›
›

Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine

pdf 112 trang vanle 2630
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfluan_van_cong_nghe_tong_hop_lysine.pdf

Nội dung text: Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine

  1. Luận văn Công nghệ tổng hợp Lysine
  2. Mục lục Danh mục hình iv Danh mục bảng vi Danh mục đồ thị viii CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1 1. 1.Giới thiệu về lysine 1 1.1.1. Khái niệm 1 1.1.2. Cấu tạo 1 1.1.3. Vai trò và ứng dụng 2 1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine 4 1.2. Các phương pháp thu nhận lysine 8 1.2.1. Phương pháp thủy phân 8 1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học 9 1.2.3. Phương pháp lên men 9 1.2.4. Phương pháp kết hợp 9 1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật 11 1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa 11 1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa 13 1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum 19 1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum 19 1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum 20 1.5.3. Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum 24 1.5.4. Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp 24 1.6. Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 25 1.6.1. Khái niệm 25 1.6.2. Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26 1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: 28 1.6.4. Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum 30 1.6.5. Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate 30 1.7. Cố định tế bào vi sinh vật 37 1.7.1. Định nghĩa cố định tế bào 37 1.7.2. Phương pháp cố định tế bào 38 1.7.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: 38 ii
  3. 1.7.4. Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào 39 1.8. Công nghệ lên men L-Lysine 39 1.8.1. Các vi khuẩn lên men L-lysine 39 1.8.2. Môi trường lên men 40 1.8.3. Các phương pháp lên men 44 1.8.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 46 1.8.5. Qui trình lên men 48 1.8.6. Thu nhận và tinh sạch sản phẩm 55 1.8.7. Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine 57 CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 58 2.1. Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine 58 2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine 58 2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus 58 2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum 59 2.2. Công nghệ lên men L-lysine 78 2.2.1. Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine 78 2.2.2. Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine 85 2.2.3. Nghiên cứu quá trình lên men thu nhận L-lysine ở các chế độ lên men khác nhau 88 2.2.4. Nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-lysine 90 2.2.5. Nghiên cứu tổng hợp lysine bằng tế bào cố định 96 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 100 Tài liệu tham khảo 101 iii
  4. Danh mục hình Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine 2 Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine. 2 Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật . 3 Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua . 4 Hình 1. 5 L-lysine sulphate . 4 Hình 1. 6 L-lysine HCl 5 Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 6 Hình 1. 8 Sản phẩm thương 6 Hình 1. 9 Sản phẩm thương 7 Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại 7 Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct. 8 Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder 8 Hình 1. 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác Hình 1. 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose . 13 Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate . 14 Hình 1. 16 Con đường tổng hợp lysine . 16 Hình 1. 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể 18 Hình 1. 18 Corynebacterium glutamicum . 20 Hình 1. 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum. 23 Hình 1. 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium glutamicum 29 Hình 1. 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria glutamicum hoang dại. . 32 Hình 1. 22 Cấu trúc của Aspartate kinase . 33 Hình 1. 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA . 36 Hình 1. 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào . 38 Hình 1. 25 Mô hình sản xuất các amino acid . 50 iv
  5. Hình 1. 26 Mô hình lên men thu L-lysine . 51 Hình 2. 1 Cô lập gen ddh của C. glutamicum và cấu trúc của một plasmid tổ hợp C. glutamicum - E.coli . 68 Hình 2. 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis . 69 Hình 2. 3 Sơ đồ vật lý, phân tích và đánh dấu trình tự của DNA 70 v
  6. Danh mục bảng Bảng 1. 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine . 9 Bảng 1. 2 Đặc điểm hình thái của C. glutamicum 19 Bảng 1. 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay. 24 Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế vector . 28 Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng, sự bài tiết L-lysine . 35 Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng . 60 Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu 61 Bảng 2. 3 Hiệu quả của gen ddh trong C. glutamicum 70 Bảng 2. 4 Cách sử dụng codon của gen ddh . 71 Bảng 2. 5 Giống C. glutamicum dùng trong bài nghiên cứu này . 73 Bảng 2. 6 Vị trí chuỗi primer đặc biệt được sử dụng phổ biến để thay thế trong G. glutamicum bằng phương pháp PCR và chuỗi DNA tiếp theo sau . 73 Bảng 2. 7 Sản lượng và những đặc trưng của sự sản xuất lysine của 75 Bảng 2. 8 Sinh khối và các chất chuyển hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr 77 Bảng 2. 9 Nhu cầu đồng hóa của C. glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp 78 Bảng 2. 10 Khả năng lên men của chủng CM24 trên 4 loại môi trường. 79 Bảng 2. 11 Ảnh hưởng của pH lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít. 80 Bảng 2. 12 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. 81 Bảng 2. 13 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. 82 Bảng 2. 14 Ảnh hưởng của oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine ở qui mô 1500 lít. 83 Bảng 2. 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine. 83 Bảng 2. 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%). 87 vi
  7. Bảng 2. 17 Sản lượng L-lysine thu được bằng các phương pháp lên men khác nhau. . 89 Bảng 2. 18 Ảnh hưởng của hàm lượng đường giới hạn lên năng suất và sản lượng L- lysine. 89 Bảng 2. 19 Năng suất và sản lượng L-Lysine trong lên men repeat fed batch và liên tục 89 Bảng 2. 20 Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 lên sinh khối và nồng độ L-Lysine 97 Bảng 2. 21 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu và thời gian lên men lên sự tổng hợp 97 vii
  8. Danh mục đồ thị Đồ thị 2. 1 So sánh sản lượng L-lysine tạo bởi C. glutamicum từ sáu chủng đột biến trong môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch . 62 Đồ thị 2. 2 Hoạt động invivo của fructose 1,6-biphosphatase trong các chủng C. glutamicum khác nhau 75 Đồ thị 2. 3 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít 79 Đồ thị 2. 4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sản lượng L-lysine ở qui mô 50 lít. 80 Đồ thị 2. 5 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng L-lysine ở qui mô 150 lít. 81 Đồ thị 2. 6 Ảnh hưởng của thời gian lên men lên sinh khối và sản lượng 82 Đồ thị 2. 7 Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng các chế phẩm 87 Đồ thị 2. 8 Thời gian nuôi cấy liên tục 91 Đồ thị 2. 9 Ảnh hưởng của tỉ lệ pha loãng lên các thông số trạng thái ổn định 92 Đồ thị 2. 10 Ảnh hưởng của tỉ lệ đường bổ sung lên năng suất 93 Đồ thị 2. 11 Ảnh hưởng của khuấy đảo lên các thông số trạng thái ổn định. 94 Đồ thị 2. 12 Ảnh hưởng của khí giàu oxy lên các thông số trạng thái ổn định. 95 Đồ thị 2. 13 Ảnh hưởng của lượng tế bào ban đầu lên sự tổng hợp L-lysine bằng các tế bào C.glutamicum cố định 98 viii
  9. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1. 1.Giới thiệu về lysine: 1.1.1. Khái niệm: Lysine là một α-amino acid thiết yếu con người không thể tổng hợp được. Lysine chứa hai nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH). Trong cấu tạo phân tử lysine có một carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-lysine và L-lysine. Hai đồng phân quang học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác nhau khả năng làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, một sang phải và một sang trái làm tính chất sinh học của chúng hoàn toàn khác và cơ thể sinh vật sống chỉ hấp thu được lysine dạng L. Lysine tồn tại dạng rắn và tinh thể trong điều kiện bình thường, bị phân hủy ở nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh khi tương tác với ninhydrin [38]. Lysine là một trong 9 amino acid không thay thế trong tổng số 20 amino acid, tìm thấy trong cấu trúc của những phân tử protein tự nhiên của tất cả sinh vật sống và được tổng hợp từ vi sinh vật. Lysine thuộc họ aspartate, được tổng hợp qua con đường phân nhánh. Lysine là acid amin rất cần thiết cho hoạt động sống của người và động vật. Nhu cầu lysine trên thế giới năm 2006 là 950,000-1000,000 tấn. 1.1.2. Cấu tạo: Công thức phân tử: C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146,188 g/mol, điểm đẳng điện pH = 9.59, Codon của lysine là AAA và AAG. [38] Công thức cấu tạo: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH 1
  10. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu D - l ysine L-Llysine Hình 1. 1 Hai dạng đồng phân quang học của lysine [38]. Hình 1. 2 Cấu trúc không gian của L-lysine [38]. Tên gọi: Lysine còn có tên gọi khác là axit α-e-diaminocaproic và 2,6- diaminohexanoic acid. 1.1.3. Vai trò và ứng dụng: Lysine giữ vai trò sống còn trong tổng hợp protein, là chìa khóa trong sản xuất enzyme, hoocmon và các kháng thể giúp cơ thể tăng cường sức đề kháng, chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi hay mụn gộp sinh dục. Cơ thể người và động vật thiếu lysine cơ thể sẽ không hoạt động bình thường, đặc biệt ở động vật còn non và trẻ em sẽ xảy ra hiện tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển kém. Chính vì thế lysine thường được đưa vào phần ăn của trẻ và của gia súc. L-lysine là một amino acid cần thiết và đòi hỏi phải luôn có sẵn trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của động vật, đặc biệt đối với thức ăn từ ngũ cốc, lúa mì hoặc lúa mạch thì nghèo lysine. Do đó bổ sung nguồn giàu lysine vào là 2
  11. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu cần thiết để tăng hiệu quả thức ăn. Ta có thể bổ sung bột đậu nành (chứa nhiều lysine) hoặc thêm trực tiếp lysine vào thức ăn. Ưu điểm của việc bổ sung trực tiếp lysine là các amino acid không thay thế khác không được thêm vào nên thành phần của chúng trong cơ thể không bị thay đổi. Ví dụ thêm 0.5% lysine tăng chất lượng đạm của thức ăn hiệu quả như là bổ sung 20% đậu nành. Từ đó, nitơ của amino acid không giới hạn thêm vào thừa của chế độ ăn có hàm lượng đạm cao thì sẽ bị chuyển hóa thành amoni và được động vật bài tiết ra ngoài, với việc bổ sung lysine làm giảm lượng đạm bổ sung từ đó làm giảm ô nhiễm môi trường từ phân. Hình 1. 3 Nhu cầu của lysine, threonine và methionine trong thức ăn heo con và thành phần của những amino acid này chứa sẵn trong thưc vật [34]. Trong năm 2000, việc sản xuất L-lysine khắp nơi trên thế giới được sử dụng như là một nguồn chất bổ sung vào thức ăn đạt sấp xỉ 550.000 tấn và trên thị trường vẫn cho thấy một sự tăng trưởng tiềm năng từ 7-10% mỗi năm [34]. Vì chỉ có L-lysine là có hiệu quả như là một nguồn chất bổ sung và tất cả các quy trình sản xuất hiện nay sử dụng phương pháp lên men quen thuộc. 3
  12. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hình 1. 4 Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) trong suốt 3 thập kỉ qua [34]. Lysine có nhiều trong trứng, thịt, cá, đậu nành nhưng dễ bị phá hủy trong quá trình chế biến và nấu nướng thức ăn. Người ta bổ sung lysine cho động vật dưới dạng thức ăn như cho lysine vào sữa. Ở người lysine được bổ sung vào thuốc dạng viên và thuốc uống. 1.1.4. Các dạng tồn tại của lysine:  L-lysine Sulphate Hình 1. 5 L-lysine sulphate [18]. Thành phần: Lysine Sulphate là muối sulphate với lysine L-lysine : 51% min, trung bình là 65% Sulphate : 15% max 4
  13. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Các acid amin : 10% min. Độ ẩm : 3% max Muối amoni (như NH4) : 1% ma Kim loại nặng : 0,003% max Arsen : 0,0002% max. Lysine Sulphate có thể được bổ sung vào L-lysine HCl làm thức ăn cho vật nuôi, chúng có hiệu quả như L-lysine HCl.  L-lysine HCl (L-Lysine monohydrochoride) [18]. Xuất xứ : Trung Quốc Hình thức : Màu nâu sáng. Hình 1. 6 L-lysine HCl [18]. Thành phần : ≥ 98.5% Ẩm : £1% Amonium (NH4) : 0.04% Kim loại nặng : £ 0.003% pH (1 :10 nước) : 5 - 6.09 Hình 2.5: L-lysine HCl L-lysine HCL 98.5% (Feed Grade) là một trong những amino acid được sử dụng rộng rãi nhất. Đây là amino acid cần thiết yêu cầu có trong chế độ ăn của lợn, gà vịt gia cầm. 5
