Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng cảu CNSH động vật, người và y sinh - Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật

Nội dung text: Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng cảu CNSH động vật, người và y sinh - Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật

1. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 1
2. Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
3. Kü thuËt chuyÓn gen lµ kü thuËt ®•a mét hay nhiÒu gen l¹ ®· ®•îc thiÕt kÕ ë d¹ng ADN t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo chñ cña ®éng vËt lµm cho gen l¹ cã thÓ tån t¹i ë d¹ng plasmit t¸i tæ hîp hoÆc g¾n vµo bé gen tÕ bµo chñ. Trong tÕ bµo chñ, c¸c gen nµy ho¹t ®éng tæng hîp nªn c¸c protein ®Æc tr•ng dÉn tíi viÖc xuÊt hiÖn c¸c ®Æc tÝnh míi cña c¬ thÓ chuyÓn gen. ®èi víi c¸c thÓ nh©n chuÈn, viÖc chuyÓn gen ®•îc xem lµ thµnh c«ng khi gen chuyÓn vµo ®•îc tæ hîp vµo genom cña tÕ bµo chñ, ®Æc tÝnh cña gen chuyÓn n¹p ®•îc duy tr× æn ®inh qua c¸c thÕ hÖ con ch¸u
4. Ph•¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp : -ChuyÓn gen nhê phèt ph¸t canxi -ChuyÓn gen nhê xung ®iÖn -ChuyÓn gen nhê vi tiªm -ChuyÓn gen nhê liposom Ph•¬ng ph¸p chuyÓn gen gi¸n tiÕp: nhê virus
5. Nguyên lý:  c¸c DNA ngo¹i lai ®•îc trén víi CaCl2 sau ®ã ®•îc chuyÓn vµo mét dung dÞch chøa ion phosphat. Mét phøc hîp ®ång ng•ng kÕt (coprecipitate) gi÷a canxi phosphat vµ DNA sÏ ®•îc h×nh thµnh, phøc hîp nµy sÏ ®•îc c¸c tÕ bµo ®éng vËt cã vó tiÕp nhËn khi nu«i cÊy, kÕt qu¶ lµ cã sù thÓ hiÖn gen ngo¹i lai trong tÕ bµo.  Kü thuËt nµy cã thÓ sö dông ®Ó ®•a bÊt k× DNA vµo tÕ bµo ®éng vËt cã vó víi môc ®Ých c¸c test thÓ hiÖn chuyÓn n¹p hay biÕn n¹p l©u dµi. C¸c DNA chuyÓn n¹p mang mét gen chØ thÞ chän läc (nh• gen aminoglycoside phosphatransferase) ®Ó gióp cho viÖc thanh läc c¸c tÕ bµo kh«ng tiÕp nhËn DNA.
6.  Khi cã mét nång ®é tÕ bµo cao vµ t¹o ra mét ®iÖn thÕ cao trong mét thêi gian rÊt ng¾n, lóc ®ã trªn mµng tÕ bµo xuÊt hiÖn c¸c lç nhá, DNA cã thÓ ®i s©u vµo trong tÕ bµo vµ ë mét sè tÕ bµo chóng cã thÓ t•¬ng t¸c víi genome cña tÕ bµo.  M¸y electroporation th•êng ®•îc l¾p ®Æt mét c«ng suÊt æn ®Þnh (vµ c¶ thêi gian g©y xung æn ®Þnh) víi c¸c ®iÖn thÕ biÕn ®æi tõ 500-1500 v/cm. §èi víi hÇu hÕt tÕ bµo, sù thiÕt lËp nh• vËy ®¶m b¶o 20-50% sè tÕ bµo cßn sèng sau khi thùc nghiÖm chuyÓn DNA.  Qu¸ tr×nh chuyÓn gen nhê electroporation ®•îc thùc hiÖn ë nhiÖt ®é phßng cßn c¸c tÕ bµo ®•îc gi÷ liªn tôc trong ®¸ ®Ó kÐo dµi thêi gian më lç c¸c tÕ bµo.
7.  Tiªm trùc tiÕp ADN ngo¹i lai vµo nh©n tÕ bµo ®éng vËt nhê dông cô vi tiªm víi kim tiªm rÊt m¶nh.  ViÖc chuyÓn gen vµo tÕ bµo ®éng vËt tèt nhÊt lµ chuyÓn vµo mét trong nh÷ng nh©n con cña trøng ®· thô tinh tr•íc khi c¸c nh©n con kÕt hîp víi nhau ®Ó t¹o ra hîp tö l•ìng béi.  NÕu tiÕn hµnh chuyÓn gen ë c¸c giai ®o¹n muén cã thÓ t¹o ra ph«i kh¶m: chØ cã mét sè tÕ bµo cã gen chuyÓn vµo.  B»ng c¸ch chuyÓn gen vµo giai ®o¹n tiÒn nh©n, gen chuyÓn vµo sÏ ®•îc truyÒn cho c¸c thÕ hÖ ph«i tiÕp theo vµ cã thÓ di truyÒn cho con ch¸u.
