›
›

Sinh học - Chương 8: Di truyền học Virus

pdf 95 trang vanle 2460
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Sinh học - Chương 8: Di truyền học Virus", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfsinh_hoc_chuong_8_di_truyen_hoc_virus.pdf

Nội dung text: Sinh học - Chương 8: Di truyền học Virus

  1. Chương 8 Di truyền học Virus Mục tiêu của chương Giới thiệu sự di truyền của thực khuẩn thể, nghiên cứu sự sắp xếp các gen, các đặc tính của virus và, trên cơ sở bản chất của genome của virus đã xác định kiểu sao chép. Số tiết: 3 Nội dung I. Di truyền học thể thực khuẩn (Bacteriophage hay phage) 1. Sự hình thành vết tan và các thể đột biến phage Phage được phát hiện dễ dàng vì trong chu trình tan, một tế bào bị nhiễm phage vỡ ra và giải phóng các hạt phage vào môi trường (Hình 8.1). Sự tạo thành các đốm đã được quan sát. Một số lớn tế bào vi khuẩn (khoảng 108 tế bào) được trãi lên trên môi trường đặc. Sau một thời gian sinh trưởng, tạo một lớp tế bào vi khuẩn màu trắng đục. Nếu phage có mặt ở thời điểm vi khuẩn được trãi lên môi trường, nó sẽ nhiễm vào tế bào vi khuẩn. Sau đó tế bào nhiễm phage bị làm tan và giải phóng nhiều phage mới. Thế hệ sau này của phage lại nhiễm vào vi khuẩn gần đó, và tham gia vào chu trình tan khác, các vi khuẩn này bị vỡ giải phóng ra nhiều phage, chúng có thể nhiễm vào các vi khuẩn khác ở vùng lân cận. Chu trình xâm nhiễm của phage được tiếp tục và sau nhiều giờ, phage phá huỷ tất cả các tế bào vi khuẩn của một vùng, tạo đốm (plage) trong suốt khác với lớp tế bào vi khuẩn màu trắng đục.
  2. Hình 8.1. Chu trình sinh tan của bacteriophage Hình 8.2. Sự xâm nhập của phage vào tế bào vật chủ theo cả 2 dạng bố mẹ đồng thời. r+: đốm nhỏ, r-: đốm lớn, h+: đốm mờ, h-: đốm trong Phage chỉ có thể được nhân lên chỉ khi sinh trưởng trong tế bào vi khuẩn, vì vậy làm cạn nguồn dinh dưỡng trong môi trường sinh trưởng, làm hạn chế sự nhân lên của phage và kích
  3. thước của đốm. Vì mỗi đốm là kết quả của sự nhiễm một hạt phage ban đầu, có thể đếm được số lượng các đốm riêng biệt có trên môi trường (Hình 8.2). Kiểu gene của các thể đột biến phage có thể được xác định nhờ nghiên cứu các đốm. Trong một số trường hợp, sự xuất hiện của các đốm là đầy đủ. Chẳng hạn, đột biến phage làm giảm số lượng phage thế hệ sau từ những tế bào bị nhiễm thường tạo đốm nhỏ hơn. Các đốm lớn có thể được tạo ra bởi các đột biến gây ra sự tan sớm các tế bào bị nhiễm, nên mỗi đốm đó tiếp tục nhiễm nhanh hơn. Kiểu đột biến khác của phage có thể được xác định bởi phage có khả năng hoặc không có khả năng tạo đốm trên những chủng vi khuẩn đặc biệt. 2. Tái tổ hợp di truyền trong một chu kỳ sinh tan (Lytic cycle) 2.1. Chu trình tan (Lytic cycle) Hình 8.3 Sự kết hợp đầu và đuôi để tạo phage hoàn chỉnh Các bacteriophage làm chết tế bào chủ gọi là độc, chúng sinh sản theo chu trình tan. Chu trình bắt đầu khi sợi đuôi của phage gắn vào điểm nhận bề bề ngoài của E.coli. Ống đuôi co lại tạo lỗ thủng xuyên vách tế bào và bơm DNA của nó vào. Capside của phage còn lại bên ngoài tế bào. Sau khi bị nhiễm ở các tế bào E.coli có quá trình phiên mã và dịch mã các gen của virus. Phage T4 có khoảng 100 gen và phần lớn đã được biết rõ. Một trong những enzyme được tạo ra đầu tiên cắt DNA của tế bào chủ. DNA của phage được phiên mã đầu tiên nhờ DNA polymerase của tế bào chủ tạo ra mARN sớm. Các mARN muộn hơn có thể được tổng hợp bởi ARN polymerase của phage hoặc ARN polymerase của vi khuẩn bị biến đổi để phiên mã các gen của phage. Các mARN muộn được dịch mã tạo các loại protein enzyme điều hòa và cấu trúc. Các protein điều hòa của phage kiểm soát sự phiên mã nối tiếp của các gen.
  4. Khi DNA của tế bào chủ bị phân hủy, bộ gen của phage kiểm soát toàn bộ hoạt động của tế bào để tạo ra các cấu phần của nó. DNA của phage được sao chép ra hàng trăm bản sao. Các protein của capsid được tổng hợp thành 3 phần riêng: đầu, ống đuôi và các sợi đuôi. Chúng tự ráp với nhau thành các virion con. Phage hoàn tất chu trình khi enzyme lysozyme được tạo ra để tiêu hóa vách tế bào vi khuẩn. Tế bào vi khuẩn bị vỡ, 100-200 virion thoát ra và chúng có thể lặp lại chu trình mới. Toàn bộ chu trình từ lúc phage tiếp xúc đến tan diễn ra trong khoảng 20-30 phút ở 370C. Trong thời gian đó số lượng phage T4 tăng hơn cả 100 lần, trong khi đó số lượng tế bào E.coli mọc nhanh nhất cũng chỉ tăng gấp đôi. Phần lớn các phage độc theo chu trình vừa nêu trên. Tuy nhiên có một số ngoại lệ như phage sợi M13 của E.coli hầu như không bao giờ làm chết hoặc làm tan tế bào. Các tế bào vi khuẩn và các phage kí sinh có sự đồng tiến hóa. Các tế bào vi khuẩn có các cơ chế bảo vệ như biến đổi màng tế bào để phage không bám vào được hoặc các enzyme cắt hạn chế cắt DNA của phage. Phage cũng biến đổi để xâm nhập được vào tế bào vi khuẩn. Các phage tuy có kích thước nhỏ bé phải nhìn dưới kính hiển vi điện tử mới thấy được. Nhưng các tính trạng của phage được quan sát dựa theo các vết tan hoặc biên độ chủ. Cho hai dòng phage T4 có kiểu gene khác nhau nhiễm vào một tế bào vi khuẩn E.coli, một vài phage thế hệ sau sẽ thực hiện tái tổ hợp di truyền. Allele r- tan nhanh, kết quả tạo ra đốm lớn, allele h- nhiễm vào các tế bào chủ, kết quả tạo đốm trong. Phép lai như sau: r-h+ r+h- Kết quả thu được bốn kiểu đốm. Hai kiểu đốm đục, lớn và đốm trong, nhỏ tương ứng với kiểu hình của phage bố mẹ. Hai kiểu hình khác, đốm trong lớn, đốm mờ nhỏ là dạng tái tổ hợp tương ứng kiểu gene r-h- và r+h+. Khi nhiều vi khuẩn bị nhiễm số dạng tái tổ hợp thuận nghịch thường được tìm thấy trong số các phage ở thế hệ sau. Trong thí nghiệm, mỗi kiểu gene trong số bốn kiểu gene trên sinh ra kiểu hình khác nhau về dạng đốm (Hình 8.2). Số lượng kiểu gene có thể xác định được bằng kiểm tra các đốm tạo thành. Tần số tái tổ hợp, được biểu diễn dưới dạng phần trăm, được xác định như sau: Tần số tái tổ hợp = 3. Sự sắp xếp của các gene trong nhiễm sắc thể phage Tần số tái tổ hợp có thể được sử dụng để xác định khoảng cách của bản đồ ở Eukaryote. Các thí nghiệm lập bản đồ cho thấy đột biến ở T4 được lập bản đồ thành 3 cụm riêng biệt. Cả ba cụm này có liên kết với một cụm khác. George Streisinger và cộng sự (1964) đã chứng minh bản đồ di truyền của phage T4 có dạng vòng tròn. Trong mỗi phép lai, lập ba đến bốn marker di truyền lần lượt với mỗi nhóm và tiến hành qua toàn bộ genome của T4. Nhiều gene khác đã được xác định và lập bản đồ đầy đủ trên phân tử vòng tròn (Hình 8.3). Những vùng ở vòng tròn bên trong là 3 cụm của marker T4 đã được xác định và lập bản đồ di truyền. Vòng ngoài có mặt của nhiều bộ marker lớn tạo thành toàn bộ vòng tròn của bản đồ di truyền. Bản đồ di truyền phage T4 cho thấy gene của phage T4 tạo cụm mở rộng theo chức năng của chúng. Chẳng hạn có cụm lớn các gene dùng cho sao chép DNA ở vị trí phần tư bên trên phía phải và có cụm gene tổng hợp các cấu phần tạo nên đầu của phage ở phía dưới của vòng tròn. Phân tử DNA của phage T4 là phân tử sợi đơn dạng thẳng, mỗi đầu tận cùng của DNA phage T4 được nhân lên hoặc lặp đoạn ở đầu cuối (terminal redundant). Do vậy, mỗi phân tử
  5. DNA có kích thước tăng thêm 2%. Khi DNA được sao chép trong tế bào, sự tái tổ hợp giữa các phần ở đầu tận cùng của bộ gen T4 với những trình tự tương đồng của bộ gen T4 khác, kết quả tạo ra sản phẩm DNA có kích thước lớn hơn khả năng chứa của phần đầu. Những phân tử chứa lặp đoạn được tạo thành vì sự tái tổ hợp trong bộ gen của phage T4 xảy ra thường xuyên, trung bình có khoảng 20% sự kiện tái tổ hợp xảy ra trên một nhiễm sắc thể. Khi phân tử DNA được gói vào phần đầu, nó được cắt bằng enzyme chỉ còn chứa khoảng 102% của chiều dài bộ gen phage T4, vì có chứa đoạn lặp lại của phần đầu. Hình 8.4. Bản đồ di truyền của T4 với các marker 4. Lập bản đồ cấu trúc tinh vi vùng rII của phage T4 Các nghiên cứu chi tiết về các đột biến rII của phage T4 làm sáng tỏ hơn về cấu trúc gene. Phage T4 ở dạng hoang dại r+ có khả năng nhiễm đồng thời hai nòi E.coli B và K. Các đột biến rII chỉ nhiễm nòi B nhưng không nhiễm nòi K. Seymour Benzer (1955) đã nhận được 2400 đột biến rII có nguồn gốc độc lập với nhau. Ông đã cho lai các đột biến với nhau và căn cứ vào sự xuất hiện các dạng tái tổ hợp hoang dại r+ mà lập bản đồ các điểm đột biến. Mỗi đột biến có thể tái tổ hợp với các đột biến khác. Đột biến mất đoạn ngăn cản sự tái tổ hợp với hai hoặc nhiều đột biến điểm ở các vị trí khác nhau của gene. Mỗi mất đoạn làm mất một phần bộ gene của phage bao gồm cả vùng rII. Sử dụng đột biến mất đoạn là phương pháp đơn giản để lập bản đồ của hàng ngàn đột biến. Bản đồ mất đoạn (Deletion mapping) dựa trên sự có hoặc không có dạng tái tổ hợp. Trong bất kỳ phép lai nào giữa một đột biến điểm chưa biết và một đột biến mất đoạn, sự xuất hiện của dạng hoang dại cho thấy đột biến điểm nằm ngoài vùng mất đoạn. Ngược lại, nếu đột biến điểm xuất hiện trong vùng mất đoạn, không xuất hiện dạng tái tổ hợp kiểu hoang dại ở thế hệ sau.
  6. Hình 8.5 Đột biến mất đoạn được sử dụng để chia locus rII của bacteriophage T4 thành 7 vùng và 47 tiểu vùng nhỏ Nhiều phép lai đã được thực hiện để lập bản đồ đột biến chi tiết gene rII. Khoảng cách từ A1 đến A6 và B được trình bày ở hình 8.4. Một đột biến đặc biệt đã được kiểm tra định vị ở vùng A4. Đột biến này không tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với các đột biến mất đoạn lớn như r1272, r1241, rJ3 và rPT1 nhưng nó có thể tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại trong phép lai với rPB242, rA105 và r638. Các đột biến được tạo ra bởi cùng một khuôn, kết quả lai với các đột biến mất đoạn lớn sẽ được xếp vào vùng A4. Bản đồ di truyền trong vùng A4 có thể được tạo ra bởi một bộ các đột biến mất đoạn được trình bày ở phần dưới của hình 8.5. Xác định 7 tiểu vùng ở trong A4 (từ a qua g).
  7. Hình 8.6 Xác định vùng rII liên quan với các marker di truyền dạng thẳng của bản đồ di truyền phage T4 Ví dụ, một đột biến trong vùng A4 kết quả tái tổ hợp tạo dạng kiểu dại với đột biến mất đoạn r1368, nhưng lại không thể thực hiện được với đột biến r221 sẽ được sắp vào tiểu vùng c. Ở mức độ chi tiết hơn, các đột biến trong một tiểu vùng được sắp xếp nhờ lai giữa chúng với nhau. Ở phage T4, các điểm đột biến ở rất gần nhau, được tách nhau nhờ tái tổ hợp. 1% tái tổ hợp tương ứng với khoảng cách khoảng 100 bp. Vì vậy, bất kỳ hai đột biến không thể tái tổ hợp được với nhau có thể được xếp vào cùng vị trí trong gene. Bản đồ di truyền cho số lớn các đột biến rII có nguồn gốc độc lập được mô tả ở hình 8.6. Nghiên cứu đột biến ở vùng rII và lập bản đồ di truyền có vai trò quan trọng, qua đó có thể rút ra các kết luận sau: + Sự trao đổi di truyền có thể xảy ra trong gene và có thể giữa các nucleotide ở gần nhau. + Các đột biến không được tạo ra ở cùng tần số với tất cả các điểm trong gene, chúng phân bố không đều nhau. Chẳng hạn, 2400 đột biến rII đã được xác định chỉ ở 304 điểm. Một trong những điểm này có thể có đến 474 đột biến (Hình 8.6). Nhũng điểm có tần số đột biến cao như thế được gọi là các điểm nóng (hotspot mutation). Ở những điểm khác, đột biến được phục hồi một lần hoặc vài lần.
  8. Hình 8.6 Bản đồ di truyền locus rII của phage T4 Kết quả phân tích vùng rII rất quan trọng, giúp cho chúng ta phân biết được 3 khái niệm về gene. Phổ biến nhất, gene liên quan với một đơn vị chức năng. Điều này tương ứng với một đoạn DNA mã hóa cho một phân tử protein. Benzer đưa ra thuật ngữ cistron để chỉ chức năng này, thuật ngữ cistron thỉnh thoảng vẫn được sử dụng. Đơn vị chức năng được xác định qua thử nghiệm bổ sung (complementation test), xác định được 2 đột biến có allele với nhau không. Trước thí nghiệm của ông rII được coi là một locus. Thí nghiệm cho thấy các đột biến xếp thành hai nhóm rIIA và rIIB. Lai các đột biến rIIA rIIB sẽ có r+, nhưng lai rIIA rIIA và rIIB rIIB thì thu được kiểu hình đột biến r. Ngoài nghĩa là đơn vị chức năng, gene còn là đơn vị tái tổ hợp (recon) và đơn vị đột biến (muton). Cả hai đơn vị này, đều tương ứng với những nucleotide riêng lẽ trong gene. 5. Tính tiềm tan (Lysogeny) và phage  Chu trình tiềm tan bắt đầu khi phân tử DNA của phage  gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn và tiến hành sao chép như một phần nhiễm sắc thể vi khuẩn. Các hạt phage không được tạo thành. Phân tử DNA của phage được gắn vào bộ gen của vi khuẩn được gọi là prophage, tế bào vi khuẩn sống sót được gọi là tế bào tiềm tan (lysogen). Một chủng tiềm tan cho phage  được ký hiệu theo tên của phage. Ví dụ chủng E. coli K12() là chủng K12 trở thành tế bào tiềm tan của phage .