  14. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.1.5. Các sản phẩm lysine thương mại:  L-lysine với B6 [37]. Hình 1. 7 Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 [37] Thành phần: L-lysine, vitamin B6 (Pyridoxine hydrochloride), Mg, Si, men, gluten, muối, đường và các sản phẩm sữa. Mỗi Capsule sẽ cung cấp: L-lysine 500mg, Vitamin B6 6mg Giá thành: 380000 VND.  Lysine power [40]. Thành phần của sản pham này là L-lysine HCl. Hình 1. 8 Sản phẩm thương mại Lisine Power [40]. 6
  15. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu  Lysine capsures [40]. Hình 1. 9 Sản phẩm thương mại Lysine Capsures. Thành phần của sản phẩm này là L-lysine HCl [40].  Lysine Vit- B12 Granules [40]. Hình 1. 10 Sản phẩm thương mại Lysine Vit – B12 Granules [40]. Thành phần: 300mg lysine, 15mg vitamin B12 Granule có hương vị ngọt.  Lysine-1000 90ct [40] Lysine đóng vai trò quan trọng cho sự phát triển đúng đắn và đóng vai trò thiết yếu trong sản xuất carnitine. Nó chịu trách nhiệm chuyển đổi các acid béo thành năng lượng và giúp giảm cholesterol. Lysine xuất hiện để giúp cơ thể hấp thụ và chuyển hóa canxi, nó đóng một vai trò quan trọng trong việc hình thành collagen, một chất quan trọng cho xương và mô liên kết bao gồm da, gân và sụn. 7
  16. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hình 1. 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct [40].  Lysine Powder [40] Hình 1. 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder [40]. Thành phần L-Lysine. 1.2. Các phương pháp thu nhận lysine:[2] 1.2.1. Phương pháp thủy phân: Người ta dùng acid hoặc kiềm để thủy phân các nguyên liệu chứa nhiều protein. Các phương pháp này hiện nay vẫn đang được sử dụng rộng rãi.Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là: Thiết bị phải chịu được acid hay kiềm. Trường hợp sử dụng kiềm để thủy phân sẽ tạo ra nhiều acid amin dạng D. Trường hợp sử dụng acid để thủy phân sẽ ô nhiễm môi trường không khí do lượng acid dư bay hơi trong quá trình thủy phân. 8
  17. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Giá thành thường cao. 1.2.2. Phương pháp tổng hợp hóa học: Ưu điểm của phương pháp là sản xuất ổn định, có thể tiêu chuẩn hóa điều kiện sản xuất, đảm bảo hiệu suất nhưng nhược điểm là thu được các acid amin dạng Racemic( L và D- acid amin) mà cơ thể không sử dụng dạng D nên công đọan tách ra rất phức tạp. 1.2.3. Phương pháp lên men: Ở đây ta tiến hành nuôi cấy vi sinh vật để thu nhận các acid amin. Ưu điểm của phương pháp là:Phương pháp này cho phép ta thu nhận acid amin dạng L. Nguyên liệu để sản xuất rẻ, dễ kiếm. Tốc độ trao đổi chất, tốc độ sinh sản và phát triển mạnh của vi sinh vật cho phép ta được năng suất cao. Giá thành sản phẩm thấp hơn giá thành sản phẩm từ các phương pháp khác. 1.2.4. Phương pháp kết hợp: Người ta kết hợp phương pháp hóa học và sinh học. Bằng con đường hóa học, thu nhận hợp chất dạng L-Keto và các tiền chất của acid amin. Sau đó sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành acid amin. Nhìn chung, phương pháp dùng vi sinh vật để chuyển các chất tiền thân của acid amin thành acid amin tương ứng là một phương pháp có nhiều triển vọng và thường được sử dụng trong sản xuất lysine. Cơ sở khoa học của phương pháp là: trong quá trình trao đổi chất, vi sinh vật có khả năng tích lũy acid amin trong môi trường. Ở điều kiện sống bình thường, lượng acid amin mà chúng tổng hợp được thường đủ đáp ứng nhu cầu bản thân, nhưng trong điều kiện nào đó, lượng acid amin này có thể vượt xa nhu cầu bản thân và tích lũy lại trong tế bào hay thoát ra môi trường. Hiện tượng này được gọi là siêu tổng hợp acid amin của vi sinhvật. Trong khoảng 10 năm gần đây, trên thị trường có một bước tiến mạnh mẽ trong công nghệ sản xuất Lysine bằng con đường lên men. Bảng 1. 1 So sánh các phương pháp thu nhận lysine [2]. Phương Khái niệm Ưu điểm Nhược điểm 9
  18. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu pháp Phương Dùng acid hoặc kiềm - Sử dụng rộng rãi do - Cần thiết bị chịu pháp thủy để thủy phân tinh bột phản ứng nhanh và triệt acid hay kiềm. phân chứa protein. để. -Tạo ra nhiều lysine - Dễ điều khiển và kiểm dạng D khi thủy soát. phân bằng kiềm. - Sản phẩm ít tạp chất. - Dùng acid gây ô nhiễm môi trường. - Giá thành cao. Phương Dùng hóa chất để - Phản ứng nhanh. - Cho ra raxemic pháp hóa tổng hợp nên lysine. - Dễ thực hiện. (hỗn hợpL-lysine học - Sản phẩm ít tạp chất. và D-lysine)_tốn kém khi tách. - Giá thành cao. Phương Nhờ khả năng tổng - Thu lysine dạng L - Thời gian lên men pháp hợp thừa của một số - Nguyên liệu sản xuất dài. lên men vi sinh vật, nuôi cấy rẻ tiền, dễ kiếm. - Điều khiển phản thu nhận lysine. - Năng suất cao do phản ứng khó, và phức ứng đặc hiệu. tạp do điều khiển tế - Không gây ô nhiễm bào sống. môi trường, có thể sử - Đòi hỏi phải có dụng nguyên liệu phế kiến thức vi sinh. thải từ nhà máy. - Sản phẩm có thể - Giá thành thấp. bị lẫn tạp chất do tế bào tiết ra. - Sản phẩm ức chế ngược lại tế bào làm giảm hiệu suất phản ứng. Phương - Kết hợp giữa con - Rút ngắn được thời - Con đường hóa pháp đường hóa học và gian lên men. học có thể gây ô 10
  19. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu kết hợp hóa sinh học. - Tạo ra các hợp chất nhiễm môi trường. học và sinh - Con đường hóa học trung gian kích thích sự - Tốn nhiều kinh học thu nhận được hợp sinh amino acid của tế phí. chất dạng L-keto và bào nhiều. - Giá thành sản các tiền chất của -Năng suất cao. phẩm cao. lysine, sau đó sử dụng vi sinh vật để chuyển hóa những chất này thành lysine. 1.3. Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật: 1.3.1. Sơ đồ chuyển hóa: Điểm quan trọng trong cơ chế tổng hợp lysine của vi khuẩn là lysine được tổng hợp cùng với methionine, threonine và đều xuất phát từ một chất chung đó là Aspactat - β - semialdehyde. Quá trình tổng hợp xảy ra theo sơ đồ tổng quát sau: 11
  20. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hình 1. 13 Sơ đồ tổng quát chuyển hóa tứ glucose ra lysine và các amino acid khác [2] Dựa vào sơ đồ trên, nhận xét tổng quát đầu tiên là muốn vi khuẩn tạo ra nhiều lysine thì làm sao để sự chuyển hóa phải theo nhánh [3]. 12
  21. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.3.2. Thuyết minh các giai đoạn chuyển hóa: Sự chuyển hóa từ glucose ra lysine với sự tham gia của các enzyme: Hình 1. 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose [2]. Từ sơ đồ hình 1.14 ta thấy vai trò của Oxaloacetate như là một tiền chất cho họ Aspartic acid. Do đó Oxaloacetate thì có tầm quan trọng thiết yếu cho việc sản xuất lysine. 13
  22. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Vào những năm trước 1969, Ozaki và Shiio đã khảo sát các quy luật của phosphoenolpyruvate carboxylase và pyruvate kinase trong Brevibacterium lactofermentum để tìm hiểu điểm phân nhánh của quá trình chuyển hóa glucose. Tăng cường các phosphoenolpyruvate carboxylase thì thấy có thể kích thích sự tạo thành acid aspartic thu được nhiều acid amin trong Brevibacterium lactofermentum. Sau đó, người ta có thể thấy trong Corynebacterium glutamicum, phosphoenolpyruvate carboxylase thì không cần thiết cho tăng trưởng và việc sản xuất lysine. Điều đó cho thấy rõ ràng là đã có phản ứng phục hồi khác phải chịu trách nhiệm bổ sung các nguồn oxaloacetate. Nổi bật nhất là pyruvate carboxylase, một enzyme xúc tác sự chuyển đổi pyruvate và CO2 tạo ra oxaloacetate dưới sự thủy phân của ATP. Hình 1. 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate và Malate [34]. Khi oxaloacetate được sử dụng để làm tiền chất tổng hợp aspartate thì để giúp cơ thể giữ được cân bằng của chu trình ATC, oxaloacetate đã được bù đắp bằng một số phản ứng phục hồi (hình 1.15). Trong đó chủ yếu có sự tham gia của các enzyme xúc tác phản ứng gắn CO2 sử dụng vitamin biotin làm coenzyme. Đó là các phản ứng gắn CO2 lên pyruvate, phosphoenolpyruvate (PEP) tạo thành 14
  23. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu oxaloacetate và malte được xúc tác bởi pyruvate carboxylase, PEP carboxylase, PEP carboxykinase và enzyme malic. Trong đó pyruvate carboxylase là enzyme điều hòa quan trọng nhất xúc tác phản ứng phục hồi pyruvate thành oxaloacetat ở gan và thận của động vật có vú và bị ức chế mạnh khi không có acetyl-CoA, còn khi xuất hiện trở lại, acetyl-CoA sẽ kích thích enzyme này xúc tác phản ứng tạo oxaloacetate. Các phản ứng: Pyruvate carbonxylase - Pyruvate + HCO3 + ATP Oxaloacetate + ADP +Pi Oxaloacetate Decarboxylase PEP carboxylase Phosphoenolpyruvate + CO2 + GDP Oxaloacetate + GTP PEP carboxykinase 15
  24. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Giai đọan tổng hợp lysine từ aspartate: Hình 1. 16 Con đường tổng hợp lysine [34]. Trong cơ chế sinh tổng hợp lysine của vi khuẩn thì lysine được tổng hợp cùng lúc với methionie, threonine, isoleunine và đều thuộc họ aspartate có chất 16
  25. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu chung là Aspartate-β- semialdehyde. Điều khiển quá trình tổng hợp lysine ở tế bào vi khuẩn ta có thể chia ra thành 2 giai đoạn: Giai đoạn 1: Giai đoạn tạo ra oxaloacetate (tiền chất để tổng hợp aspartate): Để tổng hợp lysine thì phải cung cấp nguồn nguyên liệu giàu glucose ( hoặc các nguyên liệu cung cấp nguồn cacbon khác nhưng hiệu suất chuyển hóa giảm). Từ glucose, tế bào vi khuẩn thực hiện chuyển hóa theo con đường EMP ( chu trình đường phân) tạo ra fructose 1,6-diphosphate và chất này sẽ tiếp tục chuyển hóa tạo thành pyruvic (pyruvate). Một phần piruvate bị oxy hóa tạo ra Acetyl-CoA- tiền chất của chu trình Krebs tạo ra năng lượng cho tế bào, một phần pyruvat chuyển hóa tạo ra oxaloacetate-tiền chất của họ aspartate. Aspartate là cơ chất cung cấp toàn bộ nguồn cacbon cho lysine. Do đó, để tổng hợp nhiều lysine thì nguồn aspartat phải đủ và ổn định. Vì vậy, một trong những hướng để cải tạo giống sản xuất nhiều lysine là ta có thể điều khiển quá trình tổng hợp oxaloacetate theo các cơ chế như đã trình bày phía trên. Giai đoạn 2: Quá trình sinh tổng hợp lysine từ aspartate: Từ aspartate qua các phản ứng tạo ra Aspartate-β- semialdehyde, tại đây thì con đường chuyển hóa chia làm 2 nhánh. Một nhánh đi theo con đường tổng hợp ra homoserin tạo ra các amino acid khác như methionine, threonine, isoluenine, một nhánh tổng hợp ra lysine. Quá trình này được thực hiện với sự tham gia của nhiều enzyme trong đó enzyme xem như là enzyme chìa khóa quyết định hiệu suất thu nhận lysine là aspatokinase, aspartate semildehydedehydrogenase và Dihydrodipicolinate synthase. Do đó để sản xuất lysine ta có thể điều khiển ba enzyme này. Ngoài ra ở hình 1.16, ta thấy để rút ngắn con đường chuyển hoá tạo sản phẩm lysine ta có thể điều khiển enzyme diamino pimelatedehydrogenase để từ piperideine-2,6- dicarboxylate tạo ra diaminopimelate. Bên cạnh đó ta có thể điều khiển hoạt động của enzyme permease để kiểm soát lượng lysine tiết ra ngoài (Hình 1.16). 17
  26. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.4. Điểu kiện tổng hợp dư L-lysine: Sơ đồ điều hòa dị lập thể tổng hợp lysine: Hình 1. 17 Sơ đồ diều hòa dị lập thể [5]. 18
  27. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Giải thích sơ đồ: Phổ biến nhất trong quá trình tổng hợp lysine (amino acid) là cơ chế điều hòa ngược phản ứng đầu tiên của chuỗi phản ứng bởi sản phẩm cuối. Thông thường đây là phản ứng một chiều và được xúc tác bởi enzyme điều hòa dị lập thể. Phản ứng đầu tiên nhất được xúc tác bởi 3 enzyme đồng phân (A1, A2,A3)được điều hòa độc lập nhau cho phép duy trì sự tổng hợp hài hòa của 4 amino acid. Các hiệu ứng ức chế ngược được phối hợp bởi lysine và threonine có ảnh hưởng trên enzyme đầu tiên là aspartokinase. Ngoài ra, enzyme đầu tiên của nhánh threonine là homodehydrogenase bị ức chế bởi threonine và quá trình tổng hợp threonine bị ức chế bởi methionine. Muốn điều chỉnh sơ đồ trên nhằm mục đích chỉ sản xuất lysine và đạt hàm lượng cao thì cải tạo giống để enzyme aspartokinase không bị mẫn cảm với hỗn hợp sản phẩm trên và ức chế enzyme hemoserin dehydrogenase. 1.5. Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum: 1.5.1. Đặc điểm hình thái của Corynebacterium glutamicum: Bảng 1. 2 Đặc điểm hình thái của C. glutamicum. Kích thước 1-1.5 mm Hình dạng Trơn bong, tròn, đầy Đại thể Màu sắc Màu vàng nhạt Đặc điểm Hiếu khí Kích thước 1 x 1.5 - 2µm Hình dạng Hình que ngắn, có nhánh. Sắp xếp tế bào Chuỗi ngắn Vi thể Bào tử Không Gram + Khả năng di Không động Sinh lý, sinh pH 7 hóa Nhiệt độ 30 19
