Tài liệu Sinh học phân tử (molecular biology)

pdf

190 trang vanle 4140

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Tài liệu Sinh học phân tử (molecular biology)", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

tai_lieu_sinh_hoc_phan_tu_molecular_biology.pdf

Nội dung text: Tài liệu Sinh học phân tử (molecular biology)

GV. TS. Võ Minh Trí TR Ư NG ð I H C KHOA H C T NHIÊN ð I H C QU C GIA TP. H CHÍ MINH SINH H C PHÂN T (MOLECULAR BIOLOGY) CBGD: GV.TS. Võ Minh Trí 1
NI DUNG GV. TS. Võ Minh Trí 1. Gi i thi u 2. C u trúc và s nhân b n c a v t li u di truy n 3. Bi u hi n gene 4. ðiu hịa bi u hi n gene 5. D ng c , thi t b dùng trong sinh h c phân t 6. Enzyme dùng trong sinh h c phân t 7. M t s ph ươ ng pháp trong sinh h c phân t 2
GI I THI U GV. TS. Võ Minh Trí Sinh h c phân t là gì? Mơn h c tìm hi u nh ng hi n t ư ng sinh h c mc đ phân t : đ nh ngh ĩa này khĩ phân bi t sinh h c phân t v i sinh hĩa (biochemistry). Mơn h c nghiên c u c u trúc và ch c n ăng c a gen m c đ phân t . Trong l ch s , sinh h c phân t phát tri n t mơn di truy n h c và sinh hĩa h c. ðim b t đ u c a sinh h c phân t t nh ng thí nghi m di truy n c a Mendel t gi a th k 19. Di truy n tính tr ng Sinh h c phân t ra đ i vào 1944 khi thành ph n hĩa h c c a gen đư c khám phá. 3
GV. TS. Võ Minh Trí 4
GV. TS. Võ Minh Trí CU TRÚC VÀ S NHÂN B N C A V T LI U DI TRUY N Phát hi n và v trí c a DNA trong t bào DNA là v t li u di truy n Thành ph n và c u trúc DNA Cơ ch sao chép Cơ ch s a sai và b o v DNA 5
GV. TS. Võ Minh Trí PHÁT HI N VÀ V TRÍ C A DNA TRONG T BÀO 1896 Friedrich Meischer đã phân l p DNA t tinh trùng cá và m t v t th ươ ng. Vì phân l p t vùng nhân (nuclei), F. Meischer đ t tên cho thành ph n hĩa h c m i này là nuclein Tên đư c đ i thành nucleic acid, sau đĩ là deoxyribonucleic acid (DNA) 1914 Robert Feulgen phát hi n DNA nhu m màu v i thu c nhu m fuchsin 6
Phát hi n và v trí c a DNA trong t bào GV. TS. Võ Minh Trí 7
V trí c a DNA trong t bào GV. TS. Võ Minh Trí 8
GV. TS. Võ Minh Trí DNA LÀ V T LI U DI TRUY N Thí nghi m ch ng minh hi n t ư ng bi n n p vi khu n c a Griffith (1928) Thí nghi m ch ng minh nhân t gây bi n n p là DNA c a Avery, Loeod, và Carty (1944) Thí nghi m xác đ nh v t li u do phage b ơm vào vi khu n là DNA c a Hershey và Chase (1952) 9
HI N T Ư NG BI N N P VI KHU N (Griffith)GV. TS. Võ Minh Trí Streptococcus pneumoniae : ph c u khu n gây viêm ph i Ch ng đ c (S, smooth): khu n l c tr ơn, gây ch t chu t Ch ng lành (R, rough): khu n l c thơ, khơng gây ch t chu t 10
HI N T Ư NG BI N N P VI KHU N (Griffith)GV. TS. Võ Minh Trí ðun di t ch ng đ c, tiêm vào chu t: chu t s ng. ðun di t ch ng đ c, tr n vi ch ng lành, tiêm vào chu t: chu t ch t. Kt lu n: t bào ch t ch ng đ c đã truy n tính gây b nh cho ch ng lành. Bi n n p (transformation): Griffith: hi n t ư ng truy n tính gây b nh t vi khu n đ c sang vi khu n lành. Sinh h c phân t hi n đ i: s ti p nh n DNA tr n b i t 11 bào nh n.
HI N T Ư NG BI N N P VI KHU N (Griffith)GV. TS. Võ Minh Trí 12
NHÂN T GÂY BI N N P LÀ DNA (Avery, Loeod,GV. Carty) TS. Võ Minh Trí 13
NHÂN T GÂY BI N N P LÀ DNA (Avery, Loeod,GV. TS. VõCarty) Minh Trí Huy n phù ch ng đ c đã b đun ch t đư c tr n vi các enzyme khác nhau tr ư c khi tr n v i ch ng lành và tiêm vào chu t: X lý v i protease (th y phân protein): chu t ch t. X lý v i ribonuclease (th y phân RNA): chu t ch t. X lý v i endonuclease (th y phân DNA): chu t s ng. Tr n DNA t ch ng đ c ch t v i ch ng lành, tiêm vào chu t: chu t ch t. Kt lu n: DNA là v t li u di truy n hi n t ư ng bi n n p 14
GV. TS. Võ Minh Trí VT LI U DO PHAGE B ƠM VÀO VI KHU N LÀ DNA (Hershey, Chase) S xâm nh p và nhân b n bacteriophage vi khu n Nuơi c y bacteriophage 15
S XÂM NH P VÀ NHÂN B N BACTERIOPHAGEGV. TS.VI Võ KHU Minh TríN Bacteriophage (phage, th c khu n th ): vi rút ca vi khu n Phage T2: V protein bên ngồi DNA bên trong Phage T2 xâm nhi m vi khu n E. coli Gn lên b m t vi khu n Chuy n v t ch t vào vi khu n Làm tan vi khu n và phĩng thích các phage m i Protein hay DNA đư c chuy n vào E. coli ? 16
S XÂM NH P VÀ NHÂN B N BACTERIOPHAGEGV. TS.VI Võ KHU Minh TríN 17
GV. TS. Võ Minh Trí 18
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A HERSHEY VÀ CHASE (1952) ðánh d u protein c a phage b ng 35 S b ng cách nhi m phage lên E. coli đư c nuơi trong mơi tr ư ng cĩ ch a ch t dinh d ư ng 35 S Phage đư c sinh ra cĩ protein mang 35 S 19
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A HERSHEY VÀ CHASE (1952) ðánh d u DNA c a phage b ng 32 P b ng cách nhi m phage lên E. coli đư c nuơi trong mơi tr ư ng cĩ ch a ch t dinh d ư ng 32 P Phage đư c sinh ra cĩ DNA mang 32 P 20
