Luận án Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang

120 trang vanle 3560

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Luận án Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

luan_an_nghien_cuu_phan_tich_thanh_phan_cau_truc_hoa_hoc_cua.pdf

Nội dung text: Luận án Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC    PHẠM ĐỨC THỊNH NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN, CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TỪ MỘT SỐ LOÀI RONG NÂU Ở VỊNH NHA TRANG Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 62.44.01.18 LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Bùi Minh Lý 2. PGS. TS. Lê Lan Anh Hà Nội, 2015
LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu nêu trong luận án là trung thực. Những kết luận khoa học của luận án là chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, 2015 Tác giả Phạm Đức Thịnh
LỜI CẢM ƠN Trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực cùng bạn bè và đồng nghiệp. Đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS Bùi Minh Lý và PGS.TS Lê Lan Anh đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt nhất giúp tôi hoàn thành bản luận án này. Tiếp theo, tôi xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted (Đề tài nghiên cứu khoa học cơ bản, mã số: 104.01.59.09) và Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (Đề tài hợp tác quốc tế, mã số: VAST.HTQT.NGA. 06/13-14) đã hỗ trợ kinh phí cho việc thực hiện Luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện về mọi mặt của các cô chú, các anh chị em của phòng: - Phòng Hóa phân tích và Triển khai công nghệ nói riêng cũng như Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang nói chung. - Phòng Hóa phân tích, Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học. Phòng thử nghiệm hoạt tính sinh học - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên. - Phòng Hóa enzym, Phòng cộng hưởng từ hạt nhân và khối phổ- Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, Phòng Quản lý Đào tạo sau Đai học - Viện Hóa học đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân và bạn bè đã luôn quan tâm, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành luận án. Hà Nội, ngày 20 tháng 04 năm 2015 Tác giả Luận án Phạm Đức Thịnh
i MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ viii DANH MỤC PHỤ LỤC ix MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3 2.3. RONG BIỂN 3 1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển 3 1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển 4 1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển 5 1.2 FUCOIDAN 6 1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan 6 2.3.1. Thành phần của fucoidan trong rong nâu 7 1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan 9 1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu 13 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan 15 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN 20 1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường 20 1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết 21 1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) 22 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) 23
ii 1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS) 26 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN 32 1.4.1. Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới. 32 1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam. 34 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 VÀ THỰC NGHIỆM 36 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 36 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37 2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan 37 2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường 38 2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate 38 2.2.4 Phương pháp khử sulfate 38 2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít 38 2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa 38 2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit 39 2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR 39 2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR 39 2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS 39 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu 39 2.3. THỰC NGHIỆM 40 2.3.1. Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu 40 2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường 41 2.3.3. Phân tích hàm lượng sulfate 41 2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axít 42 2.3.5. Khử sulfate 42 2.3.6. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa 42
iii 2.3.7. Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit 43 2.3.8. Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit 43 2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan 44 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU 47 3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN 48 3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 51 3.4. HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 62 3.4.1. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của fucoidan 62 3.4.2. Hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn fucoidan được phân lập từ rong Sargassum swartzii và Sargassum mcclurei 64 3.5. ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 69 3.5.1. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ IR 69 3.5.2. Các đặc trưng cấu trúc thu được từ phổ NMR 72 3.6. PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN SmF3 ĐƯỢC CHIẾT TÁCH TỪ RONG NÂU SARGASSUM MCCLUREI 77 3.7. ĐÁNH GIÁ MỐI TƯƠNG QUAN GIỮA ĐẶC TRƯNG CẤU TRÚC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA FUCOIDAN 97 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 99
1 MỞ ĐẦU Trong đa dạng và vô tận của thảm thực vật đại dương, rong nâu là một trong số các loài thực vật biển có thể tự tái tạo đáng lưu ý nhất mà con người đã phát hiện ra. Rong nâu chứa rất nhiều polysacarit sinh học quí như alginate, laminaran, fucoidan với khả năng ứng dụng hết sức rộng lớn [29,103]. Trong số đó fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do có nhiều hoạt tính sinh học quý như: hoạt tính chống đông tụ máu và chống huyết khối, chống virus, chống ung thư và điều biến miễn dịch, chống viêm, giảm lipid máu, chống oxy hóa và các đặc tính chống bổ thể (anticomplementary), chống lại các bệnh về gan, về đường tiết niệu (uropathy renalpathy), tác dụng bảo vệ dạ dày và khả năng điều trị trong phẫu thuật [69,88]. Fucoidan là một sulfate polysacarit có cấu trúc hóa học rất phức tạp bởi tính đa dạng của liên kết glycoside và khả năng phân nhánh với các vị trí nhóm sulfate được sắp xếp không theo quy luật trên mạch polymer. Thành phần của nó bao gồm nhiều loại đường, chủ yếu là fucose và một số các gốc đường khác như galactose, glucose, manose, xylose , đôi khi còn có axít uronic [23,36,69,71]. Mặc dù có rất nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan, nhưng các kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của chúng về trật tự liên kết giữa các gốc đường, sự phân nhánh và vị trí các gốc sulfate vẫn còn rất hạn chế [23,34,35,36,48]. Mặt khác, mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế cho đến nay vẫn chưa được sáng tỏ [88,36,38,48,69]. Để giúp cho việc nghiên cứu cơ chế tác dụng của fucoidan lên các tế bào sinh vật và tiến tới sử dụng fucoidan để làm dược liệu thì việc xác định chính xác thành phần và cấu trúc hóa học của fucoidan là điều tiên quyết và đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới. Nước ta có hơn 3.200 km bờ biển trải dài từ Bắc xuống Nam, với diện tích mặt nước rộng hơn 1.000.000 km2 được thiên nhiên ban tặng cho nguồn tài nguyên rong nâu rất đa dạng và phong phú, hiện tại đã có khoảng 147 loài rong nâu được phân loại [1,8], trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất
2 với hơn 60 loài và sản lượng ước tính đạt tới 10.000 tấn rong khô/năm [58]. Tuy nhiên cho đến nay ở nước ta vẫn chưa có một công trình nghiên cứu có tính hệ thống về thành phần hóa học, cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về fucoidan của rong nâu Việt Nam theo định hướng tìm kiếm những nguồn dược liệu mới phục vụ sức khỏe cộng đồng và phát triển kinh tế xã hội. Mục tiêu của luận án: Chiết tách và phân đoạn fucoidan từ một số loài rong nâu Việt Nam. Phân tích thành phần, xác định đặc điểm cấu trúc và mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính sinh học của fucoidan. Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án bao gồm: - Thu thập các loài rong nâu có trữ lượng lớn ở vùng biển vịnh Nha Trang. - Tách chiết và phân đoạn fucoidan từ các loài rong thu được. - Phân tích thành phần hóa học và thăm dò hoạt tính sinh học của fucoidan và các phân đoạn của chúng. - Xác định cấu trúc của fucoidan có hoạt tính quan tâm. - Đánh giá mối tương quan giữa hoạt tính sinh học với đặc trưng cấu trúc của fucoidan
3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 2.3 RONG BIỂN 1.1.1 Giới thiệu chung về rong biển Hàng năm đại dương cung cấp cho trái đất khoảng 200 tỷ tấn rong biển. Nhiều nhà khoa học cho rằng trên 90% cacbon trên trái đất được tổng hợp nhờ quang hợp, trong đó 20% có nguồn ngốc từ rong biển [83,97] Việc tiêu thụ sản phẩm từ rong biển (tảo đa bào ở biển) đã trải qua thời kì lịch sử rất lâu dài. Các dấu vết khảo cổ học cho thấy, người Nhật đã dùng rong biển từ hơn 10.000 năm trước. Trong nền văn hoá Trung Quốc cổ đại, rong biển được coi là đặc sản dùng trong các món ăn của triều đình và chỉ hoàng tộc hay khách của hoàng thân, quốc thích mới được thưởng thức. Dù rong biển được coi là món ăn đặc trưng của châu Á, nhưng trên thực tế các quốc gia có bờ biển trên thế giới như Scotland, Ireland, Newzealand, quần đảo nam Thái Bình Dương và các nước Nam Mỹ ven biển cũng đã sử dụng rong biển từ rất lâu. Rong biển cũng được sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác. Chúng là nguồn nguyên liệu tự nhiên cho công nghiệp thực phẩm (Cải biển Ulva lactuca, bột rong biển, chất tạo gel E400, E401 Alginate–Agar E406, E407, Carrageenan ), mỹ phẩm (chất tạo kết cấu và hoạt hóa), công nghiệp (Phycocolloids, hydrocolloids tạo độ sánh, gel hoặc chất ổn định), thức ăn gia súc, nông nghiệp Qua các tài liệu tham khảo trong lịch sử và trong thời gian sử dụng lâu dài, không có nguy cơ gây hại sức khỏe nào được đề cập đến rong biển. Vì vậy, rong biển được xếp vào loại thực phẩm chức năng ngày càng được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Hiện nay, Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc là những nước tiêu thụ rong biển thực phẩm lớn nhất và nhu cầu của họ là cơ sở của một nghề nuôi trồng thủy sản với sản lượng hằng năm trên toàn thế giới khoảng 6 triệu tấn rong tươi, trị giá lên đến 5 tỉ USD [97]. Các nước và lãnh thổ cung cấp rong biển thực phẩm chính là Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đài Loan. Các nước cung cấp chính rong biển cho công nghiệp là Đan Mạch, Pháp, Na Uy, Tây Ban Nha, Mỹ và Nhật.
4 1.1.2 Phân loại và phân bố của rong biển * Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính [30]: 1. Ngành rong nâu (Phaeophyta) 2. Ngành rong đỏ (Rhodophyta) 3. Ngành rong lục (Chlorophyta) Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữu lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại. Trên thế giới hiện nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được khoảng hơn 400 loài [1, 8]. Rong nâu (Phaeophyta) phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp theo là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ, kế tiếp là Chile, Achentina, Brazil, Hawaii, Malaysia, Mexico, Myanmar, Bồ Đào Nha. Trong đó bộ Fucales, đối tượng phổ biến và kinh tế nhất của rong nâu đại diện là họ Sargassaceae với hai loài Sargassum và Turbinaria phân bố chủ yếu ở vùng cận nhiệt đới. Sản lượng rong nâu lớn nhất thế giới tập trung tại Trung Quốc với trên 667.000 tấn khô, với 3 chi chính là Laminaria, Udaria, Ascophyllum. Hàn Quốc khoảng 96.000 tấn với 3 chi Udaria, Hizakia, Laminaria. Nhật Bản khoảng 51.000 tấn Laminaria, Udaria, Cladosiphon, Na Uy khoảng 40.000 tấn, Chile khoảng 27.000 tấn [5]. * Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam Ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm [9]. Theo điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khô/năm [1]. Rong nâu phân bố phổ biến ở các vùng biển Đà Nẵng (chân đèo Hải Vân, bán đảo Sơn Trà), Quảng Nam (Cù Lao Chàm, Núi Thành), Quảng Ngãi (Bình