  28. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Catalase + Glucose + Gelatin + Sản lượng 32g/ml lysine Ngoài ra, C. glutamicum có vách tế bào chứa arabino-galatan và acid mycolic gồm 26-36 cacbon, có thể cô lập từ đất, thành phần GC là 54.1%, có quan hệ rất gần với vi khuẩn có C. melassecola, Brevibacterium thiogenitalis, B. lactofermentum và B . flavum, hai cơ thể sinh vật sau được chứng minh là những giống của C. glutamicum. Hình 1. 18 Corynebacterium glutamicum [39]. 1.5.2. Bộ gen của Corynebacterium glutamicum: 1.5.2.1. Phân tích hệ thống gen Corynebacterium glutamicum-xác định tất cả gen từ việc bổ sung đường để tiết lysine.[39] 20
  29. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hơn 10 năm qua, nhờ kĩ thuật di truyền các nhà sinh học phân tử đã điểu khiển được con đường quan trọng trong việc sản xuất L-lysine. Khi mô tả hệ thống gen với mục đích là điều chỉnh quá trình trao đổi chất trong những giống sản xuất C. glutamicum hướng tới hiệu quả chuyển đổi cao cơ chất glucose thành sản phẩm cuối cùng L-lysine. Các phương pháp như đột biến gen nhảy, chuyển DNA bằng kỹ thuật điện biến nạp chuyển những phần nhỏ của plasmid hoặc đột biến gen gián đoạn và thay thế gene đã được thiết lập một cách thành công cho Corynebacterium để tối ưu hóa giống nhờ thực hiện kỹ thuật di truyền. Một loạt các gene C. glutamicum đã được tạo dòng nhờ sự bổ sung đầy đủ của heterologous những thể đột biến E. coli hoặc bằng cách sử dụng kỹ thuật PCR. Hơn nữa, các tác động của hầu hết các gene trong việc tổng hợp lysine acid amin trên con đường sản xuất amino acid đã được thiết lập. Tuy nhiên, mặc dù sự thành công về kĩ thuật trao đổi chất còn có một số bí mật vẫn còn tồn tại trong các con đường chuyển hóa trung tâm của vi khuẩn nhóm coryneform cái mà không chỉ quan trọng đối với khoa học thế giới mà còn là sự quan tâm lớn đối với kĩ thuật sinh học công nghiệp. Chỉ có một ít kiến thức về các quy luật của các mạng lưới tiêu thụ đường trong C.glutamicum và về ảnh hưởng đến hiệu suất tăng trưởng. Các công cụ mạnh nhất để điền vào các thông tin vào mảng kiến thức này là phân tích về toàn bộ trình tự hệ thống gen. Ngày nay, việc xác định toàn bộ hệ thống gen của một cơ thể được thực hiện trong vòng một thời gian nhất định và ít tốn công sức. Toàn bộ hệ gen của 27 vi sinh vật đã được xác định trình tự và có thể truy cập dữ liệu trong cơ sở dữ liệu công cộng, các chú thích của 17 hệ gen là tiến bộ và hơn 70 dự án xác định trình tự gen sẽ được hoàn tất trong vòng năm đầu tiên của thiên niên kỷ mới (www.tigr.org, www.ncbi.nlm.nih.gov, www.geta.life.uiuc.edu). Với sự phát triển của những khả năng xác định trình tự đạt mức cao thì trình tự hệ gen đã cung cấp thông tin về tất cả các gen xác định trong một cơ thể như C.glutamicum. Trong năm 1999, các công ty sản xuất các amino acid như công ty BASF, Degussa và Kyowa Hakko đã hoàn tất việc xác định trình tự hệ gen C.glutamicum. Về nguyên tắc, có hai cách khác nhau để bắt đầu một dự án xác 21
  30. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu định trình tự, xác định trình tự hệ gen bằng súng bắn gen và việc xác định trình tự đó dựa vào những thư viện về trật tự cosmid/bac. Phương pháp súng bắn gen Shotgun: ở đây hệ gen được cắt một cách ngẫu nhiên và trình tự DNA trong khoảng 1,5 kb thì được chèn vào những plasmid có trình tự đã được xác định. Những đoạn chèn nhỏ này thường chỉ chứa một phần của một gene do đó thì thích hợp với sự trao đổi chất của tế bào. Sử dụng kỹ thuật này, một lượng DNA lớn hơn phải được xác định trình tự để cung cấp đầy đủ các sự thừa thải (gấp khoảng 10) để tập hợp tính toán với những trình tự lặp đi lặp lại. Trong thời gian gần đây, những bất lợi này được đền bù bằng chi phí xác định trình tự thấp hơn và thông tin về sinh học rõ hơn. Thư viện trật tự cosmid/BAC. Các phương pháp tiếp cận khác được dựa trên các thư viện cosmid hoặc BAC, được biểu diễn những phần che lấn lên nhau tối thiểu bằng kỹ thuật lai tại chỗ. Bằng cách này sự thừa thải cần thiết thì được tối thiểu hoá. 1.5.2.2. Xác định trình tự hệ gen của C. glutamicum sản xuất amino acid: Đối với việc giải mã gen C. glutamicum, Degussa AG áp dụng chiến lược bằng cách sử dụng một bản đồ vật lý của hệ gen như một điểm bắt đầu. Được biết, nhiều gene từ C. glutamicum được biểu hiện một cách hiệu quả trong E. coli dẫn đến hiệu ứng độc hại làm cho nhân dòng của nhiều khu vực của hệ gen trên vector có bản sao chép cao rất khó khăn hoặc không thể đạt được. Tương tự như những bài thí nghiệm được tiến hành để xác định trình tự gen Bacillus subtilis. Bằng cách xác định trình tự gen Mycobacterium tuberculosis, một số yếu tố DNA lặp đi lặp lại được xác định. Ngoài ra, khoảng 10% khả năng mã hóa của hệ gen được hiện diện bởi hai polymorphic khác nhau lặp đi lặp lại những trình tự. Bởi vì Mycobacterium tuberculosis thì liên quan đến Corynebacterium glutamicum nên những sự kiện tương tự đã được dự kiến cho các dự án xác định trình tự này. Vì vậy, các bản đồ vật lý được cung cấp một khuôn khổ quan trọng trong suốt cả kế hoạch xác định trình tự gen. Chiến lược đã được chia thành 6 bước: 22
  31. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu (i) Hệ gen C. glutamicum đã được cắt bằng cách sử dụng ba enzyme cắt giới hạn hiếm thấy là SwaI, PacI và PmeI và với kĩ thuật PFGE, một bản đồ vật lý của hệ gen đã được thành lập. Khoảng 40 gen được biết từ cơ sở dữ liệu phổ biến trên bản đồ nhờ kĩ thuật lai tại chỗ. (ii) Một thư viện cosmid của khoảng 2300 cosmid đã được thành lập. (iii) Thư viện cosmid đã được xem xét và những dòng có phần lấn ác nhỏ nhất được chọn lựa từ thư viện nhờ kĩ thuật lai tại chỗ bằng cách sử dụng bản đồ vật lý như là một hướng dẫn trong suốt dự án. (iv) Xác định trình tự của hệ gen 3.282 Kbp của C. glutamicum ATCC 13032 bằng một cosmid-của- chiến lược trình tự cosmid. Một thiết lập của 98 cosmid bao gồm khoảng 90% toàn bộ hệ gen được nhân dòng và xác định trình tự. (v) Tập hợp dữ liệu, xác định các khoảng trống còn lại. (vi) Hoàn thành các khoảng trống còn lại trong trình tự 3,282 Kbp được tiến hành bằng cách thiết lập một thư viện BAC và sau đó xác định trình tự khoảng trống còn lại trên các mẫu BAC. Hình 1. 19 Hệ gen của Corynebacterium glutamicum [39]. 23
  32. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.5.3. Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum: Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum là đối tượng vi sinh vật có quy trình trao đổi chất của tế bào được nghiên cứu hơn 40 năm qua. Sau khi khám phá ra chúng như là một vi khuẩn bài tiết L-glutamate thì những giống đột biến hữu ích cho sản xuất lên men L-glutamate trên một quy mô lớn đã được gây giống. Đột biến gen và lên men quy mô nhỏ đã được thực hiện để lựa chọn trong số hàng trăm giống tìm ra giống có khả năng sản xuất cao nhất. Giống sau này sau đó phải chịu đột biến gen lần nữa để thích nghi quy mô lên men nhỏ để lựa chọn lại giống tốt nhất. Các bước này được lặp đi lặp lại nhiều lần để tạo một dòng có thể sản xuất L- glutamate tăng lên rỏ rệt. Rõ ràng, những giống có khả năng sản xuất cao được thực hiện bằng những nguyên tắc này. Sự cô đặc thu được lượng L-lysine và L- glutamate vượt quá 150g/l với sản lượng hơn 0.5g/g chất khô. Về cơ bản cùng một nguyên tắc áp dụng để có được. 1.5.4. Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp: Sản xuất trên quy mô lớn với C. glutamicum đã bắt đầu vào trước những năm 1958 trong kế hoạch của Kyowa Hakko ở Nhật. Những công ty khác tham gia vào việc kinh doanh và sau đó suốt 4 thập kỉ sản xuất với C. glutamicum, quy trình sản xuất lysine bằng kỹ thuật sinh học đã được cải thiện liên tục bằng các kỹ thuật cải tiến giống. Những tối ưu này làm cho lượng lớn lysine đủ để đáp ứng nhu cầu ngày nay. Bảng 1. 3 Thống kê lượng amino acid được sản xuất hiện nay. Quy mô sản xuất Amino acid Phương pháp sản Mục đích sử dụng (tấn/năm) xuất ưa chuộng 1200000 L-Glutamate Lên men Tăng mùi vị 600000 L-lysine Lên men Bổ sung thức ăn 550000 D,L-Methionine Tổng hợp hóa học Bổ sung thức ăn 40000 40000 L-Threonine Lên men Bổ sung thức ăn 16000 Glycine Tổng hợp hóa học Bổ sung thực phẩm, chất tạo vị ngọt 14000 L-Aspartate Enzyme xúc tác Tạo vị ngọt, polymer 24
  33. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 13000 L-Phenylalanine Lên men Tạo vị ngọt 4500 L-Cysteine Giảm lên men Bổ sung thực phẩm, cystine dược phẩm. 3500 L-Cystine Lên men, tách chiết Cysteine,dược phẩm 2000 t-Arginine Lên men, tách chiết Dược phẩm, chất tạo vị ngọt. 15000 L-Alanine Lên men, tách chiết Chất tạo vị ngọt 1200 L-Tryptophan Lên men Thức ăn, dược phẩm 1200 L-Leucine Lên men, tách chiết Dược phẩm 1000 L-Valine Lên men, tách chiết Dược phẩm 500 Lên men, tách chiết Dược phẩm Dựa vào bảng 1.3 ta thấy lượng L-lysine được sản xuất hàng năm cũng rất lớn chỉ đứng sau L-Glutamate. Chi phí sẽ quyết định vị trí của những nhà máy sản xuất. Những yếu tố chính bao trùm là giá của nguồn carbon và thi trường địa phương. Những nhà máy sản xuất L-glutamate với lượng lớn có mặt trên khắp thế giới, nhiều nhất ở Viễn Đông, như Thái Lan và Indonesia nhưng trường hợp của L- lysine thì lại khác. Chỉ có khoảng 1/3 thị trường trên thế giới ở vùng Bắc Mỹ có điều kiện thuận lợi, chẳng hạn như nguyên vật liệu cung cấp cho quá trình lên men. Trong hầu hết các trường hợp, những công ty sản xuất L-lysine đều có mối liên hệ với công nghiệp xay ngô, có sự nối kết các dự án cũng như có mối liên hệ với các nhà cung cấp đường rẻ. Điều này minh họa cho một chi tiết, đó là việc sản xuất amino acid thương mại đang được phát triển mạnh mẽ, thay đổi nhiều lĩnh vực và tác động toàn cầu. 1.6. Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum: 1.6.1. Khái niệm: Cải tạo giống là quá trình làm đổi mới một phần bộ máy di truyền của tế bào nhằm đáp ứng nhu cầu, mục đích sử dụng của con người. Có nhiều phương pháp cải tạo giống cho động vật, thực vật và vi sinh vât.Mỗi phương pháp có nhiều ưu điểm và nhược điểm đặc trưng, tùy theo mỗi hòan cảnh và mỗi đối tượng mà ta chọn lựa phương pháp thích hợp. 25
  34. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.6.2. Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum: 1.6.2.1 Huấn luyện thích nghi: [2] Nguyên tắc của phương pháp: Khả năng thích nghi với điển kiện sống của vi sinh vật rất cao do cơ thể chúng là cơ thể đơn bào. Mọi tác động của môi trường đều có thể là những tác động trực tiếp. Mặt khác, cơ thể vi sinh vật thực hiện những quá trình trao đổi chất, sinh sản, phát triển rất nhanh trong một chu kỳ sống rất ngắn. Do đó giai đoạn thích nghi phải được xảy ra nhanh và mạnh trong một giai đọan phải rất ngắn so với chu kỳ phát triển và chu kỳ sống của chúng. Khi đã tạo được khả năng thích nghi của giống vi sinh vật đối với một tác động môi trường nào đó phải luôn luôn duy trì tác động đó ở mức độ tạo ra tính thích nghi. Thực chất của tính thích nghi là thường biến nên không di truyền, do đó đặc điểm này không bền, dễ bị mất đi khi ngưng tác động hoặc làm thay đổi mức độ tác động. 1.6.2.2. Kỹ thuật di truyền:[1], [4], [9] a. Kỹ thuật di truyền cổ điển: Phương pháp lai: là tiến hành cho lai giữa hai tế bào có đặc điểm di truyền tốt khác nhau để tạo ra dòng chứa đặc điểm di truyền tốt của cả 2 tế bào ban đầu. Phương pháp này không phức tạp nhưng có sự giới hạn về sự pha trộn đặc tính di truyền chỉ trong một vài loài. Phương pháp gây đột biến nhân tạo nhờ tác nhân hóa học (acid nitric – HNO2), Bromode xiuridine, 5-bromuraxil, EMS, MMS, EI, NG ) hoặc tác nhân vật lý (tia tử ngoại): là phương pháp gây đột biến điểm, đột biến này nằm trong cấu trúc của các nucleotide ( trong cấu trúc của các base chứa nitơ). Ưu điểm: Dễ thực hiện, tạo ra được giống vi sinh vật có rất nhiều đặc tính quý. Nhược điểm: Tần số xảy ra đột biến thấp, không định hướng, không ổn định. 26
