Hóa sinh đại cương - Chương 7: Enzyme

39 trang vanle 16321

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Hóa sinh đại cương - Chương 7: Enzyme", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

hoa_sinh_dai_cuong_chuong_7_enzyme.pdf

Nội dung text: Hóa sinh đại cương - Chương 7: Enzyme

30/12/2013 Chương 7: Enzyme I. BẢN CHẤT VÀ CẤU TẠO CỦA ENZYME II. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYME III. TIỀN ENZYME (ZYMOGEN, PROENZYME) VÀ SỰ HOẠT HĨA IV. TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYME V. CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN VẬN TỐC PHẢN ỨNG ENZYME VI. CÁCH GỌI TÊN VÀ PHÂN LOẠI ENZYME VII.CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME VIII.ỨNG DỤNG VÀ NGUỒN THU NHẬN ENZYME Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 1 I. BẢN CHẤT VÀ CẤU TẠO CỦA ENZYME Enzyme = chất xúc tác sinh học cĩ bản chất protein, cĩ khả năng xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hĩa học nhất định Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 2 Bản chất protein của enzyme  M = 20000 – 1000000 khơng đi qua các màng bán thấm  Hịa tan trong nước, dd muối lỗng, dd hữu cơ cĩ cực, khơng hịa tan trong các dung mơi khơng phân cực  Enzyme bị biến tính và mất khả năng xúc tác do t0 cao, acid / kiềm mạnh, muối kim loại nặng  Điện ly lưỡng cực phân tách bằng pp điện di Bản chất hĩa học của enzyme là protein. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 3 1
30/12/2013 Cường lực xúc tác  Enzyme cĩ cường lực xúc tác mạnh hơn nhiều so vơi xúc tác thơng thường: – Trong 1 phút: 3+ -6 • 1mol Fe xúc tác phân ly 10 mol H2O2 • 1 phân tử catalaza cĩ 1 nguyên tử Fe xúc tác phân -6 ly 5.10 mol H2O2 – 1g pepxin trong 2 giờ thủy phân 5kg Protein trứng luộc ở nhiệt độ bình thường – 1 phân tử  - amilaza sau 1 giây cĩ thể phân giải 4000 liên kết glucozit trong phân tử tinh bột. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 4 3+ 1 giây CatalaseFe ≈ 554 GIỜ 5 5 4 10 H2O2 10 H2O + 5.10 O2 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 5 Cấu tạo hĩa học của enzyme  Enzyme được chia thành 2 loại: – Enzyme 1 cấu tử: protein đơn giản. – Enzyme 2 cấu tử: • Phần protein (feron,apoenzyme): qđ tính đặc hiệu và  hoạt tính xúc tác của enzyme • Phần phi protein (nhĩm ngoại agon, prostetic): qđ kiểu phản ứng enzyme xúc tác Khi nhĩm ngoại tồn tại và xúc tác độc lập gọi là coenzyme. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 6 2
30/12/2013 Cofactor Cofactor: cĩ thể là một hoặc một số ion kim loại như Fe2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+ hoặc một phân tử hữu cơ hay phức hữu cơ chứa kim loại phức tạp (gọi là coenzyme) Một enzyme cĩ thể cần coenzyme và thêm một vài kim loại Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 7 Một số enzyme cĩ chứa hoặc cần các nguyên tố vơ cơ để làm cofactor Cofactor Enzyme Fe2+, Fe3+ Cytochrome Oxydase Catalase, Peroxydase Cu2+ Cytochrome Oxydase Zn2+ Carbonic Anhydrase, Alcohol Dehydrogenase Mg2+ Hexokinase, Glucoso-6-phosphatase, Pyruvate kinase Mn2+ Arginase, Ribonucleotide reductase K+ Pyruvate kinase Ni2+ Urease Mo Dinitrogenase Se Glutathion eperoxidase Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 8 Một số coenzyme làm vật trung chuyển các nguyên tử hoặc các nhóm nguyên tử đặc hiệu Nhóm được Chất tiền thân trong COENZYME vận chuyển thức ăn của động vật có vú Thiamine Aldehyde Thiamine (Vit B1) pyrophosphate Flavine adenine Điện tử Riboflavine dinucleotide (Vitamine B2) Nicotinamide Điện tử Nicotinic acid dinuclotide (Niacin) Coenzyme A Nhóm acyl Acid pantothenic Pyridoxal phosphate Nhóm amine Pyridoxine (Vit B6) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 9 3
30/12/2013 II. Cơ chế tác dụng của enzyme 1. Trung tâm hoạt động 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể (Allostetic) 3. Hệ thống đa enzyme và sự điều hịa hoạt động xúc tác của enzyme 4. Các loại liên kết trong ES khi E tác dụng lên S 5. Cơ chế tác dụng của enzyme Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 10 1. Trung tâm hoạt động của enzyme Trung tâm hoạt động của enzyme = phần phân tử trong cấu trúc của enzyme mà tại đĩ enzyme + cơ chất sản phẩm – Ở enzyme 1 cấu tử: trung tâm hoạt động = các nhĩm định chức của acidamin (SH của Cys, OH của Ser, Tyr, nhĩm -NH2 của Lys, COOH của Glu, Asp, vịng imidazol của His, indol của Trp) – Ở enzyme 2 cấu tử, trung tâm hoạt động = nhĩm