  9. Hình 8.7 Chu trình tan và tiềm tan ở phage  Phân tử DNA của phage  có đầu các đầu cuối chứa 12 nucleotide không kết cặp, mà ở dạng sợi đơn tạo đầu dính (cohesive end) bổ sung. Khi vào tế bào, đầu cuối bổ sung gắn lại tạo phân tử vòng tròn. Sự tạo vòng tròn xảy ra sớm ở cả chu trình tan và chu trình tiềm tan (Hình 8.7). Có khoảng 75% tế bào vi khuẩn bị nhiễm phage, phân tử DNA vòng tròn sao chép và chu trình tan xảy ra tiếp theo. Còn khoảng 25% tế bào bị nhiễm, phân tử DNA vòng tròn của phage  và phân tử DNA vòng tròn của E. coli tương tác và xảy ra tái tổ hợp điểm chuyên biệt (site-specific recombination) và DNA của phage gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Vị trí của tái tổ hợp điểm chuyên biệt ở DNA của vi khuẩn và phage được gọi là điểm gắn vào của vi khuẩn và phage (bacterial and phage attachment sites). Mỗi điểm gắn có chứa 3 đoạn: ở đoạn trung tâm có cùng trình tự nucleotide ở cả 2 vị trí gắn và là vùng mà sự tái tổ hợp thực sự xảy ra. Điểm gắn vào của phage được ký hiệu bởi POP’ (P: phage) và điểm gắn vào ở vi khuẩn được biểu diễn bằng BOB’ (B: bacteria). So sánh bản đồ di truyền của phage và prophage POP’ nằm gần vùng trung tâm của phân tử DNA dạng thẳng. Một protein của phage, integrase, xúc tác cho tái tổ hợp điểm chuyên biệt. Enzyme integrase nhận ra điểm gắn vào của phage và vi khuẩn, gây ra sự trao đổi vật lý, kết quả là phân tử DNA của phage gắn vào phân tử DNA của vi khuẩn. Kết quả của sự tái tổ hợp làm bản đồ di truyền của prophage khác với bản đồ di truyền của phage. Bản đồ di truyền prophage là sự chuyển đổi vòng tròn bản đồ di truyền phage tự do. Prophage được chèn vào nhiễm sắc thể của E. coli giữa gene gal và gene bio. Sự chèn vào của phage  làm tăng khoảng cách giữa gene gal và gene bio. Khoảng cách giữa gene gal và gene bio ở tế bào tiềm tan với phage  là khoảng hai phút so với một phút ở tế bào không tiềm tan.
  10. Hình 8.8 Mô hình gắn của phage  vào NST của E.coli Khi tế bào tiềm tan, các gene của phage trở thành một phần nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy có thể làm kiểu hình của vi khuẩn bị thay đổi. Nhưng hầu hết các gene của phage ở prophage đều được giữ ở trạng thái bất hoạt nhờ protein repressor - sản phẩm của gene ở phage. Protein repressor được bắt đầu tổng hợp nhờ sự nhiễm vào của phage và nó được tiếp tục tổng hợp nhờ prophage. Gene mã hóa cho repressor thường chỉ là gene của prophage được biểu hiện ở chu trình tiềm tan. Nếu tế bào tiềm tan bị nhiễm bởi phage giống với prophage, sự có mặt của repressor trong prophage ngăn cản sự biểu hiện các gene của phage nhiễm vào. Tính kháng với những phage giống với prophage được gọi là tính miễn nhiễm (immunity). Đây là tiêu chuẩn để xác định tế bào vi khuẩn chứa phage đặc biệt. Chẳng hạn phage  không tạo đốm trên vi khuẩn chứa prophage . Trong tế bào tiềm tan, sự sao chép không giải phóng các phage mới. Tuy nhiên, các prophage đôi khi trở nên có hoạt tính, trải qua chu trình tan, tạo ra số lượng lớn phage ở thế hệ sau. Hiện tượng này được gọi là sự cảm ứng prophage (prophage induction), nó được bắt đầu bằng sự hư hại DNA của vi khuẩn. Đôi khi prophage có thể tách ra khỏi DNA của vi khuẩn một cách ngẫu nhiên nhưng thường nó được gây ra do các tác nhân của môi trường như hóa chất hoặc chiếu xạ. Khả năng bị cảm ứng là một thuận lợi cho phage bởi vì DNA của phage có thể thoát khỏi tế bào bị hư hại. Cơ chế sinh hóa của sự cảm ứng là phức tạp nhưng sự thoát ra của phage xảy ra dễ dàng. Sự cắt ra của phage là sự tái tổ hợp điểm chuyên biệt khác, ngược với quá trình gắn vào. Sự cắt này yêu cầu enzyme của phage, integrase thêm protein của phage là excisionase. Nghiên cứu di truyền của sự gắn vật lý cho thấy escisionase gắn với integrase và sau đó nhận ra điểm gắn vào của prophage BOP’ và POB’, gắn với các điểm này. Integrase cắt ở trình tự O và tạo ra lại BOB’ và POP’. Quá trình tách diễn ra ngược lại với sự gắn vào. II. Đặc tính của các virus 1. Tính đa dạng về cấu trúc và thành phần di truyền
  11. Virus có bộ gene rất đa dạng. Bộ máy di truyền của virus có thể là DNA mạch kép (double strand - dsDNA), DNA mạch đơn (single strand - ssDNA), RNA mạch kép (dsRNA) hay RNA mạch đơn (ssRNA). Bộ gene RNA của virus là một phân tử hoặc một đoạn, sợi đơn phân cực mạch (+) hoặc mạch (-), có thể ở dạng vòng tròn hay dạng thẳng. Virus nhỏ nhất có nhất có khoảng 4 gene, virus lớn có khoảng vài trăm gene. Bộ gene của virus cấu trúc đa dạng nhưng đều đảm bảo yêu cầu chung là phải sao chép được trong tế bào chủ tạo ra cả genome cho lắp ráp virion thế hệ sau và các mRNA phải tổng hợp protein của virus. 2. Tính đặc thù về vật chủ (Host specificity) Mỗi kiểu virus có thể nhiễm và kí sinh chỉ ở một biên độ giới hạn của tế bào được gọi là biên độ chủ (host range). Các virus nhận biết tế bào chủ theo nguyên tắc “ống khóa và chìa khóa” các protein bên ngoài của virion lấp vừa các điểm nhận trên bề mặt tế bào. Một số virus có biên độ chủ rộng đủ để xâm nhập vào vài loài. Chẳng hạn, các virus bệnh dại có thể nhiễm nhiều loài có vú gồm gậm nhấm, chó và người. Biên độ có thể rất hẹp như nhiều phage chỉ nhiễm vi khuẩn E. coli. III. Tái bản của các virus Bản chất genome của virus xác định kiểu sao chép. Virus được phân loại dựa trên các đặc điểm: - Phân loại theo bệnh: chia ra virus gây bệnh ở người, động vật và cây trồng Vấn đề chủ yếu đối với hệ thống phân loại này là nhiều loại virus khác nhau lại gây ra cùng một triệu chứng. Chẳng hạn, sự nhiễm trùng hô hấp với sốt có thể được gây ra do nhiều virus khác nhau. - Phân loại theo hình thái: phân loại virus cơ bản dựa trên cấu trúc của hạt virus. Kiểu phân loại này có hạn chế trong phân biệt giữa các virus có hình thái tương tự nhưng gây ra triệu chứng bệnh khác nhau. - Phân loại theo chức năng: trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu được tiến hành dựa trên phương thức sao chép của virus. Cần xác định thành phần và cấu trúc genome của virus và từ đó xác định cách sao chép. Kiểu tế bào bị nhiễm bởi virus có ảnh hưởng quan trọng đối với quá trình sao chép. Đối với virus của prokaryote, sự sao chép phản ánh mối quan hệ mở rộng đơn giản của các tế bào chủ. Đối với virus của tế bào eukaryote, vấn đề phức tạp hơn. Khả năng mã hoá của genome buộc virus chọn một phương thức sao chép. Phương thức sao chép của virus phụ thuộc vào bản chất vật liệu di truyền của chúng. Về phương diện này, virus được chia thành 7 nhóm: Nhóm I: Virus chứa DNA sợi đôi. Nhóm này được chia nhỏ thành hai loại: + Sao chép là chỉ của nhân. Sự sao chép của các virus này phụ thuộc tương đối vào các yếu tố của tế bào. + Sao chép xảy ra trong tế bào chất. Những virus này có liên quan với các yếu tố cần thiết cho phiên mã và sao chép genome của chúng và vì vậy phụ thuộc nhiều vào bộ máy tế bào. Nhóm II: virus chứa DNA sợi đơn. Sự sao chép xảy ra trong nhân liên quan sự tạo thành qua trung gian sợi kép được xem như là khuôn cho tổng hợp lại DNA sợi đơn thế hệ sau. Nhóm III: virus chứa RNA sợi kép. Những virus này có bộ gene được chia đoạn. Những đoạn này được phiên mã riêng để tạo ra các monocistronic mRNA.
  12. Nhóm IV: Virus chứa RNA sợi đơn mạch (+), có thể chia nhỏ thành 2 nhóm: + Virus với polycistronic mRNA. RNA genome tạo ra mRNA, phân tử này dịch mã tạo sản phẩm là một polyprotein, thường được phân cắt để tạo các protein trưởng thành. + Virus phiên mã phức tạp. Cách dịch mã (như Togavirus) hoặc các RNA của subgenome (Tobamovirus) cần thiết để tạo RNA của bộ gene. Nhóm V: Virus chứa RNA sợi đơn mạch (-), genome của virus này được chia thành 2 nhóm: - Genome không chia đoạn (Mononegvirales). Bước đầu tiên trong sao chép là phiên mã RNA sợi (-) của genome nhờ RNA polymerase phụ thuộc RNA của hạt virus để tạo ra monocistronic mRNA, được xem là khuôn cho sao chép genome. - Genome được chia đoạn (Orthomyxoviridae). Sao chép xảy ra trong nhân với monocistronic mRNA cho mỗi gene của virus được tạo ra nhờ enzyme transcriptase từ genome đầy đủ của virus. Nhóm VI: Virus chứa mRNA sợi đơn mạch (+) qua trung gian DNA. Bộ gene của retrovirus là mRNA mạch (+) nhưng ở dạng lưỡng bội. Chúng không trực tiếp tạo ra mRNA mà phiên mã ngược tạo DNA. Nhóm VII: DNA sợi đôi qua trung gian RNA. Virus nhóm này dựa vào enzyme phiên mã ngược, những khác với retrovirus, quá trình này xảy ra bên trong hạt virus trong suốt quá trình trưởng thành.
  13. Hình 8.9 Sao chép RNA của virus 1. Các virus của vi khuẩn Có 3 pha bắt đầu cho xâm nhiễm của virus. - Bắt đầu nhiễm - Sao chép và biểu hiện genome của virus - Giải phóng các virion trưởng thành từ tế bào bị nhiễm Bacteriophage được thêm vào nuôi cấy vi khuẩn đang sinh trưởng mạnh và sau một vài phút nuôi cấy bị giảm, ngăn cản tương tác giữa các hạt phage và tế bào. Ngay sau khi làm giảm nuôi cấy, có giai đoạn khoảng 10-15 phút không phát hiện thấy các hạt phage, đây là giai đoạn che khuất (eclipse period). Điều này xảy ra một thời gian sau khi nhiễm vào tế bào, liên quan với genome của chúng như là điều kiện trước tiên cho sao chép. Ở giai đoạn này không có sự nhiễm nữa vì vậy không thể phát hiện nhờ vết đốm. Giai đoạn muộn là thời gian trước khi hạt virus mới đầu tiên xuất hiện và khoảng 20-25 phút cho hầu hết các bacteriophage. Khoảng 40 phút sau khi tế bào bị nhiễm, đường cong về số lượng hạt virus tổng số và virus ngoại bào hợp nhau thành một vì lúc này, tế bào bị nhiễm làm tan và giải phóng các hạt phage ngoại bào. Các bacteriophage làm chết tế bào chủ gọi là độc (virulent) và chúng sinh sản theo chu trình tan Các virus ôn hoà (temperate virus) có thể sinh sản mà không là chết tế bào chủ. Chúng có hai khả năng sinh sản: chu trình tan và chu trình tiềm tan không làm chết tế bào chủ. Chu trình sống bắt đầu khi phage gắn vào bề mặt tế bào E. coli và bơm DNA vào trong gây nhiễm. DNA của phage sau khi vào tế bào tạo DNA vòng tròn và sẽ tham gia vào một trong hai chu trình. DNA của phage có thể hoặc tham gia vào chu trình tiềm tan của phageT4 hoặc gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn nhờ tái tổ hợp điểm chuyên biệt để bước vào chu trình tiềm tan. 2. Các virus thực vật Hầu hết virus thực vật có genome RNA, tuy nhiên 2 nhóm virus thực vật được nghiên cứu nhiều nhất có chứa genome DNA: Cauliflower mosaic virus (CaMV) và gemini virus. - Các virus RNA Phần lớn virus thực vật có bộ gene RNA sợi đơn mạch (+) và nhiều dạng có capsid hình que, các protein capsomer hình xoắn. + Tobacco mosaic virus (TMV)
  14. Genome TMV là RNA sợi đơn. Genome của chúng mã hoá ít nhất 4 chuỗi polypeptid. Protein 130 và 180 kDal được dịch mã trực tiếp từ cùng một codon bắt đầu trên RNA bộ gene. Hai protein khác, 30 kDal và protein vỏ được dịch mã từ đoạn RNA. Protein 130 và 180 kDal liên quan với sao chép virus, trong khi đó protein 30 kDal cần cho sự di chuyển của virus từ tế bào này đến tế bào khác. Vì vậy 3 loại protein này cần cho sự nhân lên của virus trong toàn bộ cây. - Các virus DNA Virus thực vật có bộ gene DNA rất hiếm, chỉ gồm 2 nhóm: + Cauliflower mosaic virus: CaMV được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm Caulimovirus. Đây là nhóm virus dạng cầu, chứa genome DNA vòng tròn, mạch kép, kích thước khoảng 8 kb. Caulimovirus gây ra một số bệnh làm thiệt hại kinh tế cấy trồng. Chúng có phổ vật chủ hạn chế, chỉ nhiễm cây 2 lá mầm. DNA của CaMV có cấu trúc không bình thường, có 3 điểm gián đoạn trên sợi kép, hai điểm trên một sợi và một điểm trên sợi còn lại với những vùng trình tự overlap. Ngoài ra DNA CaMV có ribonucleotide gắn với đầu cuối 5’ của điểm gián đoạn. Từ các nghiên cứu ở CaMV, Hull và Covey (1983), Pfeiffer và Hohn (1983) cho rằng sao chép CaMV liên quan với phiên mã ngược qua trung gian RNA của bộ gene. Chu trình sao chép giống với retrovirus và hepatitis B virus. + Gemini virus: Gemini virus là nhóm virus có phổ xâm nhiễm rộng, cả cây một lá mầm và 2 lá mầm.Virus sọc vằn lá ngô (maiz streak virus – MSV) là một gemini virus lây nhiễm qua lá, được truyền do côn trùng. Bộ gene của geminivirus chứa phân tử DNA vòng tròn sợi đơn. Sao chép DNA virus được nghĩ là xảy ra nhờ trung gian DNA và genome của virus sao chép cho nhiều bản sao trong nhân của những tế bào tăng sinh nhanh. Virus gây ra sự ức chế sinh trưởng và lá có sọc vàng của những cây ngô bị nhiễm. 3. Các virus động vật Chu trình sao chép của virus động vật có nhiều điểm tương tự với các virus khác với nhiều biến dạng đáng kể. Virus động vật thường có promoter mạnh, có thể áp dụng cho biểu hiện gene. Trong nhiều trường hợp, chúng có khả năng sao chép genome của chúng với số lượng lớn bản sao trong tế bào. Một số virus động vật như retrovirus gắn DNA của chúng vào nhiễm sắc thể tế bào chủ như là một phần chu trình sao chép của chúng. - Các virus RNA như retrovirus, paramyxo virus Retrovirus có phổ vật chủ rộng gồm chim, động vật có vú và những động vật khác. Sự nhiễm của retrovirus không dẫn đến làm chết tế bào. Biểu hiện gene của virus mạnh nhờ promoter mạnh. Retrovirus chứa genome RNA. Hạt virus chứa 2 bản sao RNA. Mỗi genome RNA có nhiều tính chất tương tự với mRNA eukaryote: có trình tự poly(A) khoảng 200 đơn vị ở đầu mút 3 và cấu trúc mũ ở đầu 5’. Virus xâm nhiễm vào tế bào kèm theo enzyme reverse transcriptase và intergrase. Enzyme reverse transcritase tham gia phản ứng tổng hợp cDNA, dẫn đến sự hình thành bản sao DNA mạch kép của RNA virus, được gọi là DNA provirus. DNA provirus được đóng vòng tròn nhờ protein intergrase và được xen vào genome tế bào chủ. Thường chỉ có một bản sao DNA provirus được gắn vào trong một tế bào chủ. Điểm gắn vào genome là ngẫu nhiên. Retrovirus là một tác nhân gây ung thư. Hầu hết chúng có cấu trúc genome chứa trình tự oncogene. Oncogene virus thường được tạo thành từ gene của tế bào và thường là kết quả của sự dung hợp gene tế bào với gene của virus. Kết quả là những virus gây ung thư như thế bị mất chức năng gene của virus. Chúng có thể sao chép trong lây nhiễm hỗn hợp với một helper virus cung cấp chức năng bị mất.
