS 1%. 4) Li tâm nhẹ rồi thu lấy nước mặt, dùng cột DEAE cellµlose để tinh chế, cơ đặc (xem phần sau). Chiết xuất bằng phenol-chloroform rồi chloroform và sau đĩ kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 36
  37. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 3.4. Thu hồi từ gel agarose tan chảy nhiệt độ thấp một số hãng (như BioRad, Takara ) sản xuất và phát mại. 1) Chế gel nêu trên bằng cách pha vào dung dịch đệm, làm tan chảy ở khoảng 70 a ethidium bromide ở khoảng 37oC rồi đổ bản gel, hạ nhiệt cho gel trở nên cứng. 2) Điện di với điện áp thấp để tránh tăng nhiệt độ làm tan chảy gel. 3) Soi UV với sự trợ giúp của ethidium bromide, cắt băng DNA đích đã phân li. 4) Thêm vào 5 lần TE, ủ ở 65oC cho gel tan chảy. 5) Thêm một lượng tương đương phenol-chloroform, trộn đều rồi quay li tâm thu lấy nước mặt rồi chiết xuất bằng chloroform lần nữa. 6) Kết tủa bằng ethanol để thu hồi DNA. Chú ý: một số hãng đã sản xuất và phát mại kit thu hồi DNA bằng cách nghiền và làm tan gel agarose thơng thường. Chẳng hạn "QIAquick Gel Extraction Kit" của hãng QIAGEN Co. dùng máy li tâm cỡ nhỏ cao tốc, cĩ thể chiết xuất và làm sạch các đoạn DNA dài từ 70 bp đến 10 kb từ gel (thơng thường cũng như nĩng chảy thấp) điện di trong dung dịch đệm TAE hoặc TBE. Bộ kit này gồm dung dịch QG (màu vàng), dung dịch PE, dung dịch đệm EB, ethanol, các cột hấp phụ (QIAquick spin column) và ống chứa 2 ml. Các bƣớc thu hồi DNA nhƣ sau: 1) Cắt băng DNA khỏi gel bằng một lưỡi dao sắc (trong khi soi dưới đèn UV năng lượng thấp). Bỏ phần gel dư thừa đến mức tối đa. 2) Cân lát gel trong ống Eppendorf 1,5 ml (khơng màu). Thêm vào đĩ 3 lần thể tích đệm QG (lọ màu vàng của kit). 3) Ủ ở 50 °C khoảng 10 phút cho đến khi gel tan hồn tồn. Thỉnh thoảng trộn xốy cho gel tan dễ dàng hơn. 4) Sau khi gel tan hồn tồn, kiểm tra màu của dung dịch, màu vàng như màu dung dịch QG nguyên gốc là được. Nếu màu hỗn hợp da cam hoặc tím thì thêm 10 μl (cho trường hợp 100 mg gel) sodium acetate pH 5,0, màu sẽ chuyển lại sang màu vàng. 5) Thêm 1 thể tích isopropanol bằng lượng gel ban đầu vào và trộn đều hỗn hợp giúp tăng khả năng thu hồi DNA nhỏ hơn 500 bp hoặc lớn hơn 4kb. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 37
  38. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 6) Đặt một QIAquick spin column (cột) vào một ống thu hồi (đều cĩ sẵn). 7) Rĩt hỗn hợp vào cột và quay li tâm 1 phút cho DNA hấp phụ vào cột. Chú ý: thể tích tối đa của ống chứa là 800 μl, nếu dịch thừa th. tải lên cột lần nữa rồi lại li tâm thêm 1 phút. 8) Bỏ dịch qua cột rồi đặt cột lại vào ống chứa. 9) Thêm ethanol (96 - 100%) vào dung dịch PE cĩ sẵn trước khi dùng. Cho 0,75 ml PE này vào cột, để 2 - 5 phút, quay li tâm 1 phút để rửa. 10) Bỏ nước thốt qua, lắp cột lại vào ống chứa và li tâm thêm 1 phút ở 10.000 ×g để loại bỏ hồn tồn ethanol. 