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A HERSHEY VÀ CHASE (1952) Nhi m phage đã đánh d u 35 S và 32 P lên E. coli nuơi trong mơi tr ư ng khơng ch a đ ng v phĩng x Tách ph n g n c a phage lên b m t E. coli bng cách l c m nh Ly tâm đ làm l ng E. coli đáy ng ly tâm Thu E. coli c n l ng (c n ly tâm, precipitant) đáy ng ly tâm và thu d ch khơng l ng (d ch n i, supernatant) ch a phage 21
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A HERSHEY VÀ CHASE (1952) Xác đ nh hàm l ư ng đ ng v phĩng x 35 S và 32 P ph n c n (ch a E. coli ) và ph n d ch n i (ch a phage): T bào E. coli (ph n c n) ch a 70% t ng 32 P Dch n i ch a phage chi m 80% t ng 35 S Kt lu n: DNA c a phage đư c chuy n vào trong t bào E. coli , cho phép nhân b n t o nhi u phage m i trong E. coli Vt ch t di truy n c a phage là DNA 22
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A HERSHEY VÀ CHASE (1952) 23
GV. TS. Võ Minh Trí THÀNH PH N VÀ C U TRÚC DNA Thành ph n hĩa h c và đ c đim DNA s i đơ n Mơ hình c u trúc DNA m ch đơi Watson-Crick ð c tính đ i song song Các c u hình DNA Cu trúc b c cao c a DNA t bào ti n nhân (prokaryote) Cu trúc b c cao c a DNA t bào nhân th t (eukaryote) 24
GV. TS. Võ Minh Trí THÀNH PH N HĨA H C C A ðƠ N PHÂN TRONG DNA VÀ RNA 25
GV. TS. Võ Minh Trí THÀNH PH N HĨA H C C A ðƠ N PHÂN TRONG DNA VÀ RNA 26
GV. TS. Võ Minh Trí 27
GV. TS. Võ Minh Trí S HÌNH THÀNH NUCLEOSIDE VÀ NUCLEOTIDE 28
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC D NG NUCLEOTIDE MONOPHOSPHATE T ADENINE: AMP, cAMP 29
GV. TS. Võ Minh Trí THÀNH PH N HĨA H C C A ðƠ N PHÂN TRONG DNA VÀ RNA Các d ng deoxyribonucleotide 30
GV. TS. Võ Minh Trí THÀNH PH N HĨA H C C A ðƠ N PHÂN TRONG DNA VÀ RNA Các d ng ribonucleotide 31
GV. TS. Võ Minh Trí PHÂN LO I NUCLEOTIDE VÀ NUCLEIC ACID 32
GV. TS. Võ Minh Trí S T O THÀNH PHÂN T POLY-(RIBO)NUCLEOTIDE B NG LIÊN K T PHOSPHODIESTER 33
GV. TS. Võ Minh Trí S S P X P BASE, RIBOSE VÀ PHOSPHATE TRONG M CH NUCLEIC ACID Khung: m ch ribose và liên k t phosphodiester ð u ch a g c phosphate t do: đ u 5’ phosphate ( đ u 5’) ð u ch a g c hydroxyl t do: đ u 3’ hydroxyl ( đ u 3’) Các base g n vuơng g c v i m t ph ng đư ng ribose Mch nucleic acid cĩ tính đ nh h ư ng 34
GV. TS. Võ Minh Trí LIÊN K T HYDROGEN GI A CÁC C P BASE PURINE-PYRIMIDINE TRONG NUCLEIC ACID M CH KÉP 35
GV. TS. Võ Minh Trí TÍNH ð I SONG SONG C A HAI M CH TRONG PHÂN T DNA 36
GV. TS. Võ Minh Trí MƠ HÌNH DNA KÉP C A WATSON-CRICK (1953) 37
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC C U HÌNH C A DNA TRONG T BÀO DNA t n t i nhi u c u hình khác nhau: Bán kính phân t (r) Kho ng cách gi a 2 nucleotide (h) Các c p nucleotide/vịng xo n (n) Dng B: trong điu ki n sinh lý bình th ư ng Các d ng khác (A, C, , Z): các điu ki n mơi tr ư ng, ni mơi tr ư ng khác nhau 38
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC THƠNG S ð C TR ƯNG C A DNA D NG A, B, Z 39
GV. TS. Võ Minh Trí KÍCH TH Ư C PHÂN T DNA 40
GV. TS. Võ Minh Trí KÍCH TH Ư C PHÂN T DNA 41
CU TRÚC B C CAO C A GV. TS. Võ Minh Trí DNA PROKARYOTE 42
GV. TS. Võ Minh Trí CU TRÚC B C CAO C A DNA PROKARYOTE 43
GV. TS. Võ Minh Trí CU TRÚC B C CAO C A DNA EUKARYOTE 44
GV. TS. Võ Minh Trí CU TRÚC B C CAO C A DNA EUKARYOTE 45
GV. TS. Võ Minh Trí CƠ CH SAO CHÉP DNA Sao chép theo khuơn, bán b o t n Cơ ch phân t c a s sao chép So sánh sao chép prokaryote và eukaryote 46
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC MƠ HÌNH SAO CHÉP DNA Sao chép (sao mã, replication) 47
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A MESELSON-STAHL (1958) 48
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A MESELSON-STAHL (1958) 49
GV. TS. Võ Minh Trí THÍ NGHI M C A MESELSON-STAHL (1958) 15 N-15 N 15 N-15 N 15 N-15 N 14 N-14 N 15 N-14 N 50
SAO CHÉP THEO KHUƠN, BÁN B O T GV. TS.N Võ Minh Trí 51
GV. TS. Võ Minh Trí CƠ CH PHÂN T C A S SAO CHÉP DNA ðiu ki n c a ph n ng t ng h p DNA (sao chép): Cn khuơn m ch đơ n Xúc tác b i DNA polymerase Cn đon m i (primer): đon RNA ng n b sung vi khuơn Cơ ch t: dATP, dCTP, dTTP, dGTP (dNTP) Mch m i đư c t ng h p b ng cách kéo dài m i theo chi u 5’ -> 3’: đ u 5’-phosphate c a nucleotide m i s gn vào đ u 3’-OH c a đư ng ribose trong oligonucleotide Các nucleotide đư c n i v i nhau b ng liên k t phosphodiester gi a 5’-P và 3’-OH 52
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC DNA POLYMERASE E. coli 53
GV. TS. Võ Minh Trí CƠ CH T C A PH N NG T NG H P RNA, DNA 54
GV. TS. Võ Minh Trí KHUƠN, M I VÀ T NG H P THEO CHI U 5’ -> 3’ 55
GV. TS. Võ Minh Trí KHUƠN, M I VÀ T NG H P THEO CHI U 5’ -> 3’ 56