ngoại (vitamin, ion kim loại) + các nhĩm định chức trong apoenzyme Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 11 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể (Allostetic)  Trong cấu trúc của các enzyme dị thể, enzyme điều hịa – enzyme allosteric, ngồi trung tâm hoạt động cịn cĩ một số vị trí khác cũng cĩ thể tương tác với các cơ chất khác gọi là “trung tâm allosteric” – trung tâm dị thể, trung tâm điều hịa  Các chất kết hợp với các trung tâm này được gọi là các chất “điều hịa allosteric” – chất điều hịa dị lập thể  Các chất này khi kết hợp với enzyme sẽ làm thay đổi cấu trúc khơng gian của enzyme và của trung tâm hoạt động. Do đĩ enzyme sẽ thay đổi hoạt độ xúc tác Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 12 4
30/12/2013 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể (Allostetic)  Trong quá trình kết hợp với enzyme chất điều hịa allosteric sẽ khơng bị chuyển hĩa dưới tác động của enzyme  Các chất điều hịa allosteric cĩ khả năng làm tăng hoạt độ của enzyme được gọi là chất điều hịa dương, cịn các chất làm giảm hoạt độ của enzyme được gọi là chất điều hịa âm  Hầu hết các enzyme dị thể cĩ cầu trúc bậc 4, trong phân tử cĩ hai hay cĩ một số trung tâm hoạt động cĩ khả năng kết hợp với một số cơ chất. Trong trường hợp cơ chất cĩ khả năng thực hiện chức năng của chất điều hịa thì ta cĩ điều hồ đồng hướng – homotropic. Trong trường hợp chất điềuHĩa Sinh hịa Đại Cương cĩ cấu – Chương trúc 7 khác với cơ chất 13 thì ta cĩ điều hịa dị hướng – heterotripic. Thơng thường 2. Trung tâm điều hồ dị lập thể (Allostetic)  Hầu hết các enzyme dị thể cĩ cầu trúc bậc 4, trong phân tử cĩ hai hay cĩ một số trung tâm hoạt động cĩ khả năng kết hợp với một số cơ chất  Trong trường hợp cơ chất cĩ khả năng thực hiện chức năng của chất điều hịa thì ta cĩ điều hồ đồng hướng – homotropic  Trong trường hợp chất điều hịa cĩ cấu trúc khác với cơ chất thì ta cĩ điều hịa dị hướng – heterotripic  Thơng thường các enzyme allosteric được điều hịa theo kiểu hỗn hợp bao gồm cả homotropic và heterotropic Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 14 3. Hệ thống đa enzyme và sự điều hịa hoạt động xúc tác của enzyme  Cĩ trọng lượng phân tử lớn  Thường chứa từ ba enzyme khác nhau trở lên kết hợp chặt chẽ bằng cách tương tác khơng đồng hĩa trị  Mỗi enzyme xúc tác một phản ứng riêng biệt nhưng cùng với các enzyme khác xúc tác một phản ứng tổng thể duy nhất  Ví dụ: Pyruvat dehydrogenase hay Synthetase acid béo Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 15 5
30/12/2013 4. Các loại liên kết trong ES khi E tác dụng lên S  Khi cơ chất liên kết với enzyme tại vị trí trung tâm hoạt động sẽ hình thành phức hợp trung gian enzyme – cơ chất ES  Liên kết chủ yếu trong phức ES: – Tương tác tĩnh điện – Liên kết hydro – Tương tác Van der Waals Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 16 5. Cơ chế tác dụng của enzyme 1 2 3 E + S ES EP E + P (E: enzyme, S: cơ chất, P: sản phẩm, ES: phức hợp trung gian enzyme-cơ chất)  3 giai đoạn: – Gđ 1: E +S bằng lk yếu phức enzyme- cơ chất (ES) khơng bền (xảy ra rất nhanh, NL hoạt hĩa thấp) – Gđ 2: biến đổi S sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hĩa trị tham gia phản ứng – Gđ 3: tạo thành P và E được giải phĩng ra dưới dạng tự do. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 17 CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA ENZYME LÊN CƠ CHẤT Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 18 6
30/12/2013 Biến thiên năng lượng tự do trong các phản ứng hĩa học Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 19 Mơ hình “Chìa và khĩa” của Fisher về sự ăn khớp của enzyme và cơ chất (Năm 1894) Cơ chất Cơ chất TT hoạt động Enzy Enzyme me Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 20 Mơ hình “Khớp cảm ứng” của Koshland về sự ăn khớp của Enzyme và cơ chất (Năm 1958) Cơ chất Cơ chất TT hoạt động Enzym Enzy e me Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 21 7