11) Đặt cột vào một ống li tâm 1,5 ml sạch. 12) Để trích li DNA, thêm 50 μl dung dịch đệm EB (Tris.HCl, 10mM) hoặc nước cất vào giữa cột, hoặc nếu cần tăng nồng độ DNA thì cho 30 μl dịch dung xuất (elution solution) để yên 1 phút, rồi quay li tâm 1 phút ở tốc độ tối đa (thường 10.000 ×g hay 13.000 v/ph). Chú ý: dung dịch DNA trong nước cần ở pH 7,0 - 8,0 và dễ bị phân hủy hơn trong dung dịch đệm nên cần bảo quản ở −20 °C. Dùng TE để dung xuất cũng được nhưng EDTA (trong thành phần của TE) cĩ thể gây trở ngại cho các phản ứng enzyme. Cũng cĩ thể sử dụng Prep-A-Gene DNA Purification System (hãng BioRad) với những hạt hấp phụ Prep-A-Gene matrix tinh chế DNA từ băng agarose gel thơng thường. III. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được, nộp bài báo cáo. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 38
  39. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền BÀI 12: KỸ THUẬT PCR TRONG PHÂN TÍCH DÕNG DNA TÁI TỔ HỢP I. MỤC ĐÍCH PCR là kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi nhằm khuếch đại một trình tự DNA sau quá trình tách chiết, kiểm tra gen mục tiêu cĩ trong plasmid tái tổ hợp hay kiểm tra cấu trúc, trạng thái của đoạn DNA . Nội dung của bài thực tập này nhằm khẳng định sự hiện diện của DNA mục tiêu trong plasmid tái tổ hợp bên trong dịng tái tổ hợp dựa theo nguyên tắc phản ứng PCR với cặp mồi chuyên biệt cho gen mục tiêu hoặc cặp mồi chuyên biệt cho vùng trình tự gen mục tiêu. Phương pháp PCR cho phép kiểm tran hanh sự hiện diện của đoạn DNA đĩ. II. NGUYÊN TẮC PCR (Polymerase Chain Reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mơ phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống. Kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền (genetic diseases), nhận dạng vân tay DNA (DNA fingerprinting), chuẩn đốn những bệnh nhiễm trùng (Infectious , tách dịng gene, và xác định huyết thống. Các thành phần trong phản ứng PCR Enzyme 1. Các đặc tính enzyme DNA polymerase và định nghĩa đơn vị (unit) của mỗi loại (hãng) sản xuất là khác nhau. Cần kiểm tra thơng tin trên các tờ hướng dẫn đi kèm hĩa chất. 2. Lượng enzyme cần thiết là phụ thuộc vào lượng DNA template và kích thước phản ứng PCR. Tuy nhiên, thành phần này chỉ nên hiệu chỉnh khi 1) sản phẩm PCR lớn hơn 5kb; 2) cĩ khả năng hoạt tính của enzyme bị giảm sút do thiếu sĩt ở khâu bảo quản; 3) đã tiến hành hiệu chỉnh bằng nhiều cách nhưng sản phẩm PCR vẫn thấp hoặc khơng cĩ gì. 3. Khơng nên tăng enzyme quá 2U (5µl) trên 50 µl tổng thể tích phản ứng 4. Việc thay đổi loại DNA polymerase cĩ thể làm thay đổi hiệu suất của phản ứng PCR. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 39