GV. TS. Võ Minh Trí BA B Ư C TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAO MÃ) Kh i s (Initiation): hình thành ph c h p sao chép (replisome) trình t kh i s sao chép ori , hình thành khuơn m ch đơ n, hình thành ch ba sao chép (replication fork), t o primer Tng h p (kéo dài, Elongation): kéo dài primer, t ng hp s i DNA theo khuơn Kt thúc (Termination): gi i th ph c h p replisome, kt thúc sao mã 57
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC PROTEIN C N CHO QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAO MÃ) DnaA: nh n di n, g n vào ori , c m ng tách m ch, cm ng g n DnaB, DnaC DnaB: t o ph c h p v i DnaC DnaC: giúp g n DnaB vào khuơn DnaG: primase SSB: g n và n đ nh DNA m ch đơ n DNA gyrase: gi i xo n DNA DNA polymerase III: kéo dài primer, t o m ch DNA m i, cĩ ho t tính 3’ => 5’ exonuclease đ lo i b nucleotide sai DNA polymerase I: th y phân m i RNA và thay bng DNA DNA ligase: n i các đon Okazaki 58
GV. TS. Võ Minh Trí GN DnaA VÀO OriC VÀ HÌNH THÀNH KHUƠN M CH ðƠ N E. coli 59
GV. TS. Võ Minh Trí KH I S SAO CHÉP (SAO MÃ) 60
GV. TS. Võ Minh Trí V TRÍ VÀ HO T ð NG C A CÁC PROTEIN TRONG SAO CHÉP 61
GV. TS. Võ Minh Trí TƯƠ NG TÁC CH T CH GI A CÁC DNA POLYMERASE GI A HAI KHUƠN TRONG SAO CHÉP 62
GV. TS. Võ Minh Trí TNG H P LIÊN T C M CH TR Ư C VÀ KHƠNG LIÊN T C M CH SAU Mch tr ư c: t ng h p liên t c, h ư ng đi vào ngã ba sao chép Mch sau: t ng h p khơng liên t c theo tng đon Okazaki (1000-2000bp), theo hư ng đi ra kh i ngã ba sao chép Tc đ sao chép E. coli 5 x 10 4 nu/phút 63
GV. TS. Võ Minh Trí VAI TRỊ C A DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE T NG H P M CH SAU 64
GV. TS. Võ Minh Trí VAI TRỊ C A DNA POLYMERASE I VÀ LIGASE T NG H P M CH SAU 65
VAI TRỊ C A DNA GV. TS. Võ Minh Trí POLYMERASE I VÀ LIGASE T NG H P MCH SAU 66
GV. TS. Võ Minh Trí TNG H P THEO M T VÀ HAI CH BA SAO CHÉP 67
GV. TS. Võ Minh Trí SAO CHÉP VÀ PHÂN TÁCH DNA CON PROKARYOTE 68
GV. TS. Võ Minh Trí KT THÚC SAO CHÉP E. coli 69
GV. TS. Võ Minh Trí PHÂN TÁCH DNA CON KHI HỒN T T SAO CHÉP 70
GV. TS. Võ Minh Trí SAO CHÉP EUKARYOTE Sao chép ph c t p và ch m h ơn so v i prokaryote (3000nu/phút) Nhi u đim xu t phát sao chép (replicon) trên 1 nhi m s c th Cơ ch ki m sốt s sao chép l p li trên 1 ori 71
GV. TS. Võ Minh Trí SAO CHÉP ð NG TH I TRÊN NHII U REPLICON EUKARYOTE 72
GV. TS. Võ Minh Trí CƠ CH S A SAI VÀ B O V DNA Các d ng đ t bi n trên DNA Sa sai trong sao chép Sa sai các đ t bi n Các h th ng b o v DNA 73
GV. TS. Võ Minh Trí CÁC D NG ð T BI N TRÊN DNA ð t bi n do sai sĩt trong sao chép ð t m ch do c ơ h c Th y phân liên k t N-glycoside làm m t base Methyl hĩa trên base d n đ n b t c p sai Mt nhĩm amine d n đ n b t c p sai Chuy n d ng enol-keto, amino-imino d n đ n bt c p sai To dimer thymine trên cùng m t m ch do tia UV 74
GV. TS. Võ Minh Trí TH Y PHÂN LIÊN K T N-GLYCOSIDE LÀM M T BASE Xy ra v i t l cao đ i v i purine so v i pyrimidine 1/10 5 purine/ngày/t bào ng ư i trong điu ki n bình th ư ng 75
GV. TS. Võ Minh Trí MT NHĨM AMINE 76
GV. TS. Võ Minh Trí CHUY N D NG ENOL-KETO, AMINO-IMINO 77
GV. TS. Võ Minh Trí TO DIMER THYMINE TRÊN CÙNG M T M CH DO TIA UV 78
GV. TS. Võ Minh Trí H TH NG S A SAI DNA ð M B O TÍNH N ð NH C A VT LI U DI TRUY N DNA QUA CÁC TH H Tn s sai sĩt c a sao chép in vitro : 10 -5 Tn s sai sĩt c a sao chép in vivo : 10 -9 H th ng s a sai DNA: Sa sai trong sao chép: DNA polymerase III, DNA polymerase I Sa sai do đ t bi n 79
GV. TS. Võ Minh Trí H TH NG S A SAI TRÊN DNA E. coli 80
GV. TS. Võ Minh Trí MCH DNA M VÀ CON PHÁT HI N NUCLEOTIDE SAI TRÊN M CH CON 81
GV. TS. Võ Minh Trí THAY ðON CH A NUCLEOTIDE SAI B NG ðON M I 82
THAY ðON CH A NUCLEOTIDE M T BASE B NGGV. ð OTS. VõN Minh M TríI V trí apurinic V trí apyrimidinic 83
THAY B NG ðON M I GV. TS. Võ Minh Trí 84
H TH NG B O V DNA GV. TS. Võ Minh Trí H th ng s a sai H th ng SOS H th ng gi i h n-bi n đ i 85
H TH NG SOS (SOS REGULATORY SYSTEM)GV. TS. Võ Minh Trí 86
GV. TS. Võ Minh Trí H TH NG GI I H N – BI N ð I (RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM Giúp vi khu n phân bi t DNA chính mình v i DNA ngo i lai (phage) và th y phân DNA ngo i lai ð c đim: Nh n di n m t trình t nucleotide chuyên bi t (trình t nh n bi t) cĩ tính đ i ng u (palindrome, trình t 5’ => 3’ ca hai s i đ ng nh t) Cĩ ho t tính methyl hĩa m t nucleotide trên trình t nh n bi t: ho t tính methylase Cĩ ho t tính c t liên k t phosphodiester t i trình t nh n bi t, ho c m t v trí nh t đ nh so v i trình t nh n bi t: ho t tính endonuclease Ho t tính endonuclease ch cĩ đ i v i trình t nh n bi t khơng b methyl hĩa 87
GV. TS. Võ Minh Trí H TH NG GI I H N – BI N ð I (RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM 88