5 Châu, đảo Lý Sơn, Sa Huỳnh), Bình Định (Phù Mỹ, Qui Nhơn), Phú Yên (vịnh Xuân Đài, Cù Mông), Khánh Hòa (vịnh Vân Phong, Hòn Khói, vịnh Nha Trang, vịnh Cam Ranh), Ninh Thuận (huyện Ninh Hải, Ninh Phước). Trong khi đó vùng bờ biển từ Bình Thuận đến Bà Rịa-Vũng Tàu không phát hiện sự có mặt của rong nâu. Đoạn bờ biển Tây Nam Bộ thuộc tỉnh Kiên Giang từ Hòn Chông, Hòn Trẹm (xã Bình An) đến thị xã Hà Tiên, Mỹ Đức, giáp biên giới Campuchia là vùng biển có nhiều điều kiện thuận lợi cho rong nâu phát triển [1]. Nhìn một cách tổng quan hai khu vực ở ven biển phía Nam Việt Nam rong nâu phân bố tập trung là vùng ven biển và đảo từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu và huyện Hà Tiên (từ xã Bình An đến Mỹ Đức Hà Tiên) [8]. 1.1.3 Thành phần hóa học có trong rong biển Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan (bảng 1.1). Trong số các hợp chất polysacarit của rong biển thì fucoidan là hợp chất được đặc biệt quan tâm nghiên cứu do chúng sở hữu rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị (kháng u, kháng đông tụ máu, kháng virus, kháng viêm, chống oxi hóa, ) với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu [69, 132]. Từ kết quả các số liệu trong bảng 1.1, ta thấy fucoidan chỉ có trong thành phần của ngành rong nâu mà không có trong thành phần của hai ngành rong đỏ và rong lục [5]. Bảng 1.1: Thành phần hoá học (%) của một số loài rong biển. Ascophyllum Laminaria Alaria Palmaria Porphyra Porphyra Ulva nodosum digitata esculenta palmata sp. yezoensis sp. Ngành rong Nâu Nâu Nâu Đỏ Đỏ Đỏ Lục Nước 70-85 73-90 73-86 79-88 86 Nd 78 Tro 15-25 73-90 73-86 15-30 8-16 7,8 13-22 Alginic axít 15-30 20-45 21-42 0 0 0 0 Xylan 0 0 0 29-45 0 0 0
6 Laminaran 0-10 0-18 0-34 0 0 0 0 Mannitol 5-10 4-16 4-13 0 0 0 0 Fucoidan 4-10 2-4 nd 0 0 0 0 Floridosid 0 0 0 2-20 nd nd 0 Protein 5-10 8-15 9-18 8-25 33-47 43,6 15-25 Chất béo 2-7 1-2 1-2 0,3-0,8 0,7 2,1 0,6-0,7 Tannin 2-10 0,1 0,5-6,0 nd nd nd nd Kali 2-3 1,3-3,8 nd 7-9 3,3 2,4 0,7 Natri 3-4 0,9-2,2 nd 2,0-2,5 Nd 0,6 3,3 Magie 0,5-0,9 0,5-0,8 nd 0,4-0,5 2,0 nd nd Iod 0,01-0,1 0,3-1,1 0,05 0,01-0,1 0,0005 nd nd 1.2 FUCOIDAN 1.2.1 Giới thiệu chung về fucoidan Fucoidan là một anion polysacarit sulfate hóa nằm trong thành tế bào của rong nâu, hợp chất này được phân lập và mô tả lần đầu tiên bởi Kylin vào năm 1913 [67], khi đó nó được đặt tên là “fucoidin” theo tên gọi của gốc đường fucose là thành phần chính cấu tạo nên polysacarits này. Nhưng theo danh pháp carbohydrate nghiêm ngặt, thuật ngữ này là không chính xác, vì các polysacarit được tạo nên bởi fucose và sulfate được đặt tên là sulfate fucan. Các polysacarit như vậy trên thực tế chỉ có mặt trong ngành Da gai, cụ thể là cầu gai và hải sâm [125]. Ngược lại, thành phần và cấu trúc của các polysacarit rong nâu phức tạp hơn nhiều. Ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, trong phân tử của fucoidan còn có thể chứa thêm các đường đơn khác như: galactose, xylose, manose, glucuronic axít , đồng thời có thể bị acetyl hóa một phần. Cấu trúc hóa học chi tiết của các polyme sinh học phức tạp này trong nhiều trường hợp còn chưa được biết đến. Chính vì vậy, tên gọi phổ thông “fucoidan” là thích hợp nhất nhằm dùng cho tất cả các polysacarit sulfate hóa
7 của rong nâu, nó không liên quan đến thành phần của chúng, nhưng hiển nhiên không được sử dụng cho fucan sulfate hóa có nguồn gốc động vật [125]. Nhờ sự đa dạng về thành phần và cấu trúc mà fucoidan sở hữu nhiều hoạt tính sinh học thú vị như: kháng đông tụ máu, kháng huyết khối, kháng virut, chống kết dính tế bào, chống tạo mạch (antiangiogenic), kháng viêm, kháng u, kháng bổ thể (anticomplementary), điều biến hệ miễn dịch, v.v [69]. Nhờ vậy, fucoidan đã trở thành đối tượng thu hút được nhiều sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học trên thế giới với tiềm năng ứng dụng rất lớn trong các lĩnh vực như thực phẩm chức năng, thực phẩm bổ dưỡng và dược liệu. Cùng với đó số các công trình nghiên cứu về fucoidan đã tăng vọt trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây (Hình 1.1) [81] Hình 1.1 Số các công trình công bố có liên quan đến fucoidan từ năm 1980-2010 Thành phần của fucoidan trong rong nâu Hàm lượng của fucoidan phụ thuộc vào loài rong, địa điểm và thời gian thu hoạch rong. Năm 1997, Park và cộng sự đã công bố hàm lượng fucoidan từ 1-20% trọng lượng rong khô và phụ thuộc vào loài rong [100]. Trước đó, công bố của Stewart và cộng sự (1961) cho rằng hàm lượng fucoidan của rong nâu không thay đổi nhiều khi thu rong ở các mùa vụ khác nhau [120]. Tuy nhiên, sau đó công bố
8 này đã được hiệu chỉnh lại trong nhiều nghiên cứu, theo các công bố [100,126] hàm lượng fucoidan phụ thuộc vào vùng địa lý, loài rong và thời điểm thu hoạch. Năm 1994, Koo đã công bố hàm lượng fucoidan được phân lập từ các loài rong L. religiosa, U. pinnatifida, H. fusiforme và S. fulvellum lần lượt là 2,7%; 6,7%; 2,5% và 1,6% [66]. Bảng 1.2. Thành phần hóa học của một số fucoidan [69] Rong nâu Thành phần hóa học (tỉ lệ mol) F. vesiculosus Fucose/sulfate (1/1,20) F. evanescens Fucose/sulfate/acetate (1/1,23/0,36) F. distichus Fucose/sulfate/acetate (1/1,21/0,08) F. serratus L. Fucose/sulfate/acetate (1/1/0,1) Lessonia vadosa Fucose/sulfate (1/1,12) Macrocytis pyrifera Fucose/galactose (18/1) Pelvetia wrightii Fucose/galactose (10/1) Undaria pinnatifida (Mekabu) Fucose/galactose (1/1,1) Ascophyllum nodosum Fucose/xylose/GlcA (4,9/1/1,1) Himanthalia lorea Fucose/xylose/GlcA (2,2/1,0/2,2) và Bifurcaria bifurcate Padina pavonia Fucose/xylose/mannose/glucose/galactose (1,5/1,5/1,2/1,2/1) Laminaria angustata Fucose/galactose/sulfate (9/1/9) Ecklonia kurome Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,67/0,03/0) Sargassum stenophyllum Fucose/galactose/mannose/xylose (1/0,2/0,02/0,24) Adenocytis utricularis Fucose/galactose/mannose (1/0,38/0,15) Hizikia fusiforme Fucose/galactose/mannose/xylose/GlcA (1/0,72/0,72/0,2/0,25) Dictyota menstrualis Fucose/xylose/uronic acid/galactose/sulfate (1/0,8/0,7/0,8/0,4) và (1/0,3/0,4/1,5/1,3) Spatoglossum schroederi Fucose/xylose/galactose/sulfate (1/0,5/2/2) Fucoidan là một sulfate polysacarit dị thể với thành phần cấu tạo hết sức phức tạp. Lần đầu tiên thành phần của fucoidan trong dịch chiết nước được xác định là một polysacarit có chứa L-fucose và D-xylose, trong khi đó D-galactose và
9 uronic axít được xem là các tạp chất [102]. Tuy nhiên, trong cô bố của Percival và Ross (1950) cho thấy fucoidan trong dịch chiết nước nóng của các loài rong Fucus vesiculosus, Fucus spiralis and Himanthalia lorea có chứa 38% ester sulfate, 56,7% fucose, 4% galactose, 1,5% xylose, 3% uronic axít và 8% khoáng [103]. Tỉ lệ fucose/galactose trong phân tử fucoidan cũng phụ thuộc vào các loài rong [80,92,102]. Dillon và cộng sự. (1953) đã phân lập được fucoidan từ loài rong Ascophyllum nodosum có tỉ lệ fucose: galactose là 8:1 [43], trong khi fucoidan được phân lập từ rong Macrocystis pyrifera có tỉ lệ fucose:galactose = 18:1 [69]. Ngoài ra, các thành phần đường khác (như xylose, mannose, ) cũng được xác nhận là hợp phần của fucoidan [102]. Thành phần của fucoidan từ rong F. vesiculosus là 44,1% fucose, 26,3% sulfate, 31,1% tro và một lượng nhỏ amino-glucose [69,103]. Như vậy, thành phần của fucoidan phụ thuộc vào các loài rong (bảng 1.2) [69,81]. Ngoài ra phương pháp chiết cũng có thể ảnh hưởng tới thành phần của fucoidan [81]. Theo công bố [81], tác giả Percival (1968) đã phân lập fucoidan từ rong Ascophyllum nodosum bằng cách chiết với nước nóng và dung dịch kiềm loãng nóng, kết quả thu được fucoidan có thành phần gồm fucose, xylose, sulfate và uronic axít , trong khi đó cũng với loài rong Ascophyllum nodosum tác giả Marais và Joseleau (2001) đã tiến hành chiết bằng dung dịch 0,01% NaCl và 1% CaCl2 thu được fucoidan có thành phần là fucose, glucose, galactose và sulfate [80]. 1.2.3. Đa dạng cấu trúc của fucoidan Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu trúc của fucoidan rong biển là vô cùng phức tạp và không đồng nhất [23] với những thay đổi về mô hình liên kết (linkages), sự phân nhánh (branching), vị trí nhóm sulfate cũng như các gốc đường trong polysacarit này phụ thuộc vào nguồn gốc của chúng [25,34,35]. Vì vậy, việc phân tích cấu trúc của chúng vẫn còn là vấn đề nan giải, ngay cả khi sử dụng các kỹ thuật phổ NMR phân giải cao mới nhất [88]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm xác định cấu trúc chi tiết của fucoidan được công bố, nhưng mới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu phát hiện được tính quy luật trong cấu trúc của fucoidan.
10 - -L-fucp-4(SO3 )  3 2)- -L-fucp-(1 2)- -L-fucp-(1 2)- -L-fucp-(1 2)- -L-fucp-(1 2) 4 4 4 4     - - - - SO3 SO3 SO3 SO3 Hình 1.2. Cấu trúc của fucoidan từ F. vesiculosus được mô tả vào năm 1950 [103] Percival và Ross (1950) đã mô tả cấu trúc fucoidan từ rong Fucus vesiculosus là một polysacarit có bộ khung mạch chính là -L-fucose(1 2), vị trí mạch nhánh là gốc đường -L-fucose(1 3) và nhóm sulfate chủ yếu gắn ở vị trí C- 4 của gốc đường L-fucospynanose (hình 1.2) [103]. Mô hình cấu trúc fucoidan này tồn tại hơn 40 năm. Năm 1993, cấu trúc fucoidan của rong F.vesiculosus đã được nghiên cứu lại bởi Patankar và công sự, kết quả cho thấy có sự khác nhau ở bản chất liên kết glycoside của fucoidan này với mạch chính là -L-fucose(1 3) thay vì - L-fucose(1 2), nhóm sulfate được tìm thấy chủ yếu ở vị trí 4, phù hợp với mô hình đã công bố trước [101]. Sự khác nhau về cấu trúc fucoidan so với công bố của Percival và Ross được Pantakar giải thích như sau: đầu tiên là kỹ thuật chiết tách khác nhau, fucoidan được Percival và Ross chiết trong dung môi nước nóng, thay vì được chiết trong dung môi axít như Pantakar; thứ hai là sự khác nhau về phương pháp methyl hóa và cuối cùng là sự khác nhau về phương pháp phân tích cấu trúc. Percival và Ross phân tích cấu trúc fucoidan dựa trên các tính chất về sắc ký và hóa học của sản phẩm methyl hóa, trong khi đó các sản phẩm methyl hóa được Patankar phân tích bằng phương pháp GC-EI/MS. Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ascopphyllum nodosum (A. nodosum) đã được công bố trong các nghiên cứu [34,35,40,42]. Năm 2001, Chevolt và cộng sự đã phân lập được fucoidan từ rong nâu Ascorphylum nodosum [35], cấu trúc fucoidan oligosacarit (bậc polyme hóa từ 8-14) của loài rong này được cấu thành bởi các liên kết luân phiên (1 3) và (1 4) (hình 1.3) [35]. Cấu trúc fucoidan từ A.nodosum cũng đã được Daniel và cộng sự nghiên cứu
11 khi sử dụng các enzym đặc hiệu làm xúc tác sinh học để thủy phân tạo fucoidan oligosacarit, kết quả cho thấy sự có mặt của lượng lớn các liên kết glycoside của gốc -L-fucose(1 3) và -L-fucose(1 4) [40]. - - [ 3)-α-L-Fucp (2SO3 )-(1 4)-α-L-Fucp (2,3SO3 )-1 ]n H H CH3 1 -O SO H HO H 3 H 3 H H CH3 4 1 - H O3SO H Hình 1.3. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan - OSO3 H tách và phân lập từ rong nâu A. nodusum. Cấu trúc fucoidan từ loài rong Ecklonia kurome đã được công bố năm 1991 bởi Nishino và Nagumo. Do tính dị thể trong phân tử của fucoidan nên phổ NMR của chúng quá phức tạp để có thể giải thích cấu trúc một cách trực tiếp. Cấu trúc phân tử trung bình của fucoidan này chủ yếu được tạo thành bởi liên kết α-L- fucose(1 3) với phần lớn nhóm sulfate gắn ở vị trí C-4 và một phần ở C-2 hoặc vị trí C-2 là các điểm chẻ nhánh (hình 1.4) [91]. H H CH3 - H OH H O3SO H CH H H 3 Hình 1.4. Cấu trúc fucoidan có sulfat ở vị trí 4 OH - H và liên kết 3-O-linked của loài rong E.kurome O3SO H H Năm 1999, cấu trúc fucoidan của 3 loài rong Cladosiphon Okamuranus (Chordariales) [89], Chorda filum (Laminariales) và Ascophyllum nodosum (Fucales) [34,41] đã được công bố. Cấu trúc fucoidan của rong Cladosiphon
12 okamuranus và Chorda filum được tạo thành bởi các gốc α-L-fucose(1 3) lặp lại đều đặn, với một số nhóm sulfate ở vị trí C-2 (2-O-sulfateation) hoặc vị trí C-4 (4- O-sulfateation) (hình 1.5). Sự xuất hiện của các nhóm O-acetyl và các mạch nhánh trong phân tử fucoidan càng làm tăng thêm tính dị thể về cấu trúc của chúng. H H CH3 R1O H R2O H H H H CH3 1 - 3 R O R = SO3 hoặc H hoặc H R2O H H COCH3 2 - - H R = SO3 hoặc H H CH3 H R1O H R2O H H H CH3 H H CH3 R1O R2O H H R1O H R2O H H OH H H H CH3 Hình 1.5. Cấu trúc trung bình của fucoidan được 1 2 R O phân lập từ rong Chorda filum [36] R O H H H Năm 2002, cấu trúc fucoidan trọng lượng phân tử cao được phân lập từ rong Fucus evanescens đã được nghiên cứu bởi Bilan và cộng sự, kết quả họ đã phát hiện thấy có sự tương đồng giữa cấu trúc fucoidan này với cấu trúc fucoidan của rong A.nodosum [23]. Sau đó vào các năm 2004 và 2006, nhóm tác giả này tiếp tục công bố thêm hai cấu trúc fucoidan từ rong Fucus distichus L và Fucus serratus được tạo thành bởi các gốc 1→3)α-L-Fucp và 1→4)α-L-Fucp liên kết lặp lại một cách tuần tự, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C-2 và C-2,4 (hình 1.6 và hình 1.7) [24,25].
