Giáo trình Vi sinh vật công nghiệp

248 trang vanle 2780

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Giáo trình Vi sinh vật công nghiệp", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

giao_trinh_vi_sinh_vat_cong_nghiep.pdf

Nội dung text: Giáo trình Vi sinh vật công nghiệp

1 MỤC LỤC Trang Chương1: MỞ ĐẦU 1. Đối tượng, nhiệm vụ và nội dung của vi sinh vật học công 4 nghiệp 2. Lược sử phát triển của vi sinh vật học công nghiệp 5 3. Vị trí và yêu cầu môn học 7 Câu hỏi ôn tập 3 Chương2: CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA VI SINH VẬT HỌC CÔNG NGHIỆP 1. Đặc điểm cấu tạo và hoạt động sống của vi sinh vật 8 2. Cơ sở hóa sinh của vi sinh vật học công nghiệp 13 3. Cơ sở di truyền vi sinh vật 21 Câu hỏi ôn tập 32 Chương 3: SỰ PHÂN LOẠI SẢN PHẨM 1. Phân loại theo tính chất thương mại 33 2. Phân loại theo sinh lý trao đổi chất 34 Câu hỏi ôn tập 47 Chương 4: CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ KỸ THUẬT LÊN MEN 1. Quá trình lên men 48 2. Vi sinh vật 52 3. Cơ chất dinh dưỡng 55 4. Nhu cầu về oxy và sự thông khí trong quá trình lên men 61 5. Khử trùng 62 6. Phương pháp nuôi 66 7. Nồi lên men 70 Câu hỏi ôn tập 74 Chương 5: SỰ THU NHẬN SINH KHỐI TẾ BÀO 1. Tiêu chuẩn về chủng 75 2. Mối quan hệ với sinh trưởng 76 3. Chất lượng sản phẩm 80 4. Giống khởi động 82 5. Protein đơn bào (SCP) 92 Câu hỏi ôn tập 98 Chương 6: CÁC SẢN PHẨM LÊN MEN 1. Lên men ethanol 99
2 2. Lên men lactic 114 3.Lên men 2,3 butadiol 120 4. Lên men butanol -aceton 125 Câu hỏi ôn tập 127 Chương 7: CÁC CHẤT TRAO ĐỔI BẬC MỘT 1. Nguyên lý của sự tổng hợp thừa 129 2. Các phương pháp tạo ra thể đột biến tổng hợp thừa 134 3. Aminoacid 138 4. Sản xuất các purin nucleotit 146 5. Vitamin 150 Câu hỏi ôn tập 151 Chương 8: CÁC CHẤT TRAO ĐỔI BẬC HAI 1. Các chất kháng sinh 153 2. Các độc tố nấm 172 Câu hỏi ôn tập 180 Chương 9: CÁC SẢN PHẨM CHUYỂN HÓA 1. Sự chuyển hóa các steroit 182 2. Sự tạo thành phenyl-axetylcacbinol 187 3. Sản phẩm từ vi khuẩn axetic 187 4. Sản xuất vitamin C 190 5.Sản xuất destran 198 Câu hỏi ôn tập 202 Chương 10 : XỬ LÝ NƯỚC THẢI BẰNG BIỆN PHÁP SINH HỌC 1. Vi sinh vật học của các nguồn nước uống 204 2. Xử lý nước thải 208 3.Lên men methane 210 Câu hỏi ôn tập 218 Chương11 : SỰ TUYỂN KHOÁNG NHỜ VI SINH VẬT 1. Các vi khuẩn ngâm chiết 220 2. Cơ chế tác động của vi khuẩn 221 3. Một số quá trình thủy luyện kim sinh học 223 4. Sự tích lũy kim loại nhờ vi khuẩn và tảo 233 Câu hỏi ôn tập 234 Chương 12: CÁC BÀI TẬP CƠ SỞ VÀ NÂNG CAO 1. Phần câu hỏi 236 2. Trả lời một số câu hỏi 245
3 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT ADP Adenosine diphosphate AMP Adenosine monophosphate APG Acid 3-phosphoglyceric A-1,3-DPG Acid 1,3 diphosphoglyceric ATP Adenosine triphosphate A-6PA Acid 6-penicillanic CoA Coenzyme A CKS Chất kháng sinh DNA Deoxiribonucleic acid R-1,5-DP Ribulose-1,5-diphosphate R-5-P Ribulose-5-diphosphate RNA Ribonucleic acid VSV Vi sinh vật F-6-P Fructose-6-phosphate FAD Flavin adenine dinucleotide G-6-P Glucose-6-phosphate GAP Glyceraldehyde phosphate KDPG 2-Keto-3-deoxi-6-phosphogluconate N Nitrogen NAD Nicotinamid adenine dinucleotide dạng oxi hóa NADH Nicotinamid adenine dinucleotide dạng khử NADP Nicotinamid adenine dinucleotide phosphat dạng oxi hóa NADPH Nicotinamid adenine dinucleotide phosphat dạng khử PP Pentose phosphate X-5-P Xylulose-5-phosphate Người biên soạn Biên soạn các chương 1. PGS.TS. Kiều Hữu Ảnh 7, 8, 9, 10 2. TS. Biền Văn Minh (Chủ biên) 1, 2, 3, 11 và 12 3. TS. Phạm Ngọc Lan 4, 5 4. ThS. Đỗ Bích Thủy 6
4 Chương 1 Mở đầu 1. Đối tượng, nhiệm vụ, nội dung của vi sinh vật học công nghiệp Vi sinh vật học công nghiệp (Industrial Microbiology) là một ngành của Vi sinh học, trong đó vi sinh vật (VSV) được xem xét để sử dụng trong công nghiệp và những lĩnh vực khác nhau của kỹ thuật. Vi sinh vật học công nghiệp (VSVHCN) giải quyết hai vấn đề chính trái ngược nhau: •Một mặt, nó dẫn tới làm rõ hoàn toàn những tính chất sinh học và sinh hoá của những cơ thể sống là nguyên nhân cơ bản và trực tiếp của sự chuyển hoá hoá học, những chất có ở cơ chất này hay cơ chất kia. Trong trường hợp này, VSVHCN sử dụng những VSV để thu những sản phẩm quan trọng và có giá trị thực tế bằng con đường lên men. Phương pháp sinh hoá để thu nhiều sản phẩm là phương pháp duy nhất có lợi về kinh tế. •Mặt khác, chúng ta cũng biết sự lên men do VSV gây ra không luôn luôn diễn ra theo một hướng như mong muốn. Sự phá huỷ một quá trình lên men thường xảy ra do sự hoạt động của những VSV lạ. Trong trường hợp này, điều rất quan trọng là không những phải biết những VSV gây ra quá trình cần thiết mà còn phải biết cả những VSV có hại gây tổn thất cho sản xuất. Nhà VSVHCN có kinh nghiệm phải khám phá ra chúng, làm rõ tính chất có hại do chúng gây ra và tìm ra những phương pháp đấu tranh với chúng. 1.1. Mục tiêu môn học Sau khi học xong học phần này, sinh viên cần hiểu được các ứng dụng công nghiệp quan trọng của vi sinh vật, sự khác biệt giữa công nghệ sinh học vi sinh vật hiện đại và vi sinh vật học truyền thống, phân biệt được các nhóm sản phẩm và quá trình công nghiệp, vai trò của vi sinh vật trong tuyển khoáng và trong xử lý nước thải bằng con đường sinh học. 1.2. Mô tả môn học VSVHCN là một bộ phận quan trọng trong công nghệ sinh học, là môn khoa học nghiên cứu những hoạt động sống của vi sinh vật để áp dụng nó một cách tốt nhất vào các quy trình sản xuất ở quy mô công nghiệp và các lĩnh vực khác nhau của kĩ thuật. VSVHCN là một ngành khoa học mới phát triển, nhưng do ý nghĩa quan trọng của nó về mặt lý thuyết cũng như thực tiễn nên đã phát triển hết sức nhanh chóng.