30/12/2013 III. Tiền enzyme (zymogen, proenzme) và sự hoạt hĩa  Zymogen hay proenzyme là trạng thái chưa hoạt hĩa của enzyme, cần phải cĩ một sự biến đổi sinh hĩa (phản ứng thủy phân chẳng hạn) để trở thành enzyme hoạt động  Thơng thường 1 phần proenzyme (1 đoạn peptide) được cắt ra để hình thành trung tâm hoạt động của enzyme  Sau khi hoạt hĩa, khả năng xúc tác của enzyme bị giới hạn (tăng tính đặc hiệu), nhưng lại tăng độ bền vững và hoạt tính xúc tác lên nhiều lần Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 22 IV. Tính đặc hiệu của enzyme  Tính đặc hiệu cao của enzyme = khả năng xúc tác cho sự chuyển hĩa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định tác dụng cĩ tính chọn lựa cao  Bao gồm: – Đặc hiệu kiểu phản ứng – Đặc hiệu cơ chất Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 23 Đặc hiệu kiểu phản ứng  Đặc hiệu kiểu phản ứng thể hiện ở chỗ mỗi enzyme chỉ cĩ thể xúc tác cho một kiểu phản ứng chuyển hĩa một chất nhất định: – Oxy hố nhờ oxydaza: RCHCOOH + ½ O2 RCOCOOH + NH3 NH2 – Khử cacboxyl nhờ decarboxylaza: RCHCOOH RCH2NH2 + CO2 NH2 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 24 8
30/12/2013 Đặc hiệu cơ chất  Cơ chất là chất cĩ khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt động của enzyme và bị chuyển hĩa dưới tác dụng của enzyme  Mức độ đặc hiệu của các enzyme khơng giống nhau, người ta thường phân biệt thành các mức sau: – Đặc hiệu tuyệt đối: – Đặc hiệu tương đối: – Đặc hiệu nhĩm: – Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 25 Đặc hiệu tuyệt đối Enzyme chỉ tác dụng trên một cơ chất nhất định và hầu như khơng cĩ tác dụng với chất nào khác: Ureaza Urea CO2 + 2NH3 H2O Acetamide Ureaza Khơng xảy ra H2O Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 26 Đặc hiệu tương đối  Enzyme cĩ khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hĩa học nhất định trong phân tử cơ chất mà khơng phụ thuộc vào cấu tạo của các phần tham gia tạo thành mối liên kết đĩ CH – O – CO - CH – O – H HOOC – R 2 R1 2 1 CH – O – CO - CH – O – H + HOOC – R2 R2 CH – O – CO – R CH – O – H HOOC – R 2 3 HO - H 2 3 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 27 9
30/12/2013 Đặc hiệu nhĩm  Enzyme cĩ khả năng tác dụng lên một kiểu liên kết hĩa học nhất định với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải cĩ cấu tạo xác định: R’ Carboxyl R’ peptidaza R – C – N – CH R – C – OH + NH2 – CH O H COOH H2O O COOH R’ Carboxyl peptidaza R – C – N – CH khơng phản ứng H O O H CH2 2 COOH Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 28 Đặc hiệu quang học (đặc hiệu lập thể) Enzyme chỉ tác dụng một trong hai dạng đồng phân quang học của các chất: COOH HO–CH Fumarathydrataza CH–COOH CH2–COOH HOOC–CH L – malic Acid fumaric Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 29 V. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzyme  Nồng độ enzyme  Nồng độ cơ chất (mơ hình Michaelis – Menten)  Ảnh hưởng của các chất kìm hãm  Các chất hoạt hĩa  Nhiệt độ  pH mơi trường Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 30 10
30/12/2013 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phản ứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzyme: v=k[E], với k=const Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn thì vận tốc phản ứng sẽ tăng chậm lại. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 31 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất (mơ hình Michaelis – Menten)  Phương trình Michaelis – Menten: v [S] v max K m [S] v: vận tốc phản ứng, vmax: vận tốc cực đại của phản ứng, [S]: nồng độ cơ chất, Km: hằng số Michaelis • [S] > Km: v = vmax • [S] = Km: v = vmax/2 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 32 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Chất kìm hãm hay cịn gọi là chất ức chế là những chất mà khi kết hợp với enzyme sẽ làm giảm hoạt tính của enzyme mà nguyên nhân trực tiếp là làm giảm ái lực giữa enzyme với cơ chất. Sự ức chế enzyme là những ức chế đặc hiệu và đặc trưng riêng cho từng enzyme. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 33 11
30/12/2013 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Dựa vào các hình thức ức chế đặc hiệu, người ta chia thành 2 nhĩm chính: – Ức chế khơng thuận nghịch: enzyme và chất ức chế được liên kết với nhau bằng liên kết đồng hĩa trị và gây nên sự thay đổi cấu hình cĩ hoạt tính của enzyme – Ức chế thuận nghịch: giữa enzyme và chất ức chế được liên kết với nhau bằng liên kết thứ yếu nào đĩ tạo nên thế cân bằng thuận nghịch. Sau khi chất ức chế bị loại trừ, hoạt tính enzyme lại được hồi phục. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 34 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm  Tùy theo đặc điểm của mối quan hệ giữa enzyme và cơ chất, cĩ 2 loại: – Ức chế cạnh tranh: chất ức chế cĩ cấu trúc tương tự như cơ chất kết hợp ngay vào trung tâm hoạt động của enzyme, chiếm chỗ cơ chất phụ thuộc vào tỷ lệ [S]/[I]  tác động ức chế bằng cách nồng độ cơ chất – Ức chế khơng cạnh tranh: chất ức chế gắn vào vị trí khác với vị trí gắn cơ chất trên phân tử enzyme cĩ cấu tạo khác với cơ chất và cĩ thể kìm hãm nhiều loại enzyme khác nhau Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 35 Ức chế cạnh tranh (competitive inhibition) E + S ES E + P E + I EI + S EI + S (I là chất ức chế cạnh tranh) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 36 12
