Tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Chuyên ngành Vi sinh y học (Tập 2)

Nội dung text: Tài liệu Hướng dẫn quy trình kỹ thuật Chuyên ngành Vi sinh y học (Tập 2)

1. BỘ Y TẾ HƯỚNG DẪN QUY TRÌNH KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH VI SINH Y HỌC (Tập 2) Hà Nội 2018
2. MỤC LỤC 1. Vi khuẩn vi hiếu khí nuôi cấy và định danh bằng phương pháp thông thường .................................................................................................................................. 1 2. MTB IGRA (Interferon γ Assay) .................................................................................. 4 3. NTM (Nontuberculous mycobacteria) định danh Real-time PCR .............................. 8 4. Vibrio cholerae soi tươi ................................................................................................ 12 5. Vibrio cholerae real-time PCR .................................................................................... 15 6. Neisseria gonorrhoreae Real-time PCR ..................................................................... 18 7. Neisseria gonorrhoreae kháng thuốc PCR ................................................................. 22 8. Neisseria gonorrhoreae kháng thuốc giải trình tự gene ............................................. 25 9. Chlamydia kháng thuốc giải trình tự gene .................................................................. 28 10. Clostridium difficile miễn dịch tự động ..................................................................... 31 11. Helicobacter pylori Ag test nhanh ............................................................................. 35 12. Helicobacter pylori Ab test nhanh ............................................................................. 38 13. Helicobacter pylori nuôi cấy, định danh và kháng thuốc ........................................ 41 14. Helicobacter pylori Ab miễn dịch bán tự động ......................................................... 46 15. Helicobacter pylori Real-time PCR ......................................................................... 50 16. Leptospira định danh PCR ......................................................................................... 53 17. Mycoplasma pneumoniae Ab miễn dịch bán tự động .............................................. 56 18. Mycoplasma hominis test nhanh ................................................................................ 60 19. Mycoplasma hominis nhuộm huỳnh quang .............................................................. 63 20. Mycoplasma hominis PCR ......................................................................................... 66 21. Mycoplasma hominis Real-time PCR ....................................................................... 70 22. Rickettsia Real-time PCR ........................................................................................... 73 23. Treponema pallidum nhuộm huỳnh quang ............................................................... 77 24. Treponema pallidum test nhanh ................................................................................. 80 25. Treponema pallidum PCR .......................................................................................... 83 26. Treponema pallidum Real-time PCR ........................................................................ 86 27. Ureaplasma urealyticum test nhanh .......................................................................... 89 28. Ureaplasma urealyticum nhuộm huỳnh quang ........................................................ 92 29. Ureaplasma urealyticum PCR ................................................................................... 95 30. Ureaplasma urealyticum Real-time PCR ................................................................. 99 31. Virus Ag miễn dịch tự động ..................................................................................... 103 32. Virus Ab miễn dịch tự động ..................................................................................... 108
3. 33. Virus Xpert ................................................................................................................ 113 34. Virus PCR ................................................................................................................. 116 35. Virus Real-time PCR ................................................................................................ 119 36. Virus giải trình tự gen ............................................................................................... 123 37. HBsAb test nhanh ..................................................................................................... 126 38. HBcAb test nhanh..................................................................................................... 129 39. HBeAg test nhanh..................................................................................................... 132 40. HBeAb test nhanh..................................................................................................... 135 41. HBeAg định lượng ................................................................................................... 