8. ThiÕt bÞ chuyÓn gen b»ng vi tiªm
9. Ph•¬ng ph¸p nµy cho kÕt qu¶ rÊt cao nh•ng sè l•îng tÕ bµo ®•îc xö lý nhá do ph¶i thao t¸c trªn tõng tÕ bµo. Ph•¬ng ph¸p nµy th•êng dïng ®Ó ®•a ADN vµo hîp tö hoÆc c¸c tÕ bµo ph«i sím.
10. Gene injected into the male pronuclei
11. Nguyªn lý thiÕt kÕ vect¬ chuyÓn gen liposom  Ph•¬ng ph¸p dùa trªn sù t•¬ng t¸c ion cña DNA vµ thÓ liposome t¹o ra mét thÓ phøc hîp, phøc hîp nµy cã thÓ phãng thÝch c¸c DNA chøc n¨ng vµo tÕ bµo nu«i cÊy  Liposom cÊu t¹o tõ c¸c líp mµng lipid t¹o d¹ng tói, bªn trong chøa n•íc, kÝch th•íc kho¶ng 10 nm ®Õn 1000 nm. Liposom th•êng cã mét líp lipid mang ®iÖn tÝch d•¬ng (lipofectamin) vµ c¸c ph©n tö lipid trung tÝnh - nªn nã cã ®iÖn tÝch d•¬ng (+). Liposom cã thÓ kÕt hîp víi c¸c ph©n tö, hoÆc c¸c chÊt mang ®iÖn tÝch ©m (-) t¹o thµnh phøc hîp æn ®Þnh.  ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt lµ t¹o c¸c phøc hîp liposom - DNA. Ph©n tö DNA cã ®iÖn tÝch ©m (-) cã thÓ kÕt hîp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hîp æn ®Þnh, ®•îc sö dông lµm vect¬ chuyÓn gen.
12. S¬ ®å cÊu tróc vµ ho¹t ®éng cña vect¬ liposom ThiÕt kÕ t¹o vect¬ liposom thùc chÊt lµ t¹o c¸c phøc hîp liposom - DNA. Ph©n tö DNA cã ®iÖn tÝch ©m (-) cã thÓ kÕt hîp víi liposom t¹o nªn c¸c phøc hîp æn ®Þnh, ®•îc sö dông lµm vect¬ chuyÓn gen.
13. C¬ chÕ ho¹t ®éng cña vect¬ liposom  Vect¬ liposom cã kh¶ n¨ng tiÕp xóc víi mµng tÕ bµo cña c¸c tÕ bµo ®Ých vµ chui qua mµng tÕ bµo, khi ®ã líp c¸c ph©n tö lipid bÞ ph©n huû lµm cho c¸c gen môc tiªu ®•îc ®•a vµo trong tÕ bµo.  Gen môc tiªu cã thÓ ®•îc ®•a vµo trong nh©n, tån t¹i trong nh©n nh• nh÷ng ®¬n vÞ gen ®éc lËp. Trong nh©n c¸c gen môc tiªu cã thÓ cã qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp lµm cho gen nµy ®•îc g¾n vµo bé gen cña tÕ bµo chñ.
14. Sơ đồ chuyển gen nhờ virus vector Khi x©m nhiÔm vµo tÕ bµo, virus cã kh¶ n¨ng chuyÓn bé gen cña nã vµo tÕ bµo chñ. Mét sè nhãm virus cã thÓ g¾n bé gen hoÆc mét sè gen cña chóng vµo bé gen tÕ bµo chñ, t¹o thµnh mét thÓ thèng nhÊt. C¸c gen virus g¾n víi bé gen cña tÕ bµo chñ cã thÓ tån t¹i l©u dµi cïng víi qu¸ tr×nh ph©n chia cña tÕ bµo chñ, t¹o nªn c¸c provirus.
15. S¬ ®å chuyÓn gen nhê virus
16.  Tạo giống -Nhiều sinh vật với các đặc điểm ưư việt  Chất lượng thực phẩm -Các thực phẩm khỏe mạnh hơn được sản xuất nhanh hơn  Kháng bệnh -Kháng lại sự lây nhiễm của vi khuẩn
17.  Tạo các sản phẩm mới -Dê sản xuất tơ nhện  Các test kiểm tra tính an toàn hóa học -Sinh vật sản xuất các enzyme mới www.carleton.c a
18.  Cấy ghép phủ tạng (Xenotransplantation) . Bổ sung dinh dưỡng (Nutrition supplements) . Trị liệu gen ở người (Human Gene Therapy)
19.  Mô hình nghiên cưứ mới -Chuột chuyển gen  Thúc đẩy tiến hóa -Sinh vật mới với nhiều đặc điểm mong muốn www.meddean.luc.ed u
20. Một số ví dụ về động vật chuyển gen
21.  N¨m 1988 Ward vµ céng sù ®· chuyÓn 2 gen m· ho¸ cho 2 enzym cña vi khuÈn vµo cõu ®Ó biÕn ®æi Serine thµnh Cystein nh»m t¨ng s¶n l•îng len do Serine k×m h·m qu¸ tr×nh tæng hîp len.  ViÖn nghiªn cøu n«ng nghiÖp quèc gia Ph¸p (INRA) ®· t¹o ra gièng bß tiÕt s÷a chua (yaourt) do chuyÓn gen lªn men s÷a chua tõ vi khuÈn vµo bé m¸y di truyÒn cña bß s÷a. Con bß nµy tªn lµ BuBu do Danny Lactaire t¹o thµnh c«ng.  ChuyÓn gen kh¸ng virut nh• interferon, gen kh¸ng influenza vµo lîn, gà vµ cõu.  ChuyÓn gen kh¸ng ®«ng l¹nh vèn m· ho¸ cho mét ph©n tö protein gi÷ cho m¸u khái bÞ ®«ng l¹nh. Protein nµy (AFPs) ®•îc De Vries ph¸t hiÖn tõ 1969 ë c¸ sèng ë vïng ®«ng l¹nh  (- 20 0C). Ng•êi ta ®ang nghiªn cøu thiÕt kÕ gen nµy ®Ó chuyÓn vµo c¸, mét sè ®éng vËt vµ kÓ c¶ c©y trång.