30/12/2013 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 37 Ức chế khơng cạnh tranh  Cĩ 2 dạng: – Noncompetitive inhibition: Khả năng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ của chất ức chế Các chất ức chế noncompetitive cĩ thể kết hợp cả với enzyme tự do và với phức hệ ES E + I EI – Uncompetitive inhibition: Kiểu ức chế này xảy ra khi một chất ức chế chỉ kết hợp thuận nghịch với phức hệ ES để tạo ra ESI mà sau đĩ khơng thể tạo ra sản phẩm: ES + I ESI Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 38 Ức chế khơng cạnh tranh Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 39 13
30/12/2013 Ảnh hưởng của các chất hoạt hĩa  Chất hoạt hĩa là những chất cĩ khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme.  Chất hoạt hĩa cĩ thể là các anion, các ion kim loại nằm ở ơ thứ 11 đến ơ thứ 55 của bảng tuần hồn Mendelev hoặc những chất hữu cơ cĩ cấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhĩm, chuyển hydro hoặc những chất cĩ khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme hoặc các chất cĩ tác dụng phục hồi những nhĩm chức của trung tâm hoạt động của enzyme.  Tuy nhiên, tác dụng hoạt hĩa chỉ giới hạn ở những nồng độ xác định, vượt quá giới hạn này cĩ thể làm giảm hoạt độ của enzyme Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 40 Ảnh hưởng của nhiệt độ  Vượt quá phạm vi nào đĩ của nhiệt độ, các phản ứng do enzyme xúc tác sẽ bị ảnh hưởng do biến tính của enzyme.  Nhiệt độ ứng với hoạt độ enzyme cao nhất gọi là 0 nhiệt độ tối ưu của enzyme (topt)  40 – 50 C, thay đổi tùy theo cơ chất, pH mơi trường, thời gian phản ứng  Nhiệt độ mà enzyme bị mất hồn tồn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn  700C. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, ít khi cĩ khả năng hồi phục lại được hoạt độ. Ngược lại, ở nhiệt độ dưới 00C, hoạt độ enzyme tuy bị giảm nhưng lại cĩ thể tăng lên khi đưa về nhiệt độ bình thường  Độ bền nhiệt của enzyme thường tăng lên khi cĩ 2+ cơ chất, coenzyme,Hĩa Sinh ĐạiCa Cương – Chương 7 41 Ảnh hưởng của nhiệt độ Hoạt độ tương đối, (% hoạt độ cực đại) 100 50 0 20 40 60 80 t(oC) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 42 14
30/12/2013 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 43 Ảnh hưởng của pH Đa số enzyme bền khi pH = 5–9, độ bền của enzyme cũng cĩ thể tăng lên khi cĩ cơ chất, coenzyme, Ca2+ Mỗi enzyme đều cĩ một pH thích hợp gọi là pHopt  7, nhưng cĩ enzyme cĩ pHopt rất thấp (pepxin, proteinaza acid của VSV ) hoặc khá cao (subtilizin, pHopt > 10). pHopt của một enzyme cũng khơng cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cơ chất, tính chất dung dịch đệm, nhiệt độ Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 44 Ảnh hưởng của pH Hoạt độ tương đối, (% hoạt độ cực đại) 100 50 pHopt 4 5 6 7 8 9 pH Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 45 15
30/12/2013 Ảnh hưởng của pH Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 46 Ảnh hưởng của pH Enzyme pHopt Enzyme pHopt Pepsin 1,5 – 2,5 Trypsin 7,8 – 9,5 Saccarase 4,6 – 5,0 Arginase 9,8 (nấm men) Amilase 4,4 – 5,0 Succinate 9,0 (malt) dehydrogenase Amilase 6,8 – 7,2 Catalase 6,8 – 7,0 (nước bọt) Mantase 6,7 – 7,2 Phosphatase ĐV 6,2 – 9,4 (nấm men) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 47 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 48 16