13 - - [ 3)- -L-Fucp-(2,4 SO3 )-(1 4)- -L-Fucp-(2SO3 )-(1 ]n 1 H H 2 HO - H H OSO3 CH3 4 - O3SO CH3 1 Hình 1.6. Cấu trúc của một phân đoạn fucoidan H H H H được phân lập từ rong Nâu Fucus distichus L. 3 2 - OSO3 - 3)- -L-Fucp(2R1,4R2)-(1 4)- -L-Fucp(2SO3 )-(1 Trong đó: - R1 = SO3 , R2 = H chiếm 50% và - - R1 = H, R 2 = -L-fucp-(1 4)- -L-fucp(2SO3 )-(1 3) -L-fucp(2SO3 )-(1 chiếm 50% Hình 1.7. Cấu trúc fucoidan từ Fucus serratus. Như vậy, mặc dù có mối liên hệ rõ ràng giữa các loài rong và cấu trúc fucoidan, nhưng chưa đủ bằng chứng để thiết lập bất cứ mối tương quan hệ thống giữa cấu trúc fucoidan với các Bộ rong (algal order). Hầu hết các công bố về cấu trúc của fucoidan được phân lập từ các loài rong ở vùng ôn đới, thành phần hóa học của các loại fucoidan này nhìn chung là đơn giản với chỉ một gốc đường fucose và sulfate. Tuy nhiên, fucoidan của các loài rong ở vùng nhiệt đới thì thành phần hóa học của chúng phức tạp hơn nhiều khi trong phân tử của chúng thường tồn tại đồng thời nhiều gốc đường khác nhau điều đó gây ra rất nhiều khó khăn cho việc phân tích cấu trúc của những loại fucoidan này. Đó cũng là lý do tại sao không có nhiều công bố về cấu trúc của fucoidan rong biển ở vùng nhiệt đới, cho dù hoạt tính sinh học của chúng vô cùng thú vị. 1.2.4. Các phương pháp chiết tách fucoidan từ rong nâu Một số quy trình khác nhau đã được sử dụng để chiết fucoidan. Mối bận tâm chính trong quy trình tách chúng là nhiễu gây bởi các polysacarit khác như
14 laminaran và alginat. Những thử nghiệm chiết đầu tiên được tiến hành với dung môi là nước. Năm 1950, fucoidan từ rong Fucus vesiculosus và Fucus spiralis đã được Percival và Ross chiết tách bằng nước sôi trong 24 giờ, sau đó loại bỏ alginate và protein bằng Pb-acetate, tiếp theo fucoidan được kết tủa dưới dạng phức hydroxide khi cho phản ứng với Ba(OH)2. Phức thu được, đem thủy phân trong dung dịch H2SO4 loãng, fucoidan được tách ra và làm sạch bằng màng thẩm tách [103]. Năm 1952, Black đã khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ, thời gian chiết và tỷ lệ dung dịch chiết với rong nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi fucoidan. Kết quả cho thấy điều kiện tối ưu để chiết fucoidan bao gồm khuấy huyền phù rong với dung dịch HCl ở pH: 2,0-2,5 (tỷ lệ 1:10) tại 70oC trong 1h. Bằng cách xử lý này chỉ 1 lần chiết có thể phân lập được cỡ 50% fucoidan trong khi 3 lần chiết có thể tách ra được hơn 80% fucoidan. Fucoidan còn có thể được chiết bằng đun nóng một phần o rong khô với 10 phần H2O tại 100 C trong 3-7,5h, bằng cách này có thể thu được 55-60% fucoidan. Khi tăng tỉ lệ H2O : rong, thời gian chiết hoặc số lần chiết có thể tăng được hiệu suất chiết. Theo tác giả chiết nước đôi khi không thích hợp do khó tách cặn rong khỏi dung dịch nước. Fucoidan thô được tách khỏi dịch chiết axít bằng trung hòa và cho bay hơi đến khô, hòa tan lại trong nước và kết tủa thu các phân đoạn fucoidan với cồn ở nồng độ 30% và 60% (v/v). Phân đoạn 60%, fucoidan thô có chứa 30-36% fucose. Có thể tách được fucoidan với hàm lượng fucose lớn hơn 40% từ sản phẩm thô bằng cách xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde [29]. Những nỗ lực đầu tiên nhằm đưa ra một phương pháp chiết fucoidan có hệ thống đã được thực hiện bởi Mian và Percival [84]. Họ đã tiến hành chiết tuần tự, đầu tiên là xử lý rong nguyên liệu với formaldehyde, tiếp theo xử lý với cồn ở nồng độ 80% để loại bỏ mannitol, các hợp chất màu và các sản phẩm khối lượng phân tử thấp, sau đó rong được chiết bằng cách khuấy trộn với dung dịch CaCl2 2% (ở nhiệt độ phòng và 70oC) để phân lập laminaran và fucoidan (alginate được cố định dưới dạng muối Ca-alginat không tan). Fucoidan được chiết tiếp với dung dịch HCl loãng (pH: 2). Sau cùng bã rong được chiết với 3% Na2CO3 để thu lại alginate dưới dạng muối tan Na-alginat. Hai dung môi bổ sung cuối cùng nhằm chiết ra thêm các
15 phân đoạn fucoidan. Quy trình chiết tuần tự phức tạp này hầu như không được sử dụng về sau, nhưng đã trở thành cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo. Các tách giả Zvyagintseva và Duarte [48,143] đã sử dụng các phương pháp chiết fucoidan đơn giản nhưng lại áp dụng các bước làm sạch phức tạp tốn nhiều công sức. Fucoidan từ rong Adenocystis utricularis đã được phân lập bởi Ponce và cộng sự [96] như sau: đầu tiên rong được xử lý với cồn 80%. Sau đó để thu nhận fucoidan, rong được chiết riêng biệt với ba dung môi khác nhau thường được sử dụng để thu nhận fucoidan là nước cất, dung dịch CaCl2 2% và dung dịch HCl loãng (pH: 2). Trong cả 3 trường hợp việc chiết được thực hiện ở nhiệt độ phòng và sau đó ở 70oC. Hiệu suất chiết và đặc tính của các sản phẩm thu được trong ba trường hợp là tương tự nhau với chỉ một số ít khác biệt. Các dung dịch chiết ở nhiệt độ phòng cho ra sản phẩm fucoidan giàu L-fucose, D-galactose và ester sulfate được gọi đặt tên là “galactofucan”, thể hiện đặc tính ức chế chống lại herpes simplex virus 1 và 2 nhưng không gây độc tế bào. Sản phẩm khác là thành phần chính của dịch chiết thu được ở 70oC, bao gồm chủ yếu là fucose cùng với các monosacarit khác (phần lớn là Man, nhưng đồng thời có cả Glc, Xyl, Rha, Gal), một lượng đáng kể axít uronic và lượng nhỏ sulfate ester, được gọi chung là “uronofucoidan”, không thể hiện hoạt tính kháng virus, nhưng lại thể hiện hoạt tính gây độc tế bào. Như vậy có thể thấy phương pháp chiết có ảnh hưởng rất lớn đến thành phần, cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của fucoidan. Hiện nay vẫn chưa có phương pháp chuẩn áp dụng để chiết tách fucoidan từ các loài rong khác nhau. Hầu hết các phương pháp chiết fucoidan hiện nay đều hướng đến mục tiêu bảo toàn cấu trúc tự nhiên vốn có của fucoidan, đồng thời hạn chế tối đa sự nhiễm tạp của các thành phần không mong muốn. 1.2.5. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của fucoidan a. Hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng huyết khối Fucoidan có phổ hoạt tính sinh học rộng và đa dạng, nhưng hoạt tính chống đông máu của chúng được nghiên cứu sớm nhất. Nishino và cộng sự, đã thử nghiệm
16 hoạt tính chống đông máu của fucoidan được phân lập từ các loài rong E. Kurome, H.fusiforme, L.angustata var. longissima kết quả cho thấy chúng có hoạt tính kháng đông tụ máu cao hơn so với Heparin [92]. Hàm lượng sulfate có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính kháng đông tụ máu của fucoidan từ một số loài rong (E.kurome, H.fusiforme, vv ), hàm lượng sulfate càng cao thì hoạt tính kháng đông tụ càng lớn [31,38,70,91,93,108]. Vị trí của các nhóm sulfate trên các gốc đường cũng rất quan trọng với hoạt tính kháng đông tụ của fucoidan. Theo các nghiên cứu [34,35,48,118,137] fucoidan sulfate hóa ở vị trí C-2 hoặc C-2, C-3 thể hiện hoạt tính kháng đông tụ, trong khi đó nhóm sulfate ở vị trí C-4 không thể hiện hoạt tính này. Trọng lượng phân tử fucoidan cũng có ảnh hưởng lên hoạt tính kháng đông tụ máu của chúng. Fucoidan tự nhiên từ Lessonia vadosa (Phaeophyta) có khối lượng phân tử (320.000 Da MW) cho thấy hoạt tính chống đông máu tốt hơn các fucoidan đề polymer hóa có khối lượng phân tử (32.000 MW) [31,35]. Một số nghiên cứu khác cho thấy thành phần đường (fucose, galactose, v.v) của fucoidan có ảnh hưởng đến hoạt tính chống đông máu [44,95,104,105,106]. Thành phần axít uronic không ảnh hưởng trực tiếp lên hoạt tính chống đông máu, nhưng nó gián tiếp làm tăng hoạt tính chống đông máu của fucoidan thông qua việc làm cho chuỗi đường trở nên linh động hơn [70]. Hoạt tính chống huyết khối của fucoidan cũng đã được thử nghiệm in vivo theo mô hình ngẽn tĩnh mạch và động mạch ở động vật thí nghiệm [87]. Sulfate galactofucan được phân lập từ rong Spatoglossum schroederi không thể hiện hoạt tính chống đông máu trên một số thử nghiệm in vitro. Tuy nhiên, nó lại thể hiện hoạt tính kháng huyết khối mạnh khi thực hiện thí nghiệm in vivo, điều này có thể được giải thích do ảnh hưởng của yếu tố thời gian đến hoạt tính kháng huyết khối của fucoidan [110]. Như vậy có thể thấy rằng fucoidan có tiềm năng rất lớn để sử dụng làm thuốc chống đông máu, thuốc chống huyết khối hoặc thực phẩm chức năng và dược liệu mà hầu như không có tác dụng phụ [33,70,87].
17 b. Hoạt tính chống virus Trong những năm gần đây, các thử nghiệm về hoạt tính kháng virus của fucoidan đã được thực hiện bằng cả “in vitro” và “in vivo” yếu tố gây độc tế bào thấp của chúng so với các thuốc kháng virus khác đang được quan tâm xem xét sử dụng trong y học lâm sàng. Fucoidan từ các loài rong Laminaria japonica [75], Adenocytis utricularis [107], Undaria pinnatifida (Mekabu) [68], Stoechospermum marginatum [13], Undaria pinnatifida [55], Cystoseira indica [79] và Undaria pinnatifida [54] cho thấy hoạt tính kháng virus HSV-1 và HSV-2 mà không gây độc cho tế bào Vero [79]. Hơn nữa, fucoidan còn cho thấy hoạt tính ức chế chống lại sự tái tạo nhiều loại virus màng bao gây ra hội chứng suy giảm miễn dịch của người và cytomegalovirus [107]. Hoạt tính antiprion và kìm hãm sự khởi phát bệnh khi bị nhiễm trùng prion đường ruột của fucoidan đã được công bố bởi Doh-ura và cộng sự [46]. c. Hoạt tính kháng u và điều hòa miễn dịch Hoạt tính kháng u của nhiều polysacarit đã được công bố trong những năm gần đây. Fucoidan từ rong Eisenia bicyclics và Laminaria japonica có tác dụng chống u báng 180 [115,119,127]. Fucoidan được phát hiện có khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào trong dòng tế bào u lympho HS-Sultan của người [14]. Fucoidan từ các loài rong L. saccharina, L. digitata, F. serratus, F. distichus và F. vesiculosus có tác dụng khóa chặt tế bào ung thư vú MDA-MB-231 ngăn kết dính với các tiểu cầu, tác dụng này có ý nghĩa quan trọng trong quá trình di căn khối u [38, 52, 82]. Khả năng phục hồi các chức năng miễn dịch của fucoidan từ rong L. japonica đã được thử nghiệm in vivo [131]. Fucoidan giúp thúc đẩy sự phục hồi chức năng miễn dịch trên các con chuột bị chiếu xạ [133,134]. Fucoidan có thể làm tăng khả năng sản xuất interleukin-1 (IL-1) và interferon-γ (IFN-γ) trong các thử nghiệm in vitro, tăng cường các chức năng của tế bào lympho T, tế bào B, đại thực bào, tế bào giết tự nhiên (NK tế bào) và thúc đẩy các kháng thể chính phản ứng lại với tế bào hồng cầu máu cừu (SRBC) trong thí nghiệm in vivo [136]. Fucoidan trọng lượng phân tử cao được điều chế từ Okinawa Mozuku (Cladosiphon
18 okamuranus) thúc đẩy sự gia tăng tỷ lệ gây độc tế bào T ở chuột [117]. Fucoidan từ rong F.vesiculosus có các tác dụng lên sự trưởng thành và điều hòa miễn dịch trên các tế bào tua (DCs), đây là các tế bào có kháng nguyên mạnh mẽ, thông qua con đường liên quan ít nhất đến yếu tố nhân tế bào (Nuclear factor - κB (NF- κB)) [65]. d. Hoạt tính chống oxy hóa Rất nhiều công bố cho thấy rằng fucoidan thể hiện hoạt tính chống oxy hóa quan trọng trong các thí nghiệm in vitro. Nó là một chất chống oxy hóa tự nhiên tuyệt vời để ngăn ngừa các bệnh gây ra bởi các gốc tự do [139]. Tác dụng ức chế sự hình thành các gốc tự do hydroxyl và gốc peoxit của fucoidan (homofucan) từ F.vesiculosus và fucan (heterofucans) từ Padina gymnospora đã được nghiên cứu bởi Micheline và cộng sự, kết quả cho thấy fucan có hoạt tính chống oxy hóa thấp so với fucoidan [85]. Hoạt tính chống oxy hóa liên quan đến trọng lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan [23]. Các phân đoạn fucoidan từ L. japonica có khả năng làm mất gốc peoxit và axít hypochlorous tuyệt vời [140]. Cả khối lượng phân tử và hàm lượng sulfate của fucoidan đều đóng vai trò rất quan trọng trong việc tác động lên các gốc azo 2-2'-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) gây ra quá trình oxy hóa LDL [76]. e. Giảm lipid máu Fucoidan là hợp chất có hoạt tính tương tự như axít sialic, nó có thể làm tăng các điện tích âm của bề mặt tế bào đến mức có hiệu lực với sự tích tụ của cholesterol trong máu, kết quả làm giảm lượng cholesterol trong huyết thanh. Các nghiên cứu [73,74,77,130] cho thấy fucoidan từ rong L. japonica giảm đáng kể cholesterol toàn phần, triglyceride và LDL-C mà không có tác dụng phụ gây tổn hại cho gan và thận. Hoạt tính giảm lipid máu của fucoidan phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của chúng, trọng lượng phân tử càng thấp thì hoạt tính càng cao [51]. f. Chống viêm Năm 2007, Cumashi và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính chống viêm của fucoidan thu nhận được từ chín loài rong nâu. Kết quả cho thấy tất cả fucoidan của 9 loài rong đều có khả năng ức chế sự tăng số lượng bạch cầu trên mô hình chuột bị
