Sinh học - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (tt)

Nội dung text: Sinh học - Chương II: Các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại (tt)

1. Chương II. Cỏc kỹ thuật nền của CNSH hiện đại  Chức năng và ứng dụng của cỏc enzyme giới hạn  Giới thiệu cỏc vector nhõn dũng và kỹ thuật nhõn dũng gen  Phương phỏp PCR  Cỏc phương phỏp lai phõn tử (lai Southern, Northern, Western)  Kỹ thuật xỏc định trỡnh tự DNA  Cỏc kỹ thuật xỏc đinh tớnh đa hỡnh DNA (dựa trờn PCR, dựa trờn RELP)  Kỹ thuật tạo thư viện hệ gen và cDNA
2. Kỹ thuật lai phõn tử
3. Cơ sở khoa học  Sự bắt cặp lai (Hybridization) theo cơ chế bổ sung (Complementarity) Cỏc dạng phức hợp lai bổ sung 1) DNA-DNA. 2) DNA-RNA. 3) Protein-Protein (thường ở dạng phức hợp khỏng nguyờn-khỏng thể )
4. Lai DNA-DNA hoặc DNA-RNA Lai phõn tử là quỏ trỡnh kết hợp lại của hai mạch đơn DNA. Cơ sở của việc lai phõn tử là cỏc mối liờn kết hydro giữa cỏc base trờn hai mạch. Giữa một base A và một base T hỡnh thành hai liờn kết hydro cũn giữa G và C hỡnh thành ba liờn kết.
5. DNA cú thể biến tớnh hoặc tỏi hồi khi đun núng hoặc làm lạnh Để tiến hành phản ứng lai phõn tử trước hết DNA mạch kộp phải được biến tớnh. Đú là một quỏ trỡnh trong đú cỏc liờn kết hydro của mạch DNA kộp ban đầu bị phỏ vỡ giải phúng hai mạch đơn với toàn bộ cỏc base sẵn sàng tiếp nhận cỏc liờn kết hydro mới.
6. Một số trường hợp xảy ra khi lai ADN
7. 42 C is more stringent condition that 35 C (hybridization is more specific)
8. Lai Southern Là kỹ thuật dùng để nhận dạng một đoạn DNA đặc thù dựa trên trỡnh tự thể hiện của nó sau khi điện di trên gel agarose. Ph•ơng pháp này đ•ợc phát triển bởi Edwin Southern (1975) nên đ•ợc gọi là ph•ơng pháp “Southern Blot”. Kỹ thuật Southern Blot cho biết Sự cú mặt của đoạn ADN (gen) Số lượng đoạn ADN cú mặt (tương ứng với số gen) Độ lớn của đoạn ADN Trỡnh tự tương tự giữ đoạn ADN mục tiờu và mẫu dũ
9. . Edwin Southern University of Oxford
10. Nguyờn tắc  Southern Blot dựa trên khả năng giữ lại các đoạn ADN đã qua xử lý enzyme giới hạn, trên một màng mỏng đặc biệt (Hybond - N).  Màng mỏng này sau đó đ•ợc ngâm trong dung dịch chứa mẫu dũ đã cho ở dạng có đánh dấu 32P. Nếu có mặt gen đã cho trong ADN trên màng mỏng thỡ các đoạn ADN của cùng gen sẽ bắt cặp (lai) theo cơ chế bổ sung (complementation) và nhận biết qua phóng xạ tự ghi.
11. Các b•ớc tiến hành 1. Chuẩn bị mẫu: . Chiết tách ADN nghiên cứu, cắt ADN nghiên cứu bằng enzym giới hạn, kết quả cho một hỗn hợp các đoạn cắt có kích th•ớc khác nhau.  Tiến hành điện di hỗn hợp sản phẩm cắt trên gel để tách các đoạn DNA  Làm biến tính (tạo thành các sợi đơn) các băng ADN trên gel điện di bằng cách xử lý gel với nhiệt độ cao hoặc điện di 20 phút trong dung dịch NaOH 0,5M hoặc NaCl1,5 M
12. Các b•ớc tiến hành (tiếp) 2. Thấm truyền (blotting):  Đặt gel lên hệ thống giá chuyển (máy Blotting) để chuyển nguyên vẹn các ADN đã biến tính trên gel lên màng lai (màng nitrocellulose, màng nylon (giữ chặt các đoạn ADN đ•ợc chuyển lên từ gel điện di). Phía trên để một lớp giấy thấm. Trên cùng đặt một vật nặng  Quá trỡnh thấm truyền thực hiện với dung dịch dẫn chuyển là NaOH 0,5M trong 8-12h.
13. Các b•ớc tiến hành (tiếp) 3. Lai phân tử  Các đoạn ADN cố định trên màng lai đ•ợc đem lai với dung dịch mẫu dò đã đ•ợc đánh dấu hoặc bằng p32 hoặc một chất gây phản ứng màu. Quá trỡnh đ•ợc thực hiện ở buồng lai (nhiệt độ 65- 680 C) trong thời gian 3- 12 giờ.  Rửa màng lai ở 650 C bằng dung dịch SSC (NaCl 3M, natri citrat 0,3 M và n•ớc, pH=7.0) để loại bỏ các mẫu dò không tham gia phản ứng lai.
14. Các b•ớc tiến hành (tiếp) 4. Xác định kết qủa bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiogragh).  Màng lai sau khi đ•ợc làm khô, lấy một tấm phim nhạy X quang đặt lên màng lai và để trong một thiết bị chuyên dụng. Xử lý ánh sáng tử ngoại, Nơi xảy ra phản ứng lai sẽ mang hoạt tính phóng xạ (do có mặt mẫu dò), Vị trí xảy ra phản ứng lai sẽ phát xạ vào phim. Tráng phim sẽ thu đ•ợc các vết đen tại nơi phát xạ địa điểm lai.
15. Southern Blot Technique
16. Southern Blot Technique
17.  MOVIE_Southern Blot
18. Ph•ơng pháp Northern Blot  Ph•ơng pháp lai Northern Blot là ph•ơng pháp lai ARN của tế bào với mẫu dò ADN. Về mặt nguyên lý và các b•ớc tiến hành cũng t•ơng tự nh• ph•ơng pháp trên.  Phương phỏp này cho biết  Sự cú mặt của mARN trong mụ  Mức độ thể hiện của gen  Độ lớn của mRNA  Trỡnh tự tương đồng giữa đoạn mục tiờu và mẫu dũ
19. Northern blot
20. Western blot  Lai Western Blot đ•ợc thực hiện giữa các protein với nhau dựa trên nguyên tắc phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể  Phương phỏp này cho biết:  Sự thể hiện của gen thụng qua sự cú mặt của protein trong mụ  Mức độ thể hiện của gen  Độ lớn của protein
21. Cỏc bước tiến hành - Western Blot Protein ở dạng cấu trỳc 2' and 3' thường khụng tớch điện õm xử lý với SDS (sodium dodecyl sulfate) để bọc protein với điện tớch õm Mixture of protein molecules
22. So sỏnh 3 phương phỏp lai Blot Type Matrix Molecule Detection Southern agarose DNA nucleic acid northern agarose RNA nucleic acid western polyacrylamide Protein antibody