30/12/2013 VI. Cách gọi tên và phân loại enzyme  Cách gọi tên: – Tên thơng dụng: pepxin, tripxin, kimotripxin – Tên quốc tế: thường gồm 2 phần: • Phần thứ nhất là tên cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên gọi của 2 cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm). • Phần thứ hai: tên phản ứng mà enzyme xúc tác cộng thêm “aza” Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 49 Cách gọi tên và phân loại enzyme  Phân loại: theo kiểu phản ứng do enzym xúc tác, bao gồm 6 nhĩm chính: – Oxydoreductaza (enzyme oxy hĩa khử) – Tranferaza (enzyme chuyển vị) – Hydrolaza (enzyme thủy phân) – Liaza (enzyme phân cắt) – Izomeaza (enzyme đồng phân hĩa) – Ligaza (enzyme tổng hợp) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 50 STT Nhóm chính Phản ứng xúc tác của Enzym 1 Oxidoreductase •Chuyển e- , H+ hoặc nguyên tử H) A- + B  A + B- 2 Transferase •Phản ứng chuyển nhóm chức A-B + C  A + B - C 3 Hydrolase •Phản ứng phân ly nhờ nước ( thuỷ giải) (chuyển nhóm chức cho phân tử nước) : A-B + H O A-H + 2  4 B-OH Lyase •Phản ứng chuyển hóa nhờ bổ sung nhóm chức vào liên kết đôi hoặc tạo liên kết đôi nhờ lấy đi nhóm chức (phân giải không có nước tham gia) X Y   5 A-B  A=B + X-Y Isomerase •Chuyển nhóm chức trong phân tử tạo các dạng đồng phân X Y Y X     6 A-B  A-B Ligase •TổngHĩa Sinh hợp Đại liên Cương kết – Chương C-C, C7 -S, C-O và C-N nhờ phản51 ứng trùng ngưng liên hợp với sự thủy giải ATP. 17
30/12/2013 VII. CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ENZYME 1. Cách xác định hoạt tính enzyme 2. Hoạt tính của enzyme 3. Thu nhận enzyme Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 52 1. Các xác định hoạt tính của enzyme  3 nhĩm phương pháp xác định như sau: Nhĩm Các thơng số cố định Các thơng số thay đổi 1 Thời gian Biến thiên của S và P Nồng độ enzym 2 Lượng S mất đi (hay Thời gian lượng P tạo thành) Nồng độ enzym 3 Thời gian Nồng độ E Lượng S mất đi (hay P tạo thành) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 53 2. Hoạt tính của enzyme  Đơn vị quốc tế (UI) là lượng enzyme cĩ khả năng xúc tác làm chuyển hĩa được 1 micromol cơ chất sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn: 1 UI = 1 mol cơ chất/phút  Đơn vị Katal (Kat) là lượng enzyme cĩ khả năng xúc tác làm chuyển hĩa được 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn: 1 Kat = 1 mol cơ chất/s Đổi đơn vị: 1 UI = 16,67 nKat (nanokatal)  Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hay Kat) ứng với một mililit dung dịch (nếu là chế phẩm dạng dung dịch) hay 1 miligam protein (nếu là bột khơ) của chế phẩm.  Hoạt độ riêng phân tử là số phân tử cơ chất chuyển hĩa bởi 1 phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 54 18
30/12/2013 3. Thu nhận enzyme  Enzyme cĩ trong tế bào động – thực vật. Muốn thu nhận enzyme cần rút chiết chúng ra khỏi tế bào bằng cách vỡ cấu trúc của tế bào: – Nghiền xay với bột thủy tinh, cát thạch anh, xay đồng hố – Dùng dung mơi hữu cơ: butanol, acetone, glycerin, etyl acetat – Bằng sĩng siêu âm Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 55 3. Thu nhận enzyme Sau chiết tách cĩ thể dùng dung dịch đệm thích hợp hoặc muối trung tính chiết rút enzyme được dung dịch enzyme + tạp chất ( muối, glucid, ) Tiến hành tinh sạch để thu được enzyme tinh khiết Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 56 Làm tinh  Loại muối và tạp chất cĩ phân tử lượng nhỏ: phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm tạp chất cĩ phân tử nhỏ đi qua.  Loại protein lạ và tạp chất cĩ phân tử lượng lớn: phối hợp nhiều phương pháp: sắc ký hấp thụ, sắc ký trao đổi ion điện ly, lọc gel, kết tủa phân đọan, biến tính chọn lọc  Kết tủa phân đoạn: dùng muối trung tính (NH4)2SO4, NaCl, Na2SO4, MgSO4 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 57 19
30/12/2013 Làm tinh  Kết tủa bằng dung mơi hữu cơ: acetone, iso – propanol, etanol, ( nhiệt độ, thời gian ngắn ).  Sắc ký hấp thụ: thường dùng: hydroxy apatite làm chất hấp thụ  Sắc ký trao đổi ion: nhựa trao đổi ion  Dẫn xuất este của celluloza (Carboxyl – metyl – cellulose, dietyl – aminol etyl – cellulose )  Lọc gel: dùng sephadex (dẫn xuất của polysaccharide – dextran ) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 58 Bảo quản Bảo quản ở dạng bột khơ sấy chân khơng ở 30 đến 400C Bảo quản ở điều kiện khơ, kín, lạnh, tránh sáng và các tác nhân ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 59 VIII. Ứng dụng và nguồn thu nhận enzyme 1. Protease 2. Amilase 3. Pectinase Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 60 20