19 viêm, hiệu quả chống viêm của fucoidan trong mô hình này không bị ảnh hưởng nhiều bởi hàm lượng của gốc fucose và sulfate cũng như các đặc tính cấu trúc khác của bộ khung mạch polysacarit của chúng [38]. Ngoài ra hoạt tính kháng viêm của fucoidan cũng đã được nghiên cứu bởi các tác giả [82,135]. g. Bảo vệ dạ dày Fucoidan từ Cladosiphon okamuranus tokida là một chất an toàn với khả năng bảo vệ dạ dày [116]. Fucoidan như là một tác nhân chống viêm loét và ức chế kết dính với vi khuẩn Helicobacter pyroli (một loại vi khuẩn gây viêm loét dạ dày) [59]. Fucoidan từ rong Cladosiphon okamuranus có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư dạ dày nhưng không cho thấy bất kỳ ảnh hưởng nào lên tế bào bình thường [62]. h. Chống lại bệnh về gan Fucoidan ngăn chặn tổn thương gan gây ra bởi concanavalin A bằng việc gián tiếp sinh ra interleukin (IL)-10 nội sinh và ức chế yếu tố tiền viêm (proinflammatory cytokine) ở chuột [113]. Một số nghiên cứu [54,63,64] thấy cho fucoidan có thể là một chất chống xơ rất tốt năng nhờ sở hữu chức năng kép, cụ thể là: bảo vệ tế bào gan và ức chế sự tăng sinh tế bào gan hình sao. i. Các ứng dụng của fucoidan Những nghiên cứu trong suốt thập niên vừa qua đã đưa ra số lượng lớn bằng chứng khoa học về những lợi ích sức khỏe của fucoidan, một loại polysacarit sulfat hóa giàu fucose từ rong nâu. Nghiên cứu về hoạt tính sinh học của fucoidan chiết xuất từ rong nâu đã mở ra những cơ hội tiềm năng cho ngành công nghiệp dược phẩm, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm và thực phẩm chức năng. Hiện nay, trên thị trường đã xuất hiện nhiều loại fucoidan với thành phần, tác dụng và nhãn mác khác nhau như: LCR fucoidan của Larson Century Ranch, INC, Mỹ có tác dụng điều trị các bệnh ung thư vú, ruột kết, buồng trứng, cũng như tác dụng chống dị ứng, chống lão hóa, chống đái tháo đường, giảm cholesterol, loét dạ dày, Fucoidan Tongan Limu Moui của công ty AHD International, LLC, Mỹ có tác dụng trị tim mạch, chống lão hóa, tăng cường miễn dịch, U-Fucoidan sản phẩm của tập đoàn Pharmaceutical Grade Nutritional & Dietary Anti-aging Supplements, Mỹ gây ra
20 sự giáng hóa các tế bào ung thư, Fucoidan của tập đoàn Qingdao Yijia Huayi Import & Export Co.,Ltd., Trung Quốc được sử dụng để phục hồi khả năng kháng ung thư, sản phẩm thuốc kháng virut, điều trị ung thư và tim mạch, [5]. Sản phẩm Best fucoidan 70% của công ty Doctor’best INC., Mỹ có tác dụng hỗ trợ điều trị ung thư, ngăn ngừa lão hóa, tăng cường hệ miễn dịch, [57]. Ở nước ta hiện nay, các sản phẩm fucoidan từ rong nâu Việt Nam đã xuất hiện trên thị trường dưới dạng thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị bệnh ung thư và viêm loét dạ dày do Công ty Cổ phần Fucoidan Việt Nam sản xuất là: FucoUmi, FucoAntiK và Fucogastro. Ngoài ra, fucoidan cũng được sử dụng như một thành phần chức năng trong sản phẩm sữa chua fucoidan và nước yến fucoidan của Công ty Sannet Khánh Hòa. Như vậy có thể thấy, fucoidan với rất nhiều hoạt tính sinh học thú vị cũng như tiềm năng ứng dụng hết sức rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống đang ngày càng thu hút sự quan tâm nghiên cứu mạnh mẽ của các nhà khoa học trên toàn thế giới. 1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CẤU TRÚC CỦA FUCOIDAN Việc phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng là một trong những thách thức lớn trong hóa học các chất hữu cơ có gốc đường. Cấu trúc của fucoidan chiết từ rong biển thường hết sức phức tạp, bao gồm nhiều vấn đề như thành phần các đường đơn, các dạng đồng phân của đường, mức độ phân nhánh và polyme hóa của chúng. Vì vậy, để xác định được cấu trúc của fucoidan cần phải phân tích, xác định được các thông số sau: - Thành phần các gốc đường và hàm lượng sulfate - Vị trí nhóm sulfate trong các gốc đường - Vị trí liên kết giữa các gốc đường - Trật tự sắp xếp của các gốc đường 1.3.1 Phương pháp phân tích thành phần đường Phân tích thành phần các đường đơn của fucoidan là bước quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Quy trình chung để xác định các đường đơn là thủy phân fucoidan thành các monosacarit (hình 1.8) và sau đó phân tích
21 thành phần của từng monosacarit bằng phương pháp sắc ký. Hai phương pháp sắc ký phổ biến nhất được sử dụng để phân tích thành phần các đường đơn là phân tích trực tiếp bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phân tích gián tiếp thông qua các dẫn xuất acetyl hóa của chúng bằng sắc ký khí (GC): Fucoidan được thủy phân → Khử → Acetyl hóa → Sắc ký [12]. Hình 1.8. Quy trình phân tích thành phần đường đơn của fucoidan 1.3.2 Phương pháp phân tích liên kết Xác định vị trí của các liên kết trong polysacarit (fucoidan) chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp metyl hóa [44]. Nguyên tắc của phương pháp dựa vào xác định dạng và số lượng dẫn xuất metyl eter của các đại lượng đường sau khi metyl hóa các nhóm hydroxy tự do trong chúng [44], phản ứng này luôn thực hiện trong dung môi DMSO. Ví dụ: nếu sản phẩm thủy phân sau khi metyl hóa là dạng 2,3,6 tri-O-methyl α-D-glucopyranose (hình 1.9) có nghĩa là các gốc glucose liên kết với nhau qua liên kết (1→4) [12].
22 Hình 1.9. Quy trình methyl hóa phân tích liên kết glycoside trong polysacarit 1.3.3 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (bảng 1.3) [12]. Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, còn với
23 equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này. Bảng 1.3. Các đỉnh phổ đặc trưng của fucoidan trên phổ hồng ngoại Đỉnh Dao động 775 Dao động dãn vòng của - anome 802-810 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí C6 822 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí equatorial 845 Dao động gấp của liên kết C-O-S của nhóm SO3 ở vị trí axial 847 Dao động của liên kết C1-H của -anome 893 Dao động của liên kết C1-H của  anomer 917 Dao động vòng của -anome 1030-1167 Dao động hoá trị của hemiacetal 1034 Dao động hoá trị đối xứng của C-O-C 1255-1264 Dao động hoá trị của S=O 1420 Dao động hoá trị đối xứng của COO 1430 Dao dộng gấp của C-H 1730 Dao động hoá trị của C=O 3300-3440 Dao động hoá trị của O-H 1.3.4 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) Trong phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton, tất cả proton của carbohydrate (bao gồm cả mono-, oligo- và polysacarit-) có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng từ 1-6 ppm. Các proton anomeric của mỗi monosacarit có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu dạng α- hoặc β- của chúng. Ví dụ, hầu hết các proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng từ 5-6 ppm, trong khi đó các proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm.
24 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton được coi như một phương pháp đặc trưng để nhận biết fucoidan dựa vào nhóm methyl ở vị trí C6 với tín hiệu  từ 1,2 đến 1,4 ppm là vùng là vùng đặc trưng H-6 của nhóm methyl, các tín hiệu có độ dịch chuyển hóa học  từ 5,0 đến 5,5ppm là vùng của H-1 (H- ) của fucoidan. Hình 1.10. Độ dịch chuyển hóa học trong phổ NMR của polysacarit Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn nhiều, nhưng lại có nhiều thuận lợi hơn phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc của polysacarit do các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H- NMR. Vì vùng giá trị  lớn nên các tín hiệu ít chồng lấp lên nhau như trong phổ proton NMR. Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi đó các tín hiệu của C-nonanomeric xuất hiện trong vùng từ 60-85 ppm. Với fucoidan thì vùng tín hiệu đặc trưng để nhận biết trong phổ 13C-NMR là vùng trường cao từ 15-20 ppm thuộc về nhóm methyl (C-6) của vòng α-L-fucopyranose. Các tín hiệu của cacbon α-anomeric thường xuất hiện trong vùng từ 95-103 ppm, trong khi cacbon của β-anomeric xuất hiện trong vùng từ 101-105 ppm. Với nguyên tử cacbon carboxyl của axít uronic các tín hiệu sẽ xuất hiện ở vùng trường thấp hơn từ 170-180 ppm (hình 1.10). Các tín hiệu của nguyên tử cacbon có gắn với nhóm -OH, như C-6 của vòng pyranose và C-5 của vòng furanose xuất hiện trong vùng trường cao hơn từ 60-64 ppm, trong khi các tín
25 hiệu của các nguyên tử cacbon với nhóm hydroxyl thứ cấp (C2,3,4 trong vòng pyranose và C2,3 trong vòng furanose) xuất hiện trong vùng 65-87 ppm. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều 13C và 1H của polysacarit thường có độ phân giải thấp, các tín hiệu trùng lấp nhau khi trong phân tử của chúng có chứa nhiều gốc đường tương tự nhau. Điều này gây ra rất nhiều khó khăn trong việc giải thích chi tiết cấu trúc của polysacarit. Khi đó, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ giúp xác định thêm những thông tin về các liên kết trong phân tử, thông qua các tương tác giữa proton với proton và giữa proton với cacbon. Phổ 1H, 1H-COSY (Correlation spectroscopy) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 1H của hạt nhân cùng loại, phổ 1H, 13C-COSY (hay cũng được gọi là phổ HMQC (Heteronuclear Multiple Quantum Correlation) hay HECTOR (Heteronuclear Correlated Spectroscopy)) biểu diễn mối tương quan giữa 1H và 13C của các hạt nhân khác loại. Phổ hai chiều 2D-NOESY (Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy) thể hiện sự tương tác về mặt không gian của các proton nằm trên các nguyên tử cacbon ở cách xa nhau nhưng khoảng cách không gian giữa chúng nhỏ hơn 4Å. Phổ 2D-HMBC (Hecteronuclear Multiple Bond Coherence) thể hiện mối tương quan của tín hiệu 1H ở một nguyên tử 13C với tín hiệu của nguyên tử 13C khác cách xa nó 2 hoặc 3 liên kết, ngược lại phổ 13C-1H HMQC hay HETCOR thể hiện mối tương tác của 1H với 13C liên kết trực tiếp với nhau. Phổ 2D-TOCSY (Totally Correlated Spectroscopy) là phổ tương quan toàn phần biểu diễn sự tương quan của các proton liên kết và không liên kết trực tiếp nhưng trong cùng một hệ spin giống nhau. Ví dụ: tất cả proton của một gốc đường là thuộc cùng một hệ spin giống nhau. Tóm lại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều sẽ cho ta thêm những thông tin để xác định trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysacarit thông qua các tương tác giữa proton với proton và proton với cacbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp. Như vậy, có thể thấy việc phân tích cấu trúc của các polysacarit là rất khó khăn, nhưng với polysacarit sulfate hóa từ rong biển còn khó khăn hơn rất nhiều do chúng có cấu trúc rất phức tạp, có mạch nhánh và chuỗi liên kết có mức độ lặp lại không cao nên việc phân tích cấu trúc chỉ dựa vào phổ 1H-NMR và 13C-NMR là
26 không đủ và đôi khi không mang lại hiệu quả. Để phân tích cấu trúc các polysacarit phức tạp này các tác giả [5,12,23,24,34,48] thường kết hợp các phương pháp hóa học như chiết phân đoạn hoặc tách phân đoạn dựa vào sắc ký trao đổi ion, sau đó làm đơn giản hóa cấu trúc bằng các phản ứng đề sulfate hóa, metyl hóa, đề acetyl hóa, tiếp theo kết hợp các phương pháp phổ NMR, đôi khi cả phương pháp khối phổ (MS) để phân tích cấu trúc. 1.3.5 Phương pháp phổ khối lượng (MS) Phổ khối là kỹ thuật phân tích dựa trên việc xác định số khối của các phân tử hoặc các mảnh phân tử mang điện tích. Nó là một trong những phương pháp quan trọng trong phân tích cấu trúc của các polysacarit. Việc ứng dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại trong phân tích cấu trúc của hợp chất carbohydrate phức tạp đã dẫn đến những tiến bộ nhanh chóng trong lĩnh vực khoa học sự sống suốt hai thập kỷ qua của thế kỷ 21. Các kỹ thuật ion hóa truyền thống như: ion hóa bằng va chạm điện tử, ion hóa hóa học, là những kỹ thuật ion hóa chỉ sử dụng được cho các hợp chất dễ bay hơi. Các kỹ thuật ion hóa mới như: bắn phá nguyên tử nhanh (fast atom bombardment-FAB), ion hóa phun mù điện tử (electrospray ionization- ESI) và gần đây là kỹ thuật ion hóa phản hập thụ laser được hỗ trợ bởi chất nền (matrix-assisted laser desorption ionization-MALDI) đã được phát triển để ứng dụng phân tích cấu trúc của các hợp chất không bay hơi như các oligosacarit, các hợp chất polysacarit trọng lượng phân tử nhỏ, protein, glycoprotein và các glycolipid. Các kỹ thuật ion hóa mới có khả năng ứng dụng phân tích được nhiều hợp chất hơn với độ nhạy và độ chính xác khối cao hơn các kỹ thuật ion hóa truyền thống. Hiện nay, cấu trúc của nhiều hợp chất polymer sinh học phức tạp đã được phân tích thành công nhờ ứng dụng các kỹ thuật phân tích khối phổ hiện đại này [17-20,32,42,53,60,86,124,138,141]. a. Kỹ thuật ESI (ElectroSpray Ionization - ion hóa phun mù điện tử): trong kỹ thuật phun mù điện tử, dung dịch có chứa phân tử mẫu được phun ra khỏi đầu của mao quản mảnh vào buồng nhiệt ở áp suất giảm (gần bằng áp suất khí quyển). Mao quản mà dung dịch mẫu đi qua có điện thế cao dọc theo bề mặt của nó và những giọt nhỏ tích điện được tách ra, đi vào buồng ion hóa. Các giọt tích điện nhập
27 với dòng khí khô (thường là khí nitơ), làm bay hơi các phân tử dung môi ra khỏi giọt mẫu. Do vậy, mật độ điện tích của mỗi giọt tăng lên cho đến khi lực đẩy tĩnh điện trội hơn sức căng bề mặt (giới hạn Rayleigh), làm cho các giọt mẫu bị vỡ ra thành các giọt nhỏ hơn. Quá trình này tiếp tục cho đến khi các ion mẫu không còn dung môi ở lại trong pha khí. b. MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization): Kỹ thuật MALDI sử dụng các chất nền hỗ trợ để ion hóa mẫu dưới tác dụng của năng lượng laser lớn. Trong kỹ thuật này, mẫu cần phân tích được hòa tan hay phân tán trong một chất nền (mạng lưới) được đặt trên đường đi của chùm photon có cường độ cao. Hầu hết các máy MALDI đều sử dụng nguồn laser nitơ phát xạ ở 337 nm, có một số ứng dụng sử dụng nguồn laser hồng ngoại (laser IR) để phân tích trực tiếp các mẫu chứa trong gel hay trong bản sắc ký lớp mỏng. Sự va chạm của các photon với mẫu sẽ ion hóa một vài phân tử mẫu và tách chúng ra khỏi bề mặt với chất nền (mạng lưới- matrix). Các ion bị tách ra sau đó được tăng tốc về phía bộ phận phân tích khối lượng (hình 1.11). Các hợp chất nền được sử dụng trong MALDI được chọn để sao cho chúng có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại từ xung laser nitơ (337 nm). Các hợp chất của axít nicotinic, picolinic, 2,5-Dihydroxybenzoic, thường được sử dụng làm chất nền. Chất nền hấp thu phần lớn năng lượng từ xung laser, do vậy cho phép tạo ra các ion mẫu nguyên vẹn được tách ra khỏi mạng lưới chất nền. Phép đo phổ MALDI-MS dùng để phân tích một khoảng rộng trọng lượng phân tử, từ polymer với trọng lượng phân tử vài ngàn dalton (Da) cho tới các oligosacarit, oligonucleotit và polypeptit, kháng thể và các protein nhỏ với trọng lượng phân tử vào khoảng 300.000 Da. Hơn nữa, kỹ thuật MALDI đòi hỏi chỉ vài femtomol mẫu chất (1.10-15 mol). Hình 1.11. Nguyên lý hoạt động của phổ khối MALDI-MS