138 42. HAV Ab test nhanh .................................................................................................. 143 43. HCV Ab test nhanh .................................................................................................. 146 44. HEV IgG miễn dịch bán tự động ............................................................................. 149 45. Dengue virus IgA test nhanh ................................................................................... 153 46. Dengue virus NS1Ag miễn dịch bán tự động ......................................................... 156 47. Dengue Virus Real-time RT-PCR ........................................................................... 160 48. HSV 2 IgG miễn dịch tự động ................................................................................. 164 49. EBV IgG miễn dịch tự động .................................................................................... 167 50. EV71 IgM/IgG test nhanh ........................................................................................ 170 51. BK virus đo tải lượng Real-time PCR .................................................................... 173 52. Enterovirus Real-time PCR ..................................................................................... 177 53. Coronavirus Real-time PCR .................................................................................... 181 54. Hantan virus test nhanh ............................................................................................ 185 55. Hantavirus PCR ........................................................................................................ 188 56. Measles virus Ab miễn dịch tự động ....................................................................... 191 57. Rota virus Ag miễn dịch bán tự động ..................................................................... 195 58. Rotavirus PCR .......................................................................................................... 199 59. Rubella virus test nhanh ........................................................................................... 203 60. Rubella virus Avidity ............................................................................................... 206 61. Rubellavirus Real-time PCR .................................................................................... 210 62. Zika virus Real-time PCR ........................................................................................ 214 63. Parvovirus B19 IgM miễn dịch bán tự động .......................................................... 218 64. Parvovirus B19 IgG miễn dịch bán tự động ........................................................... 222 65. Parvo virus B19 Real-time PCR .............................................................................. 226
4. 66. Chikungunia IgM miễn dịch bán tự động ............................................................... 231 67. Cryptosporidium test nhanh ..................................................................................... 235 68. Echinococcus granulosus (Sán dây chó) Ab miễn dịch bán tự động .................... 238 69. Paragonimus (Sán lá phổi) Ab miễn dịch bán tự động .......................................... 241 70. Schistosoma (Sán máng) Ab miễn dịch bán tự động ............................................. 244 71. Toxoplasma gondii IgM miễn dịch bán tự động..................................................... 247 72. Toxoplasma gondii IgG miễn dịch bán tự động ..................................................... 252 73. Trichinella spiralis (Giun xoắn) Ab miễn dịch bán tự động .................................. 256 74. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật PCR lồng đa tác nhân .................................. 259 75. Vi sinh vật nhiễm khuẩn não-màng não Real-time PCR đa tác nhân ................... 262 76. Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp Real-time PCR đa tác nhân ................................ 265 77. Vi sinh vật nhiễm khuẩn đường ruột Real-time PCR đa tác nhân ........................ 268 78. MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TRCReady ................................. 271 79. MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng INH nồng độ cao môi trường lỏng ................................................................................................................................... 275 80. MTB (Mycobacterium tuberculosis) định danh TB-LAMP ................................. 279 81. MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc MIC trên môi trường lỏng ................................................................................................................................... 283 82. MTB (Mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc Bedaquiline MIC trên môi trường thạch ............................................................................................................. 287 83. Norovirus test nhanh ................................................................................................. 292 PHỤ LỤC:
