›
›

Hóa học - Các quá trình tách trong sắc ký lỏng - Nguyễn Bá Hoài Anh

pdf 65 trang vanle 2780
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Hóa học - Các quá trình tách trong sắc ký lỏng - Nguyễn Bá Hoài Anh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfhoa_hoc_cac_qua_trinh_tach_trong_sac_ky_long_nguyen_ba_hoai.pdf

Nội dung text: Hóa học - Các quá trình tách trong sắc ký lỏng - Nguyễn Bá Hoài Anh

  1. CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH TRONG SẮC KÝ LỎNG TS NGUYỄN BÁ HOÀI ANH 1
  2. • Quá trình tách là quá trình quan trọng nhất trong phương pháp sắc ký nói chung và sắc ký lỏng nói riêng. • Hiệu quả của quá trình này phụ thuộc rất nhiều vào tương tác giữa các chất trong pha tĩnh và pha động. • Mục đích chính của sắc ký là tách và định tính các chất trong hỗn hợp chất phức tạp • Tuy nhiên trong thực tế không phải lúc nào việc tách các chất cũng xảy ra hòan hảo do các tương tác là rất phức tạp và tương tác của mỗi chất khi nằm riêng rẽ và nằm trong hỗn hợp lại phần nào khác nhau 2
  3. Một số lọai sắc ký ™ High Performance Liquid chromatography (HPLC) : sắc ký lỏng hiệu năng cao ™ Gas Chromatography (GC) : sắc ký khí ™ Thin-Layer Chromatography (TLC) : sắc ký lớp mỏng ™ Capillary Electrophoresis(CE) : sắc ký điện di mao quản 3
  4. Ưu điểm của phương pháp sắc ký ™ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất ™ Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột ™ Độ nhạy cao (ppm-ppb) nhờ đầu dò ™ Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100uL) 4
  5. HPLC • High performance liquid chromatography • High pressure liquid chromatography • High price liquid chromatography • High problem liquid chromatography • High pleasure liquid chromatography 5
  6. •Một số dạng HPLC – Pha thường (thuận) : Normal phase – Pha đảo : Reversed phase – Ghép cặp ion : Reversed phase ion pairing –Sắc ký ion : Ion exchange (IC) –Sắc ký gel : SEC (GPC/GFC) –Sắc ký tách đồng phân quang học : Chiral separation Cách phân chia này phụ thuộc vào cột tách • Phân chia HPLC theo cấu tạo thiết bị –Hệ đẳng dòng (đẳng thành phần pha động) : Isocratic elution –Hệ thay đổi thành phần pha động : Gradient elution 6
  7. Hỗn hợp chất tách khỏi nhau thế nào ? Hướng dòng chảy Pha tĩnh 7
  8. Tại sao lại có sự khác nhau như vậy? Yếu Mạnh Do lực tương tác khác nhau 8
  9. QuQuáá trtrììnhnh ttááchch didiễễnn rara ththếế nnààoo • Quá trình tách diễn ra trong cột sắc ký. column Vật liệu nhồi cột, 3-5um 9
  10. Tương tác giữa chất phân tích và vật liệu nhồi •Do sự tương tác khác nhau giữa các chất phân tích và vật liệu nhồi cột mà quá trình tách xảy ra. sample A packing material sample B 10
  11. QuQuáá trtrììnhnh ttááchch mixed sample Mobile phase column 11
  12. Ưu điểm củaHPLC • Điều kiện phân tích khá dễ dàng : - Không cần bay hơi mẫu như GC, do đó phân tích được các chất kém bên nhiệt. •Dễ dàng thu hồi chất phân tích với độ tinh khiết cao nếu gắn bộ thu hồi phân đoạn (fraction collector) , thường dùng trong điều chế, tách tinh dầu, dược phẩm • Độ lặp lại cao •Thường không phân hủy mẫu 12