22. Gia súc chuyển gen Bò sữa mang các thêm các bản copy của hai loại gen sinh casein có khả năng sản xuất tăng 13% protein sữa
23. EnviroPig TM Lơn biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt Phytic acid trong thức ăn của lợn được phân giải, giải phóng P P được hấp thu bởi lơn Thường thì phức hợp phytic acid/P đi qua lơn và thải ra ngoài ở dạng phân Phân lơn là chất gây ô nhiễm môi trường , thúc đẩy sự phát triẻn rêu ở ao hồ gây chết cá Figure 1. Phytase produced in the salivary glands and secreted in the saliva increases the digestion of phosphorus contained in feed grains.
24. Cá chuyển gen Tilapia Salmon/trout Catfish Tốc độ sinh trưởng tăng lần do chuyển gen sinh hocmon sinh trưởng
25. Cá chuyển gen antifreeze protein Antifreeze promoter from pout As water temperature drops the GH gene is turned on The fish continue to grow when normally they would not
26. Animal Bioreactor “Pharming” 1997, Tracy the sheep, the first transgenic animal to produce a recombinant protein drug in her milk alpha-1-antitrypsin (AAT) treatment for emphysema & cystic fibrosis Created by PPL Therapeutics & The Roslin Institute
27.  B»ng c¸ch chuyÓn gen vµo ®éng vËt lÊy s÷a cã thÓ thu ®•îc s÷a cã mang c¸c protein là s¶n phÈm của gen chuyÓn n¹p:  Gen t¹o Lysostaphin: kh¸ng khuÈn g©y bÖnh viªm vó ë tr©u bß.  Gen s¶n xuÊt Factor IX (ng•êi): yÕu tè ®«ng m¸u  ChuyÓn gen 1-PI cña ng•êi víi promotor  lactoglobulin vµo cõu vµ cho kÕt qu¶ rÊt kh¶ quan, hµm l•îng 1- PI ®¹t ®•îc 35g/lÝt s÷a, chiÕm 50% tæng l•îng s÷a.  ChuyÓn gen cho dª Alpine ®Ó s¶n xuÊt s÷a chøa protein ®Æc hiÖu ®iÒu trÞ ung th• cã tªn lµ BR96.  ChuyÓn gen t¹o albumin cña m¸u ng•êi vµo cõu ®Ó s¶n xuÊt albumin- thµnh phÇn chÝnh cÊu t¹o nªn m¸u tõ s÷a cõu. ViÖc s¶n xuÊt ®¹i trµ albumin ng•êi trong s÷a cõu sÏ ®•îc ph¸t triÓn m¹nh khi ph•¬ng ph¸p nh©n b¶n ®éng vËt ®· ®•îc hoµn thiÖn. ë Mü ®ang kÕt hîp kü thuËt nh©n b¶n ®éng vËt víi kü thuËt gen ®Ó t¹o ra c¸c bß s¶n xuÊt albumin cao trong s÷a (80 kg albumin/bß/n¨m).
28. S¬ ®å chuyÓn gen ®Ó s¶n xuÊt Factor VIII trong s÷a lîn
29.  Tr•êng ®¹i häc Cambridge ®· t¹o ra lîn chuyÓn gen kh¸ng thÓ cña ng•êi, cã tim ®•îc bao bäc bëi protein ng•êi nªn cã thÓ ghÐp cho ng•êi mµ kh«ng g©y ph¶n øng ®µo th¶i.  Ca ghÐp tim lîn cho ng•êi ®Çu tiªn thùc hiÖn cho thÊy sau 1 n¨m ghÐp qu¶ tim lîn trong c¬ thÓ ng•êi vÉn lµm viÖc b×nh th•êng.  HiÖn t¹i c¸c nhµ khoa häc Mü ®· cã 500 con lîn cã thÓ cung cÊp phñ t¹ng ghÐp.