30/12/2013 1.Protease Nhĩm protease (peptid – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptid đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin và cũng cĩ khả năng thuỷ phân liên kết ester và vận chuyển acid amin Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 61 Phân loại  Protease chia thành 2 loại: endopeptidase và exopeptidase – Endopeptidase: gồm Serine proteinase, Cystein proteinase, Aspartic proteinase, Metallo proteinase – Exopeptidase được phân chia thành 2 loại: • Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi polypeptide để giải phĩng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide • Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi polypeptide và giải phĩng ra một amino acid hoặc một dipeptide Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 62 Peptidase (Protease) (E.C.3.4) Exopeptidase Endopeptidase (E.C. 3.4.11-17) (E.C. 3.4.21-99) Serine proteinase Aminopeptidase Cystein proteinase Aspartic proteinase Carboxypeptidase Metallo proteinase Protease (peptidase) cĩ mã (E.C.3.4) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 63 21
30/12/2013 Phân loại  Ngồi ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhĩm: – Protease acid: pH 2-4 – Protease trung tính: pH 7-8 – Protease kiềm: pH 9-11 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 64 Nguồn thu nhận Nguồn động vật: –Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và cĩ chứa nhiều enzyme nhất –Dạ dày bê: thường là renin Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 65 Nguồn thu nhận  Nguồn thực vật: Cĩ 3 loại protease thực vật như Bromelain (dứa) , Papain (đu đủ) và Ficin (vả) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 66 22
30/12/2013 Nguồn thu nhận  Nguồn vi sinh vật: Enzyme protease chủ yếu cĩ ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn như Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số loại nấm men Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 67 Ứng dụng của protease -Thuộc da : làm mềm da, sạch lơng, bĩng da Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 68 -Sợi: đánh bĩng, tách tơ sợi Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 69 23
30/12/2013 -Sữa: renin, pepsin cĩ khả năng làm đơng tụ sữa, ứng dụng trong sản xuất phomat. Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 70 -Mỹ phẩm: làm da tĩc mềm mại, loại bỏ tế bào già Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 71 -Sản xuất nước mắm, nước chấm, tương, chao, Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 72 24
30/12/2013 -Xà bơng, chất tẩy rửa: tẩy sạch vết máu, sữa trên vải Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 73 Làm mềm thịt: Với bromelin, papain Thịt tươi thái miếng ngâm vào bromelin, papain 5 – 10 phút nấu bình thường Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 74 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 75 25
30/12/2013 2. Amylase Amylase là một loại enzyme cĩ ý nghĩa về mặt sinh lý, thương mại và lịch sử cịn gọi là diastase Amylase cĩ cả ở thực vật lẫn động vật Amylase thuộc nhĩm enzyme thủy phân, xúc tác sự phân giải liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 76 Phân loại  – amylase  – amylase  – amylase Oligo – 1,6-glucosidase hay dextrinase tới hạn Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 77 Nguồn thu nhận  Amylase cĩ trong tuyến nước bọt hoặc tụy tạng của động vật Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 78 26
30/12/2013  Ở thực vật, amylase cĩ nhiều trong đại mạch (Hordeum sativum), Lúa (Oryza sativa L.), Ngơ (Zea mays) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 79  Ở VSV, amylase được thu nhận từ: – Các giống nấm sợi thường dùng là giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus – Nấm men và giả nấm men thuộc các giống Candida, Saccharomyces. Endomycopsy, Endomyces – Nhiều vi khuẩn cĩ khả năng tạo lượng lớn amylase như: Bac. Polymyxa, Phytomonas destructans, Bact. cassavanum, Clostridium acetobutylium, Pseudomonas saccharophila – Micromonospora vulgaris 42 cĩ khả năng tạo một lượng nhỏ - amylase Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 80 PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN Thu nhận, xử Đại Ngâm Nẩy Sấy lý, làm sạch, mạch mầm khô phân loại Không Tách Sấy Bảo khí mầm rễ khô quản Mầm rễ Malt khô khô bảo quản Các bước quy trình sản Malt khô sản xuất malt khô xuất bia Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 81 27