  15. - Các virus DNA: SV40, Bovine papilloma virus (BPV) Hạt virus SV40 chứa DNA mạch kép, vòng tròn, khoảng 5,2 kb được gắn với 4 phân tử histon: H4, H2a, H2b và H3. SV40 có thể tham gia vào hai kiểu chu trình sống phụ thuộc vào tế bào chủ. Trong tế bào cho phép virus xâm nhiễm (permissive cell) thường là các dòng tế bào ổn định có nguồn gốc từ khỉ châu Phi, sự sao chép virus xảy ra như các trường hợp nhiễm bình thường. Trong tế bào không cho phép (non-permissive cell), thường là những dòng tế bào chuột, không có sự nhiễm làm tan tế bào vì virus không thể sao chép toàn bộ DNA của chúng. Ở những tế bào khỉ bị nhiễm và làm tan do SV40, có thể phân ra 3 giai đoạn. Trong suốt 8 giờ đầu tiên, hạt virus không vỏ và DNA của chúng di chuyển đến nhân tế bào chủ. 4 giờ tiếp theo là pha sớm (early phase), có sự tổng hợp mRNA sớm và protein sớm và có sự kích thích tổng hợp DNA của tế bào chủ. Trong pha muộn xảy ra ở 36 giờ tiếp theo, trong giai đoạn này có sự tổng hợp DNA của virus, mRNA muộn và protein muộn, lắp ráp virus và làm tan tế bào. + Bovine papilloma virus (BPV) BPV gây nên bệnh bướu (wart) ở trâu bò. BPV có genome DNA sợi kép, vòng tròn khoảng 7,9 kb. 4. Các virus gây ung thư, HIV/AIDS Khoảng 15% ung thư ở người có cơ chế hình thành liên quan với virus. Chúng có các nhóm sau : + DNA virus: họ Apovavirus (Papilloma virus), họ HepDNAavirus (Hepative-B virus), họ Herpesvirus (Eptein-Barr virus) + RNA virus: họ Retrovirus (HIV-1, virus AIDS) Các virus gây ung thư có thể tác động do xen đoạn DNA của chúng vào bộ gene chủ. Ngoài ra có thể thực hiện : + Hoạt hoá bộ máy sao chép DNA của tế bào chủ. + Kìm hãm tác động của các tumour suppressor gene chủ yếu để hoạt hoá sao chép DNA Như vậy bằng nhiều cách khác nhau các virus khi xâm nhập tế bào có thể làm tế bào mất sự kiểm soát bình thường. AIDS là hội chứng do virus làm suy giảm miễn dịch ở người (HIV). Hạt virus là một khối cầu, bờ ngoài gồ ghề, gồm vỏ bên ngoài, trong là chất nền protein bao quanh lõi có mặt cắt dạng nón. Trong lõi có genome gồm 2 sợi RNA giống nhau gắn với enzyme DNA polymerase là reverse transcriptase. Trong quá trình nhiễm, virus HIV bám và nhiễm lõi của nó vào tế bào hệ thống miễn dịch của người. Tiếp theo chúng sử dụng enzyme reverse transcriptase để sao RNA genome của chúng thành phân tử DNA sợi kép trong tế bào chất của tế bào chủ. Phân tử xoắn kép này chuyển đến nhân, gắn vào nhiễm sắc thể tế bào chủ nhờ một enzyme khác. Khi đã gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, genome của virus. Một khi đã gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào chủ, genome của virus có thể thực hiện một trong 2 quá trình. Nó có thể trưng dụng bộ máy tổng hợp protein của tế bào chủ để có thể tạo ra hàng trăm hạt virus mới sinh sản bằng nảy chồi, tách khỏi màng tế bào và đôi khi làm chết tế bào chủ. Nó cũng có thể tiềm tàng trong nhiễm sắc thể của tế bào chủ, rồi sao chép và truyền genome virus sang 2 tế bào mới khi tế bào phân chia.
  16. Hình 8.10 Chu trình sinh sản của virus HIV Ngoài ra sinh học hiện đại còn phát hiện ra hai dạng sống đặc biệt là các viroid và prion - Viroid: là những phân tử RNA rất nhỏ (200-400 nucleotide), dạng que có mức độ cấu trúc bậc hai cao (Hình 8.11). Chúng không có capsid và vỏ bao (envelope) và chỉ chứa một phân tử acid nucleic đơn. Viroid gắn liền với bệnh thực vật. Viroid đầu tiên được phát hiện và nghiên cứu đầy đủ nhất là viroid ống thoi khoai tây (potato spindle tuber viroid-PSTVd). Viroid không mã hóa cho bất kì một protein nào và nó được sao chép nhờ RNA polymerase của tế bào chủ hoặc có thể nhờ một sản phẩm của một gene RNA polymerase phụ thuộc RNA trong một vài tế bào eukaryote. Chi tiết của sao chép đến nay người ta chưa rõ, dường như nó xảy ra nhờ cơ chế vòng tròn xoay có sự cắt (autocatalytic cleavage) và gắn (self-ligation) để tạo ra viroid trưởng thành. Hình 8.11 Các vùng chức năng của phân tử RNA viroid
  17. Giữa các viroid khác nhau có các trình tự khác nhau, nó được sử dụng trong phân loại để chia viroid thành giống (genera) và loài (species). Tuy nhiên, tất cả viroid đều có đặc điểm chung là vùng trung tâm có tính chất bảo thủ liên quan với sao chép của chúng (Hình 8.12). Một nhóm các viroid có khả năng tạo thành cấu trúc « đầu búa » (hammerhead) làm cho chúng có tính chất enzyme của một ribozyme. Hoạt tính này được sử dụng để cắt cấu trúc nhiều đơn phân tạo ra trong quá trình sao chép. Các viroid khác sử dụng các enzyme chưa được biết trong tế bào chủ để thực hiện điều này. Một vài viroid gây bệnh trầm trọng và gây chết thực vật chủ. Các viroid khác gồm các loại từ không có biểu hiện bệnh bên ngoài đến có triệu chứng bệnh nhẹ. Hình 8.12 Cấu trúc RNA viroid - Prion: Một nhóm bệnh lây nhiễm hệ thần kinh kinh niên, phát triển nhanh chóng và gây chết được biết như là bệnh xốp não lây nhiễm (Transmissible spongiform encephalopathics - TSE). Tác nhân lây nhiễm liên quan đến TSE không phải là acid nucleic (Tikvah Alper, 1967). Các bệnh TSE ở người như là bệnh Kuru và Creutzfeldt-Jacob có thể gây nên do các phần tử protein gây nhiễm và Standley Prusiner (1982) gọi chúng là prion (proteinacious infectious particle). Bản chất của prion là chưa được chứng minh một cách chắc chắn. Chúng là một hiện tượng mới vượt ra ngoài hiểu biết thông thường. Tất cả các bệnh prion đều có bệnh lý giống nhau cơ bản, mặc dù giữa chúng có sự khác biệt có ý nghĩa ở những điều kiện khác nhau. Các bệnh khác nhau được đặc trưng bởi sự lắng (deposition) của các protein bất thường trong các mô khác nhau như thận, lách, gan hoặc não Sự lắng các « amyloid » này bao gồm sự tích luỹ các protein khác nhau ở dạng tấm hoặc dạng cuộn rối tạo ra protein  amyloid. Chúng là kết quả từ những sai hỏng của bộ gene trong trao đổi chất do nhiều loại nhân tố chưa được biết Mặc dù cơ chế phân tử liên quan với sự chết của tế bào là chưa rõ ràng, nhưng tác động gây ra xốp nào do tạo lỗ ở mô não đã được quan sát thấy dưới kính hiển vi. Những lỗ này gây ra do sự mất tế bào thần kinh và gliosid. Phép chẩn đoán xác định TSE không chỉ tiến hành trên lâm sàng mà yêu cầu chứng minh sự lắng protein prion (prp) bằng nhuộm hoá học miễn nhiễm mô não người sau khi chết. Câu hỏi và Bài tập 8. Hãy trình bày quá trình tái tổ hợp genome của bacteriophage. 9. Genome của vi khuẩn và virus tương tác vật lý theo cách nào? 10. Ý nghĩa của việc phân tích cấu trúc locus rII của phage T4. 11. Hãy nêu đặc điểm về chu trình sống của phage. 12. Virus thực vật có những nhóm nào? 13. Hãy trình bày phương thức sao chép của virus chứa RNA sợi đơn. 14. Đặc điểm chu trình sinh sản của virus HIV. 15. Hãy nêu tên các dạng sống chỉ có acid nucleic hoặc chỉ có protein.
  18. 16. Có bao nhiêu đốm tan của phage được tạo thành trên môi trường nuôi cấy từ một phage riêng lẽ ban đầu? 17. Bacteriophage có trật tự các gene là ABC att DEF. Hỏi trật tự của các gene này ở prophage như thế nào? Tài liệu Tham khảo Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.
  19. Chương 9 Di truyền học Vi nấm và Vi tảo Mục tiêu của chương Phân tích di truyền ở một số vi tảo và vi nấm, chủ yếu tập trung nghiên cứu các đặc điểm của vi nấm, vi tảo như tính không dung hợp, phân tích bộ bốn, phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính, nhiễm sắc thể nhân tạo Số tiết: 3 Nội dung I. Đại cương về nghiên cứu di truyền ở một số vi tảo thông dụng Loài vi tảo được sử dụng sớm nhất và nghiên cứu di truyền chi tiết hơn cả là Chlamydomonas reinhardii. Ưu thế của đối tượng này là có thể tiến hành lai và phân tích bộ bốn không xếp theo thứ tự. Ở các loài này, các tế bào đơn bội có thể sinh sản vô tính một thời gian dài. Các tế bào đơn bội gồm 2 loại: mt (+) và mt (-), tế bào đơn bội của mỗi loại không kết hợp với nhau. Sự kết hợp hai tế bào khác kiểu bắt cặp mt (+) với mt (-) tạo ra hợp tử. Hợp tử qua giảm phân cho tỷ lệ phân ly của một gen là 2 tế bào mt (+) : 2 tế bào mt (-). Trong điều kiện thí nghiệm, có thể nuôi các tế bào Chlamydomonas reinhardii để nhận các tế bào đồng nhất (synchronous culture), khi thay đổi chu kì 12 giờ sáng 12 giờ tối đều đặn. Theo dõi tổng hợp DNA cho thấy DNA của lục lạp tổng hợp vào giờ thứ 5-6 ngoài sáng, còn DNA của nhân tổng hợp khoảng giờ thứ 16-18, sau đó chia tế bào đồng loạt. Một số đột biến kháng streptomycine đã được thu nhận và nhận thấy ở một số có sự di truyền trong nhân, số khác có sự di truyền ngoài nhân.
  20. Hình 9.1 Gen nhân (yl) phân ly 2:2 trong quá trình tạo giao tử còn gen của lục lạp (sm) phân ly theo tỷ lệ 4:0 II. Phân tích di truyền ở vi nấm 1. Tính không dung hợp (incompatibility) ở vi nấm Khái niệm tính không dung hợp ở nấm được dùng để chỉ khả năng kết hợp với nhau giữa các dòng nấm trong sinh sản hữu tính. Cho đến nay gần 450 loài nấm đã được nghiên cứu về các kiểu không dung hợp. Sự không dung hợp được xác định về mặt di truyền. Theo kiểu dung hợp thì nấm được phân làm 2 loại: - Đồng tản (Homothallic) là khi có sự kết hợp với nhau giữa các tế bào (hay hệ sợi tơ- mycellium) giống nhau trong sinh sản hữu tính. Ví dụ, tế bào a kết hợp với tế bào a, hay với tạo dạng lưỡng bội 2n tương ứng aa hay . - Dị tản (Heterothallic) là kiểu khi có sự lai nhau giữa 2 loại tế bào khác nhau như a với tạo dạng dị hợp tử lưỡng bội a . Các nấm dị tản có thể chia thành: lưỡng cực (bipolar) và tứ cực (tetrapolar). Đại diện điển hình của nấm dị tản lưỡng cực (bipolar heterothallic) là nấm men Saccharomyces cerevisiae. Ở nấm men, sự hợp bào (cytogamy) và hợp nhân (karyogamy) chỉ xảy ra giữa các tế bào (hay nang bào tử - ascospora) có kiểu bắt cặp (matting type) khác nhau như a và và các allele khác nhau của locus MAT. Do có sự tham gia của 2 allele nên gọi là lưỡng cực. Nấm mốc vàng bánh mì Neurospora crassa cũng thuộc kiểu không dung hợp này. Nấm rơm (Volvariella volvacea) và nấm mỡ (Agaricus bisporus) cũng thuộc loại này. Kiểu dị tản tứ cực (tetrapola heteropolic) đặc trưng cho nhiều loại nấm đảm Bacidiomycetes mà đại diện là Schizophyllum communae. Nấm bào ngư (Pleurotus) và nấm hương (Lentinus edodes) thuộc kiểu không dung hợp này. Sự xác định di truyền không dung hợp ở các loài nấm này do 2 gen A và B. Mỗi gen có 2 allele hoặc nhiều hơn, thường là A1, A2 và B1, B2. Sự kết hợp
  21. giữa các dòng đơn bội chỉ tạo dạng hữu thụ có kiểu gene A1A2B1B2 tức bốn nhân tố khác nhau, do đó gọi là tứ cực. Sự đa dạng của các chu trình sống và các kiểu không dung hợp ở nấm có ảnh hưởng đến các phương pháp phân tích di truyền. Ở một số nấm sinh sản hữu tính thực hiện trên cơ sở dị hợp bào (heterogamy) như ở Neurospora crassa. Ở những loài khác trên cơ sở đồng hợp bào (isogamy). Song song với sinh sản hữu tính còn có chu trình cận hữu tính hoàn toàn hay không hoàn toàn phụ thuộc vào loại nấm. Chu trình sinh sản cận hữu tính là quá trình kết hợp và tái tổ hợp gene diễn ra trong nguyên phân chứ không phải giảm phân, không có sự thụ tinh như sinh sản hữu tính. 2. Phân tích bộ bốn và lập bản đồ ở vi nấm Nấm men có nhiều đặc trưng để trở thành mô hình lý tưởng cho nghiên cứu di truyền ở eukaryote. Nấm men là một eukaryote đơn bào, chu kỳ sống chỉ khoảng 90 phút, có thể thu đuợc nấm men với số lượng lớn khi nuôi trên môi trường đặc. Bộ gen của nấm men chứa khoảng 12 megabase với 6.000 gen phân bố trên 16 nhiễm sắc thể. Nấm men là eukaryote đầu tiên được giải mã bộ gen. Chu trình sống của nấm men gồm hai giai đoạn có thể chuyển đổi qua lại. Tế bào có thể tồn tại ở cả dạng lưỡng bội và cả dạng đơn bội. Trong cả hai trường hợp, tế bào mẹ tạo chồi giống hệt nó. Những tế bào lưỡng bội này có thể tiếp tục sinh trưởng bằng mọc chồi và có thể trãi qua giảm phân tạo 4 bào tử đơn bội (haploid) trong một nang (ascus) được gọi là tetrad. Bào tử đơn bội (haploid spore) của kiểu kết cặp khác nhau (a với ) sẽ qua thụ tinh tạo thể lưỡng bội. Những bào tử của kiểu kết cặp giống nhau sẽ tiếp tục sinh trưởng bằng nẩy chồi. Nấm men được xem là E. coli của các tế bào eukaryote, có thể sử dụng nấm men để phân tích đột biến. Tế bào nấm men đơn bội được gây đột biến bằng tia X, sau đó sàng lọc các kiểu hình đột biến trên môi trường nuôi cấy. Đầu tiên nuôi cấy tế bào nấm men trên môi trường giàu dinh dưỡng để tất cả các tế bào phát triển. Đĩa nuôi cấy này sau đó được nhân lên qua đĩa sao chép chứa môi trường chọn lọc hoặc điều kiện sinh trưởng đặc biệt. Chẳng hạn, các đột biến nhạy cảm nhiệt độ có thể sinh trưởng trên các đĩa gốc nhưng lại không sinh trưởng trên các đĩa sao chép ở nhiệt độ giới hạn. So sánh các khuẩn lạc ở đĩa gốc với đĩa sao chép sẽ phát hiện được những đột biến nhạy cảm với nhiệt độ.