  13. Sắc ký pha thuận (thường) Normal Phase Mode M.M. TswettTswett :: Là người đầu tiên phát triển phương pháp sắc ký, sử dụng để tách Chlorophylls Ber. Deut. Botan. Ges., 24, 384 (1906) Adsorptionsanalyse und chromatographischechromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls. 13
  14. Normal Phase PetroleumPetroleum etherether ChromatoChromatograph Color Chlorophyll'sChlorophyll's Color CaCOCaCO3 14
  15. Normal Phase • Trong hệ thống sắc ký đầu tiên người ta sử dụng – CaCO3 làm chất nhồi cột (pha tĩnh) – Petroleum ether làm dung môi pha động • Và từ đópha thuận được định nghĩa như sau : NormalNormal PhasePhase CCộộtt :: mangmang ttíínhnh phânphân ccựựcc PhaPha đđộộngng :: mangmang ttíínhnh khôngkhông phânphân ccựựcc 15
  16. Các loại cột HPLC pha thuận • Cột Silica gel : dùng đa mục đích (general use) • Cột Cyano : dùng đa mục đích (general use) • Cột Amino : phân tích đường • Cột Diol : phân tích protein -Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH CH CH NH Si 2 2 2 2 -Si-CH CH CH OCH(OH)-CH (OH) Si 2 2 2 2 Silica gel Sillica gel biến tính (bổ trợ)16
  17. Các liên kết xảy ra thế nào? HydrogenHydrogen bondingbonding Non-polar Silica gel (polar) 17
  18. Hydrogen bonding : Liên kết hydrogen ‹ Nếu chất phân tích có ™ -COOH : Nhóm Carboxyl ™ -NH2 : Nhóm Amino ™ -OH : Nhóm Hydroxyl LiênLiên kkếếtt HydrogenHydrogen ssẽẽ mmạạnh.nh. ‹ Nếu mãu có nhóm tert-butyl hoặc các nhóm không phân cực lớn DoDo chchưướớngng ngngạạii llậậpp ththểể LiênLiên kkếếtt HydrogenHydrogen ssẽẽ yyếếuu
  19. Retention Time và liên kết Hydrogen MMạạnhnh HO 1 SiOH SiOH YYếếuu RRấấtt yyếếuu OH 2 1 or 2 19
  20. Dung môi pha động sử dụng cho sắc ký lỏng pha thuận • Dung môi chủ yếu (không phân cực) : – Hydrocarbons (Pentane, Hexane, Heptane, Octane) – Aromatic Hydrocarbons (Benzene, Toluene, Xylene) – Methylene chloride – Chloroform – Carbon tetrachloride • Dung môi phụ (phân cực hoặc hơi phân cực) : – Methyl-t-butyl ether (MTBE), Diethyl ether, Tetrahydrofuran (THF), Dioxane, Pyridine, Ethyl acetate, Acetonitrile, Acetone, 2-propaol, ethanol, methanol • Dung môi chủ yếu được sử dụng chính làm pha động, dung môi phụ thường được thêm vào với tỉ lệ nhất định để thay đổi thời gian lưu. • Các dung môi thường không hấp thu trong vùng UV để dễ dàng cho việc xác định. 20
  21. Ảnh hưởng của độ phân cực 00 %% MeOHMeOH 22 %% MeOHMeOH 5%5% // MeOHMeOH 1 : Dioctyl phthalate 2 : Dibutyl phthalate Pha đ ng : Hexane 3 : Diethyl phthalate ộ 21 4 : Dimethyl phthalate
  22. PhaPha đđảảoo :: ReversedReversed PhasePhase Cột : Mang tính không phân cực Pha động : Mang tính phân cực NormalNormal phasephase CCộộtt :: mangmang ttíínhnh phânphân ccựựcc PhaPha đđộộngng :: mangmang ttíínhnh khôngkhông phânphân ccựựcc 22
  23. Các lọai cột pha đảo •Cột C18 (ODS) •Cột C8 (octyl) NonNon polarpolar propertyproperty •Cột C4 (butyl) •Cột Phenyl -Si-C18H37 •Cột TMS Si 23
  24. Các liên kết xảy ra thế nào? LiênLiên kkếếtt kkỵỵ nnưướớcc Dung môi phân cực Không phân cực 24
  25. Tính kỵ nước •Nếu mẫu có nhiều –CH3CH2CH2 : dây Carbon TTíínhnh kkỵỵ – : nhóm thơm (Aromatic) nnưướớcc mmạạnhnh hhơơnn •Nếu mẫu có nhiều : – -COOH : nhóm Carboxyl TTíínhnh kkỵỵ nnưướớcc –-NH2 : Nhóm Amino – -OH : Nhóm Hydroxyl ssẽẽ yyếếuu hhơơnn 25
