Sinh học - Chương 4: Di truyền tế bào xoma và kỹ thuật di truyền thực vật

Nội dung text: Sinh học - Chương 4: Di truyền tế bào xoma và kỹ thuật di truyền thực vật

1. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 4.1. Các khái niệm và đặc điểm tiếp cận nghiên cứu di truyền tế bào xoma thực vật 4.1.1. Khái niệm đột biến xoma và biến dị dòng tế bào xoma - Đột biến ở tế bào xoma tồn tại ở hai trạng thái: tiềm ẩn và thể hiện tính trạng. -Dòng tế bào xoma là khối tế bào xoma đưa vào môi trường nuôi cấy. Những tế bào biến đổi có thể phân chia tạo nên một khối tế bào => cây. Cây có thể có những biến đổi khác so với dạng ban đầu => biến dị dòng tế bào xoma. - Dòng tế bào xoma - có sẵn => tách dòng => cây biến đổi CHƢƠNG 4 - Trong quá trình nuôi cấy => biến đổi => DI TRUYỀN TẾ BÀO XOMA VÀ KỸ THUẬT DI TRUYỀN cây tái sinh biến đổi THỰC VẬT 4.2. Biến dị dòng tế bào xoma 4.1.2. Phân lập các đột biến xoma 4.2.1. Nguyên nhân và các yếu tố ảnh hưởng tới sự xuất hiện các biến dị dòng tế bào xoma - Phân lập các đột biến chồi a. Nguyên nhân - Các biến đổi xuất hiện khi xử lý phóng xạ - Tính không đồng nhất về di truyền của các tế bào xoma ở vật - Phân lập bằng nhân vô tính liệu ban đầu đưa vào nuôi cấy. - Các yếu tố của quá trình nuôi cấy có thể trực tiếp gây ra các biến dị di truyền và các tân biến. 4.2.2. Một số đặc điểm trong ứng dụng phương pháp chọn lọc b. Các yếu tố ảnh hưởng tới sự xuất hiện các biến dị dòng ở hệ thống in vitro xoma - Mức độ thể hiện các biến dị dòng tế bào phụ thuộc vào kiểu Mỗi tế bào sống tách ra từ cơ thể, khi ở điều kiện thích gen, vào nguồn gốc mô nuôi dùng để tạo calus hay dùng để hợp đều có khả năng phân chia và phát triển thành cơ thể hoàn tách tế bào trần. chỉnh (tính toàn năng của tế bào). - Điều kiện nuôi cấy và tái sinh cây có ảnh hưởng rất lớn tới Quá trình nuôi cấy invitro ở thực vật gồm 3 công đoàn: biến dị dòng tế bào. + Tạo các vật liệu nuôi cấy: các tổ chức mô nuôi khác nhau - Các dạng phytohoocmon khác nhau và chế độ nuôi cấy có được vô trùng, các tế bào đơn, tế bào trần thể gây nên những biến đổi khác nhau ở quần thể tế bào nuôi. + Quá trình nuôi cấy: sử dụng các môi trường nuôi cấy khác nhau, điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, quang chu kỳ để thu các khối tế bào, các phôi xoma, chồi bất định, cây non + Các chồi được tách ra, cây non được nuôi dưỡng, đưa ra bầu đất để thu cây trưởng thành. 1
2. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 4.2.3. Các biến dị dòng tế bào xoma khi nuôi cấy tế bào trần dung hợp + Phương pháp cơ học: - Tế bào trần: là tế bào đã được phân huỷ vỏ cứng (thành tế bào thực vật) bằng: + Phương pháp cơ học  Cho miếng mô vào dung dịch ưu trương để khối tế bào chất + Phương pháp enzym cùng màng sinh chất tách khỏi vỏ xenlulose, sử dụng kim nhọn và dao phẫu thuật để tách cắt các mô cùng lớp vỏ.  Sau đó ngâm vào môi trường cấy pha loãng, TBC phồng to và tách khỏi vỏ xenlulose => tế bào trần. + Dung hợp tế bào trần + Phương pháp enzyme: - Các phương pháp dung hợp tế bào trần: + Sử dụng hoá chất polyethylenglycol (PEG). PEG có tác dụng Enzyme: + Pectinase : phá huỷ pectin tạo lực hút các tế bào trần + Xenlulase phá huỷ xenlulose + Sử dụng xung điện + Hemixenlulase: phá huỷ hemixenlulose -Dung hợp tế bào trần có thể xảy ra rất nhiều trường hợp khác Tế bào trần được thu nhận bằng máy li tâm, sau đó được rửa nhau như: sạch. + Nhân lai, bào chất thuộc về một trong hai bố mẹ + Nhân lai, bào chất lai + Nhân thuộc về một trong hai bố mẹ, bào chất lai Hybrid Cybrid N C¸c trêng hîp trong lai soma 2
3. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 4.3. Tạo dòng đồng hợp tử và đa dạng di truyền các quần 4.3.2. Đặc điểm và khả năng ứng dụng của các cây đơn bội thể chọn lọc a. Đặc điểm: 4.3.1. Các phương pháp tạo cây đơn bội - Xuất hiện các biến dị không mong muốn như bạch tạng - Thường ta sử dụng kỹ thuật tự phối nhiều đời để thu dòng - Sức sống giảm hơn so với cây bình thường đồng hợp tử (dòng thuần) - Tác động của nuôi cấy có thể tạo nên một số đột biến ở nhân và - Tạo cây đơn bội (n) => lưỡng bội hoá (2n). ở các bào quan khác. Thông qua sinh sản vô phối và nuôi cấy tiểu bào tử. b. Ứng dụng - Tạo các đột biến và chọn lọc ở mức đơn bội - Chuyển nạp gen ở mức độ đơn bội - Tạo dòng đồng hợp tử 4.3.3. Nuôi cấy phôi trong lai xa và tạo sự đa dạng di truyền của quần thể chọn lọc b. Ứng dụng của nuôi cấy phôi a. Nuôi cấy phôi trong lai xa + Các phôi kém phát triển, không có sức sống thu được trong - Trong lai xa giữa các loài, các chi nhiều biến cố có thể xảy ra lai xa giữa các loài. đối với quá trình phát triển phôi và nội nhũ: xuất hiện các + Bảo toàn tính đa dạng ở quần thể phân ly không bào trong bào chất, bào chất nghèo các cơ quan tử, + Hạt không nảy mầm ở điều kiện thông thường, hạt có thời mất cân đối trong phát triển phôi và nội nhũ, nội nhũ kém gian ngủ nghỉ lâu hoàn chỉnh => phôi con lai xa kém sức sống. + Nuôi cấy phôi non trong các thực nghiệm tạo cây tái sinh và tác động chọn lọc ở invitro - Nuôi cấy phôi lai xa trong môi trường nhân tạo các tác dụng + Phôi non được sử dụng như một trong các dạng mô nuôi khắc phục những thiếu hụt mà nội nhũ không đủ đảm nhận, được đưa vào nuôi cấy invitro nhằm tạo callus và thu cây tái hoàn thiện phát triển phôi để thu nhận cây lai xa. sinh. 4.4. Chỉ thị phân tử 4.4.1. Các enzyme giới hạn, phương pháp RELP a. Các enzyme giới hạn và tính chất của chúng - Theo phương thức cắt ADN các enzyme giới hạn chia làm 2 - Trong tế bào vi khuẩn có những enzyme đặc biệt, chúng có khả năng nhóm: nhận biết các ADN lạ của phage thâm nhập vào và phân huỷ chúng làm hạn chế sự sinh sản của phage => đó là các enzyme giới hạn. + Nhóm 1 bao gồm các enzyme có khả năng nhận biết một đoạn trình tự đặc hiệu về các nhận biết. - Các enzyme giới hạn chỉ cắt ADN lạ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn mà không cắt ADN của mình. Vì vi khuẩn còn có enzyme sửa đổi, + Nhóm 2 bao gồm các enzyme có đặc điểm là cắt ADN tại có tác dụng bổ sung một nhóm phân tử vào gốc bazơ của ADN tế điểm nhận biết đặc hiệu bào chủ, làm nó khác với ADN lạ, vì thế nó không bị cắt bởi - Sự cắt của enzyme giới hạn ở ADN xảy ra theo 2 cách: enzyme giới hạn. + Cắt theo hình zigzag tạo đầu đứt lệch (đầu dính) - Cơ chế hoạt động của enzyme giới hạn: các enzyme này nhận biết một trật tự nucleotit đặc thù trên phân tử ADN và cắt ADN tại vị trí + Cắt thẳng tạo các đầu đứt tù đó. Sự cắt xảy ra ở liên kết photphodiester giống như các enzyme endonuclease. 3
4. 7/18/15 * Chỉ thị phân tử chia làm 4 loại chính: Arthrobacter luteus  Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN: RFLP  Chỉ thị dựa trên nguyên tắc nhân bội ADN bằng PCR: Haemophilus egyptius RAPD, AFLP, SSR, SNP, STS, CAP .  Chỉ thị dựa trên cơ sở những chuỗi có trình tự lặp lại  Các chỉ thị khác Bacillus amyloliquefaciens Haemophilus intluenzae Escherichia coli b.RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình 4.4.2. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, phƣơng pháp chiều dài mảnh phân cắt giới hạn) RAPD (Radomly Amplyfied Polymorphic DNA - Đa hình  Chỉ thị RFLP được ứng dụng đầu tiên bởi Bitstein et al. các đoạn ADN khuyếch đại ngẫu nhiên) (1980) để xây dựng bản đồ liên kết di truyền ở người. RFLP PCR: cũng được ứng dụng để nghiên cứu di truyền trên nhiều đối  - Phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là kỹ thuật nhân tượng thực vật như: lúa, ngô, cà chua, bông . đoạn ADN đặc hiệu do Kary Mullis phát hiện.  Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội tức là có khả năng biểu hiện  - Phản ứng chuỗi trùng hợp cho phép tạo ra một số lượng tất cả các alen của cùng một locus gen. Do vậy, có thể phân lớn các bản sao của đoạn ADN cần chọn từ genom mà biệt được các cá thể đồng hợp tử AA hoặc aa và các cá thể dị không cần tách và nhân dòng. hợp tử Aa. Do sử dụng mẫu dò mang tích đặc hiệu nên chỉ thị này có độ chính xác cao, dùng để kiểm tra các chỉ thị phân tử. Tuy nhiên hạn chế của phương pháp này là tốn thời gian, sức lực và khối lượng công việc lớn. Các loại chỉ thị phân tử khác: RAPD: - Chỉ STS.  Chỉ thị RAPD là chỉ thị trội bởi nó biểu hiện sự có mặt hay - Chỉ thị CAP (Cleaved Amplification Polymorohism - Đa không có mặt những băng ADN đặc trưng. Vì vậy không s hình đoạn nhân bội bị cắt giới hạn) phân biệt được thể dị hợp tử. - Chỉ thị STS (Sequence Tagged Site - Vị trí được đánh dấu  Chỉ thị RAPD có ưu điểm không cần biết trước thông tin về bởi trình tự) trình tự ADN để thiết kế mồi, rẻ tiền, nhanh. Tuy nhiên nhược điểm của nó là do sử dụng mồi ngắn và nhiệt độ kết - Chỉ thị SNP (Single Nucleotide Polymorphism - Đa hình của cặp thấp (34 - 370C) nên độ chính xác không cao. các Nucleotide đơn)  RAPD phù hợp cho phân tích đa dạng di truyền và lập bản - SCAR (Sequence Characterized Amplified Region - Vùng đồ những dòng nhị bội, những dòng cận phối và các quần khuếch đại trình tự đặc trưng) thể lai trở lại. - RGA (Resistance Gene Analog - Vùng tương tự gen kháng) 4
5. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam 4.4.3. Đặc điểm của các phương pháp chọn lọc theo chỉ thị  Chỉ thị enzyme Enzym là một dạng protein có khả năng xúc tác cho  Chỉ thị hình thái: những phản ứng hóa sinh học, có tính đặc thù cao và hoạt Đây là phương pháp cổ điển nhưng hiện nay vẫn được sử tính có thể điều khiển được. Isoenzym hay isozym còn được dụng rộng rãi vì không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền nhưng vẫn đảm gọi cách khác là các đẳng men, thực chất là những trạng thái bảo hiệu quả nhất định, giúp các nhà nghiên cứu có thể phân biệt khác nhau của một enzym. Các isozym của một enzym đều các giống, các vật liệu một cách nhanh chóng trên đồng ruộng. xúc tác cho một phản ứng, chỉ khác ở một số tính chất như Các đặc điểm hình thái trong phân loại được sử dụng từ rất nồng độ cơ chất hay độ pH mà ở đó nó có hoạt tính cao sớm. Nguyên tắc cơ bản của phương pháp này là: Hai đơn vị phân nhất. loại (taxon) càng có nhiều đặc điểm chung, càng giống nhau thì quan hệ giữa hai đơn vị phân loại càng gần gũi nhau. Người ta thường kết hợp nhiều đặc điểm để làm tăng giá trị tin cậy của kết Việc phân tích isozym cho biết những alen đồng trội, quả so sánh. Phương pháp dựa trên các tính trạng hình thái đưa đến là phương pháp tương đối rẻ, dễ tiến hành hơn các phương thành công còn phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm và sự khéo léo pháp phân tích ADN. Tuy nhiên do số lượng các isozym ít của các nhà chọn giống, hơn nữa phương pháp này nhiều khi không và chúng chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định của quá chính xác vì có hiện tượng đồng quy tính trạng và không phân biệt trình phát triển cá thể và là sản phẩm của gen nên chưa phản được các loài đồng hình. ánh chính xác bản chất di truyền của các cá thể.  