  40. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 5. Khi tính tốn chiến lược cloning bằng hệ thống TA vector, cần lưu ý DNA polymerase cĩ đặc tính tạo đầu treo A ở đầu 3' hay khơng. Nếu khơng thì cần phản ứng bổ sung sử dụng Klenow và ATP. 6. Tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc vào hoạt tính 3´→5´ exonuclease. Tùy thuộc mục đích thí nghiệm mà cần lựa chọn loại DNA polymerase cĩ hay khơng cĩ hoạt tính này. Các dung dịch đệm (Buffers) 1. Hiệu suất, tính chính xác của enzyme DNA polymerase phụ thuộc nhiều vào hệ buffer sử dụng. Thơng thường nên sử dụng đúng loại buffer tương ứng với enzyme do nhà sản xuất khuyến cáo. 2. Một số buffer chứa chất hoạt động bề mặt cĩ thể ảnh hưởng đến các phản ứng microarray hoặc DHPLC. 3. Nhiều loại buffer đã cĩ sẵn một lượng nhất định ion Mg2+ nên cần lưu ý khi tối ưu hĩa nồng độ Mg2+ Nồng độ Mg2+ và dNTP 1. Việc tăng nồng độ ion Mg2+ cĩ thể làm xuất hiện thêm các sản phẩm khơng đặc hiệu. Tuy nhiên nếu thiếu ion Mg2+ thì dẫn đến lượng sản phẩm PCR thấp. 2. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu phụ thuộc vào loại DNA polymerase, loại DNA template và thành phần buffer (một số buffer thương mại đã cĩ sẵn 1 lượng nhất định ion Mg2+). 3. Dị tìm nồng độ Mg2+ tối ưu thơng thường bằng gradien nồng độ từ 0.5 đến 2 mM với các khoảng cách mỗi bước là 0.2 mM. 4. dNTPs là loại hĩa chất kém bền cần lưu ý khi sử dụng và bảo quản. Nên chia nhỏ lượng dNTPs để giảm số lần làm tan, sử dụng lại. 5. Lượng dNTP tối ưu là 200 µM of mỗi loại dNTP. Việc tăng dNTP khơng làm tăng đáng kể lượng sản phẩm PCR so với việc hiệu chỉnh các yếu tố khác. DNA khuơn (Template) và mồi (Primers) 1. Nồng độ tối ưu DNA template là từ 1) đối với các mẫu DNA tương đối đồng nhất (plasmid, lambda hoặc BAC DNA): 1 pg - 10 ng / 50 µl tổng thể tích phản ứng; 2) đối với mẫu DNA genome thì từ 50 - 500 ng/50 µl tổng thể tích. 2. Nồng độ primer thường tối ưu ở 10 mM mỗi loại. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 40
  41. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Chất khác 1. Đối với các DNA template lớn, giàu GC thì cĩ thể sử dụng các chất biến tính như DMSO, formamide, glycerol, and betaine trong thành phần PCR. Tuy nhiên, phải kiểm tra độ tương thích đối với enzyme DNA polymerase. 2. Tăng lượng DMSO trong PCR sẽ cần giảm nhiệt bắt mồi xuống. 3. Một số buffer đã cĩ chứa sẵn loading buffer để cĩ thể điện di ngay sau PCR. Tuy nhiên, độ nhạy của PCR với những buffer này khơng cao. 4. Đối với các máy luân nhiệt (thermocycler) khơng cĩ gia nhiệt trên nắp thì nên bổ xung mineral oil để tránh bay hơi mẫu. III. NỘI DUNG THỰC HÀNH 1. Vật liệu, dụng cụ, thiết bị - 02 eppendorf 0,5 ml vơ trùng - Giá dựng eppendorf - 01 eppendorf chứa mồi xuơi (Forward Primer) - 01 eppendorf chứa mồi ngược (Reverse Primer) - 01 eppendorf chứa dung dịch đệm cho phản ứng PCR - 01 eppendorf chứa dung dịch dNTPs 8mM - 01 eppendorf chứa dung dịch MgCl2 25mM - 01 eppendorf chứa enzyme Taq DNA polymerase (luơn được giữ trong thùng xốp chứa đá trong quá trình thí nghiệm) - 01 eppendorf chứa nước cất vơ trùng hai lần - Chậu thủy tinh đựng nước đá - Pipettman các loại: 0,5-10µl, 2-20 µl, 10-100 µl, 100-1000 µl + các đầu típ tương ứng Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 41
