Sinh học - Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein

Nội dung text: Sinh học - Định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein

1. ĐĐịịnhnh lưlượợngng vvàà đđáánhnh gigiáá đđộộ tinhtinh ssạạchch ccủủaa chchếế phphẩẩmm proteinprotein 1
2. CCáácc phươngphương phpháápp xxáácc đđịịnhnh hhààmm lưlượợngng proteinprotein Protein sau khi đã được tách chiết và làm sạch có thể định lượng được. Nếu protein nghiên cứu là enzyme thì việc định lượng thông qua xác định hoạt độ của enzyme (theo quy ước quốc tế: 1 đơn vị hoạt độ enzyme là lượng enzyme làm chuyển hoá 1 mol cơ chất trong 1 phút ở các điều kiện tiêu chuẩn). 2
3. CCáácc phươngphương phpháápp xxáácc đđịịnhnh hhààmm lưlượợngng proteinprotein Như vậy cứ sau các bước tách chiết và làm sạch protein người ta thấy tổng lượng protein giảm nhưng hoạt độ enzyme tăng nghĩa là hoạt độ riêng tăng rất cao. Protein được coi là sạch nếu những bước tách chiết và làm sạch sau không làm tăng hoạt độ riêng của chúng nữa, và chỉ khi đó ta mới hoàn thành việc tách chiết và làm sạch protein 3
4. CCáácc phươngphương phpháápp xxáácc đđịịnhnh hhààmm lưlượợngng proteinprotein Nếu protein không phải là enzyme thì ta có thể định lượng chúng bằng các phương pháp khác. Nếu protein ta nghiên cứu là hormon hoặc các độc tố thì chúng được xác định qua hiệu ứng sinh học mà chúng gây ra; ví dụ như hormon sinh trưởng (growth hormone) sẽ kích thích sự sinh trưởng của các tế bào đích nuôi cấy. Nếu là protein vận chuyển thì có thể xác định chúng thông qua nồng độ chất mà chúng vận chuyển 4
5. ĐĐịịnhnh lưlượợngng nitrogennitrogen theotheo phươngphương phpháápp KjeldahlKjeldahl Phần lớn các phương pháp gián tiếp xác định protein đều dựa trên cơ sở xác định lượng nitrogen. Lượng nitrogen có trong các protein là gần giống nhau không phụ thuộc vào chất lượng và nguồn protein. Đương nhiên trên cơ sở lượng nitrogen có thể xác định chỉ các protein đã được tinh sạch hoặc lượng protein của các mẫu nghiên cứu mà ngoài protein ra không chứa những chất chứa nitrogen khác. 5
6. ĐĐịịnhnh lưlượợngng nitrogennitrogen theotheo phươngphương phpháápp KjeldahlKjeldahl TrongTrong nôngnông nghinghiệệpp vvàà côngcông nghinghiệệpp ththựựcc phphẩẩm,m, proteinprotein thôthô đưđượợcc đđịịnhnh lưlượợngng bbằằngng ccááchch xxáácc đđịịnhnh lưlượợngng nitrogennitrogen totoàànn phphầầnn vvàà kkếếtt ququảả nhânnhân vvớớii 6,256,25,, nghnghĩĩaa llàà coicoi proteinprotein luônluôn luônluôn chchứứaa 16%16% nitrgen.nitrgen. 6
7. ĐĐịịnhnh lưlượợngng nitrogennitrogen theotheo phươngphương phpháápp KjeldahlKjeldahl ThThựựcc ttếế,, trongtrong ththựựcc phphẩẩm,m, bênbên ccạạnhnh proteinprotein còncòn ccóó nhnhữữngng chchấấtt hhữữuu cơcơ khkháácc ccóó chchứứaa nitrogennitrogen nhưnhư amidamid,, alcaloid,alcaloid, ammoniaammonia (v(víí ddụụ nhưnhư trongtrong ththựựcc phphẩẩmm lênlên men)men) acidacid nitricnitric dodo đđóó hhààmm lưlượợngng nitrogennitrogen totoàànn phphầầnn chchíínhnh ththứứcc caocao hơnhơn 16%16% (16(16 17%)17%) nhưngnhưng ởở proteinprotein ththựựcc vvậậtt ththìì hhààmm lưlượợngng nnààyy llạạii ththấấpp hơnhơn 16%.16%. HHệệ ssốố 6,256,25 llàà hhệệ ssốố trungtrung bbììnhnh thô.thô. 7
8. ĐĐịịnhnh lưlượợngng nitrogennitrogen theotheo phươngphương phpháápp KjeldahlKjeldahl NguyênNguyên lýlý ccủủaa phươngphương phpháápp nnààyy llàà vôvô cơcơ hohoáá mmẫẫuu bbằằngng HH2SOSO4 đđậậmm đđặặcc vvàà chchấấtt xxúúcc ttáác.c. DDùùngng mmộộtt kikiềềmm mmạạnhnh (NaOH(NaOH hohoặặcc KOH)KOH) đđẩẩyy NHNH3 ttừừ mumuốốii (NH(NH4))2SOSO4 SSauau đđóó hhứứngng NHNH3 vvààoo dungdung ddịịchch acidacid ccóó nnồồngng đđộộ xxáácc đđịịnh.nh. SSauau đđóó ddùùngng kikiềềmm ccóó nnồồngng đđộộ xxáácc đđịịnhnh đđểể chuchuẩẩnn đđộộ acidacid dưdư TTừừ đđóó ttíínhnh đưđượợcc lưlượợngng nitrogennitrogen ccóó trongtrong nguyênnguyên liliệệuu 8