30.  Mét thµnh c«ng rÊt ®¸ng chó ý lµ chuyÓn gen vµo muçi ®Ó chèng l¹i bÖnh sèt rÐt víi 2 h•íng: ◦ T¹o muçi cã kh¶ n¨ng ®Ò kh¸ng víi ký sinh trïng sèt rÐt, ký sinh trïng kh«ng thÓ sèng l©u trong c¬ thÓ muçi, chóng sÏ bÞ diÖt tr•íc khi truyÒn bÖnh cho ng•êi. ◦ T¹o muçi mÉn c¶m víi ký sinh trïng sèt rÐt, muçi sÏ bÞ diÖt bëi chÝnh ký sinh trïng nµy tr•íc khi truyÒn bÖnh cho ng•êi.
31. Webster and Peter Transgenic male kids carrying silk gene
32. Transgene -> Gene coding for a growth hormone
33. ANDi, the first transgenic primate born in January, 2000 224 unfertilized rhesus eggs were infected with a GFP virus ~Half of the fertilized eggs grew and divided 40 were implanted into twenty surrogate mothers five males were born,two were stillborn ANDi was the only live monkey carrying the GFP gene
34. Alba, the EGFP (enhanced GFP) bunny Created in 2000 as a transgenic artwork
35. Transgenic Pigs Pass on the Transgene
36. GloFish, originally developed in Singapore as a way to monitor water pollution The normally black-and-silver zebrafish was turned green or red by inserting various versions of the GFP gene Glofish are on sale throughout the US except in California Glofish retail for about $5 per fish. Normal zebrafish cost around one tenth of the price
37. p27 knockout mouse p27 knockout mouse is bigger than the control This is not due to obesity, but the skeletal structure is increased in size (everything about the mouse is larger)
38. normal knockout GDF8 (Myostatin) knockout mouse Over twice the muscle mass of a wildtype mouse
39. Naturally Occurring GDF8 Mutants
40. FGF5 knockout mouse has long, angora-like hair
41. Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
42.  Vacxin sèng nh•îc ®éc: lµ c¸c dßng virut kh«ng ®éc cã trong tù nhiªn hoÆc c¸c dßng g©y bÖnh yÕu ®•îc t¹o ra do nu«i cÊy nh©n t¹o liªn tôc nhiÒu thÕ hÖ.  Vacxin bÊt ho¹t: lµ c¸c dßng virut bÞ chÕt do xö lý c¸c t¸c nh©n ho¸, lý kh¸c nhau.  Vacxin t¸i tæ hîp: T¸c nh©n kh¸ng nguyªn ë ®©y chÝnh lµ c¸c protein/glicoprotein ®Æc hiÖu cña virut ®•îc s¶n xuÊt th«ng qua c«ng nghÖ AND t¸i tæ hîp
43.  T¸c nh©n kh¸ng nguyªn cña c¸c virus g©y bÖnh lµ protein/glycoprotein cña vá virut nªn cã thÓ sö dông chóng lµm vacxin  §Ó tæng hîp c¸c ph©n tö protein/glycoprotein nµy, cÇn t¸ch vµ nh©n dßng c¸c gen m· hãa chóng tõ genom cña virus vµ gµi vµo c¸c vect¬ thÝch hîp.  C¸c vect¬ t¸i tæ hîp mang gen cña virus sÏ ®•îc ®•a vµo c¸c tÕ bµo (vi khuÈn, nÊm men ) ®Ó s¶n xuÊt ra c¸c protein/glycoprotein kh¸ng nguyªn lµm vacxin. §©y lµ vacxin t¸i tæ hîp.
44. Reverse Transcription RNA DNA
45. PCR Cloning DNA encoding gene of interest Expression plasmid
46. Transfection Extraction Plasmid growth in bacteria Purification of plasmid
47. In vitro antigen production CHO, yeast, or insect cells Vaccine vector In vivo antigen production
48.  S¶n xuÊt vacxin t¸i tæ hîp kh¸ng bÖnh lë måm long mãng. Virut FMDV (Foot ADN Mouth Disease Virut) g©y bÖnh gåm mét ph©n tö ARN ®•îc bäc bëi vá protein. Vá protein chøa 4 tiÓu phÇn VP1, VP2, VP3 vµ VP4 trong ®ã VP1 ®ãng vai trß kÝch thÝch t¹o kh¸ng thÓ.  C¸c nhµ khoa häc cña h·ng Gentech ®· t¸ch ®•îc gen m· ho¸ VP1, ®•a nã vµo E.coli th«ng qua plasmit pBR322 vµ buéc nã s¶n xuÊt VP1 trong tÕ bµo E.coli. Kh¸ng nguyªn lµ protein VP1 t¸i tæ hîp rÊt æn ®Þnh vµ cßn gi÷ ®•îc hiÖu qu¶ t¸c dông ë 100 0C.