  35. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Do những nhược điểm trên mà kĩ thuât di truyền cổ điển ít được sử dụng để cải tạo Corynebacterium glutamicum mà thường áp dụng các kĩ thụật hiện đại. b. Kỹ thuật di truyền hiện đại: Kỹ thuật sử dụng polyethylenglycol (PEG): Các protoplast sẽ được biến nạp trong điều kiện có PEG và ion Ca2+. Tần số biến nạp khỏang 105- 106 thể biến nạp/mg DNA. Để đạt được hiệu suất biến nạp cao, trước khi biến nạp DNA cần phải được methyl hóa để tránh việc giới hạn của vật chủ. PEG không chỉ hữu dụng trong biến nạp mà còn hữu dụng trong quá trình dung hợp protolast của các chủng Corynebacterium sinh tổng hợp lysine. Kỹ thuật sử dụng calcium phosphate (calcium phosphate technique) đã được phát triển đầu tiên là để xác định sự lây nhiễm của DNA virus (Graham,1973) và hiện nay được sử dụng rộng rãi để thử nghiệm hoạt động biến nạp của DNA virus cũng như DNA tách chiết từ các tế bào eukaryote (Wigler, 1978; Graham, 1979; Pellicer, 1980). Kỹ thuật này yêu cầu ủ các tế bào nhận với các chất đồng kết tủa DNA và calcium phosphate. Kết tủa này bám vào tế bào và sau đó sẽ hấp thụ vào tế bào qua quá trình ẩm bào (Loyter, 1982). Trong tế bào, các phân tử DNA ngoại lai nằm trong không bào được tạo thành do tế bào và lysosome thứ hai nhưng rất ít DNA đi đến nhân và hợp nhất vào genome chủ. Cho đến nay, đây là kỹ thuật vô cùng có giá trị đối với các nghiên cứu chuyển gen vào các tế bào soma nuôi cấy và đang được sử dụng nhiều để chuyển các dòng genome vào tế bào đích. Tỷ lệ các tế bào được biến nạp ổn định của kỹ thuật này là tương đương với phương pháp vi tiêm nhưng khác với vi tiêm là nhiều tế bào được biến nạp cùng một lần. Hơn nữa, biến nạp DNA tách chiết từ các tế bào ung thư vào các tế bào nhận không ung thư đã cho thấy đây là phương pháp duy nhất để nghiên cứu sự kiểm soát di truyền của ung thư. Phương pháp này được sử dụng phổ biến bởi vì đơn giản, protocol dễ thực hiện, ít tốn kém, số tế bào chết sau biến nạp không đáng kể, sự biểu hiện gen có thể là nhất thời hoặc ổn định và quan trọng trong việc thiết kế vector virus tái tổ hợp. Tuy nhiên hiệu quả biến nạp và mức độ biểu hiện của gen chuyển thấp dựa vào sự hình 27
  36. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu thành một phức hợp DNA-calcium dễ được tế bào thu nhận qua cơ chế thực bào.[1] Kỹ thuật điện biến nạp: dung dòng điện có điện áp cao có khả năng tạo lỗ thủng trên màng tế bào khiến DNA từ môi trường dễ xâm nhập vào bên trong. Lực điện trường là 12,5kV/cm. Phương pháp này ít tốn thời gian, dễ thực hiện và rất phổ biến. hiệu quả 4.107 thể biến nạp. Phương pháp tiếp hợp hay dùng plasmid chuyển gen từ vi khuẩn gram âm (E. coli) vào vi khuẩn gram dương (Corynebacteria). Quá trình tiếp hợp này được thực hiện bằng cách sử dụng màng lọc nitrocellulose, màng lọc này dùng làm giá thể cho vi khuẩn. Ta có thể xử lý nhiệt cho chủng Corynebacteria glutamicum ở 48-49°C trong 9 phút để tăng tính hữu thụ. 1.6.3 Các plasmid nội sinh của Corynebacteria glutamicum sử dụng trong việc thiết kế vector: Bảng 1. 4 Các plasmid nội sinh của Corynebacterium được sử dụng trong việc thiết kế vector [4]. Tên plasmid Nguồn gốc Kích Marker Tài liệu tham khảo thước (kb) pTP10 C. xerosis 50 Tc,Cm,Em,Km Kono ET AL.,1983 pHM1519 C. glutamicum 3.055 cryptic MIWA etal.,1984 pCC1 C. callunae SANDOVAL et al., 4.2 cryptic 1984 pCG2 C. glutamicum 6.8 cryptic OZAKI et al., 1984 pCG4 C. glutamicum Katsumata ET 26 Spc, Str AL.,1984 pXZ10145 C. glutamicum 5.3 Cm ZHEN et al., 1987 PẢG C. melassecola 4.5 cryptic TAKEDA et al.,1990 pAG1 C. melassecola 20.4 Tc Takeda ET AL.,1990 pCL1 C. lilium 4.1 cryptic CHAN KWO 28
  37. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu CHION et al.,1991 pGÁ C. glutamicum 4.9 cryptic SONNEN et al.,1991 Dung hợp các loại phasmid trên với các vector, các vector thường được sử dụng là vector tạo dòng của E.coli, tạo ra hệ thống vector trên khuôn là plasmid cho Corynebacterium. Các loại plasmid nhỏ tiềm ẩn số lượng bản sao lớn. Một vài plasmid lớn hơn có mang gen kháng kháng sinh đã được phân lập. Trong các plasmid ở bảng trên, loại pBL1 và pHM1519 là được sử dụng nhiều nhất. Cả hai đơn vị sao chép được sử dụng để thiết kế các vector có đồng thời hai chức năng mà có thể sao chép ở E.coli và Corynebacteria, cũng như là các vector chỉ có một chức năng duy nhất. Các vector plasmid dựa trên cơ sở của các đơn vị sao chép này có khỏang từ 5-30 bản sao/1 tế bào vi khuẩn Corynebacterium. Hình 1. 20 Bản đồ cắt giới hạn của các plasmid pHM1519 và pBL1 của Corynebacterium glutamicum [4] Nhìn vào bản đố cắt giới hạn trên, ta thấy các vị trí cắt của enzyme cắt giới hạn trong khung đọc – mở lớn được suy ra từ các trình tự nucleotide. Đơn vị sao chép nhỏ (biều thị bằng đường gạch xiên) và vùng ori V (màu đen) được xác định trong pHM1519. 29
  38. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Chú ý các plasmid pHM1519, pBL1, pCG1, pGA1 có thể tồn tại trong cùng một tế bào. 1.6.4. Việc biểu hiện gen ở Corynebacterium glutamicum: Việc biểu hiện của các gen tương đồng và dị tương đồng ở Corynebacterium đòi hỏi những hiểu biết chi tiết về cấu trúc và chức năng của các tín hiệu phiên mã và dịch mã. Các tín hiệu khởi đầu dịch mã từ các vi khuẩn khác bao gồm E.coli hòan tòan có chức năng trong Corynebacterium. Khía cạnh tín hiệu phiên mã thì phức tạp hơn. Bằng cách sử dụng các vector dò tìm vùng promoter đã kiểm tra các promoter hiệu quả cao của E.coli như Ptrp, PlacUV5, Ptac, lPRPL ở Corynebacterium. Hiệu quả của những promoter này cũng như là tính chất điều hòa của chúng được xác định bởi các gen ức chế tương ứng Trp, LacI, CI. Điều này giới hạn việc thiết kế các vector biểu hiện cao bằng cách sử dụng hệ thống lacI/Plac. Để kết thúc phiên mã sử dụng một nhân tố kết thúc phiên mã nội sinh của B. lactofermentum. 1.6.5. Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate: 1.6.5.1. Các hướng truyền thống: Sau khi khám phá những khả năng của Corynebacterium glutamicum để bài tiết acid amin, sản xuất quy mô lớn lysine đã được bắt đầu bằng cách sử dụng thể đột biến khuyết dưỡng amin acid. Những thể đột biến sớm này đã hiển thị một khả năng sản xuất lysine vượt trội. Trong vòng 70 giờ, một trong những giống thế hệ đầu tiên là giống ATCC 13287 khuyết dưỡng homoserine được công khai vào năm 1961 là 2979439 US, thu sản lượng là 44g/l với sự chuyển đổi sản lượng xấp xỉ 26% g lysine HCl/(g đường). Ngoài ra sự phát triển giống đã được thực hiện bằng cách giới thiệu thêm những khuyết dưỡng amino acid bổ sung vào, khuyết dưỡng vitamin và chống lại sự ức chế trao đổi chất. Những giống này sản xuất lysine tăng đến một sản lượng chuyển đổi hơn 50% dựa trên lượng đường. Vào trước những năm 1970, đã có những nỗ lực để vượt qua những bất lợi của các giống khuyết dưỡng vì dịch lên men cần phải được bổ sung các nhân 30
  39. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu tố tăng trưởng xác định và dáng kể. Việc tìm kiếm những giống có những đòi hỏi thấp cho nhu cầu về phức chất dẫn đến như vậy gọi là leaky strains: con đường tổng hợp sinh học có nhiều thất thoát vẫn còn chức năng nhưng chỉ có thể cung cấp rất hạn chế số lượng theo nhu cầu trao đổi chất. Vì thế, việc trao đổi chất này sẽ trở nên hạn chế tốc độ tăng trưởng mà không cần hiển thị các mô hình trao đổi chất điển hình nghèo nàng. Hậu quả là dịch nội bào sẽ rất ít do đó tránh được sự ức chế ngược và sự ức chế của một enzyme quan trọng trong con đường sản xuất mong muốn. Ví dụ là những giống làm giảm hoạt động tổng hợp citrate hoặc giảm homoserine dehydrogenase. Sugimoto và cộng sự cho thấy sự đột biến leaky có thể được gây ra bởi một cơ sở dẫn đến những thay đổi có liên quan thay thế acid amin trong hoạt động xúc tác của các enzyme. 1.6.5.2. Kỹ thuật gen đối với các enzyme chìa khóa là Aspartase kinase và Dihydrodipicolinate Synthase: Con đường tổng hợp sinh hợp lysine từ oxaloacetate và pyruvate trong C. glutamicum xảy ra thông qua một con đường phân chia. Nhưng một con đường phân chia thì không đặc trưng cho một con đường tổng hợp sinh học. Điều đó đã được chứng tỏ rằng, thêm vào sự hình thành L - lysine thì cơ chế con đường tổng hợp này bảo đảm sự cung cấp đáng tin cậy của tế bào với chất trung gian D, L-diaminopimelate- một đơn vị liên kết quan trọng trong lớp peptidoglycan. Một trong những bước kiểm soát dòng chuyển hóa thông qua con đường tổng hợp là ở cấp độ của enzyeme aspartate kinase,nó được xem như là enzyme điển hình ở đầu con đường tổng hợp, enzyme kinase được kiểm soát trong hoạt động xúc tác. Hoạt động enzyme bị ức chế khi L-Lysine cộng L- threonine cùng có mặt vượt quá giới hạn cho phép của tế bào. Do đó, tầm quan trọng của điều này trong việc kiểm soát dòng chuyển hóa tại một trong những dòng của đối tượng sản xuất là việc kiểm soát phản ứng ngược thì được lấy ra nhờ những thể đột biến trong tiểu đơn vị β của enzyme kinase. Ngoài ra, một giống với hai bản sao của gen kinase đã được thực hiện và cho kết quả hiển thị tăng việc tích lũy L-lysine. 31
  40. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hình 1. 21 Con đường tổng hợp phân nhánh của L-lysine trong giống Corynebacteria glutamicum hoang dại. [10]. Enzyme aspartate kinase xúc tác phản ứng đầu tiên trong quá trình tổng hợp L-lysine. Enzyme này được chứng tỏ như là một enzyme chìa khóa trong tổng hợp sinh học L-lysine. Đối với Escherichia coli, ba enzyme đồng phân với các hoạt động và biểu hiện được kiểm soát bởi các cơ chế khác nhau. Ngược lại với E. coli, chỉ có một aspartate kinase đã được phát hiện trong C. glutamicum. Trong thời gian đầu của việc sản xuất lysine từ C. glutamicum, người ta thấy rằng enzyme aspartate kinase trong C. glutamicum bị ức chế bởi hai sản phẩm cuối của quá trình tổng hợp, đó là L-lysine và L-threonine và việc kiểm soát chính cho dòng carbon được điều hòa bằng phản ứng ức chế ngược. 32
  41. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Trong quá trình kiểm tra để có được giống kháng ức chế ngược, những thể đột biến kháng hỗn hợp L-lysine tương tự AEC (amino-ethyl-cysteine) và L-threonine được cô lập. Sự giảm tính nhạy cảm của aspartate kinase đối với phản ứng ức chế ngược là bước quan trọng nhất trong sự phát triển của giống để sản xuất L-lysine. Năm 1990, gen tương ứng của một thể đột biến kháng AEC, aspartate kinase kháng ức chế ngược của giống DM 58-1 với hoạt động của enzyme LysC hoàn toàn không nhạy cảm với sự ức chế ngược đã được cô lập. Sự đột biến hướng đến kháng AEC của gen lysC đã được thiết lập. Các nghiên cứu cho thấy locus lysC mã hóa aspartate kinase là gồm hai gene chồng chéo lên nhau, lysCa và lysCb với lysCβ chịu trách nhiệm cho việc kháng ức chế ngược của enzyme. Ngoài ra các enzyme có một cấu trúc thú vị được hiển thị trong hình 1.22. Hình 1. 22 Cấu trúc của Aspartate kinase [34]. Hai tiểu đơn vị α và hai tiểu đơn vị β của vị trí amino acid 421 và 171 tương ứng với nhau, dưới hình thức enzyme hoạt động với trình tự của các tiểu đơn vị β được đồng nhất với phần carboxy cuối cùng của tiểu đơn vị α. Xác định trình tự của một số gene lysC từ những giống mang aspartate kinase bị ức chế ngược cung cấp thêm bằng chứng rằng lysC β mã hóa tính năng quy định của các enzyme. 33
  42. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Được biết là protein LysC không nhạy cảm khi C. glutamicum tiết ra một ít L-lysine. Tạo dòng một gen lysC (fbr) trên plasmid có khả năng sao chép cao trong loại giống C. glutamicum hoang dã ATCC 13032 kết quả tích lũy khoảng 38 mM L-lysine so với không có sự tiết lysine của giống gốc. Trong một nghiên cứu gần đây sử dụng đột biến điểm, một thể đột biến gen lysC đã được xây dựng. Trong những thể đột biến gene này, thay thế nucleotide của codon 279 (threonine) của tiểu đơn vị α (tương ứng với vị trí acid amin 30 của tiểu đơn vị β) tiết lộ chín thể đột biến với sự đột biến các acid amin khác nhau tại điểm đột biến. Đối với thể đột biến vị trí proline giới thiệu tại vị trí 279, sự giảm nhiều nhất về khả năng nhạy cảm với ức chế L-lysine đã được quan sát. Sự đột biến này là rất có thể có hiệu quả mạnh nhất đến cấu trúc của các enzyme của tất cả vị trí các acid amin được chọn trong bài nghiên cứu này. Từ đó, trong vị trí proline, những phản ứng dây chuyền được cố định theo thứ tự của chuỗi protein, có ít sự thích nghi tự do trong sườn của chuỗi protein. Jetten và cộng sự phân tích ảnh hưởng của các bản sao của một gen aspartate kinase không bị ức chế ngược trong việc sản xuất L-lysine và sự tăng trưởng trong Brevibacterium lactofermentum ATCC 21799. Giống B. lactofermentum ATCC21799 đã được lựa chọn bởi vì khả năng kháng AEC cao của chúng và khả năng sản xuất lysine cao kết quả này có được nhờ một enzyme không bị ức chế ngược aspartate kinase. Trong nghiên cứu này, giống gốc đã được so sánh với một giống mang thể đột biến gen lysC có khả năng sao chép 2 lần cho thấy tốc độ tăng trưởng của hai giống thì không khác nhau nhiều nhưng giống với khả năng sao chép 2 lần bản sao lysC sản xuất L-lysine nhiều hơn một cách đáng kể. Với gen lysC(fbr) trên plasmid có số lượng bản sao chép cao thì giống tạo ra không tăng trưởng tốt như giống gốc nhưng sản xuất lysine với lượng lớn hơn. Tuy nhiên, tốc độ sản xuất lysine chậm hơn. Những kết quả này cho thấy trong một vài trường hợp enzyme aspartate kinase không bị ức chế ngược thì không đủ để vượt qua những bước giới hạn đầu tiên trong sản xuất L- lysine nhưng hoạt động enzyme tối ưu phải được điều chỉnh để tối đa hóa tốc độ sản xuất. 34