  26. Thời gian lưu và Tính kỵ nước OH 1 C18 (ODS) Yếu Mạnh OH 1 2 2 26
  27. Các dung môi sử dụng trong HPLC pha đảo •Dung dịch đệm + dung môi hữu cơ – Khi sử dụng dung dịch đệm, nồng độ đệm và pH là những thông số rất quan trọng. – Methanol (MeOH), acetonitrile (ACN) hay THF là các dung môi thường sử dụng nhất cho sắc ký pha đảo. • Việc tối ưu hóa tỉ lệ của dung dịch đệm và dung môi hữu cơ cũng rất quan trọng. • Với cùng một lọai vật liệu nhồi cột, tùy theo kích cỡ hạt nhồi cột, hãng chế tạo cột thành phần pha động cũng có thể phải thay đổi cho phù hợp 27
  28. Ảnh hưởng khi tăng độ phân cực 20%20% HH2OO 30%30% HH2OO 40%40% HH2OO 1 : p-Hydoxymethylbenzoate 2 : p-Hydoxyethylbenzoate Pha động : MeOH 3 : p-Hydoxypropylbenzoate 4 : p-Hydoxybutylbenzoate 28
  29. Ảnh hưởng của các pha tĩnh C8 Trung bình C18 (ODS) sample M nh ạ C4 sample Yếu sample 29
  30. Ảnh hưởng của các pha tĩnh ‹ Analytical Conditions ODSODS C8C8 TMSTMS ™ Column : Shim-pack CLC-ODS ™ Mobile phase : MeOH : H2O = 7 :3 ™ Flow rate : 1.0 mL/min ™ Temperature : 40 C ™ Injection volume : 10 uL ™ Detection : UV-254 nm ‹ Peaks 1. Methyl benzoate 2. Ethyl benzoate 3. n-Propyl benzoate 4. n- Butyl benzoate 30
  31. So sánh Normal phase và Reversed phase Thông số Normal Phase Reverse Phase Độ phân cực của cộtCaoThấp Độ phân cực của dung ThấpCao môi Thứ tự rửa giảiChất kém phân cực Chất phân cực ra ra trước trước Tăng độ phân cực dung Rửa giải nhanh Rửa giải chậm hơn môi hơn
  32. So sánh Normal phase và Reversed phase • Normal Phase – Tách tốt các đồng phân lập thể, ví dụ như Vitamin E etc –Thời gian lưu kém ổn định • Reversed Phase – Độ lặp lại thời gian lưu tốt . – Pha tĩnh không đồng đều nhau. 32
  33. Sắc ký cặp ion pha đảo Reversed Phase Ion-Pair Chromatography Chất ghép cặp ion 33
  34. Các chất ghép cặp • Ghép cặp với các Anion – Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA) • Ghép cặp với các Cation – Butanesulfonic acid sodium salt (C4) – Pentanesulfonic acid sodium salt (C5) – Hexanesulfonic acid sodium salt (C6) – Heptanesulfonic acid sodium salt (C7) – Octanesulfonic acid sodium salt (C8) – Decanesulfonic acid sodium salt (C10) 34
  35. Tách các Carboxylic Acid bằng ghép cặp ion Column: bonded C18 Mobile phase: H2O/MeOH 1:1 tetrabutyl ammonium hydroxide 35
  36. Tách các hợp chất Amino bằng cách ghép cặp ‹ Analytical Conditions ™ Column : Shim-pack CLC-ODS Peaks ™ Mobile phase : [A] : [B] = 9 : 1 1. Nicotinic acid 6. Thiamine ™ [A] 2. Nicotinamide 7. Caffeine 3. Pantothenate 8. Folic acid 100 mM phosphate buffer (pH=2.1) 4. Pyridoxine 9. Biotin 0.8 mM sodium octane sulfonate 5. Riboflavin 10. Riboflavin ™ [B] acetonitrile Phosphate ™ Flow rate : 1.5 mL/min ™ Temperature : 40 C ™ Injection volume : 10 uL 36
  37. Những lưu ý quan trọng trong sắc ký ghép cặp ion • Loại chất ghép cặp • Nồng độ chất ghép cặp • pH của pha động R-COOH RCOO- + H+ (pKa=4.5) + + R-NH2 + H R-NH3 (pKa=6.0) 37
  38. Ảnh hưởng của chất ghép cặp Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate Mobile Phase: H2O/MeOH 1:1,with 0.005M ion pairing reagent and 1% HOAc 1 Maleic Acid 2 Phenylephrine 3 Phenylpropanolamine 4 Naphazoline 5 Phenacetin 6 Pyrilamine 38