5 2. Lược sử phát triển của vi sinh vật học công nghiệp Sự phát triển của VSVHCN được chia thành 3 giai đoạn chính: Giai đoạn đầu, tính đến nửa sau thế kỷ 19. Việc ứng dụng tiềm năng của VSV đã có từ buổi đầu của nền văn minh nhân loại như sản xuất rượu vang, bia, dấm. Ở Việt Nam nghề nấu rượu, làm dấm, làm tương cũng có từ rất xa xưa. Tuy một số quá trình được thực hiện ở quy mô rộng rãi, nhưng những sự thành công đó còn phụ thuộc vào sự ngẫu nhiên hay kinh nghiệm của những người thợ giỏi truyền cho các thế hệ sau. Vai trò của VSV trong sự chuyển hoá các chất hữu cơ được con người biết đến khoảng hơn 100 năm trước đây. Những công trình nghiên cứu VSVHCN đã bắt đầu từ Pasteur (1878). Như ta thấy Pasteur đã nghiên cứu nhiều quá trình lên men áp dụng trong sản xuất và học thuyết về mầm bệnh. Pasteur cũng đã đề ra phương pháp thanh trùng Pasteur để tiệt trùng rượu nho, bia mà không làm hỏng phẩm chất. Phương pháp này hiện nay có ứng dụng rất lớn. Bởi vậy Pasteur được coi là người sáng lập ra VSVHCN. Việc nghiên cứu và sử dụng các chủng nấm men thuần khiết trong sản xuất bia (Hansen, 1886) có thể xem là bước mở đầu cho công nghiệp lên men dựa trên cơ sở khoa học. Năm 1898 Buchner cũng đã nghiên cứu tác dụng lên men của nhiều nấm men, đã vạch ra mối liên hệ giữa nấm men và hoá học về men, và ứng dụng hoạt động của nấm men vào sản xuất tiếp giống ngoài. Ông đã nghiền nấm men lấy ra dung dịch có men zymase và cho lên men rượu. Như vậy giai đoạn thứ nhất là giai đoạn sử dụng các hoạt tính của VSV- giai đoạn này được đánh dấu bằng việc đặt cơ sở khoa học cho quá trình sản xuất đồ uống chứa rượu. 1 2 3 Hình 1.1: Các nhà vi sinh vật học công nghiệp tiền bối 1. Louis Pasteur (1822-1895); 2. Gerhard H. A. Hansen (1841-1912); 3. Eduard Buchner (1860- 1917)
6 Giai đoạn thứ hai của VSVHCN được tính đến giữa thế kỷ XX, bao gồm sự xuất hiện của các chất kháng sinh, những tiến bộ về di truyền học trong việc chọn lọc các thể đột biến vi khuẩn, sự nghiên cứu các điều kiện lên men tối ưu, kỹ thuật học lên men, việc tách và tinh chế sản phẩm Giai đoạn thứ ba được đặc trưng bởi sự phát triển của một nền công nghiệp VSV độc lập. Người ta đã điều khiển được các quá trình siêu tổng hợp ở VSV và tạo ra được hàng loạt các chủng đột biến ở VSV. Nhờ các thành tựu này mà người ta đã sản xuất ở quy mô lớn mì chính, lysine và nhiều loại aminoacid khác. 1 2 3 4 Hình 1.2: 1. Alexander Fleming(1881-1955); 2. Francis Crick (1916-2004); 3. James Dewey Watson (1928-); 4. Joshua Lederberg(1925-) Giai đoạn thứ tư (giai đoạn hiện nay) được đánh dấu bằng sự phát hiện ra các enzyme cắt giới hạn restrictase và các plasmid với sự gắn các gene lạ mang các thông tin tổng hợp các protein đặc biệt vào một cơ thể đã trở thành một phương pháp thông dụng và sự kiểm soát ngày càng tốt hơn sự biểu hiện của các gene này. 1 2 3 4 Hình 1.3: 1.Daniel Nathans (1928-1999); 2.Werner Arber(1929-); 3.Hamilton Othanel Smith (1931-); 4.Herbert Boyer (1936-).
7 3. Vị trí và yêu cầu môn học Môn VSVCN nhằm cung cấp cho người học những kiến thức và kỹ năng ứng dụng VSV trong một số quy trình công nghệ phục vụ khoa học và đời sống con người, ngoài ra còn giúp cho sinh viên phương pháp nắm bắt được một số quy trình kỹ thuật và giải thích được quá trình sản xuất trên cơ sở khoa học, tiến tới có thể chủ động hướng dẫn gíup đỡ một số cơ sở sản xuất trong những trường hợp cần thiết, đồng thời cung cấp thêm những kiến thức sâu, rộng về VSV học ứng dụng, góp phần đẩy mạnh sản xuất, tăng thêm của cải vật chất, cải thiện đời sống cho nhân loại. Câu hỏi ôn tập 1. Đối tượng nghiên cứu của vi sinh vật học công nghiệp là gì ? 2. Các giai đoạn phát triển của vi sinh vật học công nghiệp ? 3. Giai đoạn phát triển đầu tiên của vi sinh vật học công nghiệp được đánh dấu bằng công trình của Pasteur (1878) chứng minh vi sinh vật là tác nhân của sự lên men, và sau đó là các công trình của: (1886) dùng các chủng nấm men thuần khiết trong sản xuất bia, và (1898) phát hiện ra dịch chiết nấm men có khả năng gây ra quá trình lên men rượu ( chứng minh lên men thực chất là một quá trình enzyme). 4. Tại sao có người nói vi sinh vật vừa là người bạn thân thiết, vừa là kẻ thù nguy hiểm của con người.