28 Cho đến nay một số cấu trúc của oligo-fucoidan đã được xác định bằng phương pháp khối phổ [5,17-20,141]. Với những đoạn mạch ngắn, có thành phần monosacarit và nhóm sulfate đã biết thì việc xác định trật tự liên kết giữa các gốc đường, số nhóm sulfate trên mỗi gốc đường hầu như có thể giải quyết được bằng phương pháp khối phổ. Trong phương pháp khối phổ người ta thường sử dụng hai chế độ đo khác nhau cho mục đích phân tích cấu trúc của polysacarit là chế độ ion dương (Positive mode) và chế độ ion âm (Negative mode). Với chế độ ion dương mức năng lượng chủ yếu đủ để cắt đứt các liên kết đường và hạn chế không phá vỡ nó thành các mảnh nhỏ hơn, chế độ đo này được sử dụng để xác định thành phần và trật tự các liên kết đường [61]. Trong khi đó chế độ ion âm với mức năng lượng lớn hơn để phá vỡ các vòng đường, được sử dụng để xác định vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường. Cơ chế phân mảnh carbohydrate và hệ thống danh pháp các ion mảnh được đề xuất bởi Domon và Costello (hình 1.12) [47]. Y Z 1.5X Y Z Y Z 2 2 1 1 1 0 0 CH2OH CH2OH CH2OH O O O HO O R O OH OH O OH Đầu khử Đầu không OH OH OH khử 0.2A B C 2.4A B C 2.5A B C 1 1 1 2 2 2 3 3 3 Hình 1.12. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate * Cơ chế phân mảnh trong khối phổ: Các ion mảnh có chứa đầu cuối không khử được miêu tả bởi các chữ cái viết hoa đầu tiên trong hệ thống bảng chữ cái alphabet (A, B, C, ). Các ion mảnh có chứa đầu cuối khử của oligosacarit hoặc aglycon được miêu tả bởi các chữ cái từ cuối bảng hệ thống chữ cái alphabet (X, Y, Z, ).
29 Các ion dạng A và X được sinh ra bởi sự phân mảnh cắt ngang vòng đường và ký hiệu phía trên bên trái của ion được quy định theo số mỗi liên kết vòng và được tính theo chiều kim đồng hồ như được miêu tả trên hình 1.12. Các ion được sinh ra từ sự phân cắt lần lượt các gốc đường được ký hiệu là Am, Bm, Cm với m = 1 tính từ phía đầu không khử và Xn, Yn, Zn với n = 1 được tính từ phía đầu khử. Y0 và Z0 được quy ước cho sự phân mảnh của liên kết được liên kết với aglycone. * Các đặc trưng phân mảnh: Theo hệ thống danh pháp, quy tắc sau đây được áp dụng chung cho sự phân mảnh của các oligosacarit: Ở sự phân cắt liên kết glycoside sinh ra các ion Bn, Cn, Yn, Zn dễ xảy ra ở mức năng lượng thấp và đây là sự phân mảnh phổ biến nhất, chúng biểu lộ chi tiết về trình tự và sự phân nhánh của các hợp phần monosacarit. Sự phân cắt ngang vòng đường thường xảy ra bởi sự va chạm ở mức năng lượng cao hơn. Sự phân mảnh này mang đến những thông tin về kiểu liên kết. Các dẫn xuất có mang nhóm methyl tạo ra phổ mang nhiều thông tin nhất, sự phân tách cũng đặc trưng hơn và các tín hiệu cũng phong phú hơn. Thêm nữa, mức độ bẻ gẫy liên kết phức tạp trong trường hợp này là thấp. Các oligosacarit có chứa nhóm methyl có thể tăng độ nhạy lên gấp 10 lần. Các ion thường được quan sát thấy ở dạng [M+Na]+ Việc phân tích các carbohydrate không được chuyển hóa cho ra kết quả phổ phức tạp hơn, trường hợp này được thực hiện khi khối lượng mẫu bị hạn chế. Các gốc đường chứa nhóm sulfate thường bị cắt đến monomer trước khi vòng đường bị phá vỡ. Theo Tissot và cộng sự, vị trí nhóm sulfate có ảnh hưởng đến sự phân mảnh cắt ngang vòng đường. Tùy theo vị trí các gốc sulfate trong vòng đường chiếm vị trí C-2, C-3 hoặc C-4 sẽ xuất hiện một số mảnh đặc trưng tương ứng. Cơ chế phân mảnh các gốc đường xảy ra như trình bày trên hình 1.13. Các mảnh đặc trưng được sinh ra do sự phân mảnh cắt vòng fucose sulfate được thể hiện trong bảng 1.4 [124].
30 H3C H3C H3C - O OH OH OSO 3 H HO HO HO O OSO3 H O HO OSO3 O O 0,2 m/z 139 X H O H3C H3C O O - HSO HO OH HO OH 4 m/z 97 O O O H O S - O H C 3 O H3C H3C O OH OH OH O3SO OH O3SO OH O3SO HO OH O O H O H O m/z 183 Hình 1.13. Sơ đồ phân mảnh của fucose sulfate Bảng 1.4. Các mảnh đặc trưng cho các sulfate fucose có nhóm sulfate ở các vị trí khác nhau trong phổ khối dạng ion âm Vị trí 0,2A 0,3A 0,4A 0,2X 0,3X 0,4X sulfate 2-O- 103 73 43 139 169 199 3-O- 183 73 43 59 169 199 4-O- 183 153 43 59 89 199 n,mA, n,mX: cắt theo liên kết n,m của vòng đường như hình 1.13 ● Trong trường hợp có mặt của ion kim loại, các oligosacarit sẽ phân mảnh theo các cơ chế sau (hình 1.14) [60].
31 MÊt ion kim lo¹i Ph©n c¾t liªn kÕt glycoside Ph©n c¾t vßng Hình 1.14. Cơ chế phân mảnh oligosacarit với sự có mặt của ion kim loại c. Các phương pháp phân tích khối Vai trò của bộ phận phân tích khối là phân tách hỗn hợp ion sinh ra bởi bộ phận ion hóa thành từng loại riêng biệt theo số khối m/z để đưa các ion này đến detector. Có 05 kỹ thuật phân tích khối chính là: Tứ cực (Quadrupol-Q), Bẫy ion (Ion Trap-IT), Thời gian bay (Time of Flight-TOF), Cung từ (Magnetic Sector), Cộng hưởng bằng gia tốc ion biến đổi Fourie (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-FT-ICR). Trong đó hai phương pháp phân tích khối chủ yếu được sử dụng trong phân tích cấu trúc của polymer và các hợp chất có khối lượng phân tử lớn là IT và TOF * Phương pháp bẫy ion (Ion trap): Hệ phân tích khối gồm 3 điện cực: điện cực xuyến và hai điện cực đáy có biên dạng hyperbol. Điện cực ở giữa là điện cực xuyến được đặt điện áp dao động chính là 730 Hz dùng để tạo hố thế 2 chiều để ion đi vào và chuyển động ở tâm của Trap. Hai điện cực đáy có tần số bổ sung có tác dụng cô lập ion, phân rã ion bằng va chạm (CID) và phóng ion theo cộng hưởng phi tuyến. Khí He được đưa vào bên trong Trap có tác dụng đệm cho chuyển động của ion trong quá trình bẫy ion, CID và phân giải khối. Ion Trap có khả năng tích lũy các ion, phân tích khối, phân lập ion và phân rã ion bằng va chạm do vậy đây là phương tiện rất thuận lợi cho việc nghiên cứu cơ chế phân mảnh.
32 * Phương pháp thời gian bay (Time of Flight-TOF): Bộ phân tích khối lượng theo thời gian bay (TOF) dựa trên ý tưởng đơn giản là tốc độ của hai ion được tạo ra trong cùng thời điểm với động năng như nhau sẽ thay đổi phụ thuộc vào khối lượng của các ion: Ion nhẹ hơn sẽ có tốc độ cao hơn và chuyển động về phía detector của phổ kế nhanh hơn, chạm tới detector sớm hơn. Sự phân tách ion trong bộ phân tích TOF dựa theo nguyên lí là các ion có năng lượng ban đầu như nhau sẽ có tốc độ tỉ lệ với giá trị m/z của chúng. Phổ kế TOF hiện nay được sử dụng rất phổ biến. Vì thời gian giữa các xung ion ở nguồn ion có thể điều chỉnh theo mong muốn, nên các thiết bị TOF có thể phân tích các ion có giá trị m/z hầu như bất kì. Khi ghép với nguồn ion hóa sung laser như MALDI, phổ kế TOF có các ứng dụng phổ biến trong phân tích cấu trúc của các oligosacarit, protein, các mảnh DNA, các phân tử sinh học và các polymer với khối lượng cỡ kDa. Tóm lại: Phân tích cấu trúc của oligosacarit bao gồm xác định thành phần monosacarit, kiểu liên kết, mô hình phân nhánh và trật tự liên kết giữa các gốc đường. Vì vậy, không có phương pháp khối phổ duy nhất nào có thể giúp xác định được tất cả các thông số trên. Tuy nhiên, phổ khối kết hợp với một số phương pháp khác có thể giúp phân tích thành công cấu trúc của các oligosacarit phức tạp. 1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA LUẬN ÁN. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới. Qua tham khảo các tài liệu đã công bố về nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan trên thế giới, chúng tôi nhận thấy fucoidan từ rong nâu là một polymer sinh học có cấu trúc rất phức tạp bởi tính đa dạng và sự không đồng nhất về thành phần đường cũng như vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường [2,4,5,23-27]. Vì vậy, dù đã có rất nhiều công trình công bố về cấu trúc của fucoidan, nhưng chỉ có một số công bố đưa ra được cấu trúc một cách rõ ràng mà phần lớn chỉ đưa ra cấu trúc của một phân đoạn có độ lặp lại cao của chúng. Cho đến nay những công bố về cấu trúc của fucoidan một cách rõ ràng nhất là fucoidan được phân lập từ các loài rong nâu sinh trưởng ở vùng ôn đới như Fucus evnescens C.Ag, Fucus vesiculosus, Fucus distichus, Ascophyllum nodosum, trong thành phần đường của
33 fucoidan từ những loài rong này hầu như chỉ có 01 gốc đường là fucose và một lượng rất nhỏ các gốc đường pyranose khác. Trong khi đó các công trình nghiên cứu về cấu trúc fucoidan từ các loài rong nâu sinh trưởng ở vùng nhiệt đới không nhiều và phần lớn chỉ dừng lại ở việc đưa ra thành phần hóa học và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường, thành phần hóa học của chúng tương đối phức tạp ngoài fucose và sulfate, còn có các gốc đường khác như galactose, xylose, mannose, rhamnose, glucose, và cả gốc acetyl Trong số các công bố về cấu trúc của fucoidan, đáng lưu ý nhất là nhóm nghiên cứu do Giáo sư Usov đứng đầu thuộc Viện Hóa Hữu cơ, Viện Hàn lâm Khoa học Nga đi tiên phong trong việc sử dụng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1-D) và hai chiều (2-D) để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan. Kết quả đã có 04 loại cấu trúc của fucoidan từ các loài rong nâu Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus, Fucus distichus L. của Nga được công bố [23- 26]. Gần đây, với việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để phân tích cấu trúc của các polysacarit nói chung và fucoidan nói riêng đã tạo ra một bước đột phá mới trong phân tích cấu trúc phức tạp của polysacarit rong biển. Một trong những điểm mạnh của phương pháp này là khả năng phân tích nhanh và chính xác vị trí của nhóm sulfate cũng như trật tự giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan. Việc áp dụng thành công phương pháp này nhóm nghiên cứu của Anastyuk ở Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, Chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga đã công bố lại cấu trúc fucoidan từ loài rong Fucus evanescens [18] và thêm 03 loại cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii đã được công bố [17, 19, 20]. Do sự đa dạng về cấu trúc và hoạt tính sinh học với khả năng ứng dụng rất lớn trong lĩnh vực công nghiệp dược liệu [69,81,88]. Nên mặc dù đã được bắt đầu nghiên cứu từ hơn 100 năm trước, hiện nay fucoidan vẫn luôn thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc mới. Cho đến nay, phần lớn các công bố về hoạt tính sinh học của fucoidan được thực hiện trên các sản phẩm fucoidan thương mại hoặc chiết thô nên mối quan hệ
34 giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan thực tế vẫn chưa được nghiên cứu một cách rõ ràng. Vì vậy, để có thể sử dụng fucoidan làm thuốc thì yếu tố tiên quyết và quan trọng nhất là phải xác định được cấu trúc chi tiết của chúng. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam. Ở trong nước, fucoidan mới chỉ được biết đến và nghiên cứu trong khoảng hơn 10 năm trở lại đây bởi các nhà khoa học thuộc Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Năm 2006, lần đầu tiên tại Việt Nam, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang (nay là Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang) đã đưa ra quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam. Đây là một quy trình công nghệ cao, sử dụng màng siêu lọc cho phép đồng thời cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan tại nhiệt độ phòng, nhờ vậy giữ nguyên được hoạt tính sinh học tự nhiên vốn có của chúng [2]. Nước ta với nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú, riêng chi Sargassum đã phát hiện được trên 60 loài với sản lượng ước tính tới 10.000 tấn khô/năm [58], hàm lượng fucoidan trong các loài rong chi Sargassum từ 1-2,5% trọng lượng rong khô, đây có thể được coi là nguồn dược liệu tiềm năng rất lớn của biển Việt Nam. Tuy nhiên, các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế. Các nghiên cứu công bố về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu đưa ra các đặc điểm về cấu trúc như thành phần đường, vị trí nhóm sulfat và phần lớn chúng thực hiện trên các mẫu fucoidan chiết thô [4,5]. Cho tới nay mới chỉ có 03 công bố về cấu trúc tương đối rõ ràng của fucoidan từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum polycystum và Turbinaria ornata ở Việt Nam cụ thể là: Năm 2008, tác giả Nguyễn Duy Nhứt và cộng sự, đã công bố thành phần và cấu trúc của phân đoạn fucoidan F20 được phân lập từ rong Sargassum swartzii với thành phần chủ yếu là fucose (> 45%), bên cạnh đó các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose cũng chiếm hàm lượng đáng kể (10,81-22,07%), tác giả chỉ đưa ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic axít và fucose, nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20 [4].