9. ĐĐịịnhnh lưlượợngng proteinprotein theotheo phươngphương phpháápp LowryLowry Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng máy đo màu để xác định màu sản phẩm khử của phosphomolipden - phosphowolframate (thuốc thử Folin - Ciocalteau) với phức hợp đồng - protein. Phức màu xanh tạo thành có thể đo ở bước sóng 675nm. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ protein. Dựa vào đồ thị chuẩn protein (thông thường dùng tinh thể albumin huyết thanh bò) ta có thể tính được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. 9
10. ĐĐịịnhnh lưlượợngng proteinprotein theotheo phươngphương phpháápp LowryLowry Phương pháp Lowry được dùng rộng rãi để xác định nhiều loại protein khác nhau. Phương pháp này có độ nhạy cao, cho phép phát hiện được protein trong dung dịch ở nồng độ 1 g/ml. Tuy nhiên cường độ màu còn tuỳ thuộc nhiều vào loại protein. Ví dụ, ở cùng một nồng độ, dung dịch trypsin cho cường độ màu cao gấp 3 lần gelatin, hemoglobin cho cường độ màu thấp hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin. Ngoài ra, nhiều chất khác có thể làm tăng hay giảm cường độ màu phản ứng, vì vậy phương pháp này cho kết quả chính xác khi xác định protein đã được tinh sạch. 10
11. ĐĐịịnhnh lưlượợngng proteinprotein bbằằngng phươngphương phpháápp quangquang phphổổ PhươngPhương phpháápp đơnđơn gigiảảnn nhnhấấtt đđểể đođo nnồồngng đđộộ proteinprotein trongtrong dungdung ddịịchch llàà đđộộ hhấấpp ththụụ tiatia ccựựcc ttíímm ccủủaa nnóó NNếếuu proteinprotein tinhtinh ssạạchch ththìì nnồồngng đđộộ tuytuyệệtt đđốốii ccủủaa nnóó đưđượợcc ttíínhnh theotheo gigiáá trtrịị đođo đưđượợc.c. NNếếuu proteinprotein khôngkhông tinhtinh ssạạchch (v(víí ddụụ,, ddịịchch chichiếếtt ttừừ mmộộtt ssắắcc ký)ký) ththìì nnồồngng đđộộ ccủủaa proteinprotein ttổổngng đưđượợcc ttíínhnh tươngtương đđốốii ttừừ đđộộ hhấấpp ththụụ 11
12. ĐĐịịnhnh lưlượợngng proteinprotein bbằằngng phươngphương phpháápp quangquang phphổổ NguyênNguyên ttắắcc ccủủaa phươngphương phpháápp nnààyy llàà ccáácc proteinprotein hhấấpp ththụụ tiatia ccựựcc ttíímm ccựựcc đđạạii ởở bưbướớcc ssóóngng 280nm280nm dodo ccáácc acidacid aminamin thơmthơm nhưnhư tryptophan,tryptophan, tyrosinetyrosine vvàà phenylalaninephenylalanine ĐĐộộ hhấấpp ththụụ ởở 280280nmnm thaythay đđổổii tutuỳỳ loloạạii proteinprotein nhưngnhưng hhệệ ssốố ttắắtt đođo đưđượợcc (ngh(nghĩĩaa llàà đđộộ hhấấpp ththụụ ccủủaa dungdung ddịịchch proteinprotein 1%1% vvớớii đưđườờngng ssóóngng truytruyềềnn quaqua 1cm)1cm) chocho mmỗỗii proteinprotein chocho phphéépp ttíínhnh nnồồngng đđộộ ccủủaa proteinprotein tinhtinh ssạạch.ch. 12
13. ĐĐịịnhnh lưlượợngng proteinprotein bbằằngng phươngphương phpháápp quangquang phphổổ VVớớii mmộộtt hhỗỗnn hhợợpp ccáácc proteinprotein hohoặặcc vvớớii bbấấtt ccứứ mmộộtt loailoai proteinprotein nnààoo mmàà khôngkhông bibiếếtt hhệệ ssốố ttắắtt ththìì nnồồngng đđộộ proteinprotein đưđượợcc ttíínhnh nhưnhư sausau:: NNồồngng đđộộ proteinprotein (mg/ml)=1,55xA280(mg/ml)=1,55xA280 0,77xA2600,77xA260 TrongTrong đđóó:: AA280:280: đđộộ hhấấpp ththụụ ởở bưbướớcc ssóóngng 28280nm0nm A260:A260: đđộộ hhấấpp ththụụ ởở bưbướớcc ssóóngng 260nm260nm 13
14. ĐĐịịnhnh lưlượợngng proteinprotein bbằằngng phươngphương phpháápp quangquang phphổổ Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn 0,1mg/ml hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch truyền phù chứ không phải trong dung dịch. (Ví dụ, trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn). Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein. 14
15. ĐĐáánhnh gigiáá ttíínhnh đđồồngng ththểể ccủủaa proteinprotein Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó. Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau. Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên gel. Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết. Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây dựng đồ thị về độ hoà tan, điện di và siêu ly tâm. 15