GV. TS. Võ Minh Trí BI U HI N GEN: PH ƯƠ NG TH C S D NG THƠNG TIN DI TRUY N TRONG T BÀO Hc thuy t trung tâm DNA và mã di truy n Phiên mã prokaryote Phiên mã eukaryote ð c đim, ch c n ăng các s n ph m phiên mã (RNA) Dch mã Bi n đ i sau d ch mã 89
GV. TS. Võ Minh Trí HC THUY T TRUNG TÂM Gen và tính tr ng Nguyên t c truy n thơng tin di truy n trong t bào và qua các th h Các b ư c trong quá trình bi u hi n c a gen 90
SAI H NG C A GEN D N ð N CÁC SAI H NGGV. SINH TS. Võ Minh HĨA Trí Bnh ni u alkaptonuria (Garrod, 1908): đ t bi n l n liên quan đ n homogentisic acid oxidase Các b nh di truy n đ t bi n l n khác trong chu trình phenylalanine 91
1 GEN – 1 ENZYME GV. TS. Võ Minh Trí Beadle, Tatum (1941): thí nghi m trên m c vàng Neurospora crassa To các ch ng m c đ t bi n khuy t d ư ng (m t kh n ăng t t ng h p m t nhu c u dinh d ư ng, ví d 1 acid amin Xác đ nh m i ch ng đ t bi n liên quan đ n 1 gen: gi thuy t “1 gen -1 enzyme” M r ng khái ni m: 1 gen - 1 protein 1 gen - 1 polypeptide 1 gen - 1 đ i phân t sinh h c 92
NGUYÊN T C TRUY N THƠNG TIN DI TRUYGV. TS. Võ MinhN Trí TRONG T BÀO VÀ QUA CÁC TH H Truy n thơng tin gi a 2 th h Truy n thơng tin trong t bào 93 Functional protein
Ý NGH ĨA VÀ ð C ðIM C A CÁC B ƯGV. TS.C Võ Minh Trí TRUY N THƠNG TIN Phiên mã (transcription): Ch n l a ph n thơng tin di truy n c n s d ng t b gen Chuy n thơng tin di truy n t DNA thành RNA Kích th ư c RNA nh 1/1000 l n so v i DNA RNA kém b n do cĩ C2’-OH, ch t n t i trong m t th i gian nh t đ nh trong t bào Ph ươ ng th c mã hĩa thơng tin khơng thay đ i Bn ch t hĩa h c và ki u kiên k t h u nh ư khơng thay đ i 94
Ý NGH ĨA VÀ ð C ðIM C A CÁC B ƯGV. TS.C Võ Minh Trí TRUY N THƠNG TIN Dch mã (translation): Thơng tin di truy n đư c d ch thành trình t các amino acid cĩ b n ch t hĩa h c và ki u liên k t khác Các s n ph m phiên mã đư c d ch mã m c đ khác nhau Sn ph m d ch mã cĩ c u trúc và ch c n ăng đa d ng Protein khơng b n v ng và b phân h y sau m t th i gian nh t đ nh Bi n đ i sau d ch mã (post-translational modification) Giúp ki m sốt m c đ cao h ơn s bi u hi n c a gen Th c hi n b ng nh ng bi n đ i c ng hĩa tr và khơng c ng hĩa tr 95
CH C N ĂNG ðA D NG C A PROTEINGV. TS. Võ Minh Trí 96
DỊNG THƠNG TIN T BÀO PROKARYOTE VÀ EUKARYOTEGV. TS. Võ Minh Trí Prokaryote: DNA=>RNA=>protein=>functional protein Eukaryote: DNA=>pre-mRNA=>RNA=>protein=>functional protein 97
MÃ DI TRUY N (CODON) GV. TS. Võ Minh Trí 98
PHIÊN MÃ PROKARYOTE GV. TS. Võ Minh Trí Là ph n ng sinh t ng h p RNA trong t bào t DNA khuơn. ðiu ki n c a phiên mã in vivo : RNA polymerase cĩ ho t tính (t o liên k t phosphodiester gi a các rNTP d a theo khuơn DNA m ch đơ n) Cĩ đ rNTP (rATP, rGTP, rCTP, rUTP) Gen đư c m S phiên mã đư c th c hi n theo t ng đơ n v phiên mã S t ng h p RNA luơn theo chi u 5’ => 3’. 99
ðƠ N V PHIÊN MÃ PROKARYOTE GV. TS. Võ Minh Trí ðơ n v phiên mã: Promoter: trình DNA n ơi RNA polymerase g n vào Trình t mang mã: g m trình t các b ba mã hĩa (codon) b t đ u b ng ATG và k t thúc b ng b ba k t thúc Terminator: trình t mã hĩa c u trúc k t thúc phiên mã RNA polymerase g n v i promoter thơng qua nhân t sigma 100
PROMOTER VÀ S NH N DI N B I SIGMAGV. TS. Võ Minh Trí Promoter: vùng ch a trình t b o t n các nucleotide -10 (TATAAT) và -35 (TTGACA) so v i đim b t đ u +1. Nhân t sigma nh n di n và g n v i promoter t i vùng -10 và -35. Sigma g n v i promoter c hai m ch, m ch xuơi 5’ => 3’ ch a trình t bo t n đư c nh n di n là m ch mang mã, mch đ i di n là m ch khuơn dùng đ t ng hp RNA. Trình t ribonucleotide ca RNA t ươ ng t v i trình t nucleotide ca m ch mang mã. 101
CÁC S KI N TRONG KH I S PHIÊN MÃGV. TS. Võ Minh Trí 102
BA B Ư C TRONG S PHIÊN MÃ: KÉOGV. TS. DÀI Võ Minh Trí 103
BA B Ư C TRONG S PHIÊN MÃ: K TGV. THÚC TS. Võ Minh Trí 104
BA B Ư C TRONG S PHIÊN MÃ: K TGV. THÚC TS. Võ Minh Trí 105
GV. TS. Võ Minh Trí PHIÊN MÃ THEO CÁC ðƠ N V PHIÊN MÃ Mạch DNA khuôn Mạch DNA mang mã 106
PHIÊN MÃ THEO GV. TS. Võ Minh Trí CÁC ðƠ N V PHIÊN MÃ 107
GV. TS. Võ Minh Trí SO SÁNH PHIÊN MÃ PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE Prokaryote: Mt lo i RNA polymerase t ng h p t t c các lo i RNA mRNA th ư ng ch a nhi u ORF (nhi u gene, polycistron) Eukaryote: Vùng mang mã di truy n c a gene (exon) b gián đon bi các đon khơng mang mã (intron) mRNA đư c t ng h p qua hai b ư c: ti n mRNA (pre mRNA) và mRNA tr ư ng thành (mature mRNA) Pre mRNA cĩ ch a chĩp 7-methyl-guanosine đ u 5’ và ch a đuơi polyA (100-200 adenine) đ u 3’ Pre mRNA đư c ch bi n (splicing) đ lo i b intron và ni các exon l i tr ư c khi đi vào t bào ch t mRNA tr ư ng thành trong t bào ch t ch a thơng tin liên t c 108