30/12/2013 ỨNG DỤNG ENZYME AMYLASE Dựa vào các đặc tính biểu hiện của enzyme amylase người ta tiến hành nghiên cứu phương pháp chuẩn đốn bệnh viêm tuyến tụy Đối tượng: enzyme s-amylase và p- amylase Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 82 ỨNG DỤNG AMYLASE TRONG SX CHẤT TẨY RỬA Chất tẩy rửa bao gồm những chất kiềm, sodium silicate, sodium bicarbonate, sodium tripolyphosphate Mục đích: loại bỏ các chất vơ cơ, hữu cơ bám vào quần áo như : protein, lipid, carbohydrate và những chất màu Enzyme -amylase của vi khuẩn là một trong những enzyme thường được ứng dụng trong cơng nghiệp sản xuất chất tẩy rửa Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 83 ỨNG DỤNG TRONG CƠNG NGHIỆP DỆT RŨ HỒ VẢI -amylase QUÁ TRÌNH RŨ HỒ VẢI THEO PP LIÊN TỤC VỚI ENZYME AMYLASE CHUẨN Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 84 28
30/12/2013 Dệt: rũ bỏ hồ vải (Tầng lớp hồ để mặt vải trở nên mịn, dễ bắt màu) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 85 ỨNG DỤNG TRONG CNSX MÌ CHÍNH Nguyên liệu sử dụng chủ yếu : Tinh bột sắn, rỉ đường mía amylase Tinh bột Dextrin + maltose + glucose  amylase Tinh bột Maltose +  Dextrin (Glucogen) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 86 ỨNG DỤNG TRONG CNSX BIA Nguyên liệu sử dụng: Ngũ cốc, hoa Houblon, nước, Nấm men, chất phụ gia Trong cơng nghệ sản xuất bia, người ta thường sử dụng emzyme amylase cĩ trong 1000C : 15’ mầm đại mạch 760C : 15’ Nguyên liệu phụ Gạo và bắp 670C : 60’ Malt ( +Lúa mạch) 520C : 70’ Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 87 29
30/12/2013 ỨNG DỤNG TRONG CNSX CỒN Nguyên liệu chứa Sơ đồ Quá tinh bột trình chuyển hóa tinh bột Nấu chín ở t0 cao Amylogluco- Amylase sidase hoạt Làm nguội hoạt động ở động ở 550C 550C Đường hóa Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 88 ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT SIRO Q. trình chuyển hóa tinh bột thành siro fructose Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 89 ỨNG DỤNG AMYLASE TRONG CƠNG NGHỆ SẢN XUẤT BÁNH MÌ Trong sản xuất bánh mì, người ta sử dụng cả hai loại enzyme α-amylase và β-amylase tham gia thủy phân tinh bột để tạo thành đường Nhờ đĩ nấm men Saccharomyces cerevisiae sẽ dễ dàng chuyển hĩa chúng thành cồn, CO2, làm tăng thể tích của bánh và tạo ra màu sắc, hương vị tốt cho bánh Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 90 30
30/12/2013 Sản xuất bánh mì: làm bánh xốp, thơm ngon hơn Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 91 ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT BÁNH KẸO  Mục đích – Làm tăng mùi và vị bánh, khi chế biến bột thành các loại bánh quy các Enzyme protease và amylase của bột hoạt động làm tăng hàm lượng các amino acid tự do và làm tăng lượng đường khử – Đường khử và các amino acid tự do cĩ trong khối bột sẽ cùng tham gia vào các phản ứng oxy_ hĩa khử và kết quả tạo cho bánh quy cĩ mùi, vị màu hấp dẫn Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 92 ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT GLUCOSE VÀ MẬT  Chúng ta đã biết từ tinh bột cĩ thể thu được các phẩm vật đường khác nhau khi thủy phân tinh bột bằng acid cũng như bằng Enzym amylase sẽ thu được mật  Mật glucose hay mật maltose thường được dùng trong sản xuất bánh kẹo và trong sản xuất các sản phẩm ăn kiên cho trẻ em và người bệnh Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 93 31
30/12/2013 3. Pectinase Pectin và Pectin cơ chất khác là phức hợp polysaccharides,nĩ gĩp phần làm bền cấu trúc mơ thực vật Pectin cơ chất gồm 2 kiểu: – Homogalacturonan – Heterolacturonan (Rhamnogalacturonan) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 94 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 95 Pectinases Pectinases là phức hợp bao gồm một nhĩm enzym phân hủy Pectin cơ chất Phân loại: dựa vào cấu trúc và phương thức của sự tái chế Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 96 32
30/12/2013 Dựa vào đặc điểm hĩa sinh Polymethylgalacturonase Polygalacturonases Pectin Lyase Polygalacturonates Lyase Pectinesterases hoặc Pectinmethylesterase Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 97 Polymethylgalacturonase Hoạt tính PMG được xác định bởi giới hạn sự thủy phân đường của liên kết Glycosidis hoặc sự giới hạn tính dẻo của chất nền. Đặc điểm hĩa sinh: –Khơng cĩ tính đồng nhất và tiêu biểu –Hoạt tính khơng điển hình –pH: 4 – 7 –Sự ester hĩa cao: 95% Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 98 Polygalacturonases Thủy phân các liên kết Glycosidis của Polygalacturonates bởi 2 cơ chế là endo và exo Hoạt tính cĩ thể bị giới hạn bởi sự thủy phân đường hoặc phương pháp làm giảm tính dẻo Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 99 33