  22. Hình 9.2 Chu trình sống của nấm men. Lớp nang khuẩn (Ascomycetes) có đặc điểm là khi các tế bào lưỡng bội phân chia giảm nhiễm sẽ tạo ra các bào tử nằm trong một vỏ bao được gọi là nang (ascus). Các cơ thể này có các đặc điểm thuận lợi cho phân tích di truyền: Các vi nấm có thể tồn tại ở dạng đơn bội, nên tất cả các gene có thể biểu hiện trực tiếp thành kiểu hình. Các vi nấm này có thể tạo ra số lượng cá thể lớn ở thế hệ sau nên có thể phát hiện các sự kiện di truyền hiếm và có thể ước lượng được tần số tái tổ hợp một cách chính xác. Tế bào nấm men có thể sống ở dạng sinh dưỡng đơn bội hay dị bội. Tín hiệu chuyển từ đơn bội sang dị bội xuất hiện theo dạng kết hợp và tín hiệu chuyển từ dị bội sang đơn bội là sự giảm phân trong quá trình hình thành bào tử.
  23. Hình 9.3 Mốc vàng bánh mì (Neurospora crassa) là mô hình nghiên cứu phân li trong giảm phân Trong chu trình sống, chỉ có hợp tử là lưỡng bội, sẽ trải qua giảm phân ngay sau khi được tạo thành, tạo các bào tử đơn bội, bào tử nẩy mầm hình thành giai đoạn cây. Ở một số loài các bộ bốn tạo thành trải qua một lần phân chia nguyên nhiễm nữa để tạo ra từng cặp gồm hai bào tử giống hệt nhau. Ở mốc vàng bánh mì (N. crassa), các bào tử xếp thảng hàng trong nang theo một trật tự xác định liên quan trực tiếp đến tiến trình của giảm phân (Hình 9.3). Hầu hết các loại nấm mốc khác, sản phẩm của giảm phân không sắp xếp theo một trật tự đặc biệt trong nang như mốc vàng bánh mì. - Lập bản đồ di truyền bằng phân tích bộ bốn Đối với trường hợp bộ bốn không theo thứ tự: Ví dụ: khi lai các tổ hợp của hai gene AB ab. Sự thụ tinh cho nhân lưỡng bội AB/ab và nó chia giảm nhiễm ngay. Nếu không có trao đổi chéo xảy ra hoặc trao đổi chéo đôi xảy ra trên cùng hai chromatid thì sẽ có bộ bốn: 2 AB : 2ab, gọi là kiểu đôi cha mẹ (parental ditype – PD). Nếu trao đổi chéo xảy ra trên cả bốn chromatid của mỗi cặp nhiễm sắc thể kép, sẽ có 2AB : 2aB, gọi là bộ bốn kiểu đôi không cha mẹ (Nonparental ditype – NPD) hay còn gọi là kiểu đôi tái tổ hợp (Reconbinational ditype- RD) Trường hợp tạo ra mỗi nang bốn loại bào tử có kiểu gene khác nhau: 1AB : 1Ab : 1aB : 1ab được gọi là kiểu bốn (tetratype) Phân tích bộ bốn cho phép xác định hai gene liên kết. Khi hai gene không liên kết thì tần số bộ bốn kiểu đôi bố mẹ và kiểu đôi không bố mệ bằng nhau (PD = NPD). Ngược lại khi hai gene liên kết, kiểu PD có tần số lớn hơn kiểu NPD. Tần số tương đối của các kiểu bộ bốn khác nhau được sử dụng để xác định bản đồ khoảng cách giữa hai gene liên kết.
  24. Parent ditype Nonparent ditype Tetratype PD NPD T Hình 9.4 Phân tích bộ bốn 3. Phân tích di truyền trong chu trình cận hữu tính (tái tổ hợp trong nguyên phân) Nhiều loại nấm có sợi dinh dưỡng kết hợp với nhau, làm cho các nhân đơn bội từ các dòng cùng ở chung trong tế bào chất. Các thể dị nhân (heterocaryon) được tạo nên có thể tồn tại lâu dài như ở N. crassa. Sự tạo thành các thể dị nhân được sử dụng rộng rãi để nghiên cứu sự tương tác giữa các gene, giữa các allele và giữa các gene của nhân với tế bào chất. Trong một số trường hợp, sự so sánh các dị hợp tử và dị nhân cho thấy sự khác nhau trong tương tác giữa các allele, có lẽ do: - Tỷ lệ số lượng nhân và tương ứng các allele trong thể dị nhân có thể khác nhau - Các allele của các gene ở một nhân không được ngăn cách như ở giữa các thể dị nhân.
  25. Các nhân ở thể dị nhân đôi khi hợp nhau tạo nên đoạn lưỡng bội. Hơn nữa trong quá trình chia nguyên phân tiếp theo, nhân lưỡng bội có thể chịu tác động của hai quá trình: đơn bội hoá hoặc tái tổ hợp nguyên phân. 3.1. Sự đơn bội hoá (Haploidisation) Sự đơn bội hoá có thể xảy ra ngẫu nhiên hoặc được gây tạo bởi chất n-fluorphenylalanin. Nếu như các nhân trong nhiều nguyên phân bị 1 nhiễm sắc thể (2n – 1) thì nhân lệch bội vừa xuất hiện trở nên không ổn định và tiếp tục mất các nhiễm sắc thể khác của một bộ đơn bội, cho đến khi trở thành nhân đơn bội ổn định. Trong quá trình đó nhiễm sắc thể bị mất độc lập nhau, các gene của cùng một nhiễm sắc thể có sự liên kết hoàn toàn. Dựa vào đặc điểm này có thể xác lập sự liên kết dựa vào gene đánh dấu trên mỗi nhiễm sắc thể. 3.2. Tái tổ hợp trong nguyên phân (Mitotic recombination) Tái tổ hợp trong nguyên phân là hiện tượng thường gặp ở nhiều sinh vật, khi xảy ra trao đổi chéo giữa các nhiễm sắc thể tương đồng trong nguyên phân. Trong trường hợp này khoảng cách của gene đánh dấu xa tâm động nhất, sự đồng hợp tử hoá thường xảy ra hơn cả (được coi là 100%) và sự phân bố các gene được tính theo công thức: D = Nab/Nb x 100% D: khoảng cách của gene đến tâm động Nb - tổng số các dạng phân li, đồng hợp tử theo b. Nab - số các dạng phân li đồng hợp cả a và b, nếu như b là gene đánh dấu xa tâm động nhất. Bản đồ liên kết gene được xây dựng bằng tái tổ hợp giảm phân và tái tổ hợp nguyên phân (trong chu trình cận hữu tính) có thứ tự gene xếp giống nhau ở Aspergillus nidulans. III. Nấm men như là E. coli của các tế bào eukaryote 1. Các nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo (YAC) Để xây dựng nhiễm sắc thể nhân tạo có chức năng như một phần bộ gene của tế bào, để đảm bảo sự phân chia của nhiễm sắc thể cần có tâm động (centromere). Thứ hai, phần đầu mút của nhiễm sắc thể thẳng dài được giữ nguyên vẹn khi đưa vào tế bào, tránh được sự phân giải của nuclease nhờ đoạn trình tự DNA lặp lại đặc biệt và phức hợp protein bao đầu nhiễm sắc thể là telomer. Cuối cùng, DNA phải sao chép trước khi tế bào phân chia vì vậy để nhiễm sắc thể nhân tạo sao chép phải có ít nhất một điểm xuất phát sao chép.
  26. Hình 9.5 Plasmid của nấm men a. YIp: không chứa ori và không thể sao chép tự động b. YEp: chứa điểm ori 1 và sao chép tự động c. YCp: chứa tâm động và phân ly trong quá trình giảm phân LEU2: gen nấm men, Ori 1: xuất phát sao chép của plasmid nấm men, Ori 2: xuất phát sao chép của vi khuẩn, AMP: gen kháng kháng sinh của vi khuẩn Vào những năm 1980, các nhà di truyền học phân tử đã đưa ra 3 yếu tố chìa khóa cho một nhiễm sắc thể: centromere, telomer và điểm xuất phát sao chép và sử dụng vật liệu từ tế bào nấm men là plasmid để cấu tạo nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo. Cho đến nay, ở eukaryote chỉ tìm được một loại plasmid duy nhất đó là plasmid vòng tròn 2 m dài khoảng 6300 cặp base có nhiều trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. Sự cải tiến plasmid này qua nhiều bước tạo thành nhiễm sắc thể nhân tạo ở nấm men, gọi là YAC (yeast artificial chromosome), có chứa các trình tự nucleotide quan trọng: ARS (autonomously replicating sequence): trình tự sao chép tương tự ori ở plasmid. CEN (centromere): trình tự của tâm động, đảm bảo sự chia đôi và đi về 2 cực của tế bào như tâm động. 2 TEL (telomere): hai trình tự duy trì hai đầu mút nhiễm sắc thể thẳng mà không bị cắt, vẫn sao chép và phân chia
  27. Hình 9.6 NST nhân tạo của nấm men 2. Những hiểu biết mới về tổ chức của các nhiễm sắc thể của nấm men Nấm men là cơ thể eukaryote đơn bào, bộ máy di truyền của nó giống với tế bào của cơ thể bậc cao. Các điểm xuất phát sao chép, tâm động và telomer được xác định là một đoạn DNA nhỏ, tự do. Tế bào nấm men đơn bội có 16 nhiễm sắc thể trong nhân, xếp thành dãy có chiều dài khoảng 235.000 đến hơn 2 triệu bp. Tất cả có cấu trúc theo cùng bản đồ chi tiết. Mỗi nhiễm sắc thể chứa một tâm động. Hai đầu nhiễm sắc thể chứa đoạn lặp lại dài theo sau trình tự telomer ngắn. Trên nhiễm sắc thể có chứa nhiều điểm xuất phát sao chép, ở cách nhau khoảng 30-40 kb. Nhiễm sắc thể nấm men cũng tạo thành các đơn vị là các nucleosome chứa lõi histon gồm H2A, H2B, H3 và H4. Điện di trên gel với trường dao động (pulse field gel electrophoresis), tách ra những nhiễm sắc thể nguyên vẹn và lập được karyotype phân tử của nhiễm sắc thể nấm men. Dựa vào karyotype có thể quan sát được các biến đổi chủ yếu trong cấu trúc nhiễm sắc thể. Qua karyotype cho thấy, nhiễm sắc thể số I dài khoảng 235 kb là nhiễm sắc thể nấm men nhỏ nhất. Nhiễm sắc thể số XII lớn nhất với kích thước khoảng 2060 – 3060 kb, sự khác nhau về kích thước của nhiễm sắc thể này do số lượng gen của rRNA lặp lại với số lượng khác nhau, thường dao động khoảng 100 – 200 bản sao ở những chủng khác nhau. Trình tự DNA của nấm men được giải mã 100% vào tháng 4/1996.
  28. Hình 9.7 Nhiễm sắc thể nấm men a. Các thành phần của NST. Mỗi sợi chứa 1 tâm động, nhiều điểm khởi sự sao chép, các đoạn gần cuối lặp lại và đoạn cuối của chuỗi DNA. b. Hệ gen của NST nấm men trên hình ảnh điện di. Bản đồ di truyền của nấm men được xác định bằng phân tích bộ bốn. Một đơn vị chức năng của tần số tái tổ hợp trong giảm phân khoảng 4400 cM, trung bình khoảng 3 kb/cM. Khoảng cách di truyền tỷ lệ với khoảng cách vật lý. Bản đồ di truyền của nấm men dài khác thường so với bản đồ di truyền của các cơ thể nấm khác. Ví dụ: Neurospora crassa có cùng hàm lượng DNA như nấm men nhưng bản đồ di truyền chỉ dài khoảng 15% bản đồ di truyền của nấm men. Số lượng gene mã hoá protein của nấm men ít hơn khoảng 6 – 10 lần số lượng gene của người. Từ khi chương trình giải mã genome nấm men hoàn thành vào năm 1996, không thể nói chính xác có bao nhiêu gene mã hoá cho protein ở nấm men. Số lượng gene mã hoá protein của nấm men khoảng 6.000 – 6.500 gene ở nấm men. 3. Những hiểu biết mới về tái bản và phiên mã của bộ gen nấm men Nấm men có thể hoàn thành một chu trình sao chép và phân chia khoảng 1,4 giờ. Xuất phát cho sao chép DNA của nấm men gồm nhiều điểm giống với oriC của E. coli. Đó là vùng giàu AT được tách ra khi có một protein khởi động gắn vào điểm kề bên. Các điểm xuất phát sao chép dài hàng ngàn đến hàng chục ngàn nucleotide. Khác với prokaryote, mỗi nhiễm sắc thể eukaryote có nhiều điểm xuất phát sao chép để quá trình sao chép genome của eukaryote có kích thước lớn hơn nhiều xảy ra một cách nhanh chóng. Có khoảng 400 điểm xuất phát sao chép phân bố trên toàn bộ 16 nhiễm sắc thể của nấm men. Sự sao chép xảy ra trực tiếp trên nhiều điểm xuất phát sao chép. Sợi mạch kép được tạo thành ở mỗi điểm xuất phát sao chép kéo dài và nối với sợi kép được tạo thành ở một điểm khác. Khi sao chép trên 2 mạch đơn hoàn thành sẽ tạo ra 2 phân tử DNA con giống hệt nhau. Sự tổng hợp DNA chỉ xảy ra ở một giai đoạn trong chu trình tế bào, đó là pha S. Ở nấm nấm men có 3 protein cần cho lắp ráp của replisome. Đó là phức hợp DNA polymerase phối hợp hoạt động ở chẽ ba sao chép. Phức hợp nhận biết điểm xuất phát (Origin recognition complex – ORC) sẽ gắn vào trình tự xuất phát của nấm men như DnaA protein của E. coli. Những phức tương tự được tìm thấy ở tất cả các eukaryote. Sự có mặt của ORC làm bổ sung thêm 2 protein khác, Cdc6 và Cdt. Cả 2 protein này và ORC làm kích hoạt helicase và những thành phần khác của replisome.