  43. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Bước thứ ba trong con đường tổng hợp sinh học L-lysine bắt đầu từ aspartate là sự kết hợp của L-aspartate semialdehyde với pyruvate để tạo ra l- 2,3-dihydrodipicolinate. Đây là phản ứng được xúc tác bởi enzyme dihydrodipicolinate synthase. Các enzyme synthase được đặt tại các điểm phân nhánh để chi phối quá trình trao đổi chất hoặc là lysine hoặc là threonine và cạnh tranh với enzyme homoserine dehydrogenase vì chúng cùng có cơ chất chung là L-aspartate semialdehyde. Tạo dòng và tăng biểu hiện của gen dapA mã hóa enzyme dihydrodipicolinate synthase cho thấy enzyme DapA có thể cung cấp một mục tiêu mạnh mẽ trong sự phát triển của đối tượng sản xuất L-lysine. Việc biểu hiện chỉ của gen dapA trong giống hoang dại ATCC 13032 có kết quả trong việc sản xuất vào khoảng 11 mM L-lysine. Đây là một kết quả tương tự như việc nâng cao biểu hiện enzyme aspartate kinase. Để phân tích chức năng của enzyme DapA trong con đường chuyển hóa tạo ra L-lysine, một vài giống đã được xây dựng với các cấp độ khác nhau của việc tăng biểu hiện gen dapA. Người ta thấy rằng mức độ biểu hiện của gen dapA có liên quan đến một dòng chuyển hóa giảm theo hướng homoserine dehydrogenase. Các giống với bản sao chép thứ hai của gen dapA đưa vào hệ gen, gen dapA được tạo dòng trên plasmid có số lượng bản sao thấp và trên plasmid có số lượng bản sao cao đã được thiết lập. Số lượng bản sao gia tăng của gene dapA dẫn đến tăng hoạt động của enzyme DapA và kết quả là gia tăng việc hình thành L-lysine. Tuy nhiên, thật thú vị là tốc độ tăng trưởng của giống tạo ra thì bị giảm so với sự gia tăng hoạt động của enzyme DapA. Điều này tương tự như kết quả của việc tăng biểu hiện gen lysC trong B. lactofermentum theo quan sát của Jetten và cộng sự. Một phản ứng chung của quá trình trao đổi chất đối với hoạt động của enzyme DapA đã trở nên rõ ràng. 35
  44. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Bảng 1. 5 Ảnh hưởng của số lượng bản sao dapA khác nhau trên tốc độ tăng trưởng, sự bài tiết L-lysine [34]. Giống Số bản sao Hoạt động Tốc độ tăng L-lysine Tốc độ dapA tổng hợp trưởng (h-1) nội bào bài tiết (mM) 13032 1 0.051 0.43 3 0.0 13032::dapA 2 0.072 0.37 6 0.25 13032/pKW3::dap 6 0.250 0.36 8 0.70 13032/pJC23 20 0.630 0.22 9 3.80 Với: Hoạt động của enzyme dihydrodipicolinate synthase (mmol.min-1.mg- 1protein) và tốc độ bài tiết (mmol.min-1(mg trọng lượng khô)-1). Hình 1. 23 Trình tự DNA của vùng promoter dapA [34]. Bên cạnh việc tăng số bản sao của một gene có một số cách để điều khiển trong biểu hiện gene ở prokaryotes. Một trong những cách này là để sửa đổi các tín hiệu bắt đầu phiên mã. Tuy nhiên, sự hiểu biết sẵn có về cấu trúc promoter trong C. glutamicum và cách thức làm thế nào để tối ưu hóa dấu hiệu phiên mã để gia tăng biểu hiện gen vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu về cấu trúc pronoter và chức năng trong C. glutamicum cho thấy hoạt động của promoter gen dapA là cao so với các promoter khác của vi khuẩn. Trong so sánh với E. coli hoặc B. subtilis, có sự bảo tồn thấp của vùng - 10 trong những promoter C. glutamicum và trong một số trường hợp, khu vực - 35 bị thiếu. Một sự phân tích về đột biến của promoter gen dapA đã được thực hiện nhằm xác định các khu vực đặc biệt và các nucleotide quan trọng đối với chức năng của gen đó. Đã phát hiện một khoảng rộng Ts sáu ở vị trí -55 đến -50 và 36
  45. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu một khu vực đã được mở rộng -10 là những yếu tố quan trọng nhất trong chức năng promoter. Đối với promoter gen dapA việc mở rộng khu vực -10 đã được xác định (AGGTAACCTTG) khu vực-35 không có. Vị trí khu vực này thì tương tự như E. coli sigma promoter phụ thuộc -70 với một mở rộng khu vực - 10. Vasicova và cộng sự đã chứng minh rằng hoạt động promoter dapA có thể được tăng lên 3,9 lần sự thay thế một nucleotide trong việc mở rộng vùng-10 (Hình 1.23). Các nghiên cứu với những thể đột biến C. glutamicum MH20-22B mang một bản sao thứ hai của gene dapA với promoter loại hoang dại hoặc sự đột biến MA16 hoặc MC20 đã được thực hiện (Bảng 1.4). Theo dự kiến, hoạt động của enzyme DapA của những giống đã được tăng cường đáng kể so với giống gốc H20-22B dẫn đến kết quả là tăng cường việc sản xuất L-lysine . Kết luận: Công nghệ gen trong sản xuất L-lysine ở Corynebacterium glutamicum là ngăn chặn hiệu ứng ức chế ngược cho aspartokinase, sau đó các mức độ enzyme riêng lẻ có thể được gia tăng bằng các khuếch đại siêu biểu hiện các gen quan trọng trong con đường sinh tổng hợp. Có hai phương pháp khác nhau để ngăn cản sự ức chế ngược đối với aspartokinase. Một là chọn lọc các thể biến dưỡng homoserine để không tạo ra nhiều thremosine. Hai là liên quan tới việc sử dụng các đồng đẳng acid amin để chợn lọc các chủng đột biến có aspartokinase không nhạy cảm với tác nhân ức chế ngược. Đồng đẳng của lysine được sử dụng rộng rãi là S-(-2-aminoethyl-)-L-cystine (AEC)- phương pháp tạo dòng các gen kháng AEC. Ngoài ra, người ta còn tạo dòng và tăng cường biểu hiện enzyme dihydrodipicolinate synthase nhằm tăng khả năng sản xuất lysine và kiểm soát việc sản xuất L-lysine ở mức độ xuất lysine ra ngoài (Hình 1.23). 1.7. Cố định tế bào vi sinh vật: 1.7.1. Định nghĩa cố định tế bào: Theo định nghĩa của hội Công nghệ enzyme, cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị trong một khu vực không gian nhất 37
  46. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu định sao cho các tế bào đó giữ được tính chất xúc tác sinh học của chúng và có thể sử dụng lại nhiều lần. Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn các tế bào vào chất mang không hòa tan trong nước. Tế bào sau khi được cố định có thể sử dụng được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn [7]. 1.7.2. Phương pháp cố định tế bào: Có nhiều cách để phân loại các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật. Tuy nhiên các phương pháp cố định vi sinh vật có thể tóm tắt như sơ đồ sau đây . Cố định tế bào vi sinh vật Trên bề mặt Trong lòng chất mang Không mang chất chất mang Liên Hấp Nhốt Nhốt Liên Màng kết phụ trong trong cấu kết Membrance cấu trúc hệ trúc gel chéo sợi Hình 1. 24 Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào [15]. 1.7.3. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: 1.7.3.1. Chất mang vô cơ: Thông dụng là vật liệu thủy tinh xốp, vật liệu oxit kim loại (nhôm oxit, mangan oxit, magie oxit, titan oxit), diatomite (celit) và gốm. Đặc điểm: cấu trúc lỗ xốp, kích thước các lỗ này có thể điều chỉnh được. Có khả năng hấp thụ tốt các enzyme và tế bào. 1.7.3.2. Chất mang hữu cơ: Polymer tổng hợp: gồm một số polymer như polystyren, polyvinylalcol, polyacrylamid, polyvinylacetate, polyacrylic dùng cố định enzyme và tế bào bằng phương pháp nhốt trong lòng chất mang. 38
  47. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Polymer sinh học: chất mang protein: gellatin, keratin, albumin. Cố định tế bào bằng phương pháp nhốt trong cấu trúc gel. Chất mang polysaccharid: cellulose, agarose, sephadex, và dẫn xuất. Ngoài ra, còn có nhiều vật liệu khác như tinh bột, chitin, chitosan, alginate, carrageenan. 1.7.4. Chỉ tiêu đánh giá hiệu quả cố định tế bào: Khả năng sống của tế bào trong chất mang: lượng tế bào còn sống sót và hoạt động sau một thời gian nhất định; khả năng chuyển hóa cơ chất và thành phần dinh dưỡng đi vào; sản phẩm trao đổi chất đi ra. Độ bền cơ học của chất mang: sức chịu đựng của chất mang ở pH, nhiệt độ, lực tác động của môi trường và của lực khuấy, lực thổi của không khí đưa vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật. Khả năng bảo vệ vi sinh vật trong chất mang, tính đến yếu tố bất lợi với điều kiện ngoại cảnh. Khả năng tái sử dụng nhiều lần, quá trình sản xuất liên tục vi sinh vật không bị rửa trôi [3]. 1.8. Công nghệ lên men L-lysine: 1.8.1. Các vi khuẩn lên men L-lysine: Có nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp L-lysine. Tuy nhiên,với qui mô sản xuất công nghiệp, các chủng đột biến được sử dụng phổ biến hơn vì chúng có hoạt lực cao hơn so với chủng gốc ban đầu. Đặc điểm của các chủng này là chúng cần lượng biotin cao hơn chủng gốc và chịu được nồng độ đường cao hơn 20%, đặc biệt là cần một số acid amin cho tăng trưởng và sinh tổng hợp L-lysine. Một số chủng được dùng để sản xuất L-lysine như: Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Micrococcus glutamicum, Brevibacterium lactofermentum. Trong đó, Corynebacterium glutamicum là chủng có ưu thế trong công nghiệp hơn do điều kiện nuôi cấy phù hợp với quy mô lớn, L-lysine là sản phẩm được Corynebacterium glutamicum tổng hợp và bài tiết ra ngoài, khả năng tổng hợp lysine với mức độ cao, sống được trên môi trường có hàm lượng methionine cao và threonine thấp. Chúng không có enzyme L-homoleucine dehydrogenase nhưng chúng có giai đoạn cân bằng sinh khối và thời gian thu nhận sản phẩm bậc hai dài. Đã thiết kế được các chủng Corynebacterium glutamicum đột biến để 39
  48. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu sử dụng như các chủng siêu tổng hợp lysine (điều hòa được con đường sinh tổng hợp lysine) [6]. 1.8.2. Môi trường lên men: Thành phần môi trường lên men là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng tới quá trình lên men, thường là đối tượng cho những nghiên cứu tối ưu hóa và phát triển công nghệ. Môi trường lên men phải thích hợp cho sự phát triển và sản xuất của vi sinh vật. Môi trường được sử dụng lên men thu nhận L-lysine bao gồm: môi trường xác định cần cho sự phát triển của vi sinh vật đòi hỏi những chất dinh dưỡng và các chất bổ sung cần thiết hoặc môi trường chọn lọc không xác định chứa chất hữu cơ tự nhiên như dịch thủy phân đậu nành, nước chiết ngô, cao nấm men hoặc peptone. Môi trường lên men phổ biến trong sản xuất L-lysine chứa nguồn carbon và nitơ phong phú, những ion vô cơ và những nguyên tố vi lượng (Fe2+, Mn2+ ), các aminoacid, vitamin (biotin, thiamine-HCl, Nicothin amide) và nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp. Sự tổng hợp thừa của gen chỉ đạt được khi tối ưu hóa các yếu tố môi trường và kỹ thuật lên men dựa vào những thông số và bản chất gen [30]. 1.8.2.1. Nguồn Carbon: Thể đột biến của Corynebacterium và các giống vi sinh vật cùng họ có khả năng sản xuất các amino acid với chi phí thấp từ nguồn carbon rẻ tiền bằng cách lên men trực tiếp. Nhiều loại carbohydrate được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp trong sản xuất L- lysine như glucose, fructose, sucrose, mật rỉ ( chứa cả glucose, fructose, sucrose, v.v ), maltose, tinh bột thủy phân, cellulose thủy phân, acid hữu cơ (như acid acetic, acid propionic, acid benzoic, acid fomic, acid malic, acid citric, acid fumaric), rượu ( như etanol, propanol), glycerol, hydrocacbon, tinh dầu và chất béo (dầu từ hạt đậu nành, hoa hướng dương, đậu phộng, dầu dừa) cũng như acid béo (acid palmitic, acid stearic, acid inoleic). Những chất này được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với nhau [30]. Mật rỉ đường (từ mía, củ cải đường), tinh bột thủy phân (glucose) từ 40
  49. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu ngô và khoai mì được sử dụng rộng rãi trong sản xuất các aminoacid. Các nguồn carbon đó được sử dụng khác nhau tùy thuộc vào vị trí địa lý , nơi có các loài thực vật tương ứng. Chẳng hạn như tinh bột thủy phân từ ngô, syrup ngô là nguồn carbon thường được sử dụng ở Mỹ, trong khi đó mật rỉ đường được sử dụng ở Châu Âu và Nam Mỹ, xuất phát từ giá cả và nguồn có sẵn ở các vùng này. Khoai mì chứa tinh bột gọi là tinh bột sắn được trồng nhiều ở vùng nhiệt đới như Indonesia,Thái lan. Do đó, ở Nam Á, tinh bột sắn thủy phân được sử dụng để sản xuất amino acid [22]. a.Mật rỉ: Đây là nguồn nguyên liệu rẽ tiền, đồng thời là những thứ liệu của các ngành công nghiệp sản xuất đường từ mía hay củ cải đường. Những đặc tính quan trọng phù hợp với quá trình lên men của mật rỉ bao gồm: chứa hàm lượng đường cao, ngoài đường saccharose ra còn chứa rất nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, trong đó có vitamin H (Biotin). Tuy nhiên, muốn sử dụng chúng cho quá trình lên men đòi hỏi phải có các quá trình xử lý thích hợp vì: Rỉ đường thường có màu nâu sẫm. Sau lên men, chúng sẽ bám vào sinh khối vi sinh vật và bám vào sản phẩm. Việc tách màu ra khỏi sinh khối và sản phẩm thường rất tốn kém và rất khó khăn. So sánh giữa hai loại mật rỉ thì mật rỉ từ cây mía có màu sẫm hơn mật rỉ nhận từ sản xuất củ cải đường. Do đó ở một số nước chỉ có mật rỉ từ mía, người ta phải trộn thêm mật rỉ từ củ cải hoặc phải xử lý trước khi tiến hành quá trình lên men. Thứ hai là hệ keo trong mật rỉ. Keo càng nhiều, khả năng hòa tan của oxy càng kém và khả năng trao đổi chất của vi sinh vật càng kém. Do đó công việc quan trọng nhất khi sử dụng mật rỉ là phải phá hệ keo này. Người ta thường sử dụng acid sunfuric đậm đặc để xử lý với hàm lượng khoảng 3,5 kg / một tấn mật rỉ bằng 1 trong 3 cách sau để nhằm mục đích khử keo và màu nâu sẫm của mật rỉ: 41