GV. TS. Võ Minh Trí SO SÁNH PHIÊN MÃ PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE Eukaryote: mRNA ch ch a 1 ORF (m t gen, monocistron) RNA polymerase I và III: tng h p rRNA, tRNA và các RNA nh khác RNA polymerase II: t ng h p mRNA 109
GV. TS. Võ Minh Trí PHIÊN MÃ EUKARYOTE 110
GV. TS. Võ Minh Trí GN CHĨP 5’, ðUƠI POLYA VÀ SPLICING TRONG PHIÊN MÃ EUKARYOTE 111
CÁC VÙNG CH C N ĂNG VÀ ð B N C AGV. mRNA TS. Võ Minh Trí Các vùng ch c n ăng: 5’-UTR (untranslated region): vùng 5’ khơng d ch mã Vùng d ch mã: m t hay nhi u khung d ch mã (ORF, open reading frame) 3’-UTR: vùng 3’ khơng d ch mã Terminator: c u trúc k t thúc ð b n mRNA: Ph thu c vào c u trúc b c cao đ u 5’ và 3’, m ũ 5’ và đuơi polyA mRNA c a prokaryote cĩ c u trúc đơ n gi n, th i gian bán phân ng n (phút) mRNA c a eukaryote cĩ th i gian bán phân dài (30 phút – 24 gi ) Vùng 5’khơng Vùng d ch mã, ORF Vùng 3’ khơng dch mã dch mã 112
ðƠ N V PHIÊN MÃ C A OPERON RNA PROKARYOTEGV. TS. Võ Minh Trí 113
GV. TS. Võ Minh Trí RNA RIBOSOME (rRNA) 114
CU TRÚC B C 2 C A rRNA GV. TS. Võ Minh Trí 115
RNA V N CHUY N (tRNA) GV. TS. Võ Minh Trí 116
S G N CHUYÊN BI T AMINO ACID LÊN tRNA T ƯGV. TS.NG Võ MinhNG Trí Liên k t ester hình thành gi a 3’-OH c a tRNA và –COOH c a amino acid t ươ ng ng nh s xúc tác c a aminoacyl-tRNA synthetase t ươ ng ng 117
MƠ HÌNH PHÂN T MINH H A TÍNH CHUYÊN BIGV. TS.T VõGI MinhA Trí ENZYME, AMINO ACID VÀ tRNA 118
DCH MÃ GV. TS. Võ Minh Trí Là quá trình sinh t ng h p protein trong t bào trên khuơn mRNA và ribosome. ðiu ki n c a d ch mã in vivo : Cĩ đ amino acid và aminoacyl-tRNA (tRNA g n amino acid) Cĩ đ các nhân t d ch mã Ribosome ho t đ ng và mRNA S d ch mã đư c th c hi n theo t ng đơ n v là ORF S d ch mã luơn theo chi u 5’ => 3’ c a mRNA, đ u 5’ t ươ ng ng v i -NH 2 (đ u N), đ u 3’ t ươ ng ng v i -COOH ( đ u C) c a polypeptide 119
DCH MÃ TRÊN POLYSOME GV. TS. Võ Minh Trí ð NG TH I V I PHIÊN MÃ PROKARYOTE 120
BA B Ư C TRONG D CH MÃ: KH I S GV. TS. Võ Minh Trí Gm các s ki n l p ghép cĩ tr c t ca mRNA, các ti u ph n ribosome, tRNA-fMet t i codon kh i s tr ư c khi hình thành m t liên k t peptide Ribosome hồn ch nh cĩ ba v trí: A: n ơi ti p nh n tRNA g n amino acid P: n ơi ti p nh n tRNA-fMet và nơi ch a tRNA-peptide E: v trí thốt c a tRNA ðư c ki m sốt b i các nhân t kh i s d ch mã IF (Initiation factor) 121
TƯƠ NG TÁC GI A 16S rRNA VÀ TRÌNH T GV. TS. SHINE- Võ Minh Trí DALGARNO ð U 5’ C A mRNA 122
BA B Ư C TRONG D CH MÃ: KÉO GV.DÀI TS. Võ Minh Trí Các nhân t kéo dài d ch mã EF (elongation factor) giúp đư a tRNA mang amino acid vào v trí A và cm ng s xúc tác hình thành liên k t peptide 123
BA B Ư C TRONG D CH MÃ: KÉO GV.DÀI TS. Võ Minh Trí Ribosome di chuy n 1 b ba theo chi u 5’ => 3’ c a mRNA V trí c a các tRNA trên ribosome thay đ i Năng l ư ng đư c cung c p t s th y phân GTP 124
BA B Ư C TRONG D CH MÃ: KÉO GV.DÀI TS. Võ Minh Trí 125
HÌNH THÀNH LIÊN K T PEPTIDE VÀ S GV. TS. D Võ MinhCH Trí CHUY N C A RIBOSOME TRONG D CH MÃ 126
BA B Ư C TRONG D CH MÃ: K T THÚCGV. TS. Võ Minh Trí V trí A c a ribosome gp codon k t thúc Nhân t k t thúc dch mã RF (releasing factor) gn vào Th y phân liên k t ester gi a peptide và tRNA Hai ti u ph n ribosome tách ly và r i khuơn mRNA 127
GV. TS. Võ Minh Trí BI N ð I SAU D CH MÃ (POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION) Bi n đ i c ng hĩa tr : gn thêm đư ng, phosphate, methyl Bi n đ i khơng c ng hĩa tr : Gn v i m t h p ch t phân t l ư ng nh (tác nhân bi n c u) Gn v i m t protein khác Tươ ng tác v i chaperon phân t 128
ð T BI N (MUTATION) LÀM THAY ð I KI U GENE VÀGV. KI TS. VõU Minh HÌNH Trí ð t bi n đim: Thêm ho c m t m t nu: làm l ch khung d ch mã Thay th nu này b ng nu khác: đ t bi n l ch ngh ĩa (mis-sense), đ t bi n trung tính (neutral) hay l n (silent), đ t bi n m t ngh ĩa (non-sense) Hi bi n (reverse mutation): đ t bi n đim tr l i nu ban đ u ð t bi n m t đon, thêm đon, đ o đon, chuy n v : làm b t ho t gen và m t khung d ch mã Tn s đ t bi n t nhiên: ð t bi n trong sao chép: 10 -4-10 -8/th h ð t bi n m t ngh ĩa: 10 -6-10 -8/th h Chuy n v gene: 10 -4/th h Tác nhân gây đ t bi n: tia x , hĩa ch t, sinh h c 129
ð T BI N (MUTATION) LÀM THAY ð I KI U GENE VÀGV. KI TS. VõU Minh HÌNH Trí 130
GV. TS. Võ Minh Trí ð T BI N (MUTATION) LÀM THAY ð I KI U GENE VÀ KI U HÌNH 131
GV. TS. Võ Minh Trí ðIU HỊA S BI U HI N C A GENE VÀ S PHÁT TRI N Hi n t ư ng điu hịa bi u hi n c a gene ð c đim c ơ b n c a s điu hịa bi u hi n c a gene prokaryote và eukaryote Các m c điu hịa s bi u hi n c a gene Ki m sốt d ươ ng và ki m sốt âm prokaryote Cu trúc protein điu hịa ð c đim ki m sốt phiên mã c a gene eukaryote ðiu hịa bi u hi n c a gene trong bi t hĩa và phát tri n 132