49.  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh lë måm long mãng  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh xanh l•ìi cõu (bß)  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh b¹ch cÇu bß  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh Newcastle  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh cóm gia cÇm  Vacxin t¸i tæ hîp chèng bÖnh Marek 
50.  Cã thÓ sö dông vect¬ virus ®Ó nh©n dßng c¸c kh¸ng nguyªn vacxin  Tiªu chuÈn cña vect¬ virus:  Kh«ng g©y bÖnh cho ®éng vËt ®•îc xö lý  G©y ®•îc miÔn dÞch  Kh«ng truyÒn ngang cho ng•êi  Cã kh¶ n¨ng nhËn ®o¹n AND ngo¹i lai lín  Nh©n nhanh dÔ dµng trong tÕ bµo chñ  Trong thùc tÕ kh«ng cã lo¹i virus nµo tháa m·n c¸c ®iÒu kiÖn trªn. HiÖn nay dïng lµm vect¬ 1 sè virus: baculovirus, virus ®Ëu, virus pox, virus Herper
51.  Kh¸ng thÓ: lµ c¸c protein ®•îc c¬ thÓ ng•êi hoÆc ®éng vËt cã x•¬ng sèng s¶n sinh ra ®Ó chèng l¹i c¸c kh¸ng nguyªn t•¬ng øng. C¸c kh¸ng thÓ nµy lµ c¸c kh¸ng thÓ ®a dßng v× khi x©m nhiªm vµo c¬ thÓ, c¸c ph©n tö kh¸ng nguyªn kÝch thÝch tÕ bµo s¶n xuÊt rÊt nhiÒu ph©n tö kh¸ng thÓ kh¸c nhau.  Kh¸ng thÓ ®¬n dßng: lµ tËp hîp cña c¸c ph©n tö kh¸ng thÓ ®ång nhÊt vÒ cÊu tróc vµ tÝnh chÊt. Chóng ®•îc t¹o ra bëi dßng tÕ bµo lai gi÷a tÕ bµo ung th• myeloma vµ tÕ bµo lympho cña hÖ miÔn dÞch cña ®éng vËt hoÆc cña ng•êi.
52. Kháng thể và kháng nguyên bị các tế bào bạch cầu bao vây
53.  §Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng tr•íc hÕt ng•êi ta ph¶i t¸ch ®•îc c¸c tÕ bµo cã kh¶ n¨ng t¹o kh¸ng thÓ, sau ®ã cho lai c¸c tÕ bµo nµy víi tÕ bµo ung th• b»ng ph•¬ng ph¸p dung hîp.  Sö dông m«i tr•êng nu«i cÊy chän läc ®Ó t¸ch ra c¸c tÕ bµo lai. TÕ bµo lai cã 2 ®Æc ®iÓm: ph©n chia liªn tôc do mang ®Æc tÝnh cña tÕ bµo ung th• ®ång thêi l¹i cã ®Æc tÝnh s¶n sinh kh¸ng thÓ.  Sö dông ph•¬ng ph¸p pha lo·ng ®Ó thu ®•îc tõng tÕ bµo lai riªng rÏ. Nu«i cÊy riªng c¸c tÕ bµo nµy cho ph¸t triÓn thµnh dßng vµ s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®Æc tr•ng.  KÕt qu¶ ta sÏ thu ®•îc c¸c kh¸ng thÓ ®¬n dßng s¶n sinh ra tõ c¸c dßng tÕ bµo kh¸c nhau.
54.  T¹o c¸c tÕ bµo sinh kh¸ng thÓ: tiªm kh¸ng nguyªn vµo chuét ®Ó g©y ph¶n øng miÔn dÞch trong c¬ thÓ chuét. C¸c kh¸ng nguyªn nµy sÏ kÝch thÝch tÕ bµo tuþ chuét s¶n xuÊt kh¸ng thÓ.  T¹o c¸c tÕ bµo lai: t¸ch tÕ bµo tuþ chuét cã kh¶ n¨ng sinh kh¸ng thÓ vµ cã ®Æc tÝnh kh¸ng ®•îc hçn hîp HAT (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine). Trén chóng víi c¸c tÕ bµo u tuû (myeloma) tÕ bµo nµy kh«ng kh¸ng ®•îc HAT. Bæ sung PEG (Polyethylene Glycol) vµo dÞch huyÒn phï chøa hçn hîp hai lo¹i tÕ bµo trªn ®Ó dung hîp tÕ bµo, t¹o tÕ bµo lai.  Nu«i cÊy vµ chän läc c¸c tÕ bµo lai: nu«i cÊy hçn hîp tÕ bµo trªn m«i tr•êng chøa HAT. TÕ bµo tuþ chuét ph¸t triÓn b×nh th•êng sau 1-2 tuÇn nu«i cÊy råi chÕt. TÕ bµo myeloma kh«ng kh¸ng ®•îc HAT kh«ng sinh tr•ëng ®•îc vµ chÕt ngay sau khi nu«i cÊy. ChØ cã c¸c tÕ bµo lai ph¸t triÓn b×nh th•êng v× chóng cã hai ®Æc ®iÓm: ph©n chia v« h¹n vµ kh¸ng ®•îc HAT.  T¸ch dßng tÕ bµo lai: nu«i cÊy riªng tõng tÕ bµo lai, chän läc tÕ bµo cã kh¶ n¨ng sinh kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu víi kh¸ng nguyªn ®· ®•a vµo chuét vµ nh©n dßng tÕ bµo nµy ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng.