  50. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Cách thứ nhất: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta khuấy đều ở nhiệt độ thường trong thời gian 24h, sau đó ly tâm thu dịch trong. Cách thứ hai: Khi cho 3,5kg H2SO4 vào một tấn mật rỉ, người ta đun toàn bộ lên 85oC và khuấy đều liên tục trong 6h, sau đó ly tâm thu dịch trong. Cách thứ ba: Cho H2SO4 đến khi pH của mật rỉ đạt được giá trị là 4, người ta đun nóng đến 120-125oC trong một phút để các chất vô cơ kết tủa, sau đó ly tâm thu dịch trong [2]. Tuy nhiên, việc sử dụng mật rỉ có nhiều vấn đề: Việc vận chuyển mật rỉ đường từ nhà máy đường đến nơi lên men tạo thêm chi phí. Chất lượng mật rỉ cũng dễ bị thay đổi theo thời gian. Do đó,xu hướng hiện nay đang chuyển từ việc sử dụng mật rỉ đường sang nguồn carbon tinh khiết như là tinh bột thủy phân [21]. b. Tinh bột:  Khoai mì Trong nhiều quá trình lên men, khoai mì được coi như là nguồn nguyên liệu chứa tinh bột rất thuận lợi. Khoai mì chứa nhiều chất khoáng như kali, natri, photpho ,magie, sắt. Các khoáng chất này rất cần cho vi sinh vật phát triển và chuyển hóa các sản phẩm thứ cấp. Giá cả thường rẽ và dễ trồng nên được sử dụng nhiều trong quá trình lên men. Trong công nghệ lên men, người ta thường sử dụng bột khoai mì khô vì khoai mì tươi thường khó bảo quản. Khoai mì phải trải qua quá trình đường hóa và dịch hóa để chuyển tinh bột thành glucose để sử dụng cho quá trình lên men, quá trình này được thực hiện bằng enzyme hay thủy phân hóa học [2].  Ngô Ngô là nguồn nguyên liệu rất thông dụng trong quá trình lên men.Thành phần hóa học của ngô chứa nhiều glucid,protein, lipid.Ngô có 42
  51. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu thể bảo quản lâu, dễ mua và rẻ tiền. Cũng như khoai mì, ngô cần phải qua quá trình thủy phân trước khi sử dụng để lên men [2]. 1.8.2.2. Nguồn Nitơ: Nhiều nguồn nitơ khác nhau được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp trong sản xuất L-lysine quy mô phòng thí nghiệm và trong công nghi ệp , bao gồm những hợp chất vô vơ như: dung dịch ammonia ở dạng dung dịch hoặc khí, muối ammonium. Nguồn nitơ tự nhiên từ các nguyên liệu hữu cơ như dịch thủy phân đậu nành, dịch thủy phân protein (nitơ tổng khoảng 7%), dịch thủy phân đậu nành, nước chiết bắp, dịch thủy phân casein, cao nấm men, dịch chiết thịt, dịch chiết malt, urea, peptone, và các amino acid khác [30]. Trong đó, muối ammonium ( như ammonium sulfate) hoặc ammonia nguyên chất được sử dụng phổ biến. Ammonium sulfate dễ dàng mua được vì nó là phụ phẩm của nhiều ngành công nghiệp lớn như sản xuất caprolactam . Ammonia sử dụng trong quá trình lên men ở dạng dung dịch nồng độ 25% hoặc ở dạng khí. Nitrogen có thể bổ sung vào môi trường ban đầu bằng muối ammonium hoặc bằng cách đều chỉnh pH bằng ammonia [22]. 1.8.2.3. Các muối vô cơ, khoáng vi lượng,các chất kích thích sinh trưởng: Bên cạnh nguồn carbon và nitơ, các thành phần cần thiết được thêm vào môi trường lên men lúc đầu hoặc cho vào thành nhiều đợt trong suốt quá trình lên men L-lysine, như muối vô cơ của các kim loại: Mg (Magie sunfat), Ca, Na, K, Mn, và Zn hoặc một lượng rất rất nhỏ của các kim loại khác. Acid H3PO4, KH2PO4, K2HPO4 và các muối natri tương ứng được sử dụng phổ biến như là nguồn phospho cho sản xuất L-lysine. Những chất cần thiết cho sự phát triển vi sinh vật như amino acid, vitamin (B1) và các tiền chất thích hợp cũng được thêm vào môi trường lên men chỉ một lần hoặc từng đợt [30]. 1.8.2.4. Khử trùng môi trường: Môi trường được chuẩn bị bằng cách tiệt trùng theo mẻ hoặc liên tục. Mặc dù việc tiệt trùng theo mẻ không hiệu quả, nhưng nó vẫn được áp dụng phổ biến đối với các mẻ môi trường dưới 20m3 vì giảm được chi phí đầu tư. Đối với những mẻ môi trường lớn, tiệt trùng liên tục có nhiều ưu điểm vì nhiệt độ trong tiệt trùng theo mẻ gây biến tính một số thành phần trong môi trường. 43
  52. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Hơn nữa, nhiệt độ cao nhất trong giai đoạn đun nóng của chu trình tiệt trùng theo mẻ thì không phù hợp. Nguồn carbon và nitơ thường được tiệt trùng riêng biệt để tránh phản ứng Maillard [21]. 1.8.3. Các phương pháp lên men: 1.8.3.1. Lên men batch và fed-batch: Hầu hết các quá trình lên men amino acid trong công nghiệp đều sử dụng quá trình lên men batch hoặc fed-batch. Trong lên men batch, quá trình nuôi cấy bắt đầu khi môi trường (ngoại trừ ammonia để điều chỉnh pH) được đưa vào fermentor cho đến khi lượng đường trong môi trường sử dụng hết. Trong fed batch, một phần môi trường được đưa vào fermentor và các chất dinh dưỡng được thêm vào gián đoạn hoặc liên tục trong suốt quá trình nuôi cấy cho đến khi đạt được lượng sản phẩm tối đa. Điểm cơ bản của fed batch là hàm lượng chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy có thể kiểm soát được. Mặc dù lên men batch dễ dàng thực hiện và không cần thêm thiết bị cho chất dinh dưỡng bổ sung, nhưng quá trình sản xuất công nghiệp chủ yếu sử dụng fed-batch. Lý do chính là quá trình fed batch có thể cho năng suất tốt hơn thông qua việc tăng sản lượng và giảm thời gian lên men, đặc biệt khi nồng độ cao hay sự thay đổi nồng độ của một chất dinh dưỡng nào đó ảnh hưởng đến sản lượng hay năng suất. Những ưu điểm của fed batch bao gồm: Trong hầu hết các quá trình sản xuất amino acid, hàm lượng đường rất cao,thường là 20% hoặc nhiều hơn được sử dụng trong quá trình nuôi cấy để đạt được sản lượng cao theo mẻ. Nồng độ đường cao trong môi trường đôi khi làm ức chế sự phát triển của vi sinh vật hoặc giảm sản lượng sản phẩm, cùng với đó là sự tạo thành các sản phẩm phụ như acetate và lactate. Bằng cách hạ thấp nồng độ đường ban đầu thấp và bổ sung sau đó, tổng thời gian nuôi cấy, đặc biệt là phage lag, có thể được rút ngắn và trong một số trường hợp sản lượng có thể được tăng lên. Trong một quá trình sử dụng chủng dị dưỡng, việc cung cấp quá mức nhu cầu dinh dưỡng đôi khi dẫn đến làm giảm sản lượng do sự phát triển quá mức của tế bào hoặc do sự điều hòa ngược bởi chất dinh dưỡng.Trong nhiều 44
  53. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu quá trình, sản lượng có thể tăng cực đại bằng cách nuôi các chủng dị dưỡng trong một lượng giới hạn của chất dinh dưỡng cần thiết thông qua việc bổ sung theo một tỉ lệ được kiểm soát. Trong suốt pha sinh trưởng, nhu cầu oxy có thể vượt quá lượng oxy trong fermentor. Trong trường hợp thiếu oxy trong môi trường nuôi cấy, sản lượng sẽ giảm và kèm theo đó là các acid phụ phẩm. Bằng cách sử dụng kĩ thuật fed batch, nồng độ các chất có thể được giữ ở mức thấp nhất để ngăn chặn sự thiếu oxy .Trường hợp đó, glucose giới hạn trong fed- batch được sử dụng phổ biến trong công nghiệp. Để tăng năng suất hơn nữa, lên men fed-batch được mở rộng bằng cách lấy ra một phần canh trường tại một hoặc nhiều thời điểm, sau đó bổ sung trở lại. Tuy nhiên, xét về khía cạnh kinh tế, cả năng suất và sản lượng cần được suy xét khi quyết định sử dụng quá trình này, bởi vì việc kéo dài thời gian nuôi cấy để thu được sản lượng tối đa thường không có hiệu qủa kinh tế [22]. 1.8.3.2. Lên men liên tục: Trong lên men liên tục, môi trường mới chứa toàn bộ chất dinh dưỡng được bổ sung vào fermentor với những tỉ lệ cụ thể và một lượng canh trường tương ứng với một phần vi sinh vật được lấy ra liên tục từ fermentor để duy trì thể tích dịch nuôi cấy không đổi. Quá trình này được thực hiện bởi phương pháp chemostat với sự hạn chế về chất dinh dưỡng, chẳng hạn như môi trường giới hạn phosphate và môi trường giới hạn glucose, hoặc bằng phương pháp turbidostat trong đó tỉ lệ bổ sung và lấy ra được điều khiển sao cho sinh khối trong môi trường nuôi cấy được duy trì ổn định. Khi nồng độ của các thành phần riêng biệt trở nên không đổi, trạng thái đó được gọi là trạng thái bền vững và tế bào phát triển dưới điều kiện ổn định. Trong lên men liên tục, quá trình nuôi cấy được bắt đầu trong một mẻ hoặc theo kiểu fed batch và khi năng suất trên một đơn vị thời gian trở nên tương đối cao, quá trình lên men được chuyển từ nuôi cấy theo mẻ sang liên tục. Nuôi cấy liên tục theo lý thuyết có thể duy trì mãi không kết thúc. Nhưng theo thực nghiệm, thời gian chỉ có thể là vài trăm giờ là do các vấn đề sẽ được trình bày ở phần sau. Quá trình lên men liên tục cho phép tăng đáng kể năng suất tổng cộng cũng như công suất sản xuất mà không cần thêm nhiều fermentor, điều đó không những giảm chi phí sản xuất mà còn giảm chi phí đầu tư. Đã có nhiều 45
  54. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu nghiên cứu đáng kể về lên men liên tục.Tuy nhiên, hầu hết là để sản xuất sinh khối hoặc sản xuất rượu và acid hữu cơ, chỉ có một vài nghiên cứu lên men amino acid. Hirao et al. [16] nghiên cứu quá trình lên men liên tục L-Lysine bằng C. glutamicum B-6, một chủng đột biến sản xuất L-lysine. Chủng này cho thấy có thể sản xuất L-Lysine ổn định trong hơn 300 giờ với nồng độ và năng suất L-lysine HCl tối đa lần lượt là 105 g/l và 5.6 g/l.h. Trong khi đó chủng B- 6 có khả năng sản xuất 100 g/l L-Lysine HCl trong 48 h bằng lên men fed- batch, năng suất không vượt quá 2.1 g/ l.h. Điều đó có nghĩa là năng suất của quá trình lên men liên tục gấp hơn 2.5 lần so với lên men fed-batch. Mặc dù năng suất tăng rõ rệt khi so sánh lên men liên tục và lên men batch hoặc fed batch ở quy mô phòng thí nghiệm, nhưng việc ứng dụng vào lên men công nghiệp còn rất hạn chế vì một số lý do sau : Quá trình lên men liên tục các amino acid đòi hỏi việc bổ sung liên tục môi trường mới đã được khử trùng và cung cấp không khí tiệt trùng. Hai yếu tố đó dễ bị tạp nhiễm vi sinh vật trong qui mô công nghiệp, gây khó khăn cho việc duy trì sự tinh khiết của môi trường nuôi cấy trong một thời gian dài. Vi sinh vật thường trải qua quá trình đột biến ngẫu nhiên, dẫn đến giảm năng suất trong suốt quá trình nuôi cấy liên tục trong một thời gian dài, đặc biệt trong môi trường giới hạn dinh dưỡng chemostat. Các chủng đột biến phát triển nhanh hơn chủng bố mẹ trong cùng điều kiện nuôi cấy và do đó được ưu tiên nuôi dưỡng, kết quả là năng suất giảm nhanh. Trong một số quá trình lên men chia ra phase sinh trưởng và phase sản xuất, nuôi cấy liên tục có thể không đạt được năng suất cao bằng batch hoặc fed-batch bởi vì tế bào luôn được giữ ở pha sinh trưởng. Năng suất của nhiều quá trình lên men tăng lên bằng cách kết hợp kĩ thuật cell-recycling trong lên men fed-batch hoặc lên men liên tục [22]. 1.8.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men: 1.8.4.1. Oxy: Lên men L-lysine là một quá trình lên men hiếu khí, đòi hỏi một lượng lớn oxy. C. glutamicum có thể chịu được lượng oxy cung cấp hạn chế nhưng để quá trình sản xuất L-lysine được thuận lợi thì cần tránh sự thiếu oxy bởi vì hoạt động của vi sinh vật sẽ tăng cường chuyển hóa tạo ra các phụ phẩm, làm giảm 46
  55. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu sự tinh khiết và hiệu suất chuyển đổi. Trong điều kiện thiếu oxy, pyruvate sẽ chuyển hóa thành các sản phẩm phụ như acetate, lactate, and L-alanine [21]. Việc cung cấp oxy được thực hiện và kiểm soát bằng hai cách: sục khí và khuấy đảo. Trong không khí, ngoài các thành phần của không khí còn chứa rất nhiều VSV, do đó không khí cung cấp cho quá trình lên men đòi hỏi phải được sạch sẽ về vi sinh vật và các tạp chất khác. Trường hợp lên men trong điều kiện hiếu khí, cánh khuấy làm tăng khả năng hòa tan của oxy. Các khí sẽ ở lại lâu hơn do dòng chuyển động của môi trường, và như vậy, khả năng hòa tan của oxy từ bọt khí sẽ cao hơn. Tùy theo qui mô lên men và giống vi sinh vật sử dụng mà tốc độ sục khí và khuấy đảo sẽ khác nhau. Đối với chủng C. glutamicum, một số nghiên cứu lên men L-lysine được tiến hành bằng cách lắc trong máy lắc (250-300v/ph) hoặc bằng sục khí(0,5-1,5vvm) trong jar fermentor 30 lít [28].Thực hiện lên men thí nghiệm trong bench scale fermentor 6.6 lít ở tốc độ thổi không khí sạch là l,2vvm và thay đổi tốc độ khuấy trong suốt quá trình lên men từ 600 rpm ở 0 h đến 900 rpm ở 19h [20]. 1.8.4.2. pH: pH là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình lên men. Những hợp chất cơ bản như sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonium hydroxide, calciumcarbonate, urea, ammonia và khí ammonia hoặc những hợp chất acid vô cơ như acid sunfuric hoặc phosphoric và những hợp chất acid hữu cơ được sử dụng trong các nghiên cứu để kiểm soát pH trong lên men L-lysine ở dãy rộng pH từ 5-9 [30]. pH tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp lysine đối với chủng C. glutamicum là từ 7,0– 7,6 [2]. Trong quá trình lên men, vi sinh vật lại tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiềm, khiến pH của môi trường không còn thích hợp cho hoạt động sống của chúng. Vì vậy, việc chủ động điều chỉnh pH của môi trường luôn ở giá trị thích hợp trong suốt quá trình lên men là điều rất cần thiết. 47