HI N T Ư NG ðIU HỊA S BI U HI N C GV. TS.A Võ GENE Minh Trí ðáp ng thích nghi c a t bào, cá th v hình thái, sinh lý, sinh hĩa đ i v i s thay đ i c a mơi tr ư ng S bi u hi n n i ti p, cĩ ch ươ ng trình c a các gene vi sinh v t S bi t hĩa thành nhi u t bào cĩ ch c n ăng khác nhau trong c ơ th đa bào b c cao 133
ð C ðIM BI U HI N C A GENE PROKARYOTEGV. TS. Võ Minh Trí S bi u hi n ca gene đáp ng theo thay đ i c a mơi tr ư ng Hu nh ư khơng cĩ bi t hĩa 134
ð C ðIM BI U HI N C A GENE EUKARYOTEGV. TS. Võ Minh Trí Ph ươ ng th c điu hịa ph c t p h ơn và cĩ s bi t hĩa 135
CÁC M C ðIU HỊA S BI U HI N C GV.A TS. GENE Võ Minh Trí Mc DNA: Thay đ i c u trúc b c cao ð t bi n, s p x p l i DNA Mc phiên mã: tăng c ư ng hay c ch phiên mã t o mRNA Mc d ch mã: Tính n đ nh và c u trúc mRNA Hi u qu t ng h p protein Mc sau d ch mã: Hình thành c u hình t nhiên Ch c n ăng và ho t tính protein 136
GV. TS. Võ Minh Trí ðIU HỊA S BI U HI N C A GENE MÃ HĨA ENZYME M C PHIÊN MÃ, D CH MÃ VÀ SAU D CH MÃ 137
ðIU HỊA S T NG H P ENZYME VÀGV. HO TS. Võ MinhT Trí TÍNH ENZYME 138
GV. TS. Võ Minh Trí BI N ð I SAU D CH MÃ B NG C Ơ CH BI N C U (BI N ð I L P TH ) 139
ðIU HỊA PHIÊN MÃ PROKARYOTE:GV. TS.KI Võ MinhM Trí SỐT ÂM (NEGATIVE CONTROL) Liên quan t i repressor và operator Khi repressor g n vào operator => khơng t o mRNA Repressor đư c điu hịa sau d ch mã => tr ng thái cĩ ho t tính và khơng cĩ ho t tính: Repressor đư c ho t hĩa b i Effector và g n vào operator: s bi u hi n c a trp operon b c ch (repression) bi tryptophane Repressor b b t ho t khơng g n vào operator: s bi u hi n ca lac operon đư c c m ng (induction) b ng lactose 140
XÚC TÁC S TH Y PHÂN LACTOSE B I βββ-GALACTOSIDASE 141
KI M SỐT ÂM S BI U HI N C A OPERON LACTOSEGV. TS. Võ Minh Trí 142
KI M SỐT ÂM S BI U HI N C A OPERON TRYPTOPHANEGV. TS. Võ Minh Trí 143
GV. TS. Võ Minh Trí ðIU HỊA PHIÊN MÃ: KI M SỐT D ƯƠ NG (POSITIVE CONTROL) Liên quan t i activator và activator-binding site (ho c enhancer) Activator g n vào enhancer => t ăng c ư ng t o mRNA Activator đư c điu hịa sau d ch mã: tr ng thái cĩ ho t tính và khơng cĩ ho t tính Activator đư c ho t hĩa b i effector (cAMP) đ gn vào activator-binding site: tr ư ng h p lac operon, mal operon 144
GV. TS. Võ Minh Trí ðIU HỊA KI M SỐT D ƯƠ NG lac OPERON 145
ðIU HỊA KI M SỐT D ƯƠ NG lac OPERONGV. TS. Võ Minh Trí 146
ðIU HỊA KI M SỐT D ƯƠ NG mal OPERONGV. TS. Võ Minh Trí 147
VAI TRỊ C A ACTIVATOR TRONG KI M SỐTGV. D TS.ƯƠ Võ MinhNG Trí 148
GV. TS. Võ Minh Trí TƯƠ NG TÁC GI A PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID Tươ ng tác khơng chuyên bi t: histone-DNA Tươ ng tác chuyên bi t: protein là dimer, m i monomer g n vào m t trình t xác đ nh trên m t si DNA ð c đim c a trình t g n protein: l p l i đ o ng ư c (trên m t m ch) 149
GV. TS. Võ Minh Trí TƯƠ NG TÁC GI A PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID 150
GV. TS. Võ Minh Trí ð C ðIM C U TRÚC C A DNA-BINDING PROTEIN Cu trúc b c 2 (xo n α-helix), ph n n đ nh c u hình và ph n ch a trình t nh n di n (n ơi g n) Xo n-gp-xo n (Helix-turn-helix motif) Ngĩn tay g n k m (zinc finger) Dây kéo leucine (leucine zipper) 151
GV. TS. Võ Minh Trí MT S C U TRÚC DNA BINDING PROTEIN 152
GV. TS. Võ Minh Trí ð C ðIM ðIU HỊA PHIÊN MÃ EUKARYOTE Ph ươ ng th c điu hịa ph c t p h ơn Promoter bao g m: TATA box và UPE (upstream element) Hu h t các gene đư c điu hịa b i đ ng th i nhi u trình t điu hịa ðiu hĩa theo c ơ ch ki m sốt d ươ ng b i activator và các enhancer n m cách xa v phía th ư ng l ưu ho c h l ưu c a promoter ðiu hịa theo c ơ ch ki m sốt âm b i repressor và trình t điu hịa (repressor-binding site) 153
GV. TS. Võ Minh Trí PROMOTER PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE 154
GV. TS. Võ Minh Trí ENHANCER VÀ KI M SỐT D ƯƠ NG EUKARYOTE 155
GV. TS. Võ Minh Trí 156
GV. TS. Võ Minh Trí ðIU HỊA S BI U HI N C A GENE TRONG QUÁ TRÌNH BI T HĨA VÀ PHÁT TRI N Các t bào khác nhau c ơ th đa bào đ u cĩ l ư ng DNA nh ư nhau và cĩ kh n ăng b t c p b sung vi nhau Các t bào bi t hĩa khác nhau cĩ hàm l ư ng, ch ng lo i mRNA và protein khác nhau Các gene đư c bi u hi n theo ch ươ ng trình th i gian Phiên mã là c ơ ch ch y u c a s điu hịa bi u hi n c a gene trong bi t hĩa và phát tri n 157
MT S ENZYME C Ơ B N DÙNG TRONGGV. TS. Võ Minh Trí SINH H C PHÂN T DNA polymerase: Taq polymerase Pfu polymerase Enzyme c t h n ch : Enzyme c t đ u dính Enzyme c t đ u b ng Enzyme n i DNA: T4 DNA ligase 158
Taq polymerase GV. TS. Võ Minh Trí DNA polymerase ch u nhi t, nhi t đ ho t đ ng thích h p 70-80 oC Chi t tách t vi khu n Thermus aquaticus sng su i n ư c nĩng Tc đ t ng h p chu i oligonucleotide kho ng 1000-1500nu/phút ðư c s d ng đ t ng h p đon DNA in vitro Taq polymerase s g n các dNTP vào đ u 3’OH ca nucleotide n m trong oligonucleotide d a theo mch khuơn 159