35 Năm 2013, Bilan và các cộng sự đã công bố cấu trúc của fucoidan từ rong Sargassum polycystum có thành phần chủ yếu L-fucose, D-galactose và sulfate. Cấu trúc phân tử của fucoidan F4- S.polycystum chứa bộ khung chủ yếu được tạo bởi các gốc 3-linked α-L-fucopyranose 4- sulfate, giữa các chuỗi tương đối ngắn của các gốc này được đặt nằm rải rác bởi các gốc 2-linked α-D-galactopyranose, cũng sulfate hóa ở vị trí số 4 [27]. Cũng trong năm 2013, Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã công bố cấu trúc của fucoidan từ rong Turbinaria ornata có hàm lượng sulfate cao và thành phần đường rất đơn giản chỉ gồm fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, đây là một dạng galactofucan sulfate hóa. Cấu trúc bộ khung của chúng là các gốc α-L-Fucp liên kết 3, sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4. Nhóm sulfate cũng được phát hiện thấy chiếm ưu thế ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 của gốc galactose trong mạch nhánh được tạo nên bởi các gốc galactose liên kết 4 [122]. Các công bố về hoạt tính sinh học cũng mới chỉ được thử nghiệm với hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các mẫu fucoidan chiết thô. Mặc dù hoạt tính sinh học của fucoidan dạng sulfated galactofucan được dự đoán là rất đa dạng như hoạt tính kháng vi rút, chống nghẽn mạch, bảo vệ dạ dày, kháng ung thư, nên việc nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc và hoạt tính của fucoidan theo định hướng làm thuốc là hết sức cần thiết. Kết luận: Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú [1]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần, cấu trúc và hoạt tính của fucoidan phân lập từ các loài rong nâu Việt Nam vẫn còn rất hạn chế [2,5,27,122]. Do vậy, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở vịnh Nha Trang” nhằm hoàn chỉnh thêm những nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan từ rong biển Việt Nam để định hướng sử dụng chúng làm dược liệu hoặc thực phẩm chức năng.
36 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Dựa vào danh mục thành phần loài và trữ lượng các loài rong nâu phân bố ở Việt Nam đã công bố [1, 3, 8], chúng tôi đã chọn 08 loài rong thuộc 3 chi rong khác nhau trong ngành rong nâu để nghiên cứu (bảng 2.1). Đây là những loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn, có giá trị kinh tế cao và có thể khai thác ở quy mô công nghiệp ở vùng biển vịnh Nha Trang tỉnh Khánh Hòa. Việc nghiên cứu thành phần và cấu trúc của fucoidan có hoạt tính sinh học từ các loài rong này có ý nghĩa quan trọng trong việc tìm kiếm nguồn dược liệu mới từ tài nguyên rong biển, từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng một cách hợp lý nguồn tài nguyên rong biển ở Nha Trang nói riêng và ở khu vực Nam Trung Bộ của Việt Nam nói chung. Các mẫu rong biển được thu ngay sau thời kỳ sinh sản. Thời gian thu hoạch tùy thuộc vào từng loài rong nhưng thông thường vào khoảng thời gian từ tháng 3 đến tháng 6 hàng năm. Các mẫu rong được thu thập và phân loại bởi TS. Lê Như Hậu, chuyên gia phân loài rong biển thuộc Phòng Vật liệu hữu cơ từ tài nguyên biển của Viện Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ Nha Trang. Khi thu, dùng liềm cắt sát gốc cây rong, rửa sạch khỏi tạp chất bằng nước biển và phơi khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng. Khối lượng mỗi mẫu thu tối thiểu là 10kg rong tươi. Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang. Bảng 2.1. Các loài rong nâu được thu nghiên cứu Stt Tên loài rong Địa điểm thu mẫu 01 Sargassum mcclurei Sông Lô-Nha Trang 02 Sargassum polycystum Bãi Nam-Nha Trang 03 Sargassum oligocystum Sông Lô-Nha Trang 04 Sargassum denticapum Sông Lô-Nha Trang 05 Sargassum swartzii Bãi Tiên-Nha Trang 06 Sargassum binderi Hòn Tre-Nha Trang 07 Turbinaria ornata Hòn Rùa-Nha Trang 08 Padina australis Hòn Chồng-Nha Trang
37 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Phương pháp chiết tách và phân đoạn fucoidan * Phương pháp chiết tách [143]: Dựa trên cơ sở tham khảo tài liệu đã công bố về các phương pháp chiết tách fucoidan cho mục đích nghiên cứu cấu trúc [98,103,104,143]. Chúng tôi tiến hành chiết theo phương pháp sử dụng dung dịch axít loãng (sơ đồ hình 2.1) vì phương pháp này ít ảnh hưởng đến cấu trúc phân tử tự nhiên của fucoidan, đơn giản và dễ thực hiện. Phương pháp này cũng đã được chọn làm phương pháp chính để chiết fucoidan có hoạt tính theo Patent của Nga (Patent WO 2005/014657) [98]. Rong tươi Polyphenol, chất màu, các hợp chấ t trọng lượng phân tử thấp Chiết với (Cồn; Aceton, Chloroform) Rong đã loại chất béo Chiết với HCl 0,1N, Bã rong 60oC, t = 2 giờ (3lần) Dịch chiết rong Trung hòa với NaHCO3 8% Cô đặc, thẩm tách bằng màng 10kDa Tủa với 4 lần thể tích cồn 98 hoặc đông khô Polysacarit (thô) Hòa tan trong HCl 0,04N, ly tâm Polyuronic axit (PA) Sắc ký trao đổi anion (DEAE-Cellulose) Rửa giải với HCl 0,04N và gradient nồng độ của NaCl (0 - 2 N) 0,04N HCl a N NaCl b N NaCl c N NaCl d N NaCl L F1 F2 F3 F4 Hình 2.1. Sơ đồ chiết tách và phân đoạn fucoidan từ rong nâu.
38 * Tách phân đoạn fucoidan [143] Fucoidan được tiến hành phân đoạn tinh chế bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (hình 2.1). Mẫu bột fucoidan thô (gồm fucoidan, laminaran và polyuronan) được hòa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần không tan (polyuronan), phần dịch trong được cho chạy qua cột sắc ký DEAE-cellulose. Hợp chất laminaran (hợp chất không có nhóm mang điện tích) không bị hấp thụ trên cột sẽ được rửa giải đầu tiên bằng dung dịch HCl loãng (0,04N) hoặc nước cất. Tiếp theo các phân đoạn fucoidan sẽ được rửa giải bằng dung dịch muối NaCl ở các nồng độ khác nhau. 2.2.2 Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường * Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [49]. * Phân tích thành phần đường đơn của fucoidan: Thành phần đường đơn được xác định bằng phương pháp HPLC, sau khi fucoidan được thủy phân axít về các monomer [98]. 2.2.3 Phương pháp phân tích hàm lượng sulfate Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine (Dodgson., 1962), sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [45]. 2.2.4 Phương pháp khử sulfate Khử sulfate (desulfation) được thực hiện theo phương pháp solvolistic trong hỗn hợp (dimethyl sulfoxide và methanol) sử dụng pyridin làm xúc tác [23]. 2.2.5 Phương pháp phân tích hàm lượng uronic axít Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole, sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [28]. 2.2.6 Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa Methyl hóa (methylation) thực hiện theo phương pháp được mô tả bởi Chizhov và cộng sự (1999) [36], nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào việc xác định dạng và số lượng của các loại đường sau khi methyl hóa các nhóm (-OH) tự do của chúng.
39 2.2.7 Phương pháp thủy phân tạo oligosacarit Thủy phân fucoidan để tạo oligosacarit được thực hiện theo phương pháp tự thủy phân “autohydrolysis”, bằng phương pháp này nhóm (SO3Na) của fucoidan được chuyển về dạng axít (SO3H) và quá trình thủy phân axít polysacarit dưới điều kiện rất nhẹ nhàng do các nhóm SO3H của hợp chất fucoidan đóng vai trò như là nguồn axít [18]. 2.2.8 Phương pháp phổ hồng ngoại IR Mẫu fucoidan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga), trong vùng số sóng 4000-400 cm-1 [98]. Dựa vào phổ IR trong vùng từ 800 đến 1732 cm-1 ta có thể xác định được các nhóm sulfate trong các phân tử đường nằm ở vị trí axial hay equatorial [23,36,98]. 2.2.9 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đông, L.B.Nga và Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Mẫu fucoidan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/ml, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt o độ 35 C. 2.2.10 Phương pháp phổ khối lượng MS Phổ MALDI-TOF/MS/MS được ghi trên thiết bị khối phổ Ultra Flex III MALDI-TOF/TOF (Bruker, Đức) với nguồn laser nitrogen (337 nm). Phổ ESI-MS/MS được ghi trên máy quang phổ ESI Q-TOF (Agilent 6510 LC Q-TOF, Mỹ) với nguồn ion hóa phun mù điện tử. 2.2.11 Phương pháp thử hoạt tính sinh học và xử lý số liệu * Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào Hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan trên các dòng tế bào ưng thư người được thực hiện theo phương pháp của Likhitwitaywid [78] và Svetlana [121].
40 * Phân tích số liệu Tất cả các con số chỉ ra trong nghiên cứu này là đại diện của ít nhất 3 thí nghiệm độc lập với kết quả tương tự. Sự khác nhau thống kê được đánh giá sử dụng Student’s t-test, và sự khác nhau được coi là có ý nghĩa ở p ≤ 0.05. 2.3 THỰC NGHIỆM 2.3.1 Chiết tách và phân đoạn tinh chế fucoidan từ rong nâu * Chiết tách fucoidan từ rong nâu Các mẫu rong được cắt nhỏ (2-3 cm), xử lý loại màu và các phân đoạn trọng lượng phân tử thấp với hỗn hợp (96% EtOH : Cloroform : H2O = 89 : 1 : 10) theo tỉ lệ w/v= 1/10 trong thời gian 10-15 ngày, hỗn hợp được lọc tách, rong được phơi khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. Mẫu rong sau khi đã loại chất béo và các hợp chất màu (500 g) được tiến hành chiết 3 lần với 20 lít dung dịch 0,1N HCl (pH 2-3) ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 2h với mỗi lần chiết. Dịch chiết được lọc tách thô qua vải lọc, dịch chiết chứa các polysacarit tan trong nước của 3 lần chiết được gộp lại và trung hòa bằng dung dịch NaHCO3 8% đến pH = 6-7. Dịch chiết sau trung hòa thay vì được cô đặc bằng cô quay chân không ở nhiệt độ 50-60 oC sau đó thẩm tách loại muối và các tạp chất trọng lượng phân tử thấp bằng màng thẩm tách trong thời gian kéo dài (48 giờ) theo phương pháp [98], chúng tôi tiến hành cô đặc và làm sạch dịch chiết bằng màng siêu lọc kích thước 10kDa. Với màng siêu lọc cho phép loại nước, loại muối, các hợp chất màu, các hợp chất trọng lượng phân tử thấp ở nhiệt độ phòng trong thời gian chỉ từ 8-10 giờ, điều đó sẽ giúp bảo toàn được cấu trúc tự nhiên của fucoidan không bị ảnh hưởng bởi yếu tố nhiệt độ và thời gian. Dịch chiết sau khi được làm sạch và cô đặc tới 1/10 thể tích ban đầu được kết tủa bằng EtOH 98% theo tỉ lệ thể tích Vdịch chiết : Vethanol = 1:4 hoặc đông khô sử dụng máy đông khô chân không thu được bột polysacarit dạng thô chứa fucoidan. * Phân đoạn tinh chế fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion [98] Bột polysacarit thô gồm (fucoidan, laminaran và polyuronan) (0,5g) được hòa tan trong dung dịch 0,04N HCl, ly tâm tách phần tủa không tan ta loại được polyuronan (PA) dưới dạng kết tủa axít polyuronic, phần dịch trong đưa lên cột
41 DEAE-Cellulose (dạng Cl-, 3,0 x 32 cm). Đầu tiên rửa cột với dung dịch 0,04N HCl đến khi thử âm tính với hydrat cacbon bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [49] ta thu được phân đoạn laminaran, tiếp theo rửa giải cột bằng muối NaCl theo gradient tuyến tính liên tục nồng độ tăng dần từ 0-2N, các phân đoạn fucoidan (F1, F2, F3, ) được tách ra theo các nồng độ rửa giải khác nhau của dung dịch muối NaCl, mỗi phân đoạn thu được cho thẩm tách loại muối bằng màng thẩm tách kích thước 10kDa trong nước cất sau thời gian 24h, sau đó đem đông khô để thu các phân đoạn fucoidan dạng bột 2.3.2. Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate và thành phần đường * Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate [49] Lấy 200 µl dung dịch cần xác định có hàm lượng carbohydrate trong khoảng 20-100 µg/ml, thêm vào 200µl thuốc thử phenol 5% lắc đều đến khi dung dịch trở nên trong suốt thêm tiếp 1ml axít sulfuric đậm đặc lắc đều rồi đem đun cách thủy trong thời gian 5 phút, lấy ra để nguội, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ = 490 nm. Sử dụng glucose làm chất chuẩn. * Phân tích thành phần đường [98] Mẫu fucoidan (5 mg) cho vào ống nghiệm có nút vặn dung tích 5ml, thêm 1ml TFA (Triflorua acetic axít ) 2M lắc đều cho tan, đem thủy phân ở 100oC trong 6 giờ sau đó cho bay hơi đến gần khô bằng máy cô quay chân không, rửa lặp lại 3 lần với MeOH để đuổi hết TFA dư. Phần cặn còn lại hòa tan với 1 ml nước đề ion, dung dịch này được dùng để phân tích thành phần đường trên thiết bị phân tích carbohydrate IC-500 Biotronik (Germany), sử dụng cột Shim-pack ISA- 07/S2504 (0.4 x 25 cm), pha động là đệm borat kali, tốc độ rửa giải 0,6 ml/phút. Đường đơn được phát hiện bằng phương pháp bicinchorinate trên hệ phân tích Shimadzu C-R2 AX. Các đường đơn fucose, glucose, galactose, mannose, xylose, rhamnose được sử dụng làm chất chuẩn. Hàm lượng các đường đơn được tính theo % mol dựa vào các chất chuẩn. 2.3.3. Phân tích hàm lượng sulfate [45] Cân khoảng 5 (mg) mẫu trong một lọ thủy tinh có nút vặn dung tích 5ml, thêm vào 2 ml HCl 1N, đem thủy phân ở nhiệt độ 100oC, trong thời gian 6 giờ. Lấy
42 10 μl dung dịch mẫu sau thủy phân, thêm vào 100 μl TCA (trichlorua acetic axít ) và 100 μl hỗn hợp (0,5% gelatin + 0,5% BaCl2) lắc đều rồi đo độ hấp thụ quang ở bước sóng λ= 360 nm. Hàm lượng sulfate được tính dựa vào đường chuẩn dựng từ dung dịch K2SO4 với khoảng nồng độ từ 0,25-1 μg/ml. 2.3.4. Phân tích hàm lượng uronic axít [28] Lấy 250 μl dung dịch mẫu (mẫu fucoidan và mẫu so sánh (mẫu carbohydrate không chứa uronic axít )) cho vào ống nghiệm, thêm vào 1,5 ml dung dịch A (0,9 g NaBH4 hòa tan trong 10 ml nước cất, thêm vào từ từ 90 ml dung dịch axít sulfuric 98% đã được làm lạnh), phản ứng được tiến hành ở 100 oC trong thời gian 10 phút. Làm lạnh nhanh phản ứng trong cốc nước đá, thêm tiếp 50 μl dung dịch B (100 mg Carbazole được hòa tan trong 100 ml cồn tuyệt đối) lắc đều và cho phản ứng lại ở 100oC trong 15 phút, làm lạnh nhanh phản ứng đến nhiệt độ phòng và tiến hành đo quang ở bước sóng λ = 525 nm. Sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn. 2.3.5. Khử sulfate [23] 100 ml dung dịch fucoidan (1 mg/ml) được cho qua cột trao đổi ion (dạng H+; CG-120, 200–400 mesh, Serva, Germany). Rửa giải cột với 200 ml nước cất. Dung dịch sau rửa giải được cô tới gần khô bằng máy cô quay chân không, mẫu sau đó được hòa tan lại trong 20ml dung dịch hỗn hợp dimethylsulfoxide (DMSO) và methanol (MeOH) có tỉ lệ [DMSO (19ml) : MeOH (1ml)] thêm vào 0,5ml Pyridin, toàn bộ dung dịch được chuyển sang một ống thủy tinh có nút vặn kín và cho phản ứng ở 100 oC trong thời gian 6h. Hỗn hợp sau phản ứng được thẩm tách trong nước cất bằng màng thẩm tách 10 kDa trong thời gian 48h, hỗn hợp sau thẩm tách được đông khô ta thu được mẫu fucoidan khử sulfate ở dạng bột. 2.3.6. Phương pháp phân tích liên kết bằng methyl hóa [36] 1mg mẫu fucoidan đã khử sulfate (dSF) được hòa tan trong 1ml Me2SO (Dimethyl sulfoxide-DMSO) trong một lọ vial có nút vặn ở nhiệt độ 40oC trong thời gian 10 phút, thêm tiếp vào 100 mg bột NaOH và 0,2ml methyl iodua (MeI). Hỗn hợp phản ứng được lắc liên tục trong thời gian 20 phút ở 40 oC. Sau đó một lượng tương tự NaOH và MeI được thêm vào. Hỗn hợp tiếp tục được lắc trong thời gian 1h, sau đó làm lạnh và thêm vào 1ml nước. Lượng methyl iodua dư được loại bỏ
43 bằng cô quay chân không, phần dung dịch còn lại được đưa qua cột C18, đầu tiên rửa giải bằng nước cất, tiếp theo được rửa giải với 50% methanol (MeOH). Phần dung dịch được rửa giải với MeOH được cho bay hơi trên máy cô quay chân không tới gần khô. Mẫu sau khi cho bay hơi được hòa tan lại trong 1ml TFA 4N và cho thủy phân ở nhiệt độ 100 oC trong thời gian 6h, mẫu sau thủy phân được khử với NaBH4 và Methyl hóa với Ac2O/pyridin. Các methylate alditol acetate riêng phần được phân tích bằng GLC-MS. 2.3.7. Thủy phân tạo fucoidan oligosacarit [18] 20 ml dung dịch fucoidan (5 mg/ml pha trong nước cất) được chuyển về dạng H+ sử dụng cột trao đổi ion minicolumn Timberlite CG-120 (200-400 mesh, Serva, Germany) và để yên 48h ở 37oC. Hỗn hợp sau đó được trung hòa với dung dịch amoniac 5% và đông khô lạnh. Phân đoạn khối lượng phân tử thấp của fucoidan (LWF-AH) được thu nhận bằng tách phân đoạn trong hỗn hợp H2O/Ethanol 98% (1:5 v/v). Lớp bên trên chứa fucoidan oligosacarit được thu lại và đông khô lạnh. Sản phẩm fucoidan trọng lượng phân tử thấp này sẽ được sử dụng cho phân tích khối phổ (MS). 2.3.8. Phổ khối MALDI-TOF/MS và ESI-MS của fucoidan oligosacarit Phổ MALDI-TOF/MS và ESI-MS được đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga. Phổ MALDI-TOF/MS được đo theo chế độ ion âm sử dụng chất nền là arabioosazone. Dung dịch nền được điều chế theo phương pháp của Chen và cộng sự [32] bằng cách trộn dung dịch arabioosazone 10 mg/ml trong ethanol và 10mg/ml L-fucose trong nước để làm giảm sự phân mảnh trong nguồn ion hóa [18]. Dung dịch mẫu (0,01 mg/ml trong nước cất) được chuẩn bị từ mẫu đã đông khô. Kỹ thuật “lớp mỏng” được sử dụng để điều chế mẫu đo. Cụ thể như sau: 1μl dung dịch nền được phủ lên một mặt thép không rỉ và để cho khô. Sau đó, 11μl dung dịch mẫu được phủ lên lớp thứ 2 và làm khô trong không khí. Thiết bị được hiệu chỉnh trước sử dụng nền và các tín hiệu angiotensin-II (Sigma, Mỹ). Phổ ESI-MS được đo theo cả hai chế độ ion âm và ion dương và việc hiệu chỉnh trước được tiến hành sử dụng chuẩn “HP-mix”. Thế mao dẫn được đặt tới
44 4000 v, và nhiệt độ khi sấy khô là 325 oC. Thế buồng phân đoạn được đặt ở 160V. Cửa sổ phân lập cho các thí nghiệm MS/MS được đặt đến 1,3 đơn vị khối lượng cho các ion điện tích đơn và 4 đơn vị khối lượng cho các ion nhiều điện tích. Năng lượng va chạm được tối ưu hóa giữa 10 và 45V để đạt tới cường độ nhiều nhất của các ion mảnh. Các mẫu sấy khô được hòa tan trong 1:1 acetonitrile-nước (nồng độ mẫu là gần bằng 0.01 mg/ml) và nó được đưa vào phổ khối ở tốc độ dòng 5 μl/phút sử dụng bơm syringe (KD Scientific, USA). 2.3.9. Khảo sát hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan 1)- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào theo phương pháp của Likhitwitaywid và cộng sự, phương pháp này hiện đang được sử dụng tại Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ [78] (thí nghiệm được thực hiện tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam). Fucoidan được thử nghiệm gây độc trên các dòng tế bào ung thư của người như LU (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan), RD (ung thư màng tim) và MDA-MB-231 (ung thư vú). Các dòng tế bào ung thư người được lấy từ Viện Nghiên cứu Ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) và hiện đang được lưu giữ tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tế bào ung thư được giữ trong nitơ lỏng, khi sử dụng chúng được đánh thức và duy trì trong các môi trường dinh dưỡng MEME hoặc DMME có bổ sung thêm huyết thanh bê tươi 7-10%. Tế bào nuôi cấy cho phát triển tới mức 60-70%, thay môi trường sạch để hoạt hóa tế bào từ 18 đến 24 giờ, lúc đó tế bào đã sẵn sàng để sử dụng cho thí nghiệm. Chuẩn bị mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% (4 mg/ml) cho bước sàng lọc sơ bộ. Pha 10 thang nồng độ cho bước 2 để tính giá trị IC50. Chuẩn bị mẫu đối chứng: Pha chất chuẩn có khả năng diệt tế bào (Elipitine hoặc Colchicine) trong DMSO với nồng độ 0,01 mM. Nhỏ vào mỗi giếng 10 μl mẫu. Các bước tiến hành: Tế bào sau khi xử lý với Tripsin 0,1% được tách khỏi đáy bình. Pha loãng dung dịch huyền phù tế bào bằng môi trường sạch, rửa và đếm số lượng, pha dung dịch huyền phù tế bào nồng độ cỡ (4x104 tế bào/ml). Thêm vào
45 các giếng đã có chất chuẩn bị sẵn ở trên 190 μl dung dịch huyền phù tế bào. Phiến được ủ trong tủ CO2 thêm 3 ngày. Đọc kết quả: Tế bào sau khi ủ 3 ngày, được cố định bằng dung dịch TCA (trichlorua acetic axít ) lạnh (30-50%). Rửa, để khô, nhuộm SRB 0,4% trong axít acetic 1% và rửa lại bằng axít acetic 1% để loại bỏ mẫu thừa, để khô, hòa lại bằng dung dịch đệm Tris base 10 mM. Đọc trên máy ELISA ở bước sóng 495 - 515 nm. a. Sàng lọc sơ cấp tìm giá trị CS: Giá trị CS (% Cell Survival) là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ nào đó mà chất thử tính theo % so với mẫu đối chứng. Mẫu nào cho giá trị CS ≤ 50% ở nồng độ mẫu 20 μg/ml đối với mẫu thô và 4 μg/ml đối với mẫu tinh chế được đánh giá có hoạt tính. Dựa trên các kết quả đo độ hấp thụ quang của chúng là OD (ngày 0), OD (DMSO 10 %) và so sánh với giá trị OD khi trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) Các mẫu có biểu hiện hoạt tính (CS ≤ 50%) sẽ được chọn và tiếp tục tiến hành tìm giá trị IC50. b. Tìm giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang giá trị logarit của đường cong phát triển tế bào và nồng độ chất thử để tính giá trị IC50. Chất có hoạt tính thì giá trị IC50 ≤ 20 μg/ml đối với chất thô và ≤ 4 μg/ml đối với chất sạch. 2)- Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư theo phương pháp [121] (thực hiện tại Phòng Hóa Enzyme, Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương, Viện Hàn lâm Khoa học Nga, chi nhánh Viễn Đông, Liên Bang Nga). a. Nuối cấy tế bào Dòng tế bào ung thư kết tràng người DLD-1 (ATCC # CCL-221TM) được phát triển như một lớp đơn trong môi trường RPMi-1640 được bổ sung thêm 10% (v/v) FBS đã bất hoạt bằng nhiệt, 2 mM L-glutamine và 1% penicilin-streptomycin trong không khí được làm cho ẩm ướt chứa 5% CO2 b. Thử nghiệm gây độc tế bào Để đánh giá độc tố tế bào, tế bào được nuôi cấy ở nồng độ (3x104 tế bào/ml) trong các đĩa 96 giếng trong 200 μl dung dịch 10% FBS RPMI-1640 ở 37oC trong
46 tủ ấm chứa 5% CO2. Sau 24h, môi trường được chuyển và thay thế với môi trường mới có chứa fucoidan với các nồng độ khác nhau (50, 100, 200 μg/ml) và tế bào o được ủ thêm 24h và 48h ở 37 C trong tủ ấm chứa 5% CO2. Sau khi ủ, 10 μl muối nội (thuốc thử MTS)3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxylphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium được đưa vào từng giếng và tế bào được ủ thêm 4h o ở 37 C và 5% CO2. Sau đó đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 490/630 nm. c. Thử nghiệm gen dòng đơn tính (clonogenic) trên agar mềm Phương pháp thử nghiệm trên môi trường agar mềm được thực hiện sử dụng dòng tế bào ung thư ruột kết người (DLD-1). Cụ thể là, các tế bào (2,4 x 104 tế bào/ml) được xử lý với fucoidan (100 μg/ml) hoặc được kích hoạt và phát triển trong 1ml môi trường agar có chứa 0,3% BME (Basal Medium Eagle) và 10% FBS, như được mô tả bởi Colburn và cộng sự [121]. Môi trường nuôi cấy được giữ ở o 37 C trong tủ ấm chứa 5% CO2 khoảng 3 tuần, các khuẩn lạc thu được, được đếm trên kính hiển vi sử dụng phần mềm máy tính ImageJ.