8 Chương 2 Cơ sở khoa học của vi sinh vật học công nghiệp I. Đặc điểm cấu tạo và hoạt động sống của vi sinh vật Vi sinh vật (Microogranisms) là tên gọi chung để chỉ tất cả các loại sinh vật nhỏ bé, chỉ có thể nhìn rõ dưới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Vi sinh vật bao gồm nhiều nhóm khác nhau: Các virus (nhóm chưa có cấu tạo tế bào), các vi khuẩn và vi khuẩn lam (nhóm sinh vật nhân sơ), các vi nấm (nhóm sinh vật nhân chuẩn) và cả một số động vật nguyên sinh cũng như tảo đơn bào cũng thuộc nhóm này. Giữa các nhóm trên không có mối liên hệ chặt chẽ về mặt hình thái hay phân loại, nhưng người ta gộp chúng lại vì chúng cùng có một số phương pháp nuôi dưỡng, nghiên cứu và hoạt động sinh lý gần giống nhau và đều có các đặc điểm chung. 1. Đặc điểm chung của các vi sinh vật 1.1. Kích thước nhỏ bé Hình 2.1: Các phương pháp quan sát thế giới sống (từ nguyên tử đến tế bào) Các Vi sinh vật có kích thước rất bé, đo bằng đơn vị nanomét (1nm = 10-9 m) như các virus hoặc micromet (1μm = 10-6 m) như các vi khuẩn, vi nấm. Chẳng hạn:
9 - Các thể thực khuẩn (hay phage) T2, T4, T6 có kích thước biến thiên trong khoảng: (65 - 95) x (25 - 100) nm. - Các vi khuẩn có kích thước thay đổi trong khoảng (0,2 - 2) x (2,0 - 8,0) μm; trong đó vi khuẩn Escherichia coli rất nhỏ: 0,5 x 2,0μm. - Các tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có đường kính 5 - 10μm. Kích thước càng bé thì diện tích bề mặt của vi sinh vật trong 1 đơn vị thể tích càng lớn. Chẳng hạn đường kính của 1 cầu khuẩn (Coccus) chỉ có 1mm, nhưng nếu xếp đầy chúng thành 1 khối lập nhưng có thể lích là 1cm3 thì chúng có diện tích bề mặt rộng tới 6 m2 ! 1.2. Hấp thu nhiều, chuyển hóa nhanh Tuy vi sinh vật có kích thước rất nhỏ bé nhưng chúng lại có năng lực hấp thu và chuyển hoá vượt xa các sinh vật khác. Chẳng hạn 1 vi khuẩn lắctic (Lactobacillus) trong 1 giờ có thể phân giải được một lượng đường lactose lớn hơn 100-10 000 lần so với khối lượng của chúng, tốc độ tổng hợp protein của nấm men cao gấp 1000 lần so với đậu tương và gấp 100 000 lần so với trâu bò. Năng lực chuyển hóa sinh hóa mạnh mẽ của VSV dẫn đến các tác dụng vô cùng to lớn của chúng trong thiên nhiên cũng như trong hoạt động sống của con người. 1.3. Khả năng sinh sản nhanh Chẳng hạn, 1 trực khuẩn đại tràng (Escherichia coli ) trong các điều kiện thích hợp chỉ sau 12-20 phút lại phân cắt một lần. Nếu lấy thời gian thế hệ là 20 phút thì mỗi giờ phân cắt 3 lần, sau 24 giờ phân cắt 72 lần và tạo ra (4 722 366. 1017) tế bào- tương đương với 1 khối lượng 4722 tấn. Tất nhiên trong tự nhiên không có được các điều kiện tối ưu như vậy ( vì thiếu thức ăn, thiếu oxy, dư thừa các sản phẩm trao đổi chất có hại ). Trong nồi lên men với các điều kiện nuôi cấy thích hợp từ 1 tế bào có thể tạo ra sau 24 giờ khoảng 100 000 000- 1 000 000 000 tế bào. Thời gian thế hệ của nấm men dài hơn, ví dụ với men rượu (Saccharomyces cerevisiae) là 120 phút. Với nhiều vi sinh vật khác còn dài hơn nữa, ví dụ với tảo Tiểu cầu ( Chlorella ) là 7 giờ, với vi khuẩn lam Nostoc là 23 giờ Có thể nói không có sinh vật nào có tốc độ sinh sôi nảy nở nhanh như vi sinh vật. Đây là đặc điểm quan trọng được con người lợi dụng để sản xuất nhiều sản phẩm hữu ích như rượu, bia, tương chao, mỳ chính, các chất kháng sinh
10 Nấm men Vi kuẩn Nấm sợi Vi tảo Saccharomyces Escherichia coli Alternaria cerevisiae Chlorella Hình 2.3: Một số vi sinh vật được sử dụng trong VSVHCN 1.4. Khả năng thích ứng rất cao và phát sinh biến dị mạnh Trong quá trình tiến hoá lâu dài vi sinh vật đã tạo cho mình những cơ chế điều hoà trao đổi chất để thích ứng được với những điều kiện sống rất khác nhau, kể cả những điều kiện hết sức bất lợi mà các sinh vật khác tgường không thể tồn tại được. Có vi sinh vật sống được ở môi trường nóng đến 1300C, lạnh đến 0-50C, mặn đến nồng độ 32% muối ăn, ngọt đến nồng độ mật ong, pH thấp đến 0,5 hoặc cao đến 10,7, áp suất cao đến trên 1103 at. hay có độ phóng xạ cao đến 750 000 rad. Nhiều vi sinh vật có thể phát triển tốt trong điều kiện tuyệt đối kỵ khí, có loài nấm sợi có thể phát triển dày đặc trong bể ngâm tử thi với nộng độ Formol rất cao Vi sinh vật đa số là đơn bào, đơn bội, sinh sản nhanh, số lượng nhiều, tiếp xúc trực tiếp với môi trường sống do đó rất dễ dàng phát sinh biến dị. Tần số biến dị thường ở mức 10-5-10-10. Chỉ sau một thời gian ngắn đã có thể tạo ra một số lượng rất lớn các cá thể biến dị ở các hế hệ sau. Những biến dị có ích sẽ đưa lại hiệu quả rất lớn trong sản xuất. Nếu như khi mới phát hiện ra penicillin hoạt tính chỉ đạt 20 đơn vị/ml dịch lên men (1943) thì nay đã có thể đạt trên 100 000 đơn vị/ml. Khi mới phát hiện ra acid glutamic chỉ đạt 1-2g/l thì nay đã đạt đến 150g/ml dịch lên men (VEDAN-Việt Nam). 1.5. Phân bố rộng, chủng loại nhiều Vi sinh vật có mặt ở khắp mọi nơi trên Trái đất, trong không khí, trong đất, trên núi cao, dưới biển sâu, trên cơ thể, người, động vật, thực vật, trong thực phẩm, trên mọi đồ vật Vi sinh vật tham gia tích cực vào việc thực hiện các vòng tuần hoàn sinh-địa-hoá học (biogeochemical cycles) như vòng tuần hoàn C, vòng tuần hoàn N, vòng tuần hoàn P, vòng tuần hoàn S, vòng tuần hoàn Fe
11 Trong nước vi sinh vật có nhiều ở vùng duyên hải (littoral zone), vùng nước nông (limnetic zone) và ngay cả ở vùng nước sâu (profundal zone), vùng đáy ao hồ (benthic zone) Trong không khí thì càng lên cao số lượng vi sinh vật càng ít. Số lượng vi sinh vật trong không khí ở các khu dân cư đông đúc cao hơn rất nhiều so với không khí trên mặt biển và nhất là trong không khí ở Bắc cực, Nam cực Hầu như không có hợp chất carbon nào (trừ kim cương, đá graphít ) mà không là thức ăn của những nhóm vi sinh vật nào đó (kể cả dầu mỏ, khí thiên nhiên, formol. dioxin ). Vi sinh vật có rất phong phú các kiểu dinh dưỡng khác nhau : quang tự dưỡng (photoautotrophy), quang dị dưỡng (photoheterotrophy), hoá tự dưỡng (chemoautotrophy), hoá dị dưỡng (chemoheterotrophy), tự dưỡng chất sinh trưởng (auxoautotroph), dị dưỡng chất sinh trưởng (auxoheterotroph) 1.6. Là sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất Trái đất hình thành cách đây 4,6 tỷ năm nhưng cho đến nay mới chỉ tìm thấy dấu vết của sự sống từ cách đây khoảng 3,5 tỷ năm. Đó là các vi sinh vật hoá thạch còn để lại vết tích trong các tầng đá cổ. Vi sinh vật hoá thạch cổ xưa nhất đã được phát hiện là những dạng rất giống với Vi khuẩn lam ngày nay. Chúng được J.William Schopf tìm thấy tại các tầng đá cổ ở miền Tây Australia. Chúng có dạng đa bào đơn giản, nối thành sợi dài đến vài chục mm với đường kính khoảng 1-2 mm và có thành tế bào khá dày. Trước đó các nhà khoa học cũng đã tìm thấy vết tích của chi Gloeodiniopsis có niên đại cách đây 1,5 tỷ năm và vết tích của chi Palaeolyngbya có niên đại cách đây 950 triệu năm. Vết tích vi khuẩn lam Vết tích Vết tích Cyanobacteria Gloeodiniopsis Palaeolyngbya cách đây 3,5 tỷ năm cách đây 1,5 tỷ năm cách đây 950 triệu năm Hình 1.2: Các vi sinh vật hoá thạch cổ xưa (còn để lại vết tích trong các tầng đá cổ ở miền Tây Australia)