  39. Ảnh hưởng của nồng độ chất ghép cặp 39
  40. Rửa cột khi sử dụng TBA •Nếu sử dụng chất ghép cặp là amine tứ cấp hoặc TBA, cột phân tích cần phải rửa sau khi kết thúc phân tích. • Dung dịch rửa hiệu quả nhất thường là muối sodium perchlorate, bởi vì sodium perchlorate có ái lực rất mạnh đối với các hợp chất amine. • Dung dịch với thành phần như sau thường được sử dụng để rửa cột : Dung dịch 0.1% phosphoric acid có chứa 100 mM sodium perchlorate : methanol = 1 : 1 40
  41. Sắc ký ion : Ion Exchange R Lực ion N+ R Sample R + + + + + + - Sample + SO3 + + + + + + 41
  42. Ion Exchange •Sử dụng trong lĩnh vực sinh học (phân tích protein, peptide, amino acid) •Sắc ký Ion : phân tích các hợp chất ion Bao gồm 2 loại cột: –Cột trao đổi Cation - • Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3 ) - • Weak Cation Exchange (WCX) (R-COO ) –Cột trao đổi Anion + • Strong Anion Exchange (SAX) (R4N ) • Weak Anion Exchange (WAX) (DEAE – diethyl aminoethyl) 42
  43. Phân tích Protein sử dụng cộtWCX ‹Analytical Conditions ™Column : Shim-pack WCX-1 ™Mobile phase : [A] 20 mM phosphate buffer (pH=6.0) [B] A+0.25M sodium sulfate [A] - [B] 30 min linear gradient ™Flow rate : 1.0 mL/min ™Temperature : ambient ™Detector : UV-280 nm ™Injection volume : 10 uL ‹Peaks 1. albumin 2. myoglobin 3. α-chymotrypsinogen A 4. liponuclease A 5. lisozyme 43
  44. Những điểm quan trọng cần lưu ý trong sắc ký ion •pH của dung dịch đệm •Nồng độ của dung dịch đệm •Phương pháp rửa giải – Đẳng dòng : Isocratic – Gradient pH – Gradient lực ion 44
  45. Sắc ký gel SEC •• SSắắcc gelgel (s(sắắcc kýký sizesize phânphân ttửử)) (S(SEC)EC) ththưườờngng đưđượợcc bibiếếtt ddưướớii têntên :: ¾GPC (Gel Permeation chromatography) : sắc ký thẩm thấu gel, thường sử dụng trong lĩnh vực polymer. ¾GFC (Gel Filtration Chromatography) : sắc ký tinh lọc gel, thường sử dụng trong lĩnh vực sinh hóa. 45
  46. Nguyên lý của SEC •• KhôngKhông ssửử ddụụngng hihiệệuu ứứngng ttươươngng ttáác.c. •• TTááchch ddựựaa trêntrên ssựự khkháácc nhaunhau vvềề ththờờii giangian didi chuychuyểểnn ccủủaa chchấất.t. 46
  47. Thứ tự rửa giải SEC Column 47
  48. Mục đích củaGPC/ GFC •GPC ––SSửử ddụụngng đđểể xxáácc đđịịnhnh trtrọọngng llưượợngng phânphân ttửử ccủủaa polymer.polymer. •GFC ––TTááchch ccáácc proteinprotein 48
  49. Mối tương quan giữa trọng lượng phân tử (MW) và thời gian lưuRT Giới hạn loại trừ Giới hạn thẩm thấu Molecular Weight (LogMW) Time 49
  50. Lập đường chuẩn • Tiêm từng dung dịch chuẩn polymer có phân tử lượng khác nhau để biết được mối quan hệ giữa trọng lượng phân tử và thời gian lưu . No. time(min) mol. wet. 1 22.0 5500000 2 22.6 1800000 3 23.4 860000 4 25.0 400000 5 27.4 160000 6 31.0 50000 7 33.8 20000 8 38.4 4000 9 39.8 2000 10 42.8 600 11 46.8 80 50
  51. Tiêm mẫu thật • Để tính toán MW, cần phải có phần mềm GPC 51
  52. Tách Protein sử dụng cộtGFC ‹Analytical Conditions ™Column : Asahipak GFA-50 ™Mobile phase : 0.1 M sodium phosphate 0.1 M NaCl (pH=7.0) ™Flow rate : 0.5 mL/min ™Temperature : ambient ™Detector : UV-280 nm ™Injection volume : 10 uL ‹Peaks 1. glutamate dehydrogenase 2. lactate dehydrogenase 3. enolase 4. adenylate kinase 5. cytochrome C 52