  42. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền 2. Thao tác thực hành Thiết lập phản ứng PCR trong eppendorf 0,5ml với thứ tự bổ sung các thành phần và thể tích dưới đây Dung dịch đệm Taq polymerase 10X cho phản ứng PCR 5 µl MgCl2 25mM 3 µl Dung dịch hỗn hợp dNTPs (8mM cho mỗi loại dNTP) 2 µl Taq DNA Polymerase (5U/µl) 0.5µl Mồi xuơi (10 um/µl) 2 µl Mồi ngƣợc (10 um/µl) 2 µl DNA khuơn (10-100ng/µl) 9,5 µl Nƣớc cất 2 lần bổ sung (đến thể tích đạt 30 µl) Đặt các eppendorf đã bố sung đầy đủ các thành phần phản ứng nêu trên vào máy PCR và cài chương trình nhiệt cho phản ứng PCR với 25 chu kỳ Điện di gel agarose và quan sát kết quả trên bàn chiếu UV soi nổi Những đoạn DNA tái tổ hợp sẽ cĩ biểu hiện trên gel chụp và sinh viên phải giải thích kết quả thu được Lƣu ý: - DNA trước khi chạy PCR phải được giữ lạnh trong chậu nước đá khi hồn thành bất kỳ cơng đoạn nào - Thao tác phải được thực hiện trong điều kiện hồn tồn vơ trùng IV. KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM Mỗi sinh viên theo dõi kết quả điện di của nhĩm, phân tích kết quả thu được và giải thích, nộp bài báo cáo. Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 42
  43. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền PHỤ LỤC Cách pha chế các hĩa chất CTTH Commassie brilliant blue - R250 2%: C45H44N3NaO7S2 (Sodium salt) CÁCH CHUẨN BỊ TAE Chuẩn bị stock của EDTA Để cĩ 500 ml dung dịch đệm EDTA 0,5M, cân 93.05g EDTA disodium salt (FW=372.2). Hịa tan trong 400 ml nước cất và điều chỉnh pH=8.0 bằng NaOH. Đổ đầy dung dịch đạt 500ml bằng nước cất. Chuẩn bị dung dịch mẹ TAE Tạo 1 dung dịch đệm TAE đậm đặc (50X) bằng cách cân 242g Tris bazơ (Tris Base, FW=121.14) và hịa tan trong khoảng 750ml nước cất. Cẩn thận thêm 57.1ml acid acetic dạng băng (glacial acetic acid) và 100ml EDTA 0.5M (pH 8.0) và đổ nước cất đầy đến khi đạt thể tích 1L. Dung dịch đệm này cĩ thể chứa trong nhiệt độ phịng. Độ pH dung dịch này khơng cần phải điều chỉnh và pH trung bình khoảng 8.5. Chuẩn bị 1 dung dịch hoạt động cho TAE Điều kiện dung dịch hoạt động TAE 1X được chuẩn bị dễ dàng bằng dung dịch mẹ bằng việc pha lỗng 50x (lần) với nước cất. Nồng độ cuối cùng được đo là khoảng 40 mM Tris acetate và 1 mM EDTA. Và nồng độ dung dịch bây giờ đã sẵn sàng cho việc chạy Agarose gel. Đệm chạy mẫu (loading buffer): 100% glycerol: 50ml TE 10X 50ml Bromophenol blue hoặc commassive blue 0,015g Tris-HCl 20mM Tris-HCl, pH 7.5 Dung dịch phá vỡ tế bào và tách ADN: Dung dịch L6: 120 gr Guaniginum thiocyanate GuSCN (Fluka, Thụy sỹ) pha trong 100ml 0,1M Tris HCl, pH 6.4 + 22ml EDTA 0,2M và 2,6ml Triton X-100; hấp ướt khử trùng 1200Cx20 phút Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 43
  44. Bài giảng Thực hành Kỹ thuật di truyền Dung dịch rửa L2: 10 gr GuSCN /100ml Tris HCl 0,1M, pH 6.4; hấp ướt khử trùng 1200Cx20 phút Hỗn dịch Diatom (celite): 10 gr pha trong 50ml H2O + 500µl HCl 32% (hoặc 445µl HCl 36%). Khoa CNSH & KTMT – ĐH CNTP TPHCM 44