Taq polymerase GV. TS. Võ Minh Trí Taq polymerase s g n thêm m t nucleotide adenine (A), làm cho m ch m i t ng h p s d ư m t A so vi m ch khuơn (75% s n ph m PCR) ð chính xác khơng cao (10 -4 errors/bp) Ph n ng đư c xúc tác b i Taq polymerase ph i cĩ đ y đ các thành ph n sau: Mch DNA đơ n làm khuơn Mi-là m t đon oligonucleotide ng n (5-150 nu) ph i b sung v i m ch DNA khuơn dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP Dung d ch đ m ch a ph n mu i và pH thích h p đ duy trì ho t tính c a Taq polymerase 160
Taq polymerase GV. TS. Võ Minh Trí 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TGATCGAT-5’ 5’-ATCGGC-3’ 3’ -TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT -5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’ 3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTAA-3’ 3’-ATAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 161
Pfu polymerase GV. TS. Võ Minh Trí Là DNA polymerase ch u nhi t, nhi t đ ho t đ ng thích h p 70-80 oC Chi t tách t vi khu n c Pyrococcus furiosus sng su i n ư c nĩng (nhi t đ thích h p 100 oC ) Tc đ t ng h p chu i oligonucleotide kho ng 500-1000nu/phút ðư c s d ng đ t ng h p đon DNA in vitro Pfu polymerase s g n các dNTP vào đ u 3’OH ca nucleotide n m trong oligonucleotide d a theo mch khuơn 162
Pfu polymerase GV. TS. Võ Minh Trí Pfu polymerase khơng g n nucleotide vào đ u 3’OH ð chính xác cao (10 -6 errors/bp) Ph n ng đư c xúc tác b i Pfu polymerase ph i cĩ đ y đ các thành ph n sau (c ũng t ươ ng t Taq polymerase): Mch DNA đơ n làm khuơn Mi-là m t đon oligonucleotide ng n (5-150 nu) ph i b sung v i m ch DNA khuơn dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP Dung d ch đ m ch a ph n mu i và pH thích h p đ duy trì ho t tính c a Pfu polymerase 163
Pfu polymerase GV. TS. Võ Minh Trí 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TGATCGAT -5’ 5’-ATCGGC -3’ 3’ -TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT -5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA-3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT -5’ 5’-ATCGGCTACGGCCATGAGACTCCC///TTCCAAATCATAGCACTAGCTA -3’ 3’-TAGCCGATGCCGGTACTCTGAGGG///AAGGTTTAGTATCGTGATCGAT-5’ 164
Enzyme c t h n ch GV. TS. Võ Minh Trí Là enzyme c a vi khu n dùng đ c t DNA c a bacteriophage (phage) xâm nhi m vi khu n, nh đĩ b o v vi khu n kh i b phage tiêu di t Th y phân liên k t phosphodiester trên s i DNA t i v trí chuyên bi t s gi i phĩng s i DNA cĩ đ u 5’P và 3’OH Cĩ nhi u lo i enzyme c t h n ch Sau khi c t s n ph m DNA cĩ th đ u dính hay đ u b ng Tên g i c a enzyme c t h n ch đư c g i theo tên vi t t t c a lồi vi sinh v t đ u tiên cĩ enzyme c t gi i h n đĩ 165
Các lo i enzyme c t h n ch GV. TS. Võ Minh Trí 166
GV. TS. Võ Minh Trí Tên g i c a enzyme c t h n ch Hin dIII: Haemophilus in fluenzae serotype d Eco RI: Escherichia co li RY13 Bgl II: Bacillus gl obigii 167
V trí c t c a enzyme c t h n ch GV. TS. Võ Minh Trí Trình t đ i ng u: đ i x ng qua m t tr c Ct đ u dính: 5’-G-3’ OH 5’ P-AATTC-3’ 5’-A-3’ OH 5’ P-AGCTT-3’ 3’-CTTAA-5’ P 3’ OH -G-5’ 3’-TTCGA-5’ P 3’ OH -A-5’ 168
V trí c t c a enzyme c t h n ch GV. TS. Võ Minh Trí Ct đ u b ng: 5’-CCC-3’ OH 5’ P-GGG-3’ 5’-AGG-3’ OH 5’ P-CCT-3’ 3’-GGG-5’ P 3’ OH -CCC-5’ 3’-TCC-5’ P 3’ OH -GGA-5’ 169
T4 DNA ligase GV. TS. Võ Minh Trí ðư c tìm th y và chi t tách t bacteriophage T4 Xúc tác s hình thành phosphodiester gi a 3’OH ca chu i DNA này v i đ u 5’P c a m t chu i DNA khác T4 DNA ligase cĩ th n i DNA s i đơi ho c DNA si đơ n/RNA đ t o thành m t phân t Trong tr ư ng h p DNA s i đơi, các đon DNA đã x lý v i enzyme c t h n ch thì T4 DNA ligase ch cĩ th n i các đon DNA c t cùng lo i enzyme 170
T4 DNA ligase GV. TS. Võ Minh Trí 171
GV. TS. Võ Minh Trí Phân t DNA 1 đã x lý v i Eco RI Phân t DNA 2 đã x lý v i Eco RI 5’-ATATATACCGGA G-3’OH 5’P-AATTC TTCCACCCCCGG AAGCTT GGGAAAT-3’ 3’-TATATATGGCCT CTTAA-5’P 3’OH-GAAGGTGGGGGCC TTCGAA CCCTTTA-5’ T4 DNA ligase Liên k t hydro đư c t o thành gi a các base nit ơ b t c p b sung 3’OH 5’P 5’-ATATATACCGGA GAATTC TTCCACCCCCGG AAGCTT GGGAAAT-3’ 3’-TATATATGGCCT CTTAAG AAGGTGGGGGCC TTCGAA CCCTTTA-5’ 5’P 3’OH T4 DNA ligase s xúc tác hình thành liên k t phosphodiester c hai m ch t o thành 1 phân t DNA 5’-ATATATACCGGA GAATTC TTCCACCCCCGG AAGCTT GGGAAAT-3’ 3’-TATATATGGCCT CTTAAG AAGGTGGGGGCC TTCGAA CCCTTTA-5’ 172
MT S D NG C , THI T B VÀ PH ƯƠ GV.NG TS. VõPHÁP Minh Trí DÙNG TRONG SINH H C PHÂN T Pipetman, eppendorf Máy ly tâm, ph ươ ng pháp ly tâm ðin di và phát hi n nucleic acid Nhân b n DNA b ng ph n ng PCR Xác đ nh n ng đ và đ s ch m u nucleic acid Bi n tính DNA Lai DNA Gi i trình t DNA Tách chi t DNA b gene và plasmid Thu nh n đon DNA, gene 173