  53. Sắc ký tách đồng phân quang học H H *Chiral Center Mirror C* *C RR COOHCOOH HOOCHOOC RR NH 2 NH2 (L) form (R) form Tính chất vật lý của các chất này giống hệt nhau, ngoại trừ sự quay cực. 53
  54. Tách các đồng phân quang học – cách 1 Cho 2 đồng phân tạo dẫn xuất với chất hữu triền để tạo chất lưỡng hình (L) + (R) (L)-(R) Chất đối hình Chất lưỡng hình (R) + (R) (R)-(R) Các sản phẩm tạo thành có thể tách bằng Sắc ký pha thuận hoặc pha đảo 54
  55. Tách các đồng phân quang học – cách 2 •Tách trực tiếp sử dụng cột Chiral -Pha tĩnh được gắn một đồng phân quang học đã biết. (L) (R) Tương tác mạnh (R) Tương tác yếu (R) 55
  56. Cách lựa chọn loại sắc ký Loại sắc ký Dung môi sử dụng Chất phân tích Reverse Phase H2O/Buffer, ACN, Các chất trung hòa hoặc MeOH không ion hóa, tan trong hỗn hợp nước/dung môi hữu cơ Ion-Pair RP Giống RP nhưng Các chất dạng ion hoặc có thể thêm chất tạo cặp ion ion hóa Normal Phase Hexane, CH2Cl2 Hỗn hợp các chất không tan trong hỗn hợp dung môi hữu cơ – nước. Ion Exchange H2O/Đệm Các ion vô cơ, protein, axit nucleic 56
  57. Cách lựa chọn loại sắc ký Lọai sắc ký Dung môi sử dụng Chất phân tích GPC/GFC H2O, THF, DMF, Các chất có phân tử lượng . lớn Chiral Hỗn hợp dung môi Các đồng phân quang học hữu cơ – nước 57
  58. Các cách rửa giải trong HPLC •Rửa giải với chế độ Isocratic – Thành phần pha động không thay đổi trong suốt quá trình rửa giải. •Rửa giải với chế độ Gradient –Pha động với thành phần thay đổi trong quá trình chạy. 58
  59. Các cách rửa giải trong HPLC Isocratic Gradient concentration concentration B B Time Time 59
  60. Isocratic MeOH / H2O = 6 / 4 ThThờờii giangian phânphân ttííchch ddààii KhKhảả nnăăngng ttááchch kkéémm MeOH / H2O = 8 / 2 ( cột C18 ) 60
  61. Gradient 95% 30% % MeOH 61
  62. Ưu và nhược điểm của chế độ Isocratic • Ưu: – Thành phần pha động chính xác. –Hệ thống phân tích đơn giản, rẻ tiền. – Đường nền ổn định do thành phần không đổi nên sử dụng tốt cho các đầu dò thành phần nền ảnh hưởng nhiều đến tín hiệu như độ dẫn (CDD), đo chỉ số khúc xạ (RI) – Thành phần pha động có thể trộn trước bằng tay hoặc trộn liên tục (nếu có bộ gradient) 62
  63. Ưu và nhược điểm của chế độ Isocratic •Nhược: –Khả năng tách kém, đặc biệt trong các mẫu phức tạp. –Việc khảo sát thay đổi thành phần pha động cho phù hợp thành phần mẫu không thể thực hiện nhanh. –Thời gian phân tích dài nếu muốn tách tốt. –Nếu trộn trước (khi không có bộ gradient áp suất thấp) thành phần pha động có thể thay đổi theo thời gian khi để lâu 63
  64. Ưu và nhược điểm của chế độ Gradient • Ưu: –Khả năng tách tốt. – Thành phần pha động khá chính xác, đặc biệt với hệ gradient áp suất cao. –Cóthể thay đổi rất nhiều thành phần trong pha động. Độ chính xác của thành phần theo thời gian gần như không đổi –Thời gian phân tích khá ngắn 64
  65. Ưu và nhược điểm của chế độ Gradient •Nhược: –Thiết bị đắt tiền hơn, đặc biệt là hệ gradient áp suất cao. – Độ chính xác của thành phần pha động kém hơn hệ isocratic. –Khi một thành phần có tỉ lệ nhỏ, thành phần pha động sẽ kém chính xác và không ổn định. 65