47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP FUCOIDAN TỪ RONG NÂU Với mục đích chiết tách fucoidan cho nghiên cứu hoạt tính sinh học và cấu trúc, fucoidan được chúng tôi chiết trong môi trường axít loãng, ở nhiệt độ 60oC, chiết lặp lại 3 lần để đảm bảo hiệu quả chiết fucoidan cao nhất [143]. Kết quả thu được hàm lượng fucoidan trong 08 loài rong nâu thuộc 3 chi rong Sargassum, Padina và Turbinaria được trình bày trong bảng 3.1. Kết quả cho thấy hàm lượng fucoidan dao động từ 0,82 % (Sargassum swartzii) đến 2,57 % (Sargassum polycystum), hàm lượng fucoidan trong hai loài rong Padina australis và Turbinaria ornata tương ứng là 1,93 % và 1,23 %. Như vậy, ta thấy hàm lượng fucoidan trong các loài rong thuộc các chi khác nhau là khác nhau và trong cùng một chi (Sargassum) cũng không giống nhau. So với các kết quả về hàm lượng fucoidan đã được công bố trước đó của các loài rong S.swartzii, S.oligocystum, S.denticapum, S.mcclurei, S.polycystum, Turbinaria ornata [5] lần lượt là 2,88 %, 3,92 %, 3,74 %, 3,56 %, 2,94 %, 4,22 % có thể thấy hàm lượng fucoidan trong cùng một loài rong cũng khác nhau, theo các tác giả [84,100,126] sự khác nhau về hàm lượng fucoidan trong các loài rong này có thể được giải thích là do sự khác nhau về thời gian thu rong, vị trí địa lý và phương pháp chiết. So với các loài rong nâu thuộc họ Sargassum của các nước khác trên thế giới như Mexico, Brazil, Nhật Bản, Ấn Độ, Trung Quốc, hàm lượng fucoidan của rong nâu Việt Nam cao hơn so với loài rong Sargassum stenophyllum (Brazil) 0,4 % [48] và các loài rong Sargassum ringgoldianum 0,13 % [56], Sargassum thunbergii 0,88 % [39], Sargassum fusiformis còn được gọi là Hizikia fusiformis 1,30 % [109]của Nhật Bản và thấp hơn các loài rong, Sargassum myriocystum 5,34 %, Sargassum wightii 6,72 % (Ấn Độ) [50], Sargassum horneri 4,3 % (Mexico) [128]. Tóm lại, sự khác biệt về hàm lượng fucoidan trong các loài rong rất khó để đưa ra so sánh, bởi hàm lượng fucoidan thu được nhìn chung thay đổi rất nhiều (0,1-20%) phụ thuộc vào điều kiện địa lý, quá trình sinh trưởng và phát triển, cũng như phương pháp chiết tách để thu nhận fucoidan.
48 Bảng 3.1. Hàm lượng và thành phần monosacarit của fucoidan từ 08 loài rong nâu Việt Nam 2- Stt Loài rong Ký hiệu Hàm Thành phần đường đơn của SO4 Axít mẫu lượng fucoidan (mol %) uronic % w/w fucoidan fucoidan % w/w Fuc Man Gal Xyl Glc %* 1 S.swartzii SwF 0,82 35,8 19,2 32,3 9,9 2,8 20,40 14,28 2 S.oligocystum SoF 1,78 42,3 8,9 38,3 7,1 3,4 22,46 21,54 3 S.denticapum SdF 2,00 40,1 15,9 38,7 5,3 nd 25,69 21,20 4 S.mcclurei SmF 2,37 38,5 4,2 33,1 3,6 20,6 33,15 17,87 5 S.polycystum SpF 2,57 42,4 12,6 23,5 1,3 10,2 25,60 23,74 6 S.binderi SbF 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 nd 21,47 5,35 7 T.ornata ToF 1,23 55,8 9,2 24,8 9,0 1,2 25,30 7,50 8 Padina australis PaF 1,93 47,1 2,5 22,3 11,5 16,6 21,90 21,02 * Hàm lượng tính theo khối lượng rong khô đã loại chất béo Hàm lượng tính theo khối lượng của fucoidan; nd: không phát hiện thấy Gần đây có rất nhiều công trình công bố về hoạt tính sinh học hết sức có giá trị của fucoidan [48,70,69,93,98,123]. Vì vậy, để tìm hiểu các đặc trưng cấu trúc và hoạt tính của fucoidan trong các loài rong nâu của Việt Nam nhằm mục đích tìm kiếm những hoạt chất mới có khả năng ứng dụng làm thực phẩm chức năng và dược liệu chúng tôi tiến hành phân tích thành phần hóa học, đặc trưng cấu trúc và khảo sát một số hoạt tính sinh học của chúng. 3.2. PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA FUCOIDAN Phân tích xác định thành phần của các monosacarit là việc quan trọng đầu tiên trong nghiên cứu cấu trúc của các polysacarit nói chung và của fucoidan nói riêng.
49 Fucoidan là một polymer dị thể có thành phần hóa học phức tạp, ngoài hai thành phần chính là fucose và sulfate, chúng còn chứa các đường đơn khác như galactose, mannose, xylose, glucose, và uronic axít [69]. Vì vậy, để xác định thành phần hóa học của fucoidan chúng tôi tiến hành thủy phân fucoidan thành các monomer trong môi trường axít. Việc thủy phân hoàn toàn để xác định thành phần các đường đơn của fucoidan trên thực tế rất khó xảy ra, do đó chúng tôi tiến hành xác định tỉ lệ mol giữa các gốc đường đã được thủy phân và dựa vào tổng carbohydrate để tính thành phần của mỗi đường đơn trong mẫu fucoidan. Sắc ký đồ của các mẫu đường chuẩn được trình bày trên hình 3.1. Kết quả phân tích thành phần monosacarit, hàm lượng sulfate và uronic axít của các mẫu fucoidan được trình bày trên bảng 3.1 Kết quả bảng 3.1 cho thấy fucose chiếm hàm lượng đáng kể từ 35,8-55,8 % trong tất cả các mẫu fucoidan, trong đó hàm lượng fucose cao nhất là fucoidan chiết từ rong Turbinaria ornata (55,8%) và thấp nhất là fucoidan chiết từ rong S.swartzii (35,8%). Hàm lượng galactose của fucoidan chiết từ các loài rong thuộc chi Sargassum chiếm tỉ lệ gần bằng hàm lượng fucose, ngoại trừ fucoidan chiết từ rong S.polycystum có tỉ lệ fucose : galactose = 2 : 1. Trong khi đó, các mẫu fucoidan chiết từ hai chi rong khác là Turbinaria ornata và Padina australis cũng giống như fucoidan của loài rong S.polycystum có hàm lượng galactose gần bằng một nửa so với fucose. Ngoài hai thành phần chính là fucose và galactose, tất cả các mẫu fucoidan của 08 loài rong nghiên cứu đều có thêm các đường đơn khác với hàm lượng nhỏ hơn là mannose (2,5-19,2%), xylose (1,3-11,5%) và glucose (0-20,6%). Hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng chi rong và từng loài rong khác nhau, tuy nhiên trong cùng chi rong chúng biến đổi không nhiều. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của fucoidan [5, 69]. Bên cạnh thành phần là các gốc đường, trong phân tử của fucoidan còn chứa các gốc sulfate và axít uronic. Hàm lượng sulfate của các mẫu fucoidan khác nhau không nhiều (bảng 3.1), dao động trong khoảng 20,40-33,15% so với lượng mẫu phân tích, trong đó lớn nhất là fucoidan của rong S.mcclurei (33,15%) và nhỏ nhất là fucoidan chiết từ rong S.swartzii (20,40%), theo các tài liệu
50 đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường, trong đó hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của fucoidan [34,38,69]. So với fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc, [23,24,48,92,129,142] thì fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn và hàm lượng uronic axít cao hơn. Fucoidan phân lập từ rong Turbinaria ornata có hàm lượng fucose cao nhất là 55,8%, trong khi đó fucoidan phân lập từ một số loài rong nâu của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica và Laminaria cichorioides có hàm lượng fucose lần lượt là 88%, 86% và 100% [142], hay fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis (Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80% [109], fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brasil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại fucoidan duy nhất được bán thương mại bởi hãng hóa chất Sigma (Mỹ) được chiết từ rong Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100% [69]. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của fucoidan trong các loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brasil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác [23-25,42,142]. Trong khi đó fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose, [27,48,55,56,72,96,110,122]. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysacarit của rong nâu.
51 Hình 3.1. Sắc ký đồ HPLC của các mẫu đường đơn chuẩn Fucoidan chiết từ hai loài rong S.denticapum và S.binderi có tỉ lệ các gốc đường fucose/galactose/mannose/xylose gần giống nhau và không có gốc đường glucose trong phân tử điều này có thể dự đoán về khung monosacarit trong hai loại fucoidan này là giống nhau, các mẫu fucoidan đều có chứa đồng thời cả 5 gốc đường với các tỉ lệ khác nhau chứng tỏ các fucoidan này có cấu trúc rất phức tạp và độ lặp lại không cao. Theo cách phân loại mới nhất về fucoidan thì các mẫu fucoidan này được gọi là fucogalactose sulfate [69,98,109]. Do sự phức tạp trong thành phần cũng như cấu trúc, nên việc xác định các đặc trưng cấu trúc của fucoidan là hết sức khó khăn. Phân đoạn tinh chế fucoidan là một bước quan trọng làm đơn giản hóa việc phân tích các đặc trưng cấu của chúng. 3.3. TÁCH PHÂN ĐOẠN VÀ PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN CỦA CÁC PHÂN ĐOẠN FUCOIDAN 05 loại fucoidan được phân lập từ các loài rong Sargassum swartzii, Sargassum mcclurei, Sargassum polycystum, Sargassum denticapum và Turbinaria ornata được chúng tôi lựa chọn để tiến hành phân đoạn và phân tích các đặc trưng
52 cấu trúc của chúng. Vì đây là những loài rong phổ biến, có trữ lượng lớn và có khả năng khai thác ở quy mô công nghiệp. Kết quả phân đoạn tinh chế các mẫu fucoidan bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2x32 cm) (hình 2.1) được chỉ ra trên hình 3.2-hình 3.6. 1,4 SdF1 2 1,2 1,5 1 SdF3 SdF2 m n 0,8 M 0 , l 9 1 4 C , 0,6 a O N D Hình 3.2. Phân đoạn 0,4 0,5 fucoidan được chiết từ rong S.denticapum 0,2 bằng sắc ký trao đổi 0 0 anion trên cột 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 DEAE-cellulose V, ml Bảng 3.2. Hàm lượng và thành phần đường của các phân đoạn fucoidan từ rong S.denticapum thu được bằng sắc ký trao đổi anion Phân đoạn Hàm Tổng 2- Thành phần monosacarit , SO4 fucoidan lượng carbohydrate (%)* mol% (%)* (%)* Fuc Man Gal Xyl Glc SdF1-0,5 М NaCl 17,2 48,04 23,67 38,6 22,1 24,6 14,7 nd SdF2-1,0 М NaCl 45,7 54,12 27,64 48,6 12,8 28,2 10,4 nd SdF3-1,5 М NaCl 15,3 54,09 39,14 51,9 5,8 33,4 8,9 nd *: tính theo khối lượng mẫu fucoidan nd: không phát hiện thấy Kết quả phân đoạn fucoidan của rong S.denticapum trên hình 3.2 cho thấy có 03 phân đoạn SdF1, SdF2 và SdF3 được tách ra theo các gradient nồng độ muối NaCl khác nhau tương ứng là 0,5M; 1,0M và 1,5M. Hàm lượng mỗi phân đoạn
53 được tính theo khối lượng mẫu fucoidan đưa lên cột tách, trong đó phân đoạn cao nhất là SdF2 chiếm 45,7% và thấp nhất là phân đoạn SdF3 15,3%. Kết quả phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn này (bảng 3.2) cho thấy cả 03 phân đoạn đều chứa 4 gốc đường đơn là fucose, mannose, galactose, xylose với các tỉ lệ khác nhau trong đó fucose chiếm hàm lượng cao nhất trong thành phần của cả 3 phân đoạn, chúng dao động trong khoảng 38,6-51,9% cao nhất là phân đoạn SdF3 (51,9%) và thấp nhất là phân đoạn SdF1 (38,6%), các gốc đường rhamnose và glucose không được phát hiện thấy trong các phân đoạn của loại fucoidan này, hàm lượng mannose và xylose giảm dần từ phần đoạn SdF1 đến SdF3. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn SdF1 đến SdF3 chúng dao động từ 23,67% - 39,14% điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, nên để giải phóng phân đoạn fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Với kết quả này, ta thấy fucoidan của rong S.denticapum có thể tồn tại 03 loại cấu trúc khác nhau, phân đoạn SdF3 chứa lượng lớn sulfate, fucose, galactose và một lượng nhỏ hơn mannose, xylose phân đoạn này được gọi là sulfate galactofucan. Hai phân đoạn SdF1 và SdF2 ngoài 2 thành phần chính là sulfate và fucose, chúng còn chứa một hàm lượng đáng kể galactose, mannose và xylose nên có thể gọi với tên chung là fucoidan. 0,12 SwF2 2 SwF3 0,1 SwF1 1,5 0,08 SwF4 SwF5 m n M 0 , l 9 0,06 1 4 C , a O N D 0,04 Hình 3.3. Phân đoạn fucoidan được chiết 0,5 0,02 từ rong S.swartzii bằng sắc ký trao đổi 0 0 anion trên cột 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 DEAE-cellulose V, ml