Pipetman GV. TS. Võ Minh Trí Hút chính xác vi dung tích (µl) 174
Eppendorf GV. TS. Võ Minh Trí Ch a m u v i dung tích nh (0,5µl – 2ml) ng ly tâm ng th c hi n ph n ng PCR 175
Ph ươ ng pháp ly tâm GV. TS. Võ Minh Trí Phân tách các thành ph n r n trong huy n phù d a vào trong l ư ng phân t d ư i tác d ng c a l c ly tâm F = m ω2r RCF = (1.119 x 10 -5)(rpm) 2(r) 176
ðin di DNA GV. TS. Võ Minh Trí Phân tách các đon DNA cĩ kích th ư c phân t khác nhau d ư i tác d ng ca đin tr ư ng Mu di chuy n t c c âm sang c c d ươ ng B ngu n: cung c p dịng đin Bn đin di: n ơi ch a dung d ch đin di, giá th đin di (agarose gel), n ơi x y ra quá trình di chuy n c a các đon DNA 177
ðin di DNA GV. TS. Võ Minh Trí Cách ti ến hành : Chu n b giá th đin di (agarose gel): đun ch y agarose gel, ch ngu i, đ vào khuơn đã g n l ư c t o gi ng, ch agarose gel đơng Tháo l ư c ra kh i agarose gel, l p vào b n đin di, thêm dung d ch di n di v ư t qua m t gel 178
ðin di DNA GV. TS. Võ Minh Trí Cách ti ến hành : Chu n b m u đin di: m u DNA đư c tr n v i dung d ch n p m u Ch a glycerol ho c succrose: ng ăn khơng cho m u DNA thốt ra kh i gi ng Ch a ph m màu: nh n bi t m u đin di đã di chuy n t i đâu trong giá th đin di Mi m u DNA đư c n p m i gi ng khác nhau Gi ng đ u tiên đư c n p v i thang DNA Ch a các đon DNA đã bi t tr ư c kích th ư c ð y n p b n đin di, b t ngu n đ cung c p dịng đin, quan sát s di chuy n c a v ch màu, t t ngu n khi v ch màu di chuy n t i m t v trí thích h p 179
ðin di DNA GV. TS. Võ Minh Trí Cách ti ến hành : Ngâm gel vào dung d ch ch a ethidium bromide Ethidium bromide cĩ ái l c m nh v i nucleic acid và xen gi a hai base nit ơ, phát sáng khi kích thích b ng tia UV, vì v y trên gel agarose n ơi cĩ DNA thì ethidium bromide s g n vào và phát ra v ch sáng Xem k t qu trên h p đèn UV, ch p hình 1 2 3 4 5 3.5 kb 3.0 kb 2.5 kb 1.0 kb 2148bp bp bp 1176bp bp bp 0.5 kb 180
Xác đ nh n ng đ và đ s ch m u nucleicGV. TS. acid Võ Minh Trí Xác đ nh n ng đ c a dung d ch nucleic acid: Da vào s h p thu c a nucleic acid b ư c sĩng 260nm ð i v i dung d ch DNA m ch đơi: 1 đơ n v OD 260nm tươ ng ng 50µg/ml ð i v i dung d ch DNA m ch đơ n ho c RNA: 1 đơ n v OD 260nm tươ ng ng 40 µg/ml Xác đ nh đ s ch c a m u nucleic acid: Da vào t l OD 260nm /OD 280nm OD 260nm /OD 280nm = 1,8 – 2 => m u nucleic acid s ch protein 181
Xác đ nh n ng đ và đ s ch m u nucleicGV. TS. acid Võ Minh Trí 182
Nhân b n DNA b ng ph n ng PCR GV. TS. Võ Minh Trí PCR (Polymerase Chain Reaction): là ph n ng nhân b n in vitro DNA d ư i xúc tác c a DNA polymerase ch u nhi t Gm 3 b ư c: Bi n tính DNA: ph n ng PCR đư c nâng nhi t đ t i kho ng 95 oC đ hai m ch c a phân t DNA tách r i nhau ra. Hai mch này đư c s d ng làm khuơn Bt c p: Ph n ng PCR đư c h nhi t đ xu ng trong kho ng 50-65 oC đ m ch khuơn và m i b t c p v i nhau. Nhi t đ b t c p tùy thu c vào đ c tính c a m i 183
Nhân b n DNA b ng ph n ng PCR GV. TS. Võ Minh Trí Kéo dài: Ph n ng PCR đư c nâng lên nhi t đ thích h p cho DNA polymerase ch u nhi t ho t đ ng kho ng 72 oC đ kéo dài m i theo chi u 5’ => 3’ b ng cách thêm nucleotide vào đ u 3’OH và d a vào m ch b sung Ba b ư c này t o thành m t chu k ỳ trong ph n ng PCR. Mi ph n ng PCR th ư ng lp l i kho ng 30 – 35 chu k ỳ Khu ch đ i s l ư ng b n sao đon DNA lên 10 6 ln 184
Bi n tính DNA GV. TS. Võ Minh Trí Liên k t hydrogen gi a hai m ch b sung cĩ th b c t đ t khi x lý vi tác nhân hĩa h c-vt lý, giúp hai m ch tách r i nhau Tm : nhi t đ c n thi t đ m ch đơi c a phân t DNA tách thành mch đơ n Hai m ch DNA đã tách cĩ th tái b t c p b sung đ tr v dng ban đ u (phân t DNA mch đơi) khi dung d ch đư c h nhi t đ t t 185
Lai DNA (DNA hybridization) GV. TS. Võ Minh Trí Ph ươ ng pháp lai Southern Giúp phát hi n trình t chuyên bi t trên m t đon DNA Da vào s b t c p b sung gi a trình t c n xác đ nh và m u dị (probe) Probe: oligonucleotide vi trình t đã bi t và đư c đánh d u b ng đ ng v phĩng xa, ch t phát hu ỳnh quang, m t ch t cĩ kh n ăng t o màu 186
Lai DNA (DNA hybridization) GV. TS. Võ Minh Trí 187
Gi i trình t DNA GV. TS. Võ Minh Trí Dùng ph ươ ng pháp Sanger v i dideoxyribonucleotide (ddNTP) đánh d u Trình t DNA đư c đ c d a trên t ng h p các s i b sung b ng DNA polymerase b gián đon b i m t ddNTP nh t đ nh đư c đánh d u Tách các đon DNA bng đin di trên polyacrylamide gel ð c trình t 188
Gi i trình t DNA GV. TS. Võ Minh Trí 189
Thu nh n DNA b gene và plasmid GV. TS. Võ Minh Trí Tách chi t DNA b gene, plasmid t t bào Phân tích b ng đin di Ki m tra đ s ch, n ng đ 190