55.  Ph•¬ng ph¸p s¶n xuÊt mang tÝnh c«ng nghiÖp, lµ kh¸ng thÓ tinh khiÕt vµ cã tÝnh ®Æc hiÖu cao.  X¸c ®Þnh sù hiÖn diÖn chÝnh x¸c cña virut, vi khuÈn g©y bÖnh.  Cã thÓ ph¸t hiÖn ®•îc nhiÒu kh¸ng nguyªn ch•a biÕt trªn bÒ mÆt tÕ bµo.  Dïng kh¸ng thÓ ®¬n dßng ®Æc hiÖu cã thÓ chèng l¹i kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu cña tÕ bµo lympho T qua ®ã øc chÕ ph¶n øng th¶i lo¹i khi ghÐp c¬ quan
56.  Cã thÓ chÈn ®o¸n ®•îc khèi u qua viÖc x¸c ®Þnh hµm l•îng hocmon vµ ®¸nh gi¸ ho¹t ®éng cña tuyÕn néi tiÕt hoÆc c¸c protein ®Æc hiÖu cho sù h×nh thµnh khèi u. ThÝ dô nh•: hµm l•îng phetoprotein cã nhiÒu ë bÖnh nh©n ung th• gan vµ ung th• tiÒn liÖt tuyÕn hoÆc protein HCG (human chorionic Gonadotropin) cã mÆt ë nhiÒu bÖnh nh©n ung th• kh¸c.  §Þnh h•íng thuèc: cã thÓ g¾n kh¸ng thÓ ®¬n dßng víi thuèc nh»m ®Þnh h•íng cho thuèc chøa bÖnh tíi trùc tiÕp n¬i cÇn ch÷a trÞ (n¬i cã protein ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ ®¬n dßng).
57. S¶n xuÊt kh¸ng thÓ ®¬n dßng ë chuét
58. Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
59.  Mỗi sinh vật hưa một số trình tự DNA duy nhất, đặc trưng cho loài  Chẩn đoán phân tử giúp cho việc phát hiện được các trình tự DNA đặc hiệu cho loài này. 70
60. Mark Teân ñaày ñuû er RFLP Restriction fragment length polymorphism (Söï ña hình caùc ñoaïn do caét bôûi RE) ALP Amplicon length polymorphism (Söï ña hình ñoaïn khueách ñaïi) AFLP Amplified fragment length polymorphism (Söï ña hình caùc ñoaïn khueách ñaïi) RAPD Random amplified polymorphic DNA (Söï ña hình ñoaïn DNA khueách ñaïi ngaãu nhieân) DAF DNA amplification fingerprinting (In daáu di truyeàn khueách ñaïi DNA) SSR Simple sequence repeat (microsatellite) (Laëp ñoaïn ñôn) AP-PCR Arbitrary primer-PCR (PCR moài tuøy choïn) SSCP Single strand conformation polymorphism (Söï ña daïng caáu hình maïch ñôn) MRDH- Moderately repeated, dispersed, and highly variable DNA (minisatellite) (DNA DNA laëp laïi trung bình, phaân taùn vaø bieán dò cao) SNP Single nucleotide polymorphism (Söï ña hình ñôn nucleotide)
61. Chaån ñoaùn phaân töû goàm caùc kó thuaät chuû yeáu :  – Lai phaân töû nucleic acid : Nhaèm xaùc ñònh söï hieän dieän cuûa trình töï nucleotide ñaëc hieäu cuûa moät ñoaïn gen hay DNA.  – PCR : Duøng primer (moài) ñaëc hieäu ñeå khueách ñaïi soá löôïng 1 ñoaïn gen.  – RFLP (Restriction fragment length polymorphism) : Döïa vaøo veät treân baûn ñieän di do caùc ñoaïn DNA di chuyeån taïo ra.
62. Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh (HIV)
63. Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm
64. Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong chẩn đoán bệnh hồng cầu hình lưỡi liềm
65. Một số ví dụ Ứng dụng PCR trong gi¸m ®Þnh h×nh sù
66. Một số ví dụ
67. Nội dung 1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 2. Công nghệ nhân bản động vật 3. Công nghệ tế bào gốc 4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 5. Công nghệ vaxin và sản xuất kháng thể đơn dòng 6. Chẩn đoán phân tử 7. Dự án genom người và các ứng dụng
68.  Khởi động năm 1988, nhận tài trợ 3 tỷ $ năm 1990 từ US Department of Energy.  Mục tiêu chính là giải trình tự toàn bộ hệ gen của người trong 15 naêm, keát thuùc vaøo 2005
69.  Năm 2003: hoàn tất việc giải mã.  Có thông tin đầy đủ cho mỗi NST  Danh sách đầy đủ các gen trên mỗi NST
70. a) Xây dựng bản đồ hệ gen người có độ phân giải cao b) Xây dựng bản đồ vật lý của tất cả các nhiễm sắc thể của người và một số sinh vật model điẻn hình khác c) Phát triển năng lực thu thập, dự trữ, phân phát và phân tích các dữ liệu thu dược d) Sáng tạo các công nghệ phù hợp để đạt được các mục tiêu trên e) Vaïch ra nhöõng vaán ñeà ñaïo ñöùc, luaät phaùp vaø xaõ hoäi (the ethical, legal, and social issues - ELSI) coù theå naûy sinh töø döï aùn.