5. CÁC TỪ VIẾT TẮT BCĐN: Bạch cầu đa nhân CLIA: Chemiluminescence immunoassay CLSI: Clinical and laboratory standards institute CO: Cut off DNA: Deoxyribonucleic acid ELISA: Enzyme-linked immunosorbant assay EQAS: External quality assessment scheme HBV: Hepatitis B virus HCV: Hepatitis C virus HIV: Human immunodeficiency virus HPC: High positive control HT: Huyết thanh I: Intermediate IU: International unit KKT: Kháng kháng thể KN-KT: Kháng nguyên - Kháng thể KST: Ký sinh trùng LPC: Low positive control NC: Negative control OD: Optical density PC: Positive control PCR: Polymerase chain reaction QC: Quality control R: Resistant RNA: Ribonucleic acid RT – PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction S: Susceptible VD: Ví dụ VK: Vi khuẩn VSV: Vi sinh vật
6. 1. Vi khuẩn vi hiếu khí nuôi cấy và định danh bằng phương pháp thông thường I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ 1. Mục đích Phát hiện và định danh vi khuẩn vi hiếu khí gây bệnh bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển. 2. Nguyên lý Dựa vào đ c điểm v hình dạng, tính chất bắt màu c a vi khuẩn khi nhuộm Gram, đ c điểm c a khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy, đi u kiện khí trường cần cho nuôi cấy và các thử nghiệm sinh vật hóa học để xác định vi khuẩn. II. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện - Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh. - Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh 2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương): 2.1 Trang thiết bị: - T an toàn sinh học cấp 2 - T ấm thường, t ấm CO2 - Kính hiển vi - Lò hấp - Máy đo độ đục chuẩn - Máy tính cài phần m m đọc API (nếu có) - Hộp nuôi cấy kín 2.2 Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm) STT Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao Đơn vị 1 Môi trường vận chuyển bệnh phẩm lọ 2 Môi trường nuôi cấy vi hiếu khí đĩa 3 Túi Genbag vi hiếu khí túi 4 Bộ định danh API bộ 5 Dung dịch Oxydase ml 1
7. 6 Thuốc nhuộm tím Gentian ml 7 Lugol ml 8 Cồn tẩy màu 950 ml 9 Thuốc nhuộm đỏ Fucsin ml 10 Dầu soi kính ml 11 Cồn 700 lau t an toàn sinh học ml 12 Đầu côn 200µl vô trùng cái 13 Lam kính cái 14 Que cấy nhựa vô trùng cái 15 Tube plastic 5 ml vô trùng cái 16 Khay đựng bệnh phẩm cái 17 Hộp vận chuyển bệnh phẩm cái 18 Dung dịch xà phòng rửa tay ml 19 A xít ngâm lam ml 20 Mũ bảo hộ cái 21 Khẩu trang cái 22 Găng tay đôi 23 Giấy lau b m t t an toàn tờ 24 Dung dịch khử trùng ml 25 Găng xử lý dụng cụ đôi 26 Bút viết kính cái 27 Bút bi cái 28 Túi đựng rác cái 29 Áo phòng xét nghiệm cái 30 Sổ xét nghiệm tờ 31 Giấy trả kết quả xét nghiệm tờ 32 Nội kiểm tra chất lượng (QC)* (nếu thực hiện) 33 Ngoại kiểm tra (EQAS)* (nếu thực hiện) * Ghi chú: - Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng > 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật). 2
8. - Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 4 lần/1 năm). 3 Bệnh phẩm Tất cả bệnh phẩm được chỉ định nuôi cấy tìm vi khuẩn vi hiếu khí. 4 Phiếu xét nghiệm Đi n đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH 1. Lấy bệnh phẩm Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh. 2. Tiến hành kỹ thuật - Nhuộm soi bệnh phẩm, đánh giá sơ bộ - Cấy bệnh phẩm trên môi trường nuôi cấy - ấm trong đi u kiện khí trường tối ưu phù hợp, nhiệt độ thích hợp và trong thời gian phù hợp với tuỳ loại căn nguyên cần tìm kiếm. - Lấy khuẩn lạc nghi ngờ nhuộm Gram, thử tính chất sinh vật hóa học đơn giản, định danh bằng bộ API. IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ Dựa kết quả nhuộm Gram, đ c điểm khuẩn lạc và đ c điểm sinh vật hóa học c a vi khuẩn để nhận định kết quả. - Dương tính: Phân lập và định danh được vi khuẩn gây bệnh. Trả tên vi khuẩn gây bệnh đến mức độ chi và/ho c loài. - Âm tính: Không tìm thấy ho c không phân lập được vi khuẩn gây bệnh V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ - Quy trình này chỉ áp dụng cho nuôi cấy và định danh tìm vi khuẩn vi hiếu khí trong các loại bệnh phẩm. - Kết quả âm tính không có nghĩa là không có vi khuẩn gây bệnh trong bệnh phẩm, mà chỉ khẳng định là không tìm thấy vi khuẩn gây bệnh có thể phân lập được bằng quy trình nuôi cấy này. - Bệnh phẩm lấy, vận chuyển và bảo quản không đúng yêu cầu có thể đưa đến kết quả âm tính ho c dương tính giả. 3
9. 2. MTB IGRA (Interferon γ Assay) I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ 1. Mục đích Xét nghiệm hỗ trợ phát hiện nhiễm M. tuberculosis thông qua việc phát hiện interferon γ (IFN-γ) bằng kỹ thuật ELISA. 2. Nguyên lý Phát hiện interferon γ do các tế bào miễn dịch tạo ra khi bị kích thích b i các mycobacterial peptides (ESAT-6, CFP-10 và TB7.7(p4)) dựa trên nguyên lý c a kỹ thuật ELISA. II. CHUẨN BỊ 1. Người thực hiện: - Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ ho c chứng nhận v chuyên ngành xét nghiệm. - Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học v chuyên ngành xét nghiệm. 2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương) 2.1. Trang thiết bị - T ấm thường - Dàn máy ELISA - Máy ly tâm thường - Máy lắc phiến nhựa - Máy Vortex - Máy đọc phiến nhựa bước sóng 450 nm và 620 – 650 nm - T lạnh 20C - 80C - Micropipette đơn kênh thể tích từ 10 µl đến 1000 µl. - Bộ micropipette 8 kênh thể tích từ 50 µl đến 200 µl 2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm) STT Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao Đơn vị 1 Bông Kg 2 Dây garô Cái 3 Cồn mL 4 Bơm kim tiêm Cái 5 Panh Cái 4