12 2. Những điểm khác biệt giữa các tế bào sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn Các sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn có một số đặc điểm giống nhau: đều có tế bào là đơn vị cấu tạo, chức năng là đơn vị di truyền; vật chất di truyền trong các tế bào là DNA xoắn kép cùng các sản phẩm của nó là RNA, protein Tuy nhiên giữa chúng có nhiều nét sai khác rất rõ. Thậm chí ngay cả các tế bào nhân chuẩn nhỏ nhất cũng khác biệt một cách căn bản so với các tế bào nhân sơ trong cấu tạo, cách tổ chức thông tin di truyền cũng như trong các kiểu tổng hợp RNA và protein của chúng (bảng 2.1). Bảng 2.1: Những sai khác giữa các tế bào sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn Đặc điểm Sinh vật nhân sơ Sinh vật nhân chuẩn 1. Tổ chức di truyền - Màng nhân Không có Có - Số nhiễm sắc thể khác nhau 1 > 1 - Các nhiễm sắc thể chứa Không có Có histon - Hạch nhân Không có Có - Trao đổi di truyền Một chiều, qua plasmid Bằng sự kết hợp giao tử 2. Các cấu trúc của tế bào - Lưới nội chất Không có Có - Bộ máy Golgi Không có Có - Các lysosome Không có Có - Các ty thể Không có Có - Các lạp thể Không có Có ở thực vật - Kích thước ribosome 70 S 80 S - Sợi thoi vô sắc Không có Có -Vách tế bào chứa Có, ngoại trừ Không có peptidoglycan Mycoplasma và vi khuẩn cổ 3. Một số đặc tính chức năng - Thực bào Không có Đôi khi có - Ẩm bào (uống bào) Không có Đôi khi có - Vị trí vận chuyển điện tử Màng tế bào Màng bào quan - Dòng tế bào chất Không có Có (Nguồn: Stanier et al, 1976; dẫn theo Watson et al, 1987. p. 97)
13 [A] [B] Hình 2.2: Cấu trúc tế bào vi khuẩn [A] ; tế bào động vật [B] II. Cơ sở hóa sinh của vi sinh vật học công nghiệp 1. Đường phân. Đường phân là quá trình phân huỷ phân tử glucose (C6H12O6) tạo thành acid pyruvic và NADH+ H+. Điểm đặc biệt của đường phân là không phải phân tử glucose tự do bị phân huỷ mà phân tử đường glucose đã được hoạt hoá bởi việc gắn gốc P vào tạo dạng đường phosphate. Quá trình đường phân gồm 2 giai đoạn với nhiều phản ứng phức tạp: - Phân cắt phân tử glucose thành 2 phân tử triose là AlPG và PDA.
14 - Biến đổi 2 phân tử triose thành 2 phân tử acid pyruvic. Quá trình đường phân có thể tóm tắt theo sơ đồ sau: Hình 2.3. Sơ đồ đường phân Kết quả của đường phân có thể tóm tắt là: + + C6H12O6 + 2NAD + 2ADP + 2H3PO4 → 2CH3COCOOH + 2NADH+H + 2ATP Trong hô hấp hiếu khí, acid pyruvic tiếp tục phân huỷ qua chu trình Krebs, còn 2NADH+H thực hiện chuỗi hô hấp để tạo H2O. + + 2NADH+H + O2 → 2NAD + 2H2O Phản ứng này kèm theo việc tổng hợp được 6ATP qua quá trình phosphoryl hoá.
15 Vậy kết quả của đường phân trong hô hấp hiếu khí là: C6H12O6 + O2 → 2CH3COCOOH + 2H2O Đồng thời tạo ra được 8 ATP + Trong hô hấp kỵ khí, 2NADH+H sẽ được dùng khử CH3COCOOH (trong lên men lactic) hay khử CH3CHO (trong lên men rượu) nên không thực hiện chuỗi hô hấp. Phản ứng lên men lactic như sau: + + 2CH3COCOOH + 2NADH+H → 2CH3CHOHCOOH + 2NAD Vậy kết quả của đường phân trong hô hấp kỵ khí là C6H12O6 → 2CH3CHOHCOOH Quá trình này chỉ tạo ra được 2ATP 2. Chu trình Krebs. Sản phẩm của đường phân là acid pyruvic sẽ được decarboxyl hóa tạo acetyl-CoA và một phân tử CO2. Acetyl-CoA tiếp tục phân huỷ qua chu trình Krebs trong hô hấp kỵ khí. Quá trình phân huỷ acid pyruvic qua chu trình Krebs được thực hiện tại ty thể do nhiều hệ enzyme xúc tác. Chu trình xảy ra qua 2 giai đoạn: - Phân huỷ acid pyruvic. Trong quá trình này sẽ tạo ra nhiều + coenzyme khử (NADH+H , FADH2). - Thực hiện chuỗi hô hấp qua các coenzyme khử được tạo ra do phân huỷ acid pyruvic. Chu trình Krebs được tóm tắt qua sơ đồ sau: (a) (b) Hình 2.4: a) Krebs, Sir Hans Adolf (1900-1981); b) Sơ đồ minh hoạ chu trình Krebs
16 Từ phân tử acid pyruvic qua chu trình tạo ra + CH3COCOOH + 3H2O → 3CO2 + 5H2 (4NADPH +H + 1FADH2) +, Các coenzyme (NADH + H FADH2) thực hiện chuỗi hô hấp: 5H2 + 5/2O2 → 5H2O Vậy kết quả chu trình sẽ là: CH3COCOOH + 5/2O2 → 3CO2 + 2H2O Từ 1 phân tử glucose qua đường phân tạo ra 2 phân tử acid pyruvic với kết quả đã phân tích ở trên. Từ 2 acid pyruvic qua chu trình Krebs tạo ra: 2CH3COCOOH + 5O2 → 6CO2 + 4H2O Kết hợp với giai đoạn đường phân, ta được kết quả tổng quát của quá trình phân huỷ glucose qua hô hấp hiếu khí là: C6H12O6 + 6CO2 → 6CO2 + 6H2O Trong quá trình phân huỷ acid pyruvic qua chu trình Krebs sẽ tạo được + 4 NADH+H và 1 FADH2. Các coenzyme khử này qua chuỗi hô hấp sẽ tổng hợp ATP với kết quả: -4NADFH+H+ tạo ra 12 ATP -1FADH2 tạo ra 2ATP -Trong chu trình tạo ra 1ATP. Như vậy, phân huỷ 1 phân tử acid pyruvic qua chu trình Krebs tạo ra 15ATP. Nếu phân huỷ 2 acid pyruvic sẽ tạo ra 30ATP, kết hợp với giai đoạn đường phân thì phân huỷ 1 phân tử glucose tạo ra được 38ATP. 3. Chuỗi hô hấp và phosphoryl hoá 3.1. Chuỗi hô hấp Trong tế bào sự trao đổi năng lượng luôn gắn với phản ứng oxi hoá- khử. Trong hệ thống oxi hoá khử hai phản ứng oxi hoá và khử luôn đi kèm nhau. AH2 + B → A + BH2 Trong tế bào để phản ứng trên xảy ra thường cần hệ thống các chất truyền điện tử và H+ trung gian, đó là hệ enzyme oxi hoá-khử. Các enzyme này cùng với cơ chất hoạt động trong một chuỗi phản ứng chặt chẽ để chuyển H2 từ cơ chất đến O2 tạo nên chuỗi hô hấp. Khởi đầu của chuỗi là cơ chất dạng khử AH2. AH2 làm nhiệm vụ là chất cho H2. H2 tách ra từ cơ chất được hệ thống các coenzyme của hệ enzymee oxi hoá-khử vận chuyển đến khâu cuối cùng của chuỗi là O2 để khử O2 tạo phân tử H2O.