  29. Sự gắn vào của helicase được xem là sự “xác nhận” (license) cho điểm xuất phát, giúp lắp ráp replisome và bắt đầu tổng hợp DNA. Trong số các gene mã hoá protein, intron chỉ có khoảng 4-5% tất cả các gene của nấm men (276 gene chứa một intron đơn và 7 gene chứa 2 intron riêng rẽ), kích thước trung bình của intron khoảng 2000 nucleotide. Tần số thấp của intron ở nấm men có lẽ liên quan với tần số thấp của các gene giả (pseudogene) giống như intron, phổ biến ở eukaryote bậc cao. Gene giả chứa trình tự mã hoá, nhưng vì thiếu intron và promoter phiên mã nên trình tự mã hoá không được biểu hiện. Gene mã hoá protein không chỉ là những dạng gene chức năng. Genome của nấm men chứa số lớn gen tạo ra RNA không mã hoá, bao gồm các gene lặp lại mã hoá cho rRNA, 274 gene của tRNA, trong đó có 80 gene chứa nhóm intron đặc biệt, 71 RNA nhân nhỏ (smRNA) tham gia chức năng chế biến rRNA, 5 smRNA tham gia chế biến intron, một vài RNA chưa biết chức năng và 3 RNA như là các tiểu đơn vị chức năng của enzyme Rnase, endoribonuclease và telomer. 4. Những hiểu biết mới về ADN ty thể của nấm men DNA ty thể nấm men dài 4 lần hơn DNA ty thể của người và những động vật khác. Hai yếu tố trên DNA ty thể nấm men được cho là có kích thước lớn hơn so với các đối tượng khác: trình tự giữa các gen (intergenic) và intron. Trình tự dài, giàu A-T của vùng đệm “spacer” tách biệt với các gene của mtDNA. Hầu hết DNA của spacer đều được dịch mã và một số trong chúng được duy trì trên mRNA như đầu 5’ và 3’ kéo dài, không dịch mã. Yếu tố thứ hai là intron, chiếm khoảng 25% genome ty thể nấm men và nó được xem là tạo ra sự khác nhau về kích thước giữa mt DNA của nấm men và người. Hình 9.8 DNA ty thể nấm men Câu hỏi và Bài tập 1. Hãy trình bày quá trình sinh sản vô tính của tảo Chlamydomonas reihardii. 2. Hãy cho biết các kiểu dung hợp ở vi nấm.
  30. 3. Sự xác định giới tính ở vi nâm như thế nào? Cho ví dụ. 4. Các kiểu bộ bốn nào được tạo ra do dòng nấm men lưỡng bội có kiểu gene AB/ab, nếu A và B liên kết hoàn toàn? 5. Trong 100 chu trình giảm nhiễm của Neurospora theo cách bình thường có bao nhiêu bào tử được tạo thành? 6. Ý nghĩa của phân tích bộ bốn trong nghiên cứu di truyền. 7. Hãy trình bày cấu tạo nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men và ứng dụng của chúng. 8. Một chủng kháng kháng sinh của nấm men được phân lập, cho kết cặp với một chủng hoang dại nhạy cảm với kháng sinh tạo thể lưỡng bội. Sau khi sinh sản một vài thế hệ, chúng được kích thích để sinh bào tử. Kết quả thu được bộ bốn nguyên phân chứa 8 bào tử gồm 4 bào tử kháng kháng sinh và 4 bào tử nhạy cảm kháng sinh. Hãy kết luận về sự di truyền của tính kháng kháng sinh. Tài liệu Tham khảo Phạm Thành Hổ. 2000. Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Hoàng Trọng Phán. 1995. Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Cann AJ. 2001. Priciple of molecular virolory. Academic Press. London, UK. Flint SJ, Enquist LW, Krug RM, Racaniello VR, Skalka AM. 2000. Principles of Virology. Molecular Biology, Pathogenesis, and Control. ASM Press, Washington DC. Printed in the United States of America. Harlt D.L., Jones E.W. 1998. Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Hartwell et al. 2003. Genetics: From genes to genomes, Second editor. The McGraw-Hill Companies. Old RW & Primrose SB. 1989. Principles of gene manipulation. Blackwell Scientific Publication. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamine Cummings, San Francisco, United States of America.
  31. Chương 10 Di truyền Tế bào chất Mục tiêu của chương Giới thiệu DNA của các bào quan ty thể, lạp thể và sự di truyền do các gene trong tế bào chất quy đinh. Số tiết: 3 Nội dung I. Sự di truyền tế bào chất Hình 10.1 Cấu trúc tế bào 1. Sự di truyền của các gene lạp thể Trong sự thụ phấn của thực vật bậc cao, một tế bào trứng có kích thước lớn có nhiều tế bào chất phối hợp với nhân của hạt phấn không có tế bào chất ở chung quanh. Do đó hợp tử nhận được phần lớn tế bào chất của tế bào trứng. Nếu hai bố mẹ có thành phần nguyên liệu di truyền trong tế bào chất khác nhau thì thế hệ con sẽ nhận được nhiều nguyên liệu di truyền trong tế bào chất của mẹ. Do đó sẽ xảy ra sự di truyền theo thế hệ mẹ. Hiện tượng di truyền lá đốm được phát hiện rất sớm ở Mirabilis jalapa (Correns, 1908), ở Pelargonium zonale (E.Bauner, 1909). Các cây có lá đốm có thể có nguyên cành với lá trắng không có chlorophylle.
  32. Hình 10.2 Thể khảm đốm lá Thí nghiệm: Tạp giao giữa cây Mirabilis jalapa có những cành khảm trắng xanh theo các phép lai như sau: - Thụ phấn cho hoa trên cành lá trắng bằng hạt phấn của hoa trên cành lá xanh lục, cho thế hệ con những cây giống cá thể mẹ có lá trắng không có chlorophylle. Các cây này chết vì không có khả năng quang hợp - Tạp giao hoa trên cành lá xanh lục bằng hạt phấn của hoa trên cành lá trắng, tất cả thế hệ con có lá màu xanh lục bình thường. - Nếu thụ phấn các hoa của cành lá đốm bởi phấn hoa của cây xanh lục thì ở đời con có các cá thể lá trắng, lá đốm và lá xanh lục. - Nếu thụ phấn cho hoa của cành lá xanh lục với phấn hoa cây lá đốm thì ở đời con gồm toàn cá thể lá xanh lục. * Giải thích: Trong trường hợp này người ta thấy những chất cơ sở hình thành lạp thể có ở trong tế bào trứng sẽ hình thành tiền lạp thể, sau đó hình thành lục lạp. Hạt phấn không có chất cơ sở để hình thành lạp thể nên hạt phấn không thể truyền lục lạp được. Sự khác nhau giữa con cái và bố mẹ về một hoặc nhiều tính trạng khi tạp giao thuận nghịch chứng tỏ có sự tham gia của nguyên liệu di truyền ở trong tế bào chất. Sự di truyền theo hệ mẹ quy định sự thể hiện tính trạng phụ thuộc vào cá thể mẹ.
  33. Hình 10.3 Sự di truyền các gene lạp thể Ở thực vật Pelargonium zonale có trường hợp di truyền theo dòng cha. Nếu hoa của cây lá đốm được thụ phấn của cây lá xanh lục thì 30% cây lai có lá đốm, 70% lá xanh lục. Khi lai hoán đổi cha mẹ thì 70% cây lai lá đốm và 30% lá xanh lục. 2. Sự di truyền của các gene ty thể 2.1. Đặc điểm di truyền của các gene ty thể Theo Mendel, khi tạp giao những sinh vật lưỡng bội thì có sự phân ly tính trạng theo đúng định luật của Mendel vì những gene ở trong nhân đều nằm trên nhiễm sắc thể và trong giảm phân được phân chia cho các giao tử cùng với nhiễm sắc thể. Đối với những tính trạng ở trong tế bào chất không có một hệ thống phân chia nào đảm nhận nên không có sự phân ly theo một quy luật nhất định. Ở nấm men có một thể đột biến có thể hình thành những khuẩn lạc petite kích thước nhỏ hơn bình thường, đường kính chỉ bắng 1/2 - 1/2 khuẩn lạc bình thường. Các tế bào tạo nên khuẩn lạc petite có kích thước giống kích thước tế bào bình thường. Nguyên nhân tạo nên khuẩn lạc kích
  34. thước nhỏ là do các tế bào đột biến petite bị hỏng hệ thống hô hấp, tức là những enzyme oxy hóa trong ti thể là các cytochrom b, c, a, a3 và cytochrom oxydase bị phá hủy. Đây là những enzyme của màng trong ty thể. Khác với kiểu dại, các đột biến petite không thực hiện được phản ứng phosphoryl hóa để sản ra năng lượng, vì vậy tốc độ sinh trưởng và phân bào của chúng thấp hơn. Ở ty thể của nấm men (Saccharomyces cerevisiae) có 3 kiểu đột biến chủ yếu: petite, antR và mit-. Một ví dụ về ty thể là đột biến thiểu năng hô hấp ở nấm men. Vào những năm 1940, Boris Ephrussi và cs. đã mô tả các đột biến đặc biệt ở nấm men.Các đột biến này được gọi là petite, có khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với khuẩn lạc hoang dại. Theo phương thức di truyền, các đột biến petite chia làm 3 loại khác nhau: - Petite phân ly (Segregation petites): khi lai với dạng hoang dại khuẩn lạc bình thường thì tỷ lệ phân ly trong các nang bào tử (ascospore) là 1 khuẩn lạc to: 1 petite. - Petite trung tính (Neutral petites): khi lai với khuẩn lạc to thì sự phân ly trong nang bào tử chỉ có dạng khuẩn lạc to bình thường, thể hiện sự di truyền theo một cha mẹ (Uniparental) - Petite ức chế (Suppressive petites): khi lai tạo các nang bào tử, một số mọc thành khuẩn lạc to bình thường, một số khác tạo khuẩn lạc petite. Tỷ lệ giữa khuẩn lạc to và nhỏ dao động nhưng có tính đặc hiệu của chủng, một số petite ức chế chỉ tạo thế hệ con khuẩn lạc petite. Qua các petite ức chế cho thấy có sự di truyền ngoài nhân tế bào và một số có sự di truyền theo một cha mẹ. Khi lai nấm men 2 tế bào cha mẹ, hai tế bào cha mẹ kết hợp với nhau và góp tế bào chất như nhau vào tế bào con lưỡng bội. Sự di truyền của các petite trung tính và ức chế độc lập với kiểu bắt cặp thể hiện rõ sự di truyền ngoài nhân nên được gọi là petite tế bào chất. Qua nghiên cứu chúng có các đặc điểm kiểu hình như sau: - Chuỗi chuyền điện tử của ty thể bị sai hỏng ở các petite tế bào chất. Do sai hỏng này, chúng lên men để tạo ATP kém nên mọc chậm. - Không có sinh tổng hợp protein ở các petite tế bào chất. Các ty thể có hệ thống sinh tổng hợp riêng gồm tRNA, các ribosome khác với tế bào chất. - mtDNA ở các đột biến petite có biến đổi lớn. Ty thể của tất cả các Eukaryote có mtDNA riêng tuy số lượng nhỏ, nhưng khác với DNA của nhân tế bào. Ở các petite trung tính, mtDNA bị mất hoàn toàn, còn ở các petite ức chế có sự thay đổi đáng kể tỷ lệ base so với mtDNA của dạng khuẩn lạc to bình thường. Nhóm các đột biến thứ hai của nấm men là antR (antR mutants), có kiểu hình đề kháng với các kháng sinh khác nhau. Ví dụ: capR (chloramphenicol resistance) kháng chloramphenicol, eryR kháng erythromycine, spiR kháng spiromycine, parR kháng paranomycine và oliR kháng oligomycine. Các đột biến này khi lai (ví dụ eryR eryS) cho tỷ lệ phân ly không theo quy luật Mendel, giống như các petite ức chế nhưng sự di truyền có khác. Khi các tế bào cha mẹ kết hợp, sản phẩm lưỡng bội là hợp tử hai cha mẹ cytohet (cytoplasmically heterozygote). Các diploid này có thể sinh sản vô tính bằng mọc chồi.Trong nguyên phân, quá trình phân ly tế bào chất và tái tổ hợp xảy ra và các tế bào con trở thành eryS hay eryR. Nhóm đột biến quan trọng thứ ba là mit- (mit- mutants) được phát hiện sau cùng nhờ kỹ thuật chọn lọc đặc biệt. Các đột biến này, tương tự các đột biến petite ở chỗ có khuẩn lạc nhỏ và các chức năng bất thường của chuỗi chuyền điện tử, nhưng điểm khác căn bản là sinh tổng hợp protein bình thường và có khả năng hồi biến. Như vậy, các kiểu đột biến mit- là đột biến điểm. Sự di truyền cuả kiểu đột biến mit- giống với kiểu antR, có sự phân ly tế bào chất và sự di truyền theo một cha mẹ trong giảm phân.
  35. Trong thế hệ con của những tế bào thuộc khuẩn lạc bình thường, có khoảng vài phần trăm tế bào hình thành những khuẩn lạc petite. Những tế bào khuẩn lạc petite luôn luôn phát triển thành những khuẩn lạc petite. Điều đó chứng tỏ có sự thay đổi về cấu trúc di truyền. Ngoài đột biến xảy ra ở kiểu bào gene nói trên dẫn đến sinh ra những khuẩn lạc petite, còn có những khuẩn lạc petite do những gene ở trong nhân quy định. Hình 10.4 Sự di truyền các gen của ty thể trong hình thành khuẩn lạc petite Thí nghiệm: Tạp giao của một nòi nấm men kích thước khuẩn lạc bình thường với một nòi có kích thước khuẩn lạc petite, thế hệ con hình thành khuẩn lạc bình thường. Còn đối với những gene trong nhân (gene ade), thì sự phân ly ở thế hệ con về những gene này cho tỷ lệ 1:1, do chúng nằm trên NST và được chia đều cho các tế bào con. Ở đây, nguyên liệu di truyền trong tế bào sẽ được trộn lẫn nhau trong hợp tử và khi tạo thành bào tử thì mỗi bào tử đều nhận được các gene ở trong ti thể như nhau, nên chúng đều có chức năng hô hấp bình thường. Thí nghiệm cho thấy sự di truyền khuẩn lạc không theo quy luật Mendel.