71.  Public • Commerial/private ◦ Human Genome Project • Celera Genomics ◦ Academic Laboratories • Rockville, MD (from around the world) • J Craig ◦ Most contributions Venter from 6 laboratories (US, UK, Japan) Science Vol 291, 16 February 2001 Nature Vol 409, 15 February 2001
72.  Nhoùm nghieân cöùu chuû yeáu laø ôû NIH (Hoa Kyø) phoái hôïp vôùi caùc nöôùc Anh, Phaùp, Ñöùc, Trung Quoác vaø Nhaät Baûn goïi laø nhoùm Consortium (Lieân hieäp caùc phoøng thí nghieäm) vaø sau naøy F.Collins chuû trì. Taát caû coù 18 cô quan khoa hoïc lôùn treân toaøn theá giôùi tröïc tieáp tham gia döï aùn.
73.  James Watson, ngöôøi phaùt minh moâ hình chuoãi xoaén keùp DNA Watson- Crick naêm 1953, laø ngöôøi chuû trì ñaàu tieân cuûa chöông trình ôû caùc Vieän söùc khoûe Quoác gia Hoa Kyø NIH (National Institutes of Health) ñeán naêm 1992 töø chöùc. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 84
74.  Nhoùm thöù hai Celera Genomics do Craig Venter chuû trì, ra ñôøi chaäm hôn nhöng ñaït keát quaû nhanh vôùi chi phí thaáp. Naêm 1967, Craig Venter laøm y taù quaân y ôû Vieät Nam, trôû veà Hoa Kyø oâng thaáy caàn soáng gaáp. Naêm 1998, nhôø coâng ty Applied Biosystems vaø soá voán 300 trieäu ñoâ-la (USD) oâng laäp coâng ty tö Celera Genomics (Celera nghóa laø taêng toác).
75.  – Ngaøy 26/6/2000 : Coâng boá baûn thaûo haønh ñoäng (working draft) cuûa nguyeân boä gen ngöôøi (> 90% vôùi soá base phaân tích gaáp 3 – 4 laàn boä gen).  – Thaùng 2/2001 : Caùc phaân tích cuûa baûn thaûo haønh ñoäng ñöôïc coâng boá.  – Ngaøy 14/4/2003 : Döï aùn boä gen ngöôøi hoaøn thaønh vaø tuyeân boá keát thuùc sôùm 2 naêm ôû Hoäi nghò khoa hoïc cuûa NIH kæ nieäm 50 naêm chuoãi xoaén keùp DNA.
76.  Vieäc laäp baûn ñoà (mapping) cuoái cuøng caån troïng hôn gaáp 300 laàn so vôùi coâng boá naêm 2000, caùc loã troáng (400 gaps) ñöôïc laáp kín vaø caùc nhaø khoa hoïc Mó chæ tieâu toán 2,7 tæ USD. Ñaây laø söï kieän troïng ñaïi nhö yù kieán cuûa caùc nhaø khoa hoïc : “Ñaây laø ngaøy chuùng ta hoaøn taát laàn xuaát baûn ñaàu tieân “Cuoán saùch cuûa söï soáng (the Book of Life).” hay “Trong nhieàu theá kæ tôùi, ngaøy hoâm nay seõ ñöôïc nhôù ñeán nhö moät coät moác lòch söû”.  Caùc ñoät phaù kó thuaät goùp phaàn hoaøn thaønh döï aùn coù giaù trò to lôùn trong taát caû caùc lónh vöïc sinh hoïc.
77.  Naêm 2000, Chöông trình boä gen ngöôøi ñaõ ñaït nhöõng keát quaû ngoaïn muïc, Toång thoáng Hoa Kyø Bill Clinton ñaõ tröïc tieáp giaøn xeáp ñeå ñaïi dieän nhoùm “Consortium” laø Francis Collins vaø Craig Venter hôïp taùc nhau coâng boá keát quaû.
78.  Ngaøy 26/6/2000, döôùi söï chuû trì cuûa Toång thoáng Hoa Kyø Bill Clinton vaø Thuû töôùng Anh Tony Blair, Fr. Collins vaø C.Venter laàn ñaàu tieân coâng boá veà giaûi trình töï boä gen ngöôøi gaàn xong (99%). Thaønh töïu naøy laø moät kì coâng vó ñaïi cuûa loaøi ngöôøi. Do nhöõng keát quaû coâng boá ñaàu tieân naøy coøn haøng traêm loã troáng (gaps) vaø nhieàu sai soùt neân noù ñöôïc goïi laø baûn phaùt thaûo (the Draft), nhöng noù seõ giuùp ñònh höôùng khai thaùc neân coøn goïi laø baûn phaùt thaûo haønh ñoäng (the Working Draft).
79. Thaùng 2/2001 hai nhoùm coâng boá nhöõng keát quaû phaân tích chi tieát hôn caùc soá lieäu :  – Nhoùm Venter xaùc ñònh chaéc chaén 26.588 gen maõ hoùa protein vaø 12.000 gen khaùc.  – Nhoùm Consortium cho raèng soá gen khoaûng 30.000 ñeán 40.000.  – Venter cho raèng coù 300 gen cuûa ngöôøi khoâng tìm thaáy töông töï ôû chuoät.  – Nhoùm Consortium xaùc ñònh ñöôïc 113 gen cuûa vi khuaån gaén vaøo boä gen ngöôøi, khoâng phaûi do thöøa keá trong tieán hoùa.