  56. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.8.4.3. Nhiệt độ: Nhiệt độ tối ưu của Corynebacteria sản xuất các amino acid là từ 25 đến 37˚C [21]. C. glutamicum có nhiệt độ tối ưu là khoảng 30oC, nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men lysine duy trì trong khoảng từ 28-30oC. Do đó việc sử dụng C. glutamicum ở các nước nhiệt đới có ý nghĩa về kinh tế, bởi vì chi phí cho việc giữ nhiệt độ tối ưu cho quá trình lên men không đáng kể [22],[2]. Quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt rất mạnh nên nhiệt độ trong các thiết bị lên men thường có xu hướng gia tăng vượt quá ngưỡng nhiệt độ thích hợp đối với hoạt động sống của vi sinh vật đó. Vì vậy phải thường xuyên giám sát và điều chỉnh nhiệt độ theo yêu cầu của quá trình lên men. Muốn đạt được nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men, người ta trang bị hệ thống làm nóng và làm nguội bằng nước chảy quanh nồi dưới dạng các ống ruột gà . 1.8.4.4. Hiện tượng tạo bọt: Trong lên men fed-batch, hiện tượng tạo bọt cũng là một điều quan trọng cần nghiên cứu, đặc biệt trong quy mô công nghiệp, khi tốc độ khí trên bề mặt tăng theo kích thiết bị. Kích thước fermentor không phải là tiêu chuẩn đánh giá tốt cho qui mô của một qui trình công nghệ lên men. Thông thường, lượng canh trường lên men trong bình phản ứng chịu ảnh hưởng bởi hiện tượng sủi bọt, do đó trong sản xuất công nghiệp, độ chứa đầy từ 70 đến 85% thể tích. Hiện tượng tạo bọt bị ảnh hưởng bởi tỉ trọng của canh trường lên men, cũng như phụ thuộc vào chủng sản xuất, thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. Bên cạnh áp lực thủy tĩnh lớn trong các thiết bị qui mô lớn do lượng CO2 rất lớn sinh ra trong chất lỏng, sự sủi bọt cũng ảnh hưởng rất lớn trong suốt quá trình nuôi cấy và trong suốt quá trình downstream sau này[21]. Hiện tượng tạo bọt xuất hiện trong suốt quá trình lên men có thể được kiểm soát bằng chất chống tạo bọt như acid béo, ester polyglycol, hoặc silicon và polypropylene [30]. 1.8.5. Qui trình lên men: Trong qui mô công nghiệp,quá trình lên men được thực hiện trong các fermentor có sục khí và lắc hoặc airlift tank fermentor có kích thước từ 50.000 đến 50.0000l. Do nhu cầu amino acid càng tăng và cần phải giảm giá thành để cạnh tranh, 48
  57. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu kích thước các fermentor ngày càng tăng. Hình 1.25 mô tả sơ đồ một quá trình lên men amino acid điển hình. Giống nuôi cấy trong bình flask được chuyển sang thiết bị nhân giống cấp 1 ( kích thước 1.000lít - 2.000lít ). Khi tế bào phát triển đến một tốc độ thích hợp, giống cấp 1 sẽ được chuyển sang thiết bị nhân giống cấp 2 (kích thước 10.000lít- 20.000lít), sau đó sẽ cung cấp giống cho thiết bị lên men chính. Các bước nhân giống trên rất quan trọng, để đảm bảo hiệu suất lên men cao nhất trong thời gian ngắn nhất, cũng như việc tái sản xuất tốt hơn. Chất lượng và số lượng của giống thường ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng và năng suất trong quá trình lên men, và do đó, việc nuôi cấy trong mỗi bước nhân giống cần phải chuẩn bị cẩn thận để đạt được trạng thái tối ưu trong quá trình nhân giống. Các thông số ảnh hưởng đến sản lượng sản xuất trong quá trình nuôi cấy trong fermentor bao gồm: sục khí,khuấy đảo, áp suất trong thiết bị, tỉ lệ bổ sung đường, pH, và nhiệt độ. Trong số đó, bốn thông số đầu tiên đặc biệt chú ý bởi vì điều kiện tối ưu của chúng có thể khác nhau đáng kể tùy thuộc vào loại fermentor và quy mô hoạt động. Nâng cấp từ phòng thí nghiệm đến nhà máy sản xuất chủ yếu dựa trên các thông số vật lý như oxy hòa tan, tốc độ sục khí, tốc độ khuấy, thời gian, và năng suất ra. Tuy nhiên, sản lượng thu được trong quy mô công nghiệp thường không giống như kết quả trong phòng thí nghiệm. Nguyên nhân chính là do sự phức tạp của các fermentor. Sự phân phối đường bổ sung và oxy có thể ảnh hưởng đến sinh lý tế bào gây nên hiện tượng stress không mong muốn như :sự đổi hướng tổng hợp từ amino acid mong muốn sang những sản phẩm phụ không mong muốn như CO2, các acid, và sinh khối. Do đó, việc nâng cấp quy mô thành công đòi hỏi sự am hiểu tốt về động lực học chất lỏng trong các fermentor cũng như sự tương tác giữa điều kiện nuôi cấy, điều kiện hóa học và vật lý trong môi trường nuôi cấy và sinh lý vi sinh vật. 49
  58. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu khí Nhân giống Sản xuất Gi ống cấp 1 Nhân giống cấp 2 Hình 1. 25 Mô hình sản xuất các amino acid [22]. 50
  59. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu carbon Khử trùng liên tục (NH ) SO 4 2 4 Khử trùng liên tục Nước Muối, khoáng, vitamin Nguồn Hợp chất hữu cơ phức tạp (NH4)2SO4 C đã đã khử khử trùng trùng Chuẩn bị môi trường Khử trùng liên tục Khí nén NH3 Thu nhận và tinh sạch Hình 1. 26 Mô hình lên men thu L-lysine [21]. 51
  60. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.8.5.1. Nhân giống: Bởi vì C. glutamicum có phage lag dài nếu nuôi cấy ở lượng sinh khối dưới 0.1 g/l, nên giống dùng cho quá trình lên men công nghiệp được nhân giống qua nhiều cấp liên tiếp (hình 5.2). Các fermentor nhân giống ở các cấp khác nhau thường bao gồm một fermentor từ 1 đến 5 m3 ở cấp thứ nhất và từ 10 3 đến 50 m ở cấp thứ hai. Nhiệt độ, pH, và O2 cung cấp được kiểm soát để tránh sự ức chế và đảm bảo vi sinh vật sinh trưởng. Quá trình này được kiểm soát thông qua việc xác định sinh khối và hàm lượng carbon. Trong sản xuất công nghiệp, quá trình trên được kiểm soát thông qua việc theo dõi sự tỏa nhiệt và hàm lượng oxy hấp thu. Trong giai đoạn nhân giống và khử trùng môi trường, kĩ thuật khử trùng, sự trang bị máy móc dụng cụ,chất lượng mối hàn, thiết kế đường ống dẫn, thiết kế bình phản ứng, vận hành và duy trì quá trình nuôi cấy vô trùng là cực kì quan trọng. Bởi vì C. glutamicum thường được nuôi cấy ở giữa pH 6 và pH 9, ở nhiệt độ ôn hoà, sự tạp nhiễm chẳng hạn như nhiễm Bacillus.sp là mối đe dọa cho quá trình sản xuất, nếu chúng có mặt trong giống, môi trường khử trùng chuẩn bị lên men, hoặc trong môi trường khử trùng dự trữ. Bacillus.sp tạp nhiễm thường phát triển với tốc độ cao hơn C. glutamicum và lấn áp chủng sản xuất, ảnh hưởng đến năng suất. Sự tạp nhiễm phage không phải là vấn đề đáng lo lắng trong công nghiệp lên men L-lysine bởi vì C. glutamicum thường tỏ ra ít nhạy cảm với phage hơn E. coli [21]. 1.8.5.2. Nuôi cấy lên men: Do sức ép về việc giảm giá thành sản phẩm,kích thước fermentor đã tăng lên từ 50m 3 lên 750 m3 trong 2 thập niên qua. Hầu hết đều sử dụng các bình khuấy trộn, bởi vì chúng có năng suất cao do tỉ lệ oxy chuyển hóa cao. Bên cạnh đó, do có hiệu quả cung cấp oxy tốt hơn, các air lift reactor cũng được sử dụng trong quy mô công nghiệp,tuy nhiên chúng bị hạn chế khi lượng oxy chuyển hóa tổng cộng có thể đạt được. Khi mà ngày càng có nhiều chủng C. glutamicum có khả năng sản xuất cao, chịu được stress cao, áp suất thẩm thấu cao thì chính các hệ thống bình phản ứng hơn là do vi sinh vật là nguyên nhân hạn chế năng suất lên men. Để điều khiển quá trình lên men đạt được năng suất và hiệu suất chuyển đổi lớn nhất và những biến động trong quá trình lên men là thấp nhất, đặc điểm 52
  61. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu vi sinh vật, lựa chọn môi trường và điều kiện công nghệ cần được tính toán cẩn thận. Một khía cạnh quan trọng khác khi kiểm soát hàm lượng carbon cung cấp, trong điều kiện hiếu khí hoàn toàn, C. glutamicum sẽ phản ứng lại sự thừa carbon cung cấp trong lên men L-lysine bằng cách tăng cường sự chuyển hóa thành các sản phẩm phụ. Trong những trường hợp đó,nếu không điều chỉnh lại, thì tùy theo đặc trưng của giống vi sinh vật , các chất trung gian của chu trình acid citric có thể dễ dàng tích lũy ngoài tế bào khoảng10 g/ l hoặc cao hơn. Do đó, tỉ lệ carbon cung cấp và các nguồn dinh dưỡng khác cần phải tính toán cẩn thẩn, tỉ lệ tối ưu dựa trên đặc tính của giống và điều kiện công nghệ .Kiểm soát các chất dinh dưỡng cung cấp cũng rất phức tạp, ước lượng trực tiếp dựa trên con đường chuyển hóa. Trong quy mô công nghiệp, fed-batch, repeated fed- batch, và lên men liên tục được ứng dụng. Đặc điểm của fed-batch là bổ sung một lượng lớn nguồn carbon và nitơ khi mà nguồn carbon trong môi trường ban đầu bị cạn kiệt. Nguồn carbon có thể được bổ sung vào ở dạng tinh khiết hoặc ở dạng môi trường bổ sung bao gồm nhiều chất dinh dưỡng khác như các amino acid và các khoáng chất. Trong cả hai trường hợp, hàm lượng carbon được duy trì ở nồng độ thấp, để hạn chế tỉ lệ oxy hấp thu và để tránh sự chuyển hóa thành các phụ phẩm. Phase bổ sung có thể được kéo dài bằng cách lấy ra một phần canh trường khi mà bình phản ứng đầy và tiếp tục bổ sung sau đó. Sự khả thi của phương pháp này là khả năng vi sinh vật tiếp tục chuyển hóa thành L- lysine với hiệu suất chuyển đổi và năng suất cao. Một đặc điểm khác của fed- batch là hàm lượng nhiều chất dinh dưỡng giảm trong suất quá trình nuôi cấy nếu không bổ sung thêm môi trường. Đó là ưu điểm để sản xuất L-lysine, đặc biệt nếu chủng sản xuất dị dưỡng các amino acid và có phase sinh trưởng và phase sản xuất riêng biệt. Mặt khác, nó rút ngắn thời gian nuôi cấy ở mỗi mẻ. Ưu điểm lớn nhất của fed-batch là thu được nồng độ sản phẩm cao. Đối với L- lysine điều đó hoàn toàn đúng, bởi vì không có giới hạn cho sự hòa tan trong quá trình lên men. Do đó, nồng độ sản phẩm cao có lợi cho quá trình thu nhận và tinh sạch. Tuy nhiên, khi nồng độ sản phẩm tăng,áp suất thẩm thấu cũng như khả năng tiết ra các chất của vi sinh vật ảnh hưởng toàn bộ hiệu suất của quá trình. Sự tích tụ L-lysine bị tác động xấu của áp suất thẩm thấu cao, nó tác động xấu lên sự sinh trưởng,sự chuyển hóa và năng suất. Để sự tạo thành L-lysine 53
  62. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu hiệu quả trong điều kiện áp suất thẩm thấu cao, glycine betaine tỏ ra có hiệu quả và được biết tới trong nhiều năm qua. Kawahara et al. [19] mô tả một quá trình chuyển hóa khoảng 55% với năng suất khả thi 2 g/l.h trong lên men batch bắt đầu với nồng độ glucose 160 g/ l và cung cấp đủ betaine . Yêu cầu duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong fed-batch ít nghiêm ngặt hơn so với lên men liên tục trong fermentor. Bởi vì quá trình lên men thường không bị ảnh hưởng với điều kiện sự tạp nhiễm không vượt quá 0.1% giống sản xuất, quá trình lên men chịu được sự tạp nhiễm ở mức độ thấp trong thiết bị lên men, điều đó cho phép một số sửa đổi các van, ống dẫn, do đó giảm chi phí đầu tư. Theo công nghệ của Biolys®, một số phương pháp nghiêm ngặt được áp dụng để giữ cho sự tạp nhiễm trong quá trình sản xuất ở mức thấp nhất bằng chương trình thiết kế khá phức tạp và tự động để kiểm soát sự tạp nhiễm. Nếu sự phát triển hướng về lượng chất khô và nồng độ L-lysine cao hơn trong fed-batch bị hạn chế bởi những khía cạnh vừa nêu, thì năng suất của một quá trình fed-batch có thể tăng lên bằng kĩ thuật repeated fed-batch [25]. Khi đạt được độ chứa đầy tối đa, một thể tích thích hợp ( 10-20%) giữ lại trong reactor xem như là giống cho chu kì tiếp theo. Phương pháp đó (còn gọi là bán liên tục –semi continuos) chỉ khả thi đối với những giống có đủ sự ổn định. Hirao et al. [16] phát triển một quá trình liên tục, giảm thời gian chết do vệ sinh, chuẩn bị và tiệt trùng. Mặc dù có tiềm năng lớn để tăng năng suất và giảm chi phí đầu tư, nhưng lên men liên tục ít được áp dụng trong công nghiệp sản xuất. Yêu cầu thiết kế cao đối với bình phản ứng, hệ thống van, trang thiết bị, bảo trì phức tạp và sự vận hành sản xuất cần phải giữ cho sự tạp nhiễm trong sản xuất quy mô lớn dưới 5% (giới hạn cho phép: 102 VSV tạp nhiễm /ml canh trường), đó là một điều kiện tiên quyết trong lên men liên tục. Khi các bioreactor qui mô hơn 100m3, điều kiện vô trùng trong sản xuất là một thách thức lớn. Do đường kính ống dẫn,áp suất thủy tĩnh, ứng suất cơ học tăng trong các thiết bị đó, thật khó để tìm ra một giải pháp cơ khí có đủ khả năng thực hiện sản xuất trong điều kiện vô trùng. Nếu những vấn đề đó không được nghiên cứu đúng đắn, thì thời gian kết thúc của các mẻ và thời gian chết sẽ dài, làm giảm công suất tổng cộng của nhà máy. Một hạn chế nữa của lên men liên tục là C. glutamicum thường bị đột biến ngẫu nhiên, đặc biệt trong điều kiện cơ chất giới 54