  36. 2.2. Hiện tượng bất dục bào chất đực Tính bất dục do nhiều nguyên nhân, bất dục đực (không tạo phấn hoa hay tạo phấn hoa không có khả năng thụ tinh) ở thực vật có các trường hợp sau: - Do gene nhân quy định, như gene ms ở cây ngô - Do ảnh hưởng của điều kiện môi trường như độ ẩm, quang chiếu, khả năng cung cấp chất dinh dưỡng không đáp ứng đúng nhu cầu sinh lý của cây Ví dụ: gene ms ở cây ngô - Do lai xa cũng đưa đến các cơ thể lai không có hạt phấn vì NST có nguồn gốc khác nhau không thể tiếp hợp nhau trong giảm phân. Những hiện tượng bất dục này đều có ý nghĩa hạn chế chỉ có bất dục bào chất đực là có vai trò quan trọng. Đó là trường hợp bất dục của hạt phấn bắt nguồn từ tế bào chất, còn nhân thì có thể có điều chỉnh được nhờ đó có thể dùng các cây bất dục bào chất đực để phát huy ưu thế lai ở các đối tượng ngô, cao lương, củ cải đường Hình 10.5 Sơ đồ thí nghiệm chứng minh sự di truyền theo hệ mẹ của bất thụ đực Ví dụ: Xét mối quan hệ giữa kiểu gene, kiểu bào gene và kiểu hình của bắp được sử dụng trong lai một tính mà không cần khử đực ở cây mẹ STT Kiểu gene kiểu bào gene kiểu hình (hạt phấn)
  37. 1 Rfrf S (bất dục) hỏng 2 Rfrf N (hữu dục) tốt 3 RfRf hoặc Rfrf N tốt 4 RfRf hoặc Rfrf S tốt Vậy hạt phấn của ngô chỉ bị mất hoạt tính khi có yếu tố bất dục trong tế bào chất mà lại thiếu thiếu gene phục hồi hữu dục (Rf) ở trong nhân, alen của gene này là rf là gene cũng cố tính bất dục. Cây được phục hồi hữu dục RfrfS cho tự thụ phấn thì ở đời sau sẽ có 1/4 rfrf có hạt phấn hỏng. Nếu lấy bắp của dạng rfrfS thụ phấn của rfrfN, thì phấn hoa của toàn bộ đời sau sẽ bị hỏng, cây này chỉ còn bắp mang nhị cái. Đó là cách dùng phương pháp di truyền để khử cờ ngô. Khi sản xuất hạt giống, những cây này muốn có hạt thì phải thụ phấn hữu dục của những cây bình thường. Nếu muốn dùng những hạt đó để sau này trồng lại thì cây bố phải có kiểu gene RfRf và kiểu bào gene N hoặc S. Trong sản xuất giống ngô có thể dùng tổ hợp dòng thuần dạng 1 làm cây mẹ và dạng 3 hoặc dạng 4 đồng hợp tử làm cây bố. Như thế sẽ đỡ mất công khử đực ở cây mẹ và hạt lai thu được từ cây mẹ sẽ có kiểu gene Rfrf, kiểu bào gene S. Kiểu gene này đảm bảo được sự thụ phấn bình thường lúc trồng trong sản xuất. Bất thụ đực tế bào chất ở ngô liên quan đến 2 plasmid dạng thẳng S1 và S2. Chúng ở trong ty thể cùng với mtADN. Một trong những tính chất khó hiểu của plasmid này là chúng có thể thực hiện tái tổ hợp với mtADN. 3. Hiệu quả dòng mẹ lên chiều xoắn vỏ ốc Trứng và phôi chịu ảnh hưởng của môi trường cơ thể mẹ nhiều hơn cơ thể bố. Ngay cả khi bị tách khỏi cơ thể mẹ từ một giai đoạn rất sớm, chúng cũng đã nhận được tế bào chất, các chất dinh dưỡng trong trứng từ mẹ và những ảnh hưởng đặc biệt lên hoạt động của gene. Những tiềm năng nhất định của trứng được xác định trước khi thụ tinh và trong một số trường hợp chúng đã chịu ảnh hưởng của môi trường mẹ bao quanh. Sự quyết định trước như vậy do các gene của mẹ hơn là các gene của con, được gọi là hiệu ứng mẹ. Sự tồn tại của hiệu ứng mẹ nói chung được chứng minh bằng phương pháp lai thuận nghịch, khi đó kết quả phép lai thuận nghịch sẽ khác nhau. Ví dụ về hiệu quả dòng mẹ: chiều xoắn của vỏ ốc Limnaea peregra. Chiều xoắn này được xác định bởi một cặp alen. D là xoắn phải, d là xoắn trái. Các phép lai cho thấy D là trội so với d và chiều xoắn luôn luôn được xác định bởi kiểu gene của mẹ. Tiến hành phép lai thuận nghịch giữa đồng hợp tử DD xoắn phải và đồng hợp tử dd xoắn trái: Khi trứng bắt nguồn từ ốc xoắn phải thì F1 là Dd về kiểu gene và ốc có kiểu hình xoắn phải. Cho các con ốc này tự phối thì sinh ra thế hệ sau có tỉ lệ phân li về kiểu gene là 1DD : 2 Dd : 1 dd, tất cả các con ốc thậm chí cả con có kiểu gene dd đều có chiều xoắn phải. Nhưng khi mỗi con ốc của thế hệ này tự phối riêng biệt thì chỉ có những con có kiểu gene DD và Dd cho thế hệ sau xoắn phải, còn những con dd mặc dù có kiểu hình xoắn phải nhưng lại cho thế hệ sau xoắn trái. Ngược lại nếu dùng ốc dd xoắn trái làm mẹ thì F1 Dd đều xoắn trái giống mẹ. Cho các ốc con này tự phối thì tất cả ốc thế hệ sau có xoắn phải vì kiểu gene của mẹ chúng là Dd. Nếu cho mỗi con của thế hệ này tự phối thì kết quả nhận được như phép lai thuận trên, nghĩa là thế hệ sau có tỷ lệ phân ly 3 xoắn phải : 1 xoắn trái.
  38. Hình 10.6 Hiệu quả dòng mẹ lên chiều xoắn vỏ ốc Như vậy hiệu quả dòng mẹ chỉ kéo dài một thế hệ và trường hợp này không thể xem là di truyền qua tế bào chất bởi vì ở đây các đặc tính của tế bào chất đã được xác định trước bởi tác dụng của các gene trong nhân chứ không phải bởi các gene trong tế bào chất. Nói cách khác ở đây cơ chế di truyền nhiễm sắc thể làm biến đổi tế bào chất của trứng trước khi nó thụ tinh. II. Lập bản đồ ở lạp thể và ty thể 1. Lập bản đồ gene của DNA lạp thể Các gene của lục lạp ở Chlamydomonas reinhardii Sự di truyền lục lạp được nghiên cứu chi tiết hơn cả ở vi tảo Chlamydomonas reinhardii. Tế bào của vi tảo này có một lục lạp lớn với đường kính trung bình 5 m chứa 50 đến 80 bản sao của phân tử DNA vòng tròn dài 196 kb. Theo Sager (1975), ở chlamydomonas reinhardii có các đột biến trong nhóm liên kết gene của lục lạp. Các đột biến có biểu hiện kiểu hình như sau: - Mất khả năng quang hợp để mọc được ngoài ánh sáng và trong tối cần bổ sung đường khử là acetat - Nhạy cảm với nhiệt độ cao hoặc thấp - Tính đề kháng với thuốc kháng sinh hoặc có nhu cầu được cung cấp thuốc kháng sinh.
  39. Tất cả các đột biến trên có sự di truyền theo một cha mẹ, có kiểu bát cặp mt+ (có thể coi là dòng mẹ). Điều này liên quan đến sự hình thành lục lạp trong hợp tử, bằng cách nào đó, chỉ nhận DNA từ lục lạp mt+. Năm 1954, R. Sager đã nghiên cứu các đột biến kháng streptomycine ở C. reinhardii từ dạng hoang dại nhạy cảm sm-s. Một số đột biến sm-r có sự di truyền nhiễm sắc thể với sự phân ly 1 : 1. Tuy nhiên một số đột biến có sự di truyền khác thường như sau: sm-r mt+ sm-s mt- tất cả thế hệ con đều sm-r với tỷ lệ 1 mt+ : 1 mt-. sm-s mt+ sm-r mt- tất cả thế hệ con đều sm-s với tỷ lệ 1 mt+ : 1 mt- Như vậy ở đây khi có sự hoán đổi cha mẹ trong lai, thế hệ con đều có kiểu hình streptomycine của mt+. Sự truyền thụ tính trạng này được gọi là sự di truyền theo một cha mẹ. Sager coi mt+ như dòng mẹ và trường hợp trên giống như di truyền theo dòng mẹ. Các kiểu bắt cặp mt có tỷ lệ phân ly của gene trong nhân là 1 : 1. Hình 10.7 Bản đồ vòng tròn của cpDNA ở Chlamydomonas
  40. Hình 10.8 Bản đồ DNA chloroplast của Marchantia polymorpha IRA và IRB là những trình tự đảo ngược (theo K. Umesono và H. Ozeki, 1987) Trong tổ hợp lai mt+ sm-r mt- sm-s có khoảng 0,1% thế hệ hợp tử con mang cả sm-r và sm- s. Các hợp tử như vậy gọi là hợp tử hai cha mẹ cytohet (cytoplasmically heterozygote). Tần số các cytohet có thể tăng lên 40-100% ở thế hệ hợp tử con nếu mt+ được chiếu tia tử ngoại trước khi lai. Ở Chlamydomonas, các hợp tử 2 cha mẹ được dùng làm điểm xuất phát cho tất cả các nghiên cứu về sự phân ly và tái tổ hợp của các gene lục lạp. Trên cơ sơ nhiều tổ hợp lai, R. Sager đã nêu ra bản đồ vòng tròn của cpDNA với các gene tương ứng. 2. Lập bản đồ gene của DNA ty thể * Lập bản đồ bộ gene ty thể của nấm men Có c ác phương pháp khác nhau xây dựng bản đồ bộ gene ty thể: - Lập bản đồ tái tổ hợp (recombination mapping): Ở nấm men sự phân li tế bào chất và tái tổ hợp xảy ra trong quá trình mọc chồi ở cytohet lưỡng bội. Sự phân li và tái tổ hợp có thể phát hiện trực tiếp ở các dạng lưỡng bội mọc chồi hay quan sát sản phẩm giảm phân khi chồi được kích thích tạo bào tử. Ví dụ khi lai eryRspiR erySspS có thể nhận được các kiểu bộ bốn với số lượng như sau: eryRspiR 63 bộ bốn erySspiS 48 bộ bốn erySspiR 7 bộ bốn eryRspiS 1 bộ bốn Các kiểu gene erySspiR và eryRspiS là các dạng tái tổ hợp. - Lập bản đồ bằng phân tích petite: Một số kỹ thuật lập bản đồ có hiệu quả dựa trên sự phối hợp cả 3 loại đột biến petite, antR và mit-. Phần lớn các tiếp cận này dựa vào sự mất đoạn của mtDNA của các đột biến petite. Sự kết hợp các kiểu phân tích di truyền đặc biệt với kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã dẫn đến xây dựng bản đồ di truyền hoàn chỉnh của mtDNA. - Lập bản đồ bằng phân tích restriction enzyme: các restriction enzyme là công cụ hữu hiệu mới để phân tích di truyền. Nó được sử dụng không những để phân tích mtDNA của nấm men, mà cả mtDNA của bất kỳ sinh vật nào miễn chiết tách và tinh sạch được DNA di truyền. * Bản đồ mtDNA của nấm men và người Việc xây dựng bản đồ mtDNA hoàn chỉnh của nấm men và người là những thành tựu đáng kể của nghiên cứu di truyền tế bào chất. - Một số trình tự có codon khởi sự và codon kết thúc ở cuối nhưng chưa biết chức năng - mtDNA của người rất ít dư thừa
  41. Hình10.9 Bản đồ mtDNA của người (Theo Larson N.G và Clayton D.A, 1995) III. Di truyền học phân tử các bào quan 1. Các bộ gene lạp thể (cpDNA) Là bào quan có khả năng tự tái sinh ở tế bào thực vật. Sự phân chia của các bào quan này về về các tế bào con trong phân bào là không đều như sự phân chia của nhiễm sắc thể trong nguyên phân và giảm phân. Chúng có số lượng lớn và phân chia ngẫu nhiên về các tế bào con nên mỗi tế bào có thể chứa nhiều hoặc ít lục lạp. DNA của lục lạp được ký hiệu là cpDNA (Chloroplast DNA). Bộ gene này ở dạng DNA vòng tròn, thường dài hơn DNA của ty thể 8-9 lần. Trong lục lạp còn tìm thấy bộ máy sinh tổng hợp protein khác rất nhiều với hệ thống trong tế bào chất của Eukaryota nhưng giống với bộ máy sinh tổng hợp protein của Prokaryota. Mặc dù sự di truyền của lục lạp được phát hiện rất sớm, nhưng trong một thời gian dài sự hiểu biết chi tiết về các gene của lục lạp không có bước tiến đáng kể. Các nghiên cứu phân tử đã góp phần chủ yếu cho sự phân tích chi tiết các gene ở các bào quan. Ngoài các nghiên cứu ở Mirabilis jalapa và Chlamydomonas, bản đồ chi tiết cpDNA của thực vật Marchantia polymorpha đã được xây dựng. CpADN điển hình dài khoảng 120-200 kb tùy loài thực vật. Ở Marchantia, kích thước phân tử là 121 kb. Trên cpDNA của Marchantia có tất cả 136 gene gồm 4 loại mã hóa tổng hợp rRNA, 31 loại mã hóa tổng hợp tRNA và khoảng 90 gene tổng hợp protein. Trong số 90 gene mã hóa tổng hợp protein, có 20 gene mã hóa tổng hợp enzyme cho quang hợp và chuỗi chuyền điện tử. Các gene
  42. mã hóa cho các chức năng dịch mã chiếm khoảng một nữa bộ gene của lục lạp và bao gồm các protein và các RNA cần thiết cho dịch mã bên trong lục lạp. Thực tế DNA của lục lạp, ty thể và nhân tế bào có sự phối hợp chặt chẽ trong việc tạo ra các tiểu phần của những protein được sử dụng bên trong lục lạp. Ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/ oxygenase là enzyme dồi dào nhất của lục lạp. Nó xúc tác 2 phản ứng cạnh tranh nhau, cố định CO2 và bước đầu tiên của quang hô hấp (photorespiration) với sự tạo ra glycolate. Enzyme gồm 8 tiểu phần lớn LS (large unit) giống nhau và 8 tiểu phần nhỏ giống nhau được mã hóa tương ứng bởi các gene của lục lạp và nhân tế bào. Tiểu phần lớn LS mang trung tâm xúc tác, còn vai trò của các tiểu phần nhỏ chưa rõ. Gene LS nằm trên cpDNA của một số thực vật như bắp, Chlamydomonas reinhardii, thuốc lá, Euglena Trong tất cả các trường hợp, gene LS hiện diện 1 bản sao cho 1 DNA của lục lạp. Ngược lại, các gene của tiểu phần nhỏ được tìm thấy ở các trình tự DNA của nhân tế bào với số bản sao ít. 2. Các bộ gene ty thể (mtDNA) Bào quan ti thể có ở tất cả các tế bào của Eukaryote. Bộ gene của ti thể được ký hiệu là mtDNA (Mitochodrial DNA). mtDNA mã hóa cho sự tổng hợp nhiều thành phần của ti thể như hệ thống 2 loại rRNA, 22-25 loại tRNA và nhiều loại protein có trong thành phần màng bên trong ti thể. Trong khi đó, phần lớn protein của ribosom của ti thể thì do các gene ở trong nhân xác định. Bộ gene của ti thể có hai chức năng chủ yếu: - Mã hóa cho một số protein tham gia chuỗi chuyền điện tử - Mã hóa cho hệ thống sinh tổng hợp protein gồm một số protein, tất cả các tRNA và cả 2 loại rRNA. Tuy nhiên trong cả hai trường hợp, những cấu phần còn lại của hệ thống được mã hóa do các gene nhân và được dịch mã ở bào tương (cytosol) rồi chuyển vào ti thể. Như vậy, việc nghiên cứu các gene của ti thể cho thấy tế bào Eukaryote không lục lạp có ít nhất 2 hệ thống sinh tổng hợp protein độc lập tương đối nhưng luôn hợp tác chặt chẽ với nhau. Ở các Eukaryote có lục lạp thì 3 hệ thống sinh tổng hợp protein độc lập tương đối nhưng hợp tác với nhau. Cả 2 bào quan ty thể và lục lạp tham gia trực tiếp vào chuyển hóa năng lượng của tế bào. Di truyền tế bào chất là hiện tượng di truyền do các gene nằm trên nhiễm sắc thể ở ngoài nhân quy định. Câu hỏi ôn tập 1. Hãy nêu các kiểu đột biến của ty thể. 2. Trình bày chứng minh thực nghiệm về di truyền lạp thể. 3. So sánh sự giống nhau và khác nhau của mtDNA và cpDNA. 4. Nếu có hạt bắp từ dòng bất thu đực, làm sao xác định sự bất thụ do gene trong nhân hay ngoài nhân? 5. Nêu các đặc điểm riêng của di truyền ngoài nhiễm sắc thể và nêu các sai khác cơ bản so với di truyền của gene nhân. 6. Hãy phân biệt hiệu quả dòng mẹ với sự di truyền ngoài nhân. 7. Hãy phân biệt các loại đột biến petite ở nấm men. 8. Cho 2 dòng bắp bất dục đực: một dòng bất dục bào chất, một dòng bất dục do gene nhân di truyền theo Mendel. Hãy trình bày phương pháp xác định hai dòng bất dục trên. 9. Một con ốc loài Limnaea peregra có vỏ xoắn trái qua tự phối cho tất cả thế hệ sau xoắn phải. Hãy xác định genotype của con ốc này. Nếu thế hệ sau cho tự phối riêng rẽ, hỏi chiều xoắn vỏ của các con ốc thế hệ này như thế nào?