Chỉ thị phân tử: 4.5. Chuyển nạp gen ở thực vật Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị có bản chất là 4.5.1. Các bước của công nghệ nhằm thu nhận gen đa hình ADN. Đặc điểm của chỉ thị phân tử là: - Tách các đoạn ADN từ genom, - Rất đa hình - Thu ADN (gen) từ ARNm thông qua sao chép ngược - Là đồng trội hoặc trội - Phương pháp tổng hợp hoá học. - Không ảnh hưởng bởi môi trường Chỉ thị phân tử có nhiều loại, đa dạng và ổn định trong mọi giai đoạn của sinh vật. Chỉ thị phân tử có ưu điểm hơn nhiều so với chỉ thị hình thái và chỉ thị enzym. a. Tách các đoạn ADN từ genom - Mỗi phân tử ADN của genom được cắt ra nhiều mảnh nhờ các enzym giới hạn b. Thu nhân gen từ ARNm của gen tương ứng - Những đoạn cắt ADN được phân tách và phát hiện bằng  - Phương pháp này được thực hiện nhờ sử dụng enzim ARN- phương pháp điện di trên gel. Những đoạn ADN có thể được dependent ADN- polymerase hay reverse transcriptase. phân lập ra bằng sử dụng kỹ thuật tạo khối lai phân tử:  - Nhờ enzim sao chép ngược một gen bất kỳ được tổng hợp + Sử dụng màng lọc notroxenlulose, ở đó được nạp các đoạn khi có ARNm của gen đó. ADN mạch đơn có đánh dấu phóng xạ, các đoạn này phân bố  - ARNm được tách ra từ hỗn hợp các loại ARN nhờ cấu trúc ở màng lọc như những vệt băng. Những mẫu ADN thử này là chuỗi poly-A có ở đầu 3’. Người ta nạp các đoạn poly-dT vào các đoạn ADN đã biết trước kích thước và cấu trúc. cột xenlulose hay agarose. Khi đi qua, ARNm được giữ lại nhờ + Các đoạn ADN trên gel được tách mạch đơn bằng kiềm, sau đó sự liên kết của chuỗi poly-A với poly-dT.Sau khi rửa các chúng thấm sang màng lọc khi cho gel và màng lọc áp sát ARNm được tách ra. nhau. Ở màng lọc những đoạn ADN nào tương đồng với các đoạn thử chúng sẽ tạo khối lai phân tử. Sau đó màng lọc được rửa sạch. Từ đó nhờ khối lai người ta tách được những đoạn ADN cụ thể trong hỗn hợp nhiều đoạn cắt. 5
6. 7/18/15 Lớp Học Phần VNUA ( Khoa Nông Học ) - Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam  - Quá trình sao chéo ngược gồm hai giai đoạn: c. Tổng hợp gen bằng phương pháp hoá học  + Đoạn mồi sử dụng ở đây là đoạn olygo-dT, nó kết cặp - Để tổng hợp nhân tạo gen cần phải biết trình tự các nucleotit với poly-A, từ đó xảy ra tổng hợp mạch ADN đơn bổ sung của nó, từ đó người ta thiết kế hệ thống tổng hợp ADN theo sợi ARNm khuôn dưới xúc tác của enzym sao chép trong ống nghiệm. Thường áp dụng đối với gen ngắn. ngược.  + Tiếp theo mạch c-ADN đơn được tách ra và tiếp tục tổng hợp thành c-ADN mạch kép nhờ enzym ADN polymerase.  - Các c-ADN được nhân dòng bằng cách gắn chúng vào vector. Tập hợp các c-ADN thu nhận từ tất cả các loại ARNm ở tế bào chuyên hoá của một loài sinh vật gọi là ngân hàng c- ADN hay thư viện c- ADN của loài đó. 4.5.3. Một số thành tựu khi sử dụng cây trồng chuyển gen 4.5.2. Kỹ thuật ARN – ngược nghĩa - Tạo giống kháng virus - Sử dung ARNm ngược nghĩa trong quá trình điều khiển sự - Tạo giống kháng sâu biểu hiện của gen. ARNm ngược nghĩa bắt cặp bổ sung với - Tạo giống kháng thuốc trừ cỏ ARNm bình thường, từ đó quá trình dịch mã bị kìm hãm. - Các cải tiến khác ở cây trồng: - Kỹ thuật tạo dòng ADN ngược nghĩa cho một gen bất kỳ bằng + Cải tiến chiến lược thực phẩm của cây trồng cách quay ngược toàn bộ phần mã hoá của gen. + Đối với những cây hoa, cây cảnh, người ta xử dụng kỹ thuật di truyền nhằm biến đổi màu sắc hoa theo ý muốn. + Tạo cây trồng chuyển gen để sản xuất những hợp chất quý hiếm + Tạo các dòng bất dục đực, tạo giống chống chịu với một số yếu tố bất lợi của ngoại cảnh. 6