  63. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu hạn của quá trình hoạt động chemostat. Bởi vì các chủng đột biến thường chuyển hóa nguồn carbon với sản lượng L-lysine thấp hơn và lượng sinh khối cao hơn. Nên quá trình sản xuất liên tục L-lysine chỉ có thể thực hiện được ở thời gian giới hạn. Thời gian nuôi cấy kéo dài, vi sinh vật sẽ bị ảnh hưởng bởi những đột biến bất lợi [21]. De Hollander et al. [13] cho biết tỉ lệ phospho và carbon từ 0.5 đến 4.0 mmol phospho/1 mol carbon thì có lợi cho quá trình sản xuất liên tục L-lysine bằng vi khuẩn Coryne. So sánh với quá trình chỉ giới hạn nguồn carbon, năng suất tăng khi giới hạn cả nguồn carbon và phosphate từ 3.18 g/ l.h lên 3.75 g/ l.h L-lysine-HCl. Một hạn chế nữa của nuôi cấy liên tục là để tăng sự chuyển đổi chỉ có cách là tăng thời gian lưu. Do đó, năng suất không cao. Hirao et al. [16] chứng minh rằng sự chuyển đổi là 38% với 105 g/ l L-lysine đạt được sau 30 h, năng suất chỉ là 2.8 g/ l.h, so sánh với năng suất lớn nhất là 5.6 g/ l.h trong 7 h với 40 g/ l L-lysine. Một so sánh giữa phương pháp liên tục và repeated fed-batch được đưa ra bởi Nakamura et al. [25]. Khi thời gian lưu là 20 h, sự chuyển đổi trong quá trình liên tục chỉ là 35% với năng suất 3.5 g/ l.h, so sánh với 41% năng suất 3.9 g/ l.h trong quá trình repeated fed- batch với cùng một giống vi sinh vật . 1.8.6. Thu nhận và tinh sạch sản phẩm: Thu nhận và tinh sạch sản phẩm là một công đoạn rất quan trọng, nó ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá trình lên men và chi phí sản xuất, cần phải nghiên cứu để nâng cao hiệu suất thu nhận L-lysine. Trong nhiều năm qua, tinh thể L- lysine HCl đã được sản xuất qua nhiều bước khác nhau như lên men, thu nhận, tinh sạch, kết tinh và làm khô. Dịch sau lên men có nồng độ chất khô khoảng 10-13%.Dịch sau khi lên men rất dễ bị hư hỏng do quá trình tự phân của vi sinh vật, hoặc bị tạp nhiễm. Do đó cần phải đem dịch lên men đi thu nhận và tinh sạch L-lysine ngay. Trong trường hợp không thể tiến hành thu nhận và tinh sạch ngay thì cần tiến hành các biện pháp để bảo quản bằng cách: dùng HCl acid hóa dung dịch lên men (đưa về pH=5), đồng thời bổ sung methabisunfit natri với liều lượng 4% so với dịch lên men. Để thu nhận được L-lysine tinh khiết ở dạng kết tinh người ta thực hiện các bước sau: 55
  64. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Tiến hành lọc và ly tâm dịch lên men để loại bỏ sinh khối, cặn và các thành phần không tan (muối carbonat, canxi phosphat, ). Dịch sau ly tâm được cho hấp phụ ở cột nhựa trao đổi ion cationit. Sau đó rửa cột cẩn thận đến khi nước không còn màu và tiến hành nhả hấp phụ bằng dung dịch ammonia 0,5-5% . Đun nóng dịch L-lysine thu được để đuổi ammoniac. Sau đó dùng dung dịch HCl hạ pH của dung dịch tới 4,9-5. Tiến hành cô trong nồi cô chân không để nồng độ lysine đạt được 30-50%. L-lysine sẽ tác dụng với HCl (dùng khi hạ pH dung dịch) tạo thành monochlohydrat lysine. Làm lạnh toàn bộ tới nhiệt độ 10-12 oC, khi đó thấy xuất hiện những tinh thể màu vàng nhạt (kết tinh lần một). Tiến hành ly tâm để thu nhận tinh thể. Dịch sau ly tâm được cô đặc thêm và tận dụng như dịch lysine cô đặc, hay đem tái kết tinh để thu nhận triệt để L-lysine có trong dịch lên men. Tinh thể thu được sẽ đem đi sấy chân không . Nếu muốn tinh thể sạch hơn, người ta hòa tan tinh thể trong cồn (3-4 lần thể tích) rồi cho kết tinh và làm đi làm lại nhiều lần, các tinh thể sẽ tách khỏi tạp chất và các chất màu, L-lysine thương phẩm có độ tinh khiết trên 97% dihydromonohydrat lysine, độ ẩm không quá 0,5%; tro 0,3% được bảo quản trong túi PE hay hộp carton. L-lysine tinh khiết được dùng trong thực phẩm và y học. Trong một số trường hợp không cần L-lysine ở mức độ tinh khiết cao, chẳng hạn như làm thức ăn gia súc, ta có thể tiến hành làm khô trực tiếp dịch lên men mà không cần đến các bước tinh sạch đắt tiền .Qui trình được thực hiện như sau: Dung dịch lên men được bơm vào nồi chân không, tiến hành cô cho đến khi nồng độ chất khô trong dịch đạt tới 35-40 %.Ta thu được chế phẩm thô đầu tiên.Ta có thể sử dụng chế phẩm này cho chăn nuôi gia súc.Tuy nhiên dạng chế phẩm này chỉ có thể bảo quản trong khoảng 4 tháng. 56
  65. Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Để bảo quản lâu hơn ta phải tạo ra sản phẩm có độ ẩm thấp.Bằng cách trộn thêm một chất độn nào đó (bột xương, bột ngủ cốc) vào trong dịch đã cô đặc trên sau đó đem sấy khô hoặc ép thành viên rồi sấy. Một cách khác có thể được sử dụng là đưa dung dịch đã cô đặc đi sấy phun. Độ ẩm của sản phẩm này khoảng 5-6% [2]. 1.8.7. Phân tích chất lượng và số lượng L-lysine Để định tính L-lysine ta có thể sử dụng phương pháp sắc kí giấy, đây là một trong những phương pháp có độ nhạy cao trong việc định tính các amino acid. Trong khi đó, để định lượng L-lysine , 2 phương pháp có thể sử dụng là phương pháp quang phổ và phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC). 57
  66. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 2.1. Nghiên cứu về các đối tượng sản xuất lysine: 2.1.1 Sử dụng dịch cỏ như một gradient trong sản xuất lysine: Để hạ giá thành cho sản phẩm lysine, người ta sử dụng dịch từ cỏ như một gradient để sản xuất lysine. Sử dụng bốn môi trường lên men khác nhau là A, A1, B và C với ba giống vi sinh vật là IFA 129 (Brevibacterium E 531), 133 (Corynebacterium glutamicum) và 134 (Brevibacterium lactofermentum) để sản xuất lysine. Cỏ được thu hoạch từ một khu vực được trộn với nước và xay nhuyễn tạo ra thể đồng nhất gọi là dịch cỏ. Dịch cỏ này đem trộn với glucose, đối với môi trường A là 30 g/l glucose và dịch men 20/l, môi trường B là 50 g/l glucose và dịch bắp 50 g/l. Còn môi trường C gồm dịch cỏ trộn với mật đường từ củ cải tía với lượng carbonhydrate khoảng 100 g/l và dịch men 20 g/l, môi trường A1 sử dich dịch chiết bắp 50g/l và glucose 30 g/l. Sau đó thêm vào tất cả các môi trường trên một số chất: (NH4)2SO4 30 g/l, CaCO3 30 g/l, biotin 0,0003 g/l. Ba loại giống cho vào có thể tích chiếm khoảng 10% so với fermenter khi chưa cho môi trường vào. Lên men liên tục ở 30°C và duy trì mức pH ở 7,2-7,5. Sau khi khảo sát thấy rằng chủng IFA 129 và 133 là hai chủng có tiềm năng sản xuất lysine với sản lượng cao ở tất cả các môi trường nêu trên. Môi trường C có thành phần là phù hợp cho sản xuất lysine nhất với nguồn dinh dưỡng và carbohydrate thích hợp. Lượng lysine thu được sau 72 giờ lên men ở môi trường C đạt 32.65 g/l (IFA 129) và 40.32 g/l (IFA 133), 14.21 g/l (IFA 134). Lượng lysine đạt thấp hơn ở ba môi trường còn lại. Ngoài ra, dịch chiết bắp cũng được xem là nguồn dinh dưỡng tốt cho sản xuất lysine, vì nó có chứa methionine và threonine. 2.1.2 Đặc điểm con đường tổng hợp sinh học lysine trong Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus: Con đường tổng hợp lysine của vi khuẩn Gram âm obligate methylotroph Methylophilus methylotrophus AS1 thì được kiểm tra thông qua đặc điểm của 58
  67. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan enzyme aspartokinase (AK), aspartsemialdehyde dehydrogenase, dihydrodipicolinate synthase (DDPS), dihydrodipicolinate reductase và diaminopimelate decarboxylase. AK thì bị ức chế bởi L-threonine và bởi hỗn hợp của L-threonine và L-lysine nhưng không bị ức chế bởi L-lysine riêng lẻ và hoạt động của DDPS bị giảm một cách vừa phải bởi lysine. Ở thể đột biến sản xuất L- lysine (G49) được cô lập như là chủng kháng S-(2-aminoethyl)-L-cysteine (lysine analog), cả AK và DDPS thì một phần được kháng ức chế ngược. Gen ask và gen dapA mã hóa enzyme AK và DDPS thì được cô lập từ chủng gốc AS1 và chủng G49 xuất phát từ AS1. So sánh những trình tự thì thấy một sự đột biến điểm trong mỗi gen này ở G49. Sự đột biến trong gen ask thay đổi aspartic acid trong một vùng chủ chốt tham gia vào quy luật chung allosteric bằng AKs trong khi ở một sự đột biến cũ là trong gen dapA thay đổi tyrosine 106, được giả định là tham gia vào tổng hợp lysine bằng DDPS. 2.1.3. Các nghiên cứu về đối tượng sản xuất lysine là Corynebacterium glutamicum: 2.1.3.1. So sánh tiềm năng sản xuất L-lysine giữa các chủng Corynebacterium glutamicum khác nhau:[17] Corynebacterium glutamicum là một sinh vật công nghiệp quan trọng được sử dụng để sản xuất các axit amin khác nhau. Sản xuất một L-lysine bằng cách đưa các đột biến lysC (T311I) vào lần lượt sáu chủng C. glutamicum đại diện. So sánh các kết quả sản xuất L-lysine của các chủng đột biến có nguồn gốc từ một chủng ban đầu ở điều kiện 30°C theo phương pháp truyền thống và 40°C trong công nghiệp. Qua đó tìm thấy rằng có sự khác biệt đáng kể trong sản lượng và năng suất, đặc biệt là ở 40°C. Các kết quả này cho thấy sự đa dạng giữa các chủng C. glutamicum trong lên men, cũng như tầm quan trọng của việc chọn một chủng với hiệu suất tốt nhất trong công nghiệp. Corynebacterium glutamicum và các vi sinh vật cùng loài với nó được xếp vào loại vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic, đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp vi sinh vật, sử dụng để sản xuất nhiều loại amino acid. Vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic gồm các chủng đa dạng, các chủng này cũng có thể dùng để sản xuất các amino acid bằng phương pháp đột biến gen. Bảng sau 59
  68. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan đưa ra các chủng hoang dại và ứng dụng sản xuất amino acid tương ứng của chúng: Bảng 2. 1 Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo như là chủng bố mẹ để sản xuất các amino acid và như là gen chủ cho nhân dòng [17]. Chủng hoang dại Sử dụng Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Sản xuất L-lys, L-Trp, L-Phe Corynebacterium glutamicum ATCC 14752 Sản xuất L-Gln Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Sử dụng trong phòng thí nghiệm để nhân dòng Corynebacterium glutamicum KY 10025 Sản xuất L-Glu hay L-Val Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 Sản xuất L-Lys hay L-Glu Corynebacterium acetoacidophilum ATCC Sản xuất L-Arg hay L-Pro 13032 Abe et al. nghiên cứu vể đặc tính sinh lý và phân loại các vi khuẩn sản xuất ra acid L-glutamic. Chúng được chỉ ra là vi khuẩn gram dương, không di động, có hình dạng ellip, hình cầu hay là hình que ngắn, sinh trưởng trong môi trường đòi hỏi có biotin. Tuy nhiên, có sự khác biệt nhỏ về sinh lý giữa các chủng vi khuẩn này. Theo báo cáo, có 208 chủng vi khuẩn thuộc nhóm sản xuất acid L-glutamic được phân thành mười hai dạng dựa vào đặc tính sinh lý. Một trong số đó là sáu chủng liệt kê ở bảng 2.1, và trong số đó các chủng được xếp vào dạng 1 là ATCC 13032, ATCC 13869, KY 10025 dựa vào việc sản xuất ra acid từ vài nguồn carbon, hoạt động urease, việc làm giảm lượng nitrate giống nhau giữa các chủng này. Chủng ATCC 13870 thuộc dạng 9 được chỉ ra là có các đặc tính giống dạng 1 trử việc chúng thiếu sự làm giảm lượng nitrate. Hai chủng khác là ATCC 31833, ATCC 14752 không có các đặc tính sinh lý như hai dạng trên. Chủng ATCC 31833 được dùng làm gene chủ trong hệ thống nhân dòng. Mặt khác, chủng ATCC 14752 vừa được phát hiện là có cấu trúc lớp S-proteins. Mặc dù các chủng C. glutamicum có sự khác biệt nho nhỏ trong phân loại và đặc tính sinh lý, nhưng chúng có đặc tính giống nhau không chỉ ở khả 60
  69. Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan năng sản xuất các amino acid mà còn giống nhau ở các đặc tính quan trọng trong sự hữu ích cho ngành công nghiệp như là khả năng tăng trưởng, tỉ lệ tiêu thụ đường và chịu được sự khác nghiệt của môi trường. Từ những sự khác nhau đó sẽ chọn ra được chủng phủ hợp nhất đưa vào fermenter sản xuất và thu được kết quả cải thiện đáng kể. Dựa vào những nghiên cứu ở phòng thí nghiệm, quyết định lấy bộ gene của chủng hoang dại của C. glutamicum, ATCC 13032 làm gene giống để gây đột biến có lợi cho sản xuất. Phương pháp này thật sự hữu ích cho việc tạo ra các chủng phục vụ sản xuất công nghiệp và theo một cơ chế sàn xuất hợp lí. Những nghiên cứu gần đây đã xác định cụ thể là sự đột biến lysC (T311I), giảm bớt sự kìm hãm của aspartokinase là chìa khóa để gây đột biến trong sản xuất L-lysine. Phương pháp gây độ biến lysC cho sáu chủng liệt kê ở bảng 2.1 bẳng cách thay thế gene dựa vào phasmid hai lần tái tổ hợp pClysC311 via. Mỗi chủng sẽ được nhân dòng lên mười lần mang thể đột biến lysC rồi chọn ngẫu nhiên để đi kiểm tra sự sản xuất L-lysine. Tất cả các chủng đột biến này đều tích lũy L-lysine, L-lysine tạo ra sẽ được mang đi đo bằng phương pháp HPLC sau khi làm giảm nhạy với o-phthalaldehyde. Vì không có sự khác biệt rõ về các sản phẩm L-Lysine được khảo sát trong mười dòng của mỗi chủng nên các nhà khoa học đã chọn một trong mười dòng của mỗi chủng đem nghiên cứu chi tiết. Kết quả được đưa ra ở bảng 2.2. Bảng 2. 2 Kết quả thu được từ sáu chủng đột biến ở điều kiện lên men thu L-lysine khác nhau. 30°C 40°C Chủng Thời Sản lượng Năng Thời Sản lượng Năng Chủng bố mẹ gian L-Lysine suất gian L-Lysine suất (h) (g/l) (g/l/h) (h) (g/l) (g/l/h) ATCC AK-1 29 53 1.8 27 58 2.1 13032 ATCC AK-14752 32 33 1.0 35 37 1.1 14752 61