  43. 10. Tỷ lệ tiến hóa DNA của ty thể được tính bằng sự biến đổi 1 nucleotid của 1 ty thêr trong thời gian 1.500 đến 3.000 năm. DNA ty thể người có khoảng 16.500 nucleotid. Hỏi tỷ lệ biến đổi của 1 nucleotid trong 106 năm là bao nhiêu? Tài liệu Tham khảo Phạm Thành Hổ (2000). Di truyền học. NXB Giáo Dục. Lê Đình Lương, Phan Cự Nhân (1998). Cơ sở di truyền học. NXB Giáo dục. Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh. 1999. Di truyền học. NXB Giáo dục Hoàng Trọng Phán (1995). Di truyền học phân tử. Trung tâm Đào tạo Từ xa, Đại học Huế Anthony J. F. Griffiths, Susan R. Wessler, Richard C. Lewontin, William M. Gelbart, David T. Suzuki, Jeffrey H. Miller. 2004. An introduction to genetics analysis. W.H. Freeman Publishers. Harlt D.L., Jones E.W. (1998). Genetics - Principle and analysis. Jone and Bartlett Publshers, Toronto, Canada. Stansfield W.D. 1991. Schaum’s outline of theory and problems of genetics. McGraw-Hill, Companies, Inc., United States of America. Watson D.J, Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R. 2004. Molecular biology of the gene. Benjamin Cummings, San Francisco, United States of America.
  44. Chương 11 Sự điều hòa biểu hiện của gene Mục tiêu của chương Giới thiệu về các quá trình điều hòa trong cơ thể sinh vật. Sự điều hòa của gen được thực hiện ở các mức khác nhau. Hoạt động theo kiểu operon đặc trưng cho điều hòa ở Prokaryote. Ở Eukaryote có các cơ chế điều hòa phức tạp. Số tiết: 3 Nội dung I. Các nguyên lý điều hòa và mức độ kiểm soát phiên mã Không phải tất cả các gene đều có biểu hiện liên tục. Mức độ biểu hiện của gene khác nhau giữa các tế bào hoặc khác nhau theo giai đoạn trong chu trình tế bào. Chẳng hạn gene mã hóa cho hemoglobin được biểu hiện ở mức độ cao chỉ ở trong tế bào tiền thể (precursor) của tế bào máu. Hoạt tính của gene khác nhau theo chức năng tế bào. Ở động vật có xương sống như chuột, chứa khoảng 200 loại tế bào được phân hóa chức năng khác nhau. Tất cả các tế bào đều chứa cùng thông tin di truyền, những tế bào khác nhau chỉ ở những gene hoạt động. Trong nhiều trường hợp, hoạt tính của gene được điều hòa ở mức độ phiên mã, cả qua những tín hiệu bắt đầu bên trong tế bào và cả phản ứng với những điều kiện bên ngoài. Tuy nhiên thông tin di truyền được điều hòa theo những cách khác nhau. Các bước điều khiển hoạt động gene bao gồm: - Cấu trúc lại DNA, trong đó những thay đổi biểu hiện gene phụ thuộc vào vị trí trình tự DNA trong genome. - Điều hòa phiên mã trong tổng hợp bản phiên mã RNA bằng sự điều khiển sự mở đầu và sự kết thúc - Quá trình chế biến RNA hoặc điều hòa qua quá trình cắt nối trên RNA (RNA splicing) - Điều hòa dịch mã quá trình tổng hợp chuỗi polypeptid
  45. Hình 11.1 Mô hình điều hòa âm tính (negative regulation) và điều hòa dương tính (positive regulation). A. Trong điều hòa âm tính, protein ức chế bám vào phân tử DNA, ngăn cản phiên mã B. Trong điều hòa dương tính, sự bám vào của protein hoạt hóa phiên mã, kích thích phiên mã. - Sự bền vững của mRNA Có sự khác nhau đáng kể trong sự điều hòa biểu hiện của các gene ở eukaryote và prokaryote. Prokaryote là những cơ thể đơn bào sống tự do, sinh trưởng và phân chia trong điều kiện thích hợp và được cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng. Do đó hoạt động của các gene được điều hòa do nhu cầu của tế bào khi cần thiết.
  46. Khác với prokaryote, eukaryote là những cơ thể đa bào. Trong cơ thể đang phát triển, một tế bào không chỉ sinh trưởng và phân chia mà tế bào thế hệ sau trải qua những thay đổi quan trọng về hình thái và hóa sinh và duy trì trạng thái biến đổi của nó. Hơn nữa trong quá trình phát triển phôi, tế bào eukaryote ít chịu ảnh hưởng của môi trường hơn so với vi khuẩn. Cuối cùng, ở cơ thể trưởng thành, sự sinh trưởng và phân chia tế bào của hầu hết các loại tế bào bị ngừng, mỗi tế bào chỉ phải duy trì các tính chất riêng biệt của nó. II. Điều hòa hoạt động gene ở prokaryote Ở vi khuẩn và phage, hoạt tính đóng mở gene thường được điều khiển qua phiên mã tổng hợp các mRNA xảy ra khi sản phẩm của gene được cần đến. Cơ chế phân tử cho mỗi mô hình điều hòa hoàn toàn khác nhau, nhưng thường theo một trong hai kiểu chính: điều hòa âm tính và điều hòa dương tính (Hình 11.1). Trong hệ thống điều hòa âm tính (Hình 11.1A) một protein ức chế có mặt trong tế bào, ngăn cản sự phiên mã. Trong hệ thống cảm ứng được điều hòa âm tính, protein ức chế hoạt động làm ngăn cản phiên mã. Nhân tố cảm ứng kìm hãm chất ức chế, cho phép bắt đầu phiên mã. Trong hệ thống ức chế, protein aporepressor gắn với co-repressor tạo ra chất ức chế có hoạt tính, làm ngăn cản phiên mã. Ngược lại trong hệ thống điều hòa dương tính (Hình 11.1B), sự tổng hợp mRNA xảy ra nều protein điều hòa gắn vào một vùng của gene làm hoạt hóa phiên mã. Những protein này được xem là những nhân tố hoạt hóa phiên mã. Điều hòa âm tính và dương tính không loại trừ lẫn nhau. Một vài hệ thống là cả điều hòa âm tính và dương tính, sử dụng cả 2 hệ thống điều hòa để phản ứng với các điều kiện khác nhau trong tế bào. Điều hòa âm tính là phổ biến cho prokaryote, trong khi điều hòa dương tính lại phổ biến cho eukaryote. 1. Cấu trúc của operon Mô hình operon của điều hòa phiên mã Cơ chế điều hòa di truyền của hệ thống lac (lac system) được giải thích bằng mô hình operon của Francois Jacob và Jacque Monod (1960) (Hình 11.2). Hệ thống sử dụng lactose gồm 2 loại thành phần: gene cấu trúc mã hóa protein cần thiết cho sự vận chuyển và chuyển hóa lactose và các yếu tố điều hòa (gene ức chế lacI, promotor lac P và operator lacO). Sản phẩm gene cấu trúc được mã hóa bởi một phân tử mRNA đa gene (polycistronic). Gene Z mã hóa cho enzyme - galactosidase (thủy phân đường lactose thành galactose và glucose), gene Y mã hóa cho enzyme permease (cần cho vận chuyển lactose qua màng), gene A mã hóa cho enzyme transacetylase (vai trò chuyển hóa lactose chưa rõ). Đột biến promotor (lacP-) làm mất khả năng tổng hợp mRNA. Sản phẩm của gene lacI là chất ức chế, nó bám vào trình tự các base của DNA cấu tạo operator. Chất ức chế bám vào operator, ngăn cản sự khởi đầu phiên mã mRNA nhờ RNA polymerase. Chất cảm ứng (lactose) kích thích sự sinh tổng hợp mRNA bằng cách kết hợp và làm bất hoạt chất ức chế. Sự có mặt của chất cảm ứng làm chất ức chế không gắn vào operator, promotor cho phép khởi đầu tổng hợp mRNA. Khi môi trường có lactose, lactose được chuyển vào tế bào nhờ permease. Khi vào trong tế bào một số lactose (liên kết  -1,4) được chuyển thành allolactose (liên kết -1,6) nhờ - galactosidase. Allolactose là chất cảm ứng, nó gắn vào protein kìm hãm, gây biến đổi cấu hình tạo phức hợp allolactose-repressor. Phức hợp này mất khả năng gắn vào operator. Lúc này operon mở ra, RNA polymerase bắt đầu phiên mã từ gene cấu trúc.
  47. Khi môi trường không có lactose, protein ức chế có hoạt tính gắn vào operator, làm sự phiên mã của tất cả các gene cấu trúc của operon lac bị dừng. Sự điều hòa của operon yêu cầu promotor nằm chồng lên một phần hoặc kề sát bên promotor của gene cấu trúc, vì nó gắn với chất ức chế ngăn cản phiên mã.
  48. Hình 11.2. A Bản đồ của operon lac B. Sơ đồ của operon lac ở trạng thái bị kìm hãm C. Sơ đồ của operon lac ở trạng thái được kích thích 2. Điều hòa dương tính operon lactose Chức năng của -galactosidase trong chuyển hóa lactose để tạo ra glucose bằng cách cắt lactose (một sản phẩm cắt khác là galactose cũng có thể được chuyển thành glucose nhờ enzyme của operon galactose). Nếu cả glucose và lactose có mặt trong môi trường sinh trưởng, không cần hoạt động của operon lac. Trong môi trường có glucose, enzyme -galactosidase không được tạo thành cho đến khi glucose trong môi trường được sử sụng hết. Sự có mặt của glucose làm mRNA không được tổng hợp, do đó không có sự tổng hợp -galactosidase, vì sự thêm vào nhân tố cảm ứng làm bất hoạt chất kìm hãm. Một yếu tố khác cần cho sự bắt đầu tổng hợp mRNA, hoạt tính của yếu tố này được điều hòa bởi nồng độ glucose. Glucose có ảnh hưởng ức chế gián tiếp lên sự biểu hiện của operon lac. Những phân tử nhỏ adenosine monophosphate vòng (cAMP) phân bố rộng rãi trong mô động vật và trong các cơ thể eukaryote đa bào, có vai trò quan trọng làm chất trung gian hoạt động hormone. Chất này cũng có trong tế bào E. coli và nhiều tế bào vi khuẩn khác với chức năng khác nhau. cAMP được tổng hợp bởi enzyme adenyl cyclase, và nồng độ của cAMP được điều hòa gián tiếp qua trao đổi chất glucose. Khi vi khuẩn sinh trưởng ở môi trường chứa glucose, hàm lượng cAMP rất thấp. Trong môi trường chứa glycerol hoặc các nguồn carbon không thể đi vào con đường hóa sinh được sử dụng để trao đổi chất glucose (con đường glycolytic) hoặc khi vi khuẩn bị đói nguồn năng lượng, nồng độ cAMP cao. Hàm lượng glucose giúp điều hòa nồng độ cAMP trong tế bào và cAMP lại điều hòa hoạt tính của operon lac. Hình 11.3 Cấu trúc của cAMP E. coli chứa protein nhận cAMP hay CRP (cyclic AMP receptor protein) còn được gọi là protein hoạt hóa dị hóa CAP (catabolite activator protein), được mã hóa bởi gene crp. Đột biến ở gene crp và gene adenyl cyclase làm ngăn cản sự tổng hợp của mRNA lac. Điều này cho thấy chức năng của CRP và cAMP cần thiết cho tổng hợp mRNA lac. CRP và cAMP gắn vào một vị trí khác tạo phức hợp cAMP-CRP được biểu hiện. Phức hợp này là một yếu tố điều hòa hoạt hóa ở hệ thống lac.
  49. Hình 11.4 Bốn trạng thái điều hòa của operon lac Nhu cầu về cAMP-CRP phụ thuộc vào hệ thống ức chế lac, vì đột biến crp và adenyl cyclase không thể tạo mRNA lac ngay cả khi có mặt đột biến ở gene điều hòa (lacI-) và gene chỉ huy (lacO-). Sở dĩ như vậy là vì phức hợp cAMP-CRP phải gắn vào trình tự base trên DNA ở vùng promotor để xảy ra phiên mã (Hình 11.4). Khác với chất ức chế trong điều hòa âm tính, phức hợp cAMP-CRP là chất điều hòa dương tính. Các thí nghiệm ở điều kiện in vitro cho thấy: mRNA lac được tổng hợp chỉ khi có cAMP vòng và không có chất ức chế. Khi vắng mặt phức hợp cAMP-CRP, RNA polymerase chỉ bám lỏng lẽo vào promotor. Vì vậy hiếm khi dẫn đến phiên mã vì không có sự tương tác đúng giữa RNA polymerase và promotor. Nhưng RNA polymerase được kích thích gắn vào promotor khi cAMP-CRP được gắn vào DNA. Những kết quả này giải thích chức năng lactose và glucose cùng nhau tham gia điều hòa phiên mã operon lac như thế nào. 3. Điều hòa âm tính operon tryptophan
  50. Hình 11.5 Điều hòa của operon trp ở E. coli A. Protein aporepressor không bám được vào operator, phiên mã xảy ra. B. Khi có đủ tryptophan, phức hợp aporepressor và tryptophan làm chất ức chế hoạt động gắn được vào operator, sự phiên mã bị kìm hãm. Operon tryptophan (trp) của E.coli chứa các gene cấu trúc mã hóa cho các enzyme tông hợp amino acid tryptophan. Operon này được điều hòa theo cách sau: khi tryptophan có mặt đầy đủ trong môi trường sinh trưởng, sự phiên mã của operon bị ức chế. Khi sự cung cấp tryptophan bị thiếu, sự phiên mã xảy ra. Sự điều hòa của operon lactose tương tự với operon lactose, vì sự tổng hợp mRNA được điều hòa âm tính nhờ chất ức chế. Tuy nhiên, khác với điều hòa ở operon lac, tryptophan hoạt động như chất đồng kìm hãm, kích thích chất ức chế gắn vào operator ngừng sự tổng hợp. Operon tryptophan hoạt động theo kiểu ức chế, điều hòa âm tính. Tryptophan được tổng hợp qua 5 giai đoạn, mỗi giai đoạn có sự xúc tác của một enzyme đặc biệt. Các gene mã hóa cho các enzyme này nằm kề nhau trên nhiễm sắc thể của E.coli Đó là các gene trpE, trpD, trpC, trpB, trpA. Các enzyme được dịch mã từ một phân tử mRNA đa gene. Vùng mã hóa gene E được dịch mã trước tiên. Phía trước trpE về đầu 5' có promotor, operator và 2 vùng xếp lần lượt là leader (trpL) và đoạn kìm hãm phiên mã attenuator (trpa, không phải là trpA). Gene ức chế trpR nằm xa operon, tổng hợp protein aporepressor, là chất kìm hãm mà riêng nó không có hoạt tính. Khi tryptophan dư thừa, nó kết hợp với aporepressor tạo chất kìm hãm có
  51. hoạt tính, gắn vào operator của operon tryptophan làm dừng phiên mã các gene cấu trúc. Khi nồng độ tryptophan thấp, nó tách khỏi phức hợp kìm hãm và aporepressor mất hoạt tính. Lúc này operator mở ra, RNA polymerase dịch mã 5 gene cấu trúc để tổng hợp 5 enzyme tạo tryptophan. (Hình 11.5.). 4. Phiên mã dở (Attenuation) Kiểu điều hòa thứ hai được phát hiện ở operon tryptophan được gọi là attenuation. Nó dùng sử dịch mã để điều khiển sự phiên mã. Khi có mặt tryptophan nội bào, ngay cả với nồng độ thấp, sự dịch mã một phần vùng leader của mRNA ngay khi vừa được tổng hợp, kết quả làm dừng sự phiên mã trước khi gene cấu trúc đầu tiên của operon được sao chép. Attenuation là kết quả sự tương tác giữa các trình tự DNA trong vùng leader của bản phiên mã trp. Ở tế bào kiểu dại, sự phiên mã operon trp thường được bắt đầu. Tuy nhiên khi có mắt một lượng nhỏ tryptophan, hầu hết phân tử mRNA kết thúc ở vùng 28 base đặc biệt ở trong trình tự leader. Kết quả của sự kết thúc sớm này tạo phân tử mRNA chứa 140 nucleotide chấm dứt một đoạn ngắn của các gene mã hóa cho các enzyme trp. Vùng 28 base xảy ra sự kết thúc được gọi attenuator. Trình tự base của vùng này thường có các tính chất điểm kết thúc, gồm dạng đoạn và vòng (stem-loop) trên mRNA theo sau là trình tự của 8 uridine. Trình tự leader có các đặc điểm: - Một vùng có codon AUG và phía sau là codon kết thúc UGA, mã hóa cho một polypeptide chứa 14 amino acid được gọi là leader polypeptide. - Hai codon tryptophan ở vị trí 10 và 11 trên mRNA của leader polypeptide. Trình tự lặp lại ngắn này có ý nghĩa trọng điều hòa. - Bốn đoạn của RNA leader là vùng 1, 2, 3 và 4 tạo thành do khả năng kết cặp của các base với nhau. Các base ở vùng 1 kết cặp với vùng 2, vùng 3 kết cặp với vùng 4 (Hình 11.6).