30/12/2013 Polygalacturonases Endo – PGs cĩ trọng lượng thay đổi: 30 – 80kDa. Độ đẳng điện: 3,8 – 7,6 pH tối ưu nhất cĩ tính acid: 2,5 – 6,0 Nhiệt độ tối ưu: 30 – 500C Exo – PGs cĩ trọng lượng thay đổi: 30 – 50kDa Độ đẳng điện: 4,0 – 6,0 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 100 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 101 Pectin Lyase Hoạt tính của PL hoạt động cần cĩ sự hiện diện của Ca2+ Phân tử khối của PL khoảng 30 – 40 kDa ngoại trừ trường hợp của PL từ Aureobasidium Pullulans và Pichia Pinus (~90 kDa) pH khoảng 4,0 – 7,0 Điểm đẳng điện khoảng 3,5 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 102 34
30/12/2013 Polygalacturonates Lyase  Endo – PGL và exo – PGL làm suy thối Pectate bởi trans – elimination bẻ cong 4,5 – Oligomethyl- galacturonates khơng no  PGLs cĩ pH tối ưu: 6 - 10  Trọng lượng phân tử của PGL khoảng 30 – 50 kDa ngoại trừ PGL từ Bacteroides và Psuedo- alteromonas (~75 kDa) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 103 Polygalacturonates Lyase  pH tối ưu khoảng 8 – 10  Nhiệt độ tối ưu phổ biến để PGL cĩ hoạt tính là 30 – 400C  PGL được sản xuất chủ yếu bởi các vi khuẩn gây bệnh Erwnia, Bacillus và 1 số lồi nấm khác như Colletotrichum magna, Colletotrichum gloeo Sporiodes, Amylocota sp Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 104 Pectinesterases hoặc Pectinmethylesterase Pectinesterases chủ yếu cĩ trong thực vật như chuối, cam quít và cà chua, ngồi ra cịn cĩ trong vi khuẩn và nấm Hoạt tính PE tăng khi tăng mức độ của sự ester hố chất nền Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 105 35
30/12/2013 Pectinesterases hoặc Pectinmethylesterase Khối lượng phân tử của PE vi khuẩn, thực vật thay đổi từ 30 – 50 kDa pH tối ưu khoảng 4 – 7  Nhiệt độ tối ưu: 40 – 600C Độ đẳng điện: 4,0 – 8,0 PE cơng nghiệp cĩ thể sử dụng duy trì cấu trúc; làm bền và làm trong nước trái cây Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 106 Cấu trúc và chức năng của Pectinases Cấu trúc ba chiều của Pectinase cho phép hiểu đĩ là phân tử cơ bản của enzym Cấu trúc tinh thể của Pectin bao gồm thành phần của nhiều lớp Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 107 Polygalacturonases Endo – PGL là cấu trúc đảo ngược của glycosidase nĩ đảo ngược anomeric của sản phẩm trong quá trình phản ứng GalpA ràng buộc cấu trúc bậc ba phức tạp, nhĩm cacboxyl được cơng nhận là bảo tồn cấu trúc Cĩ nhiều trong cà chua chín.Tồn tại dưới 2 dạng và cả 2 đều là endo – enzym (PG1 và PG2) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 108 36
30/12/2013 Polygalacturonate Lyase Tất cả Protein họ PGL cĩ cùng cơ chế hoạt động enzym tương tự nhau β – elimination chịu sự tác dụng của pectolytic, dễ bị tách, gồm 3 bước: Sự trung hồ của nhĩm cacboxyl Sự tách ra của C5 proton Sự di chuyển của proton đến glycosidic oxygen Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 109 Pectin Lyase Rãnh PL xuất hiện cùng với phản ứng đào thải β – elimination như ở PGLs PL là chất nền đặc hiệu cho những mẫu tẩm methylate cao và khơng địi hỏi Ca2+ để hoạt động Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 110 Pectin methylesterase Pes catalyze pectin bị deester hố bởi hydrolysis giữa α – (1,4) – methylate và D – galacturonosyl Sản phẩm cuối cùng là polymer và methanol Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 111 37
30/12/2013 Ứng dụng Trong cơng nghiệp: được phân loại thành 2 kiểu Pectinases acid và Pectinases kiềm Pectinases acid cĩ những ứng dụng rộng rãi: tách và làm trong nước trái cây Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 112 Ứng dụng Pectinases kiềm cĩ tiềm tàng những ứng dụng: –Tẩy vết bẩn trên vải –Cải thiện tính chất sợi thớ –Sự lên men trà và cà phê –Cơng nghiệp giấy Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 113 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 114 38
30/12/2013 Pectinase cĩ khả năng thủy phân pectin Sản xuất nước quả từ nguyên liệu quả nhờ cơ chế phá vỡ protopectin ( chất làm liên kết tế bào ), thủy phân protein, phá vỡ nguyên sinh chất của tế bào vỡ tế bào nước chảy ra, hiệu suất tăng. Làm trong nước quả ép ( bia, rượu ) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 115 Bảo quản thực phẩm : -Phối hợp với catalase kéo dài thời gian bảo quản của bột trứng, sữa khơ, làm ổn định bia -Chống rỉ các bao bì đựng nước giải khát CO2 ( do đuổi O2 ra khỏi sản phẩm khi thêm nước vào ) Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 116 Hĩa Sinh Đại Cương – Chương 7 117 39