80.  Ñieàu ñaùng kinh ngaïc laø soá gen ngöôøi khoaûng 35.000, ít hôn raát nhieàu so vôùi döï kieán tröôùc ñaây laø 50.000 ÑEÁN 140.000 gen, vaø noù chæ khoaûng gaáp 2 laàn nhieàu hôn soá gen cuûa tuyeán truøng Caenorhabditis elegans (19.099 gen).
81.  Tuy soá löôïng gen caàn chænh lyù laïi, töø phaùt hieän khieâm toán vaø gôïi toø moø naøy, caùc nhaø khoa hoïc cho raèng chìa khoùa di truyeàn cho söï phöùc taïp cuûa con ngöôøi khoâng do soá löôïng gen, maø ôû choã caùc phaàn cuûa gen ñöôïc söû duïng nhö theá naøo ñeå taïo neân caùc saûn phaåm khaùc nhau trong gheùp noái caùc phaàn cuûa gen theo löïa choïn (Alternative Splicing). Söï phöùc taïp ñöôïc gia taêng töø nhieàu nguoàn khaùc laø haøng nghìn bieán ñoåi hoùa hoïc sau dòch maõ (Post- translational chemical modification) taùc ñoäng ñeán caùc protein vaø chöông trình cuûa caùc cô cheá ñieàu hoøa kieåm soaùt caùc quaù trình ñoù.
82.  Ñeå xaây döïng baûn phaùt thaûo haønh ñoäng, 16 Trung taâm giaûi kyù töï chuoãi ñaõ phaân tích hôn 22,1 tyû base cuûa trình töï khôûi ñaàu, goàm caùc ñoaïn truøng laép toång coäng 3,9 tyû base vaø cung caáp 7 laàn phuû kín boä gen ngöôøi (coù theå hieåu laø giaûi kyù töï chuoãi gaáp 7 laàn boä gen ngöôøi). Hôn 30% ñaït chaát löôïng cao, laø nhöõng trình töï cho keát quaû cuoái cuøng, vôùi ñoä phuû kín 8 ñeán 10 laàn, ñoä caån troïng 99,99% vaø moät soá choã troáng.
83. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 96
84. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 97
85. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, ĐHNNHN 98
86. Thôøi ñaïi sau boä gen (Post Genomics Era) ñaõ baét ñaàu vôùi caùc daáu hieäu : – Söû duïng caùc coâng cuï vaø coâng ngheä ñeå khai thaùc boä gen ngöôøi. – Sinh hoïc phaùt trieån ôû möùc cao hôn nhö Sinh hoïc caùc heä thoáng (the Systems Biology). – Söï phaùt trieån haøng loaït caùc coâng ngheä then choát (key tehnologies) môùi nhö Tin sinh hoïc (Bioinformatics), Biochip vaø microarrays, Coâng ngheä sinh hoïc nano (Nanobiotechnology),
87.  – Cellomics : nghieân cöùu chöùc naêng teá baøo vaø taùc ñoäng cuûa thuoác ôû caáp ñoä teá baøo nhôø söï gaén keát vôùi coâng ngheä thoâng tin (IT). Söû duïng caùc thuaät toaùn (algorithm) ñeå phaân tích töï ñoäng hoùa hình thaùi hoïc cuûa caùc teá baøo seõ cung caáp caùc keát quaû ñònh löôïng giuùp cho taàm soaùt dung löôïng cao (high content screening).  Metabolomis : coâng ngheä gen ñieàu khieån trao ñoåi chaát. .  Ionomics : caùc gen chi phoái söï ñieàu hoøa taát caû caùc ion trong teá baøo.
88.  Töø naêm 1999, söï phaùt trieån cuûa Genomics vaø Proteomics daãn ñeán Coâng ngheä microarray (Microarray technology) vaø ñeán naêm 2002 saûn phaåm ñaàu tieân coù maët treân thò tröôøng. Xuaát phaùt töø nhu caàu thöïc teá chaån ñoaùn, caùc haõng döôïc phaåm cuõng nhö caùc trung taâm nghieân cöùu lôùn ñaõ cho ra ñôøi nhieàu saûn phaåm duøng cho phaùt hieän nhanh (nhö xaùc ñònh SNP) coù theå ôû daïng chip (boï ñieän töû), daïng bi (bead) coù töø tính (hình 4.9) hay caùc microarray (hình 4.10) vaø coù theå ôû nhieàu daïng khaùc hoaëc laø söï keát hôïp cuûa caùc daïng treân. Töïu chung, nhaèm taïo thuaän lôïi nhaát cho chaån ñoaùn nhanh, nhaïy vaø chính xaùc caùc SNP ñang quan taâm.
89. Hình 4.9. Caùc vieân bi coù gaén maãu doø Hình 4.10. Microarray vôùi caùc lai vôùi RNA/DNA muïc tieâu daõy chaám, phía treân laø chuøm tia saùng cuûa ñaàu doø (detector) khueách ñaïi caùc ñoám saùng ñeå ñoïc keát quaû