  52. Hình 11.6 A. Sơ đồ phiên mã của leader trp B. Chi tiết cấu trúc của 2 codon trp ở vòng 1-2 Khi sự kết cặp xảy ra ở dạng này, sự phiên mã kết thúc ở đoạn đi qua uridine phía trước nucleotide 140. Kiểu kết cặp này xảy ra ở mRNA leader được tinh sạch. - Một kiểu kết cặp biến đổi có thể xảy ra, trong đó các base vùng 2 kết cặp với vùng 3 nhờ các cặp base ở 2 vùng này gần như bổ sung nhau (Hình 11.6B). Qua mô hình kết cặp base biến đổi này (3-4 hoặc 2-3), sự tổ chức trình tự mRNA có thể điều hòa phiên mã qua dịch mã của leader polypeptide (Hình 11.7). Khi vùng leader được phiên mã, sự dịch mã leader polypeptid cũng bắt đầu. Vì có 2 codon trptophan trong trình tự mã hóa, nên sự dịch mã nhạy cảm với số lượng tRNAtrp đưa vào. Nếu môi trường cung cấp đầy đủ tryptophan, ribosome trượt qua codon tryptophan và đi vào vùng 2 (Hình 11.7B). Sự có mặt của ribosome loại bỏ khả năng kết cặp của vùng khoảng 10 base ở mỗi phía của codon đang dịch mã. Sự có mặt của ribosome ở vùng 2 ngăn cản nó kết cặp với vùng 3. Trong trường hợp này vùng 3 kết cặp với vùng 4, tạo ra điểm kết thúc phiên mã. Sự phiên mã kết thúc khi qua các uridine nằm phía sau vùng 4.
  53. Hình 11.7 Phiên mã dở (attenuation) của operon trp ở E. coli A. Ở mRNA tự do có sự kết cặp base giữa 1-2 và 3-4 B. Ở nồng độ cao của tryptophan, ribosome tiến đến vùng 2 và sự kết cặp 3-4 làm kết thúc phiên mã C. Ở nồng độ tryptophan thấp, ribosome ở vùng codon trp cho phép kết cặp 2-3 và phiên mã không bị kết thúc sau khi qua vùng 4 Khi số lượng tRNAtrp không đủ, sự dịch mã leader polypeptide bị dừng lại đột ngột ở các codon tryptophan. Sự dùng lại này ngăn cản ribosome tiến vào vùng 2, vì vậy vùng 2 được tự do sẽ kết cặp với vùng 3 làm cản trở sự hình thành cấu trúc kết thúc. Vì vậy phân tử trp mRNA hoàn chỉnh được tạo thành, chứa cả trình tự mã hóa cho gene cấu trúc. Tóm lại, attenuation là cơ chế điều hòa tinh tế trên cơ sở điều hòa âm tính: Khi tRNAtrp đến đủ cung cấp cho sự dịch mã leader polypeptide, sự phiên mã bị dừng, các trp enzyme không được tổng hợp. Khi nồng độ tRNAtrp quá thấp, sự phiên mã xảy ra cho đến hết, các trp enzyme được tạo nên. Nhiều operon chịu trách nhiệm tổng hợp các amino acid khác (như operon leucine, isoleucine, phenylalanine, histidine) cũng được điều hòa nhờ attenuator với chức năng tạo ra vùng kết cặp biến đổi ở bản phiên mã. Ở operon histidine vùng mã hóa của leader polypeptide chứa 7 codon histidine kế nhau. Ở operon phenylalanine vùng mã hóa cho leader polypeptide chứa 7 codon phenylalanin chia 3 nhóm. Điều hòa kiểu attenuation không thể xảy ra ở eukaryote vì ở eukaryote sự phiên mã và dịch mã không xảy ra đồng thời. Sự phiên mã xảy ra trong nhân, còn sự dịch mã xảy ra ở tế bào chất. Điều hòa ở operon lac và operon trp là ví dụ về một trong số các cơ chế quan trọng điều hòa hoạt động gene ở mức phiên mã của prokaryote. III. Điều hòa biểu hiện gene ở eukaryote Điều hòa hoạt động gene ở eukaryote phức tạp hơn nhiều so với prokaryote. Liên quan đến điều hòa, giữa prokaryote và eukaryote có một số điểm khác biệt: - Ở eukaryote thường chỉ có một chuỗi polypeptide đơn được dịch mã từ một phân tử mRNA hoàn chỉnh. mRNA đa gene (polycistronic) chỉ có ở prokaryote, không có ở eukaryote.
  54. - DNA của eukaryote gắn với protein histone tạo sợi chromatin, và gắn với protein phi histone. Chỉ có một đoạn nhỏ DNA để trần. Ở prokaryote, một vài protein có mặt trên nhiễm sắc thể bị gấp nếp, còn lại hầu hết DNA trần. - Một đoạn DNA quan trọng của eukaryote chứa trình tự nucleotide lặp lại trung bình hoặc lặp lại cao. Một vài trình tự lặp lại được xếp nối tiếp thành các bản sao tiếp nối nhau, một vài trình tự khác lại không xếp nối tiếp. Vi khuẩn chứa đoạn DNA lặp lại nhỏ khác các gene của rRNA và tRNA nhân đoạn và một vài yếu tố di động. Một đoạn lớn DNA của eukaryote không được dịch mã. Hầu hết trình tự nucleotide không được mã hóa thành protein. Các eukaryote đơn bào, chẳng hạn nấm men là trường hợp ngoại lệ đối với tính chất này. Một vài gene eukaryote được biểu hiện và điều hòa nhờ cơ chế cấu trúc lại những đoạn DNA nhất định theo một phương thức được điều khiển và để tăng số lượng các gene đặc biệt này khi cần thiết. Các gene eukaryote là gián đoạn được phân thành các exon và intron. Các intron được cắt bỏ trong quá trình chế biến bản phiên mã RNA trước khi bắt đầu dịch mã. Ở eukaryote, mRNA được tổng hợp trong nhân và được chuyển qua màng nhân, vào tế bào chất mới được sử dụng. Tế bào vi khuẩn không có nhân được tách biệt với tế bào chất. 1. Sự biến đổi DNA Một số gene của eukaryote được điều hòa bằng sự biến đổi DNA. Chẳng hạn, những trình tự nhất định có thể được khuyếch đại hoặc cấu trúc lại trong genome hoặc các base có thể bị biến đổi về mặt hóa học. Một vài biến đổi được phục hồi, những biến đổi khác lại bền vững. Tuy nhiên những thay đổi bền vững này thường xảy ra ở tế bào sinh dưỡng, vì vậy chúng không được truyền lại cho thế hệ sau qua dòng giao tử. 2. Các promoter Tương tự vi khuẩn, các promoter của eukaryote cũng nằm phía trước điểm xuất phát trên mRNA và có những trình tự được bảo tồn trong tiến hóa. Hộp TATA định hướng cho mRNA bắt đầu phiên mã nằm ở phía trước điểm bắt đầu phiên mã khoảng 30 bp ở động vật có vú và 60 đến 120 bp ở nấm men. Hộp TATA hoạt động có hiệu quả cùng với 2 trình tự tương ứng ở phía trước khoảng 40 bp là CCAAT và 110 bp là trình tự giàu GC. Sự thay đổi hộp TATA làm giảm tốc độ phiên mã. Hiệu quả của tốc độ phiên mã được đo bằng sự thay đổi của từng base trong promoter * Sự cấu trúc lại DNA theo chương trình (programmed DNA rearrangement) Sự cấu trúc lại trình tự DNA trong genome là cơ chế bất thường nhưng quan trọng, nhờ đó một số gene được điều hòa. 3. Những trình tự tăng cường phiên mã (Enhancer) Các thụ thể của hormone và những protein hoạt hóa phiên mã khắc gắn với trình tự DNA đặc biệt được biết là enhancer. Trình tự enhancer khá ngắn (thường chỉ 20 cặp base) được tìm thấy ở các vị trí khác nhau quanh gene được điều hòa. Hầu hết các enhancer nằm ở phía dưới điểm bắt đầu phiên mã (đôi khi cách xa nhiều kb). Những enhancer khác là các intron nằm trong vùng mã hóa và một vài enhancer thậm chí nằm ở đầu 3' của gene.
  55. Enhancer là thành phần nhạy cảm của tổ chức gene ở eukaryote vì chúng cho phép gene phiên mã chỉ khi nào có nhân tố hoạt hóa phiên mã đúng. Một vài enhancer phản ứng với các phân tử bên ngoài tế bào, chẳng hạn hormone steroid tạo phức hợp receptor-hormone. Những enhancer khác phản ứng với các phân tử được tạo thành ở bên trong tế bào (chẳng hạn trong suốt quá trình phát triển). Những enhancer này cho phép các gene dưới sự điều khiển của nó tham gia vào biệt hóa tế bào (diffrentiation) hoặc được biểu hiện theo cách đặc biệt ở trong mô. Nhiều gene ở dưới sự kiểm soát của các enhancer khác nhau, vì vậy chúng có thể phản ứng với nhiều tín hiệu phân tử khác nhau cả bên trong và bên ngoài. Hình 11.8 Sơ đồ tổ chức các gene điển hình ở Eukaryote bậc cao Qua sơ đồ ở hình 11.8 cho thấy nhiều yếu tố di truyền được tìm thấy ở trong gene của eukaryote điển hình. Phức hợp phiên mã bám vào promotor bắt đầu tổng hợp mRNA. Vùng mã hóa của gene (exon) bị gián đoạn bởi một hoặc nhiều trình tự gián đoạn (intron), các trình tự này sẽ bị loại bỏ trong quá trình chế biến RNA. Sự phiên mã được điều hòa bởi các yếu tố enhancer, các yếu tố này phản ứng với các phân tử khác nhau có vai trò là tín hiệu cảm ứng. Enhancer có mặt ở cả phía trên và phía dưới promoter. Một vài enhancer có nhiều bản sao. Nhiều enhancer kích thích phiên mã bằng cách hình thành vòng DNA (DNA looping), liên quan đến sự tương tác giữa các vùng cách xa nhau có liên quan dọc sợi DNA. Các nhân tố cần thiết cho phiên mã bao gồm protein hoạt hóa phiên mã, nó tương tác với ít nhất một yếu tố protein có trong một hoặc nhiều phức hợp protein lớn, nhiều yếu tố. Yếu tố protein trong phức hợp này được biết như là yếu tố phiên mã chung (general transcription factors), vì chúng gắn liền với sự phiên mã của nhiều gene khác nhau. Nhân tố phiên mã chung ở eukaryote có tính bảo tồn cao trong tiến hóa. Một trong số các phức hợp này là TFIID, gồm protein gắn với hộp TATA (TATA- box-binding protein) TBP gắn với promotor trong vùng TATA box. Ngoài TBP, phức hợp TFIID cũng gồm một số protein khác được gọi là những nhân tố gắn liền với TBP (TBP-associated factor) = TAFs. Chúng hoạt động như các chất trung gian qua đó ảnh hưởng của nhân tố hoạt hóa phiên mã được truyền đi. Sự phiên mã cũng yêu cầu một holoenzyme là RNA polymerase, chứa pol III tổ hợp ít nhất với 9 yếu tố protein khác. Ở nấm men, nhứng yếu tố này chứa nhân tố phiên mã TFIIB, TFIIF và TFIIH cũng như những protein khác. 4. Trình tự bất hoạt gene (gene silencing) Trình tự bất hoạt gene có thể nằm trước hoặc sau gene được điều hòa khoảng vài trăm cặp base. Chúng làm ngừng quá trình phiên mã bằng cách biến đổi histon và DNA. 5. Promoter chọn lọc (alternative promoter) Một vài gene eukaryote có hai hoặc nhiều promoter hoạt động trong những tế bào khác nhau. Những promoter khác nhau này dẫn đến những bản phiên mã khác nhau chứa cùng vùng mã hóa protein. Ví dụ ở Drosophila, gene mã hóa cho alcohol dehydrogenase, cấu tạo của nó trong
  56. genome có ba vùng mã hóa protein bị gián đoạn bởi hai intron. Sự phiên mã ở ấu trùng sử dụng một promoter khác với sự phiên mã ở ruồi trưởng thành. Bản phiên mã ở ruồi giấm trưởng thành có trình tự dẫn đầu 5' dài hơn. Nhưng hầu hết trình tự này bị loại bỏ trong splicing. Promoter biến đổi làm sự điều hòa phiên mã có thể không phụ thuộc vào ấu trùng hay ruồi giấm trưởng thành. 6. Splicing chọn lọc Cùng promoter được sử dụng để phiên mã một gene, ở các loại tế bào khác nhau có thể tạo sản phẩm có số lượng khác nhau hoặc tạo ra những protein khác nhau. Điều này là do cùng một bản phiên mã có thể có quá trình chế biến ở các loại tế bào là khác nhau. Hình 11.9 Sản phẩm các phân tử mRNA amylase khác nhau do quá trình splicing khác nhau xảy ra ở tế bào tuyến nước bọt và tế bào gan của chuột Sự tổng hợp -amylase ở chuột, những phân tử mRNA khác nhau được tạo ra từ cùng một gene vì những phần intron khác nhau bị loại bỏ trong quá trình chế biến RNA. Tuyến nước bọt của chuột tạo nhiều enzyme hơn gan mặc dù cùng một trình tự mã hóa được phiên mã. Ở mỗi loại tế bào, cùng một bản phiên mã sơ cấp (primary transcript) được tổng hợp, nhưng có hai quá trình chế biến khác nhau (Hình 11.9). Trình tự mã hóa bắt đầu 50 bp bên trong exon 2 được tạo thành nhờ nối với exon 3 và những exon tiếp theo. Ở tuyến nước bọt bản phiên mã sơ cấp được chế biến để exon S nối với exon 2 (exon L bị loại đi như là intron 1 và 2). Ở gan exon L nối với exon 2, exon S bị loại đi cùng với intron 1. Exon S và exon L trở thành những trình tự 5' biến đổi của amylase mRNA và mRNA này được dịch mã ở những tỷ lệ khác nhau. Câu hỏi và Bài tập 1. Sự biểu hiện gene ở prokaryote và eukaryote có đặc điểm gì? 2. Hãy nêu các kiểu điều hòa chủ yếu. 3. Trình bày cơ chế hoạt động của operon lactose.