17 Trong chuỗi hô hấp điện tử được chuyển từ cơ chất là chất có năng lượng cao nhất đến oxi có năng lượng thấp nhất, thế oxi hoá cao nhất (+0,81V). Giữa hai thành phần trên là các coenzyme có thể oxi hoá-khử trung gian, thế khử giảm dần từ cơ chất đến O2. Bởi vậy chuỗi hô hấp là quá trình giải phóng năng lượng. Năng lượng thải ra trong chuỗi hô hấp được xác định theo phương trình: ΔG’ = -nF. ΔEo (kCal/mol) Trong đó: ΔG’ : mức biến đổi năng lượng của phản ứng oxi hoá-khử n: số điện tử trao đổi trong phản ứng. F: số Faraday (23,06) (hằng số Faraday). ΔEo: chênh lệch thế oxi hoá-khử của 2 chất tham gia phản ứng. Với phương trình trên có thể xác định được năng lượng thải ra của từng phản ứng trong chuỗi trên cơ sở thế oxi hoá-khử của các hệ đã xác định. 3.2. Phosphoryl hoá Quá trình tổng hợp ATP trong tế bào là quá trình phosphoryl hoá: ADP + H3PO4 → ATP + H2O Phản ứng này đòi hỏi năng lượng tương đương năng lượng của liên kết cao năng thứ nhất (7,3 Kcalo/mol - trong điều kiện chuẩn). Tuỳ nguồn năng lượng cung cấp mà có các hình thức phosphoryl hoá quang hóa (xảy ra trong quang hợp) và phosphoryl hóa oxi hóa (xảy ra trong hô hấp). Trong hô hấp có hai hình thức tổng hợp ATP - Phosphoryl hoá mức cơ chất: là quá trình tổng hợp ATP nhờ năng lượng thải ra của phản ứng oxi hoá trực tiếp cơ chất. - Phosphoryl hoá qua chuỗi hô hấp: là quá trình tổng hợp ATP nhờ năng lượng thải ra của các phản ứng trong chuỗi hô hấp. Chuỗi hô hấp xảy ra nhiều phản ứng, phản ứng nào thoả mãn các điều kiện của quá trình phosphoryl hoá thì quá trình tổng hợp ATP xảy ra ở đó. Trong chuỗi hô hấp có 3 vị trí đủ điều kiện để tổng hợp ATP. Như vậy, cứ vận chuyển được H2 từ cơ chất đến O2 sẽ tạo ra được 3 ATP cho tế bào.
18 4. Sự trao đổi protein, lipid, acid nucleic trong tế bào vi sinh vật 4.1. Sự trao đổi protein 4.1.1. Sự tổng hợp protein Tổng hợp protein là quá trình rất phức tạp nhưng có vai trò rất quan trọng trong hoạt động sống của VSV. Con đường tổng hợp protein chủ yếu là tổng hợp theo cơ chế khuôn, tức là quá trình giải mã. Phân tử protein được mã hoá trong gene theo mã bộ ba: cứ 3 nucleotide trên mạch khuôn của gene mã hoá một amino acids trên cấu trúc bậc I của protein. Bộ ba mã gốc trên gene được phiên mã sang bộ mã hoá trên mRNA thông qua quá trình phiên mã - tổng hợp mRNA. Từ mRNA là khuôn chuỗi polypeptid-protein bậc I sẽ được tổng hợp tại ribosome. Quá trình tổng hợp protein xảy ra qua nhiều giai đoạn: - Hoạt hoá amino acids nhờ ATP và gắn amino acids vào tRNA; - Tổng hợp chuỗi polypeptid tại ribosome; - Hoàn thiện phân tử protein. 4.1.2. Phân huỷ protein Protein trong tế bào VSV luôn luôn được đổi mới. Bởi vậy quá trình phân huỷ protein xảy ra thường xuyên cùng với quá trình tổng hợp. Sự phân huỷ protein xảy ra qua 2 giai đoạn - Thủy phân protein thành các amino acids nhờ enzyme thủy phân protease. - Các amino acids không cần thiết sẽ bị phân huỷ tiếp hay chuyển hoá thành các amino acids cần thiết khác. Sự phân huỷ amino acids xảy ra bằng nhiều con đường: khử amin, khử cacboxyl, chuyển vị amin. 4.2. Trao đổi acid nucleic.
19 4.2.1. Tổng hợp acid nucleic Tổng hợp acid nucleic là quá trình quan trọng trong cơ chế truyền đạt thông tin di truyền. Tổng hợp acid nucleic gồm tổng hợp DNA và quá trình tổng hợp RNA. * Sao chép DNA: Từ 1 phân tử DNA gốc qua sao chép tạo ra 2 phân tử DNA mới hoàn toàn giống nhau và giống DNA gốc. Quá trình sao chép xảy ra bằng nhiều cơ chế trong đó cơ chế bản bảo thủ là phổ biến và quan trọng nhất. Trên DNA khuôn, hai chuỗi có chiều ngược nhau do vậy quá trình sao chép xảy ra trên hai chuỗi khác nhau. - Trên chuỗi có chiều 3’-5’ của DNA gốc: sau khi enzymee helicase tháo xoắn, tách 2 mạch của phân tử DNA gốc, trên mạch 3’-5’ tiến hành tổng hợp một đoạn RNA mồi ngắn nhờ primase xúc tác. Từ RNA mồi các nucleotide mới tiếp tục đến kéo dài chuỗi theo chiều 5’-3’ nhờ DNA-polymerase III xúc tác. Quá trình nối các nucleotide tự do vào mạch mới theo nguyên tắc bổ sung với mạch gốc. Sau khi tổng hợp bổ sung xong cả mạch, đoạn RNA mồi bị cắt bỏ và thay vào đó bằng mạch DNA tương ứng nhờ DNA-polymerase I xúc tác. - Trên mạch có chiều 5’-3’ của DNA gốc: do trên mạch này chiều tổng hợp mạch mới ngược chiều tháo xoắn nên diễn ra phức tạp hơn. Quá trình tổng hợp mạch bổ sung xảy ra theo từng đoạn ngắn. Cứ mở xoắn một đoạn vài trăm nucleotide quá trình tổng hợp xảy ra ngược chiều tháo xoắn theo tuần tự tổng hợp đoạn RNA mồi rồi tổng hợp tiếp đoạn DNA. Tổng hợp xong đoạn này, tháo xoắn tiếp và lại tổng hợp như đoạn trước đó. Cứ như vậy trên mạch này DNA được tổng hợp theo từng đoạn ngắn-đoạn Okazaki. Sau đó các RNA mồi được cắt bỏ, thay vào các đoạn DNA tương ứng, nhờ ligase nối các đoạn Okazaki lại. * Phiên mã: xảy ra qua 2 giai đoạn. Giai đoạn đầu phiên mã từ gene thành pro RNA. Sau đó từ pro-RNA sẽ biến đổi thành mRNA tương ứng. RNA tổng hợp trên DNA khuôn hay trên RNA khuôn (với virus chứa RNA). DNA khuôn nhờ RNA polymerase tháo xoắn cục bộ tạo nên bóng phiên mã. Bóng phiên mã có chiều dài 30 cặp nucleotide. Nhờ yếu tố sigma (δ) của RNA-polymerase nhận biết điểm mở đầu và chuỗi DNA dùng làm khuôn. Nhờ lõi enzyme polymerase tiến hành tổng hợp chuỗi RNA bổ sung với chuỗi khuôn trên DNA. Quá trình tiếp diễn cho đến khi yếu tố rho (ρ) nhận biết điểm kết thúc trên DNA và kết thúc quá trình
20 tổng hợp chuỗi RNA bổ sung. RNA tách khỏi DNA khuôn tạo ra pro- RNA. Từ proRNA qua nhiều biến đổi phức tạp để tạo mRNA trưởng thành. - Nối thêm mũ; - Nối thêm đuôi; - Nhờ enzyme cắt ghép tiến hành cắt bỏ các đoạn không mã hoá intron (I) và nối các đoạn mã hoá exon (E) lại với nhau sẽ tạo ra mRNA. Kết quả là từ 1 đoạn DNA (gene) tạo nên một phân tử mRNA. Thành phần trật tự các nucleotide trên các đoạn exon của DNA qui định thành phần, trật tự các ribonucleotide trên mRNA. 4.2.2. Phân huỷ acid nucleic Trong tế bào acid nucleic luôn biến đổi, nhất là các phân tử RNA. Đời sống các phân tử mRNA, tRNA rất ngắn. Chúng thường xuyên bị phân huỷ để thay thế các loại mới. Sự phân huỷ acid nucleic xảy ra qua 3 giai đoạn: - Thủy phân acid nucleic thành nucleotide nhờ các nuclease tương ứng xúc tác; - Thuỷ phân nucleotidee thành các đơn phân (base-nitrogene, đường pentose và H3PO4) nhờ enzyme thuỷ phân nucleotidease xúc tác; - Biến đổi tiếp base-nitrogene, đường pentose thành các sản phẩm khác nhau. 4.3. Trao đổi lipid 4.3.1. Tổng hợp lipid Trong tế bào lipid phổ biến nhất là chất béo. Chất béo được tổng hợp từ glycerin và các acid béo qua các bứơc: - Glycerin + ATP → glycero-P + ADP - Glycero-P + acid béo 1 → monoglyceric. - Monoglyceric + acid béo 2 → diglyceric. - Diglyceric + acid béo 3 → Triglyceric + H3PO4. 4.3.2. Phân huỷ lipid. Quá trình phân huỷ chất béo xảy ra qua 2 giai đoạn - Thuỷ phân acid béo thành glycerin và các acid béo. - Phân huỷ tiếp glycerin và các acid béo. + Glycerin + ATP → glycero-P + ADP
21 + Glycero-P → AlGP → đường phân. Các acid béo phân huỷ bằng nhiều con đường trong đó phổ biến nhất là phân huỷ theo con đường β-oxi hoá. Các acid béo phân huỷ theo con đường β-oxi hoá tạo nên các acetyl-CoA. Từ acetyl-CoA phân huỷ tiếp bằng chu trình Krebs. Sự phân huỷ acid béo tạo ra năng lượng ATP khá lớn cho tế bào VSV. Ví dụ khi phân huỷ acid palmitic tạo ra được 130 ATP. III. Cơ sở di truyền vi sinh vật Như chúng ta đều biết, cho đến đầu thập niên 1940 các VSV mới bắt đầu được sử dụng trong nghiên cứu di truyền học. Từ đây hình thành nên di truyền học VSV và di truyền sinh-hóa, mở đường cho sự ra đời của di truyền học phân tử (1953) và công nghệ DNA tái tổ hợp sau này (1972). 1. Di truyền học virus Theo R.M. Atlas (1994) thì “Virus là một thực thể vô bào có chứa một lượng tối thiểu protein và acid nucleic mà chỉ có thể sao chép sau khi đã xâm nhập vào những tế bào sống chuyên biệt. Chúng không có quá trình trao đổi chất nội tại, sự sao chép dựa vào việc điều khiển trao đổi chất tế bào nhờ hệ gene của virus. Trong tế bào chủ các thành phần của virus được tổng hợp riêng rẽ, rồi lắp ráp thành dạng thành thục”. 1.1. Đặc điểm và cấu tạo của virus - Virus là các thể sống chưa có cấu tạo tế bào, ký sinh nội bào bắt buộc. Mỗi kiểu virus có một phạm vi vật chủ nhất định. Chúng nhận diện tế bào chủ theo nguyên tắc “ổ khóa và chìa khóa” giữa các protein vỏ của nó với các điểm nhận trên bề mặt màng tế bào. Các virus của vi khuẩn gọi là bacteriophage (thể thực khuẩn), gọi tắt là phage. - Virus không có hệ thống sinh năng lượng, không có ribosome, không có hệ thống biến dưỡng riêng và do vậy các virus không tăng trưởng. - Virus không tạo màng lipid riêng; - Virus không có khung sườn tế bào; - Virus không bị tác động bởi các chất kháng sinh; - Mỗi hạt virus thường gồm 1 phân tử acid nucleic ở trong, gọi là lõi, và lớp vỏ (capsid) bao bên ngoài là các protein (tổ hợp theo các đơn vị gọi là capsomere), có mang các thành phần kháng nguyên. Kết cấu cơ bản đó gọi là nucleocapsid.
22 Hình 2.5. Virus trần và virus có vỏ ngoài Hệ gene của virus rất đặc biệt (bảng 2.2), mỗi loại virus chỉ chứa một loại acid nucleic, hoặc là DNA hoặc là RNA, chuỗi đơn hay chuỗi kép, dạng sợi thẳng hay dạng vòng. Virus bé nhất khoảng 4 gene và lớn nhất khoảng vài trăm gene. Một số virus ngoài vỏ protein còn có thêm vài lớp màng bao khác gồm (protein + phospholipid) bắt nguồn từ màng sinh chất tế bào chủ, hoặc cả (protein + glycoprotein) từ virus HIV, virus SARS, H5N1 là một ví dụ. (HIVgây hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (HCSGMDMP); Virus SARS gây hội chứng viêm đường hô hấp cấp (VĐHHC); H5N1 gây bệnh cúm gà) Bảng 2.2. Phân biệt quá trình truyền bệnh AIDS, SARS, CÚM GÀ Bệnh Acid Tên virus Vật chủ Phương thức lan nucleic truyền -Qua máu AIDS RNA HIV1, HIV2 Người, khỉ -Quan hệ tình dục -Mẹ sang con Cầy hương, SARS RNA SARS -Hô hấp người -Hô hấp, tiêu hóa CÚM GÀ RNA H5N1 Gia cầm
23 Hình 2.6: Virus và đường truyền bệnh AIDS, SARS, CÚM GÀ Bảng 2.3: Dạng acid nucleic và kích thước hệ gene một số virus Virus Vật chủ Dạng acid Kích thước hệ gene nucleic ( số cặp base) Phage MS2, f2, R17 E. coli RNA sợi đơn- 3.569 thẳng Virus TMV Thuốc lá “ ~ 6.000 Các Reovirus Thú RNA sợi kép- ~ 50.000 thẳng Phage ΦX174 E. coli DNA sợi đơn- 5.375 vòng Virus SV40 Thú DNA sợi kép- 5.243 vòng Baculovirus Côn trùng “ (100-150)x103 Adenovirus Ad5 Người DNA sợi kép- ~ 36.000 thẳng Phage λ (Lambda) E. coli “ 48.502 Phage T2, T4 E. coli “ ~ 200.000 Ghi chú: Các virus gây bệnh ở người và động vật có hệ gene chủ yếu là DNA sợi kép-thẳng, như: các virus thuộc họ Adenoviridae gây bệnh đường hô hấp, họ Herpesviridae gây mụn rộp herpes ở người, bệnh đậu gà, họ Poxviridae gây đậu mùa, đậu bò Hoặc là RNA sợi đơn-thẳng, như các virus thuộc họ Retroviridae
24 gây ung thư, AIDS, bạch cầu , họ Paramyxoviridae gây sởi, quai bị, bệnh gà toi, họ Rhabdoviridae với bệnh dại, họ Orthomyxoviridae với bệnh cúm, họ Picornaviridae với các bệnh viêm tủy xám, viêm gan A do virus, bệnh lở mồm long móng ở trâu bò 1.2. Phương thức sinh sản và vòng đời của virus Ở đây chúng ta sẽ tìm hiểu những nét chung nhất trong chu trình sống-sinh sản của virus qua đại diện là các phage ký sinh ở E. coli. Thông thường được chia làm 5 giai đoạn: Hấp thụ → Xâm nhập → Sao chép → Thành thục → Phóng thích, hoặc 3 giai đoạn như sau: (1) Phage bám bằng phần đuôi trên bề mặt tế bào vi khuẩn và tiết enzyme tiêu hủy vách tế bào; (2) Phage dùng phần đuôi để tiêm lõi acid nucleic (DNA) vào trong tế bào chủ; (3) Trong tế bào chủ, tùy loại DNA các phage khác nhau mà có thể diễn ra một trong hai trạng thái: gây tan hoặc tiềm tan. + Đối với các phage độc như T2 và T4, lúc này DNA của chúng sẽ sao chép nhiều lần và tổng hợp đủ các protein cần cho tạo vỏ và đuôi, để sau đó chúng lắp ráp với nhau tạo ra các phage thế hệ con. Sau đó, dưới tác dụng của lysozyme làm tan tế bào chủ và phóng thích chừng 100-200 phage con. Hình 2.7: Chu trình hoạt động gây tan (lytic cycle) và tiềm tan (lysogeneic cycle) của phage λ ở E. coli. + Đối với phage ôn hòa như lambda (λ), có thể gây tan hoặc không gây tan. Trường hợp tiềm tan (lysogeney) xảy ra là do: sau khi chui vào tế bào chủ, DNA của phage tự đóng vòng ( nhờ có các đầu dính và xúc tác
25 của ligase), rồi xen vào nhiễm sắc thể chính của vi khuẩn bằng sự tái tổ hợp vị trí đặc hiệu và nó tiềm ẩn ở trạng thái đó, gọi là tiền virus (prophage). Tuy nhiên, các prophage này có thể hoạt động trở lại để gây tan. Chẳng hạn, nếu có tác động của tia UV gây tổn thương nhiễm sắc thể vật chủ thì một trao đổi chéo ngược trở lại sẽ xảy ra, nhờ vậy DNA - phage được tách ra khỏi nhiễm sắc thể vi khuẩn chủ và bắt đầu chu trình sinh sản gây tan. + Đối với virus thuộc nhóm retrovirus (virus gây ung thư, gây bệnh AIDS, gây bệnh bạch cầu tế bào T ) có chu trình sống điển hình (hình 2.6). Hình 2.8: Chu trình sống của virus nhóm retrovirus Ở đây cần để ý hai điểm quan trọng liên quan công nghệ gene: + Tái tổ hợp: Khi có nhiều virus nhiễm đồng thời tế bào chủ thì giữa chúng xảy ra sự trao đổi gene, tạo ra các thể tái tổ hợp. Nhờ vậy có thể lập bản đồ di truyền ở virus. Dạng tái tổ hợp điểm đặc hiệu để gắn DNA phage vào nhiễm sắc thể vi khuẩn chủ và tách ra ( khi bị cảm ứng tia UV) được xúc tác bởi cặp enzyme tương ứng là integrase và excisionase. Lợi dụng đặc điểm này, người ta sử dụng phage làm vector trong kỹ thuật gene. + Sao chép: Do vật liệu di truyền của các virus rất đa dạng, nên sự sao chép/sao chép của chúng cũng khác nhau, theo 3 con đường:
26 DNA → DNA; RNA→ RNA; và RNA → cDNA kép → RNA. Trong đó, các retrovirus có hệ gene RNA gây ung thư, bệnh AIDS (HIV), bệnh bạch cầu tế bào T (HTLV-I) đều có chứa enzyme phiên mã ngược (reverse transcriptase) để tổng hợp cDNA sợi đơn trên khuôn RNA của nó, rồi sau đó là cDNA sợi kép để có thể xen vào nhiễm sắc thể vật chủ ở trạng thái provirus ổn định. Lợi dụng enzyme này để tổng hợp và tạo dòng cDNA. + Phiên mã: Hình 2.8: Sơ đồ minh họa quá trình phiên mã ở một số virus 2. Di truyền học vi khuẩn 2.1. Vật liệu di truyền của vi khuẩn Vi khuẩn là một nhóm lớn của Prokaryote, có cấu trúc tế bào nhưng chưa có nhân điển hình. Bộ máy di truyền của vi khuẩn phức tạp hơn virus nhiều, thường gồm 1 phân tử DNA sợi kép-vòng kích thước lớn (ví dụ ở E. coli là 4,6 x106 cặp base). Nó liên kết với các protein tương tự histon tạo thành cấu trúc siêu xoắn tập trung ở một vùng gọi là vùng nhân (nucleoid). Và trong dịch bào có rất nhiều phân tử DNA trần sợi kép, dạng vòng, kích thước bé bằng khoảng 0,05-10% kích thước nhiễm sắc thể vi khuẩn và có khả năng sao chép độc lập, gọi là các plasmid. Ở E. coli có nhiều loại plasmid với tính chất và số bản sao có mặt khác nhau trong tế bào, ở đây đề cập 2 loại: - Các plasmid kháng thuốc, gọi là plasmid R (R-resistance), thường có mang nhiều gene mã hóa các enzyme có khả năng phân hủy chất kháng
27 sinh tương ứng có mặt trong môi trường. Ví dụ, plasmid pBR322 (4362 cặp base) có 2 gene kháng ampicilline (AmpR) và tetracyline (TetR). Loại plasmid này thuộc loại sao chép mạnh, có thể tạo ra khoảng 50 bản sao (copies) trong một tế bào. Đó là những đặc điểm chính mà người ta lợi dụng nó làm công cụ đắc lực (vector) trong kỹ thuật di truyền. - Các plasmid giới tính, tức plasmid F (F-fertility) có chứa các gene truyền và bắt buộc tham gia vào quá trình tiếp hợp ở E. coli. Các tế bào vi khuẩn có mang plasmid F, ký hiệu F+ và tế bào không có F, ký hiệu F-. Nhân tố F có kích thước lớn (khoảng 100.000 cặp nucleotide), được sao chép chỉ 1 lần trong chu kỳ tế bào (nhờ xen vào trong nhiễm sắc thể vi khuẩn) và phân ly về cả 2 tế bào con. Cho nên trong 1 tế bào F+ điển hình thường có 1-2 bản sao của plasmid F. 2.2. Ba phương thức trao đổi vật liệu di truyền ở vi khuẩn Lần đầu tiên, năm 1946 Lederberg và Tatum phát hiện ra sự tái tổ hợp ở vi khuẩn. Cho đến nay, ta biết rằng ở vi khuẩn có các quá trình sinh sản tương đương sinh sản hữu tính, gọi là cận hữu tính (parasexuality), đó là: tiếp hợp, biến nạp và tải nạp. Các quá trình này có các đặc điểm sau: (1) Truyền thông tin 1 chiều từ tế bào cho (donor) sang tế bào nhận (recipient); (2) Tạo ra hợp tử từng phần (merozygote), vì thể cho chỉ truyền sang thể nhận một phần bộ gene của nó; (3) Vì bộ gene chỉ là một phân tử DNA trần nên chỉ có một nhóm liên kết và tái tổ hợp về thực chất là lai phân tử. Những hiểu biết sâu sắc về các quá trình sinh sản cận hữu tính ở vi khuẩn đã góp phần quan trọng trong sự phát triển của di truyền học phân tử cũng như của kỹ thuật gene sau này. a) Tiếp hợp (Conjugation) Tiếp hợp là sự tiếp xúc trực tiếp giữa hai tế bào vi khuẩn, trong đó diễn ra sự truyền đi một phần vật liệu di truyền từ thể cho sang thể nhận. Ở đây, nhân tố F được truyền từ tế bào F+ sang F- trong quá trình tiếp hợp, nhờ kiểu sao chép “vòng lăn” (rolling circle) hay còn gọi là sao chép sigma (σ). Kết quả của sự tiếp xúc là tế bào F- cũng trở thành F+, nghĩa là có sự thay đổi giới tính (cái → đực). Tuy nhiên, tần số lai F+ x F- rất thấp, khoảng 10-6. Về sau, người ta còn phát hiện một dạng vi khuẩn, trong đó plasmid F được xen cài vào trong nhiễm sắc thể vi khuẩn, dạng này có khả năng lai với tế bào F- với tần số cao hơn khoảng 104 lần, gọi là tế bào Hfr (High
28 Frequency of recombination). Khác với các tế bào F+, các tế bào Hfr còn có thể truyền đi một phần nhiễm sắc thể vi khuẩn qua ống tiếp hợp. Lợi dụng đặc tính này người ta đã lập bản đồ di truyền bằng tiếp hợp cho hơn 700 gene của nhiễm sắc thể E. coli và cho thấy nó có dạng vòng. b) Biến nạp ( Transformation) Biến nạp là hiện tượng xâm nhập của DNA ngoại bào vào tế bào thể nhận và gây biến đổi một số đặc tính của thể nhận bởi ảnh hưởng của DNA thể cho. Hiện tượng biến nạp được Frederick Griffith phát hiện lần đầu tiên năm 1928 và về sau được Oswald T. Avery, Colin MacLeod và Maclyn McCarty cùng phát hiện lại năm 1944. 1 2 3 4 Hình 2.9: 1. Frederick Griffith; 2. Oswald T. Avery (1877-1955); 3. Colin MacLeod (1909-1972); 4. Maclyn McCarty (1911-) Khác với tiếp hợp và tải nạp, biến nạp là quá trình chuyển DNA trực tiếp tách ra từ tế bào thể cho sang tế bào thể nhận. Đặc trưng của biến nạp là ở chỗ DNA thể cho phải ở dạng xoắn kép. Hiệu quả của nó phụ thuộc vào khả năng dung nạp của tế bào nhận, kích thước đoạn DNA và nồng độ DNA. Tế bào có khả năng tiếp nhận đoạn DNA ngoại lai đó gọi là tế bào khả biến, và có thể xảy ra lưỡng bội hóa ở một phần bộ gene (hợp tử từng phần). Sự gắn kết đoạn DNA ngoại lai vào DNA tế bào nhận được thực hiện nhờ cơ chế tái tổ hợp tương đồng. Vì sau khi chui qua màng tế bào nhận, một sợi của đoạn DNA ngoại lai bị phân hủy, cho nên nếu như đoạn sợi đơn còn lại không được gắn vào thì sẽ bị phân hủy luôn. Nói chung, tần số xuất hiện các tế bào khả biến là rất thấp (ngay cả ở các loài vi khuẩn có khả năng biến nạp) và tần số biến nạp (đối với các tế bào khả biến) cũng chỉ khoảng 10-3. Vì vậy, biến nạp chỉ được dùng làm
29 kỹ thuật lập bản đồ gene cho 1 số loài. Tuy nhiên, ngày nay biến nạp được ứng dụng rất rộng rãi như là một khâu cơ bản trong kỹ thuật di truyền: cấy-chuyển gene, tiêm lắp-ghép gene, ở E. coli, nấm men bia, thực vật, động vật và cả ở người. c) Tải nạp (Transduction) Tải nạp là quá trình truyền DNA từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận nhờ phage. Có 2 kiểu tải nạp: tải nạp chung và tải nạp đặc hiệu. * Tải nạp chung là trường hợp phage truyền bất kỳ gene nào của vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận ở E. coli, phage P1 là phage tải nạp chung đã được nghiên cứu kỹ. Trong khi nhiễm vào vi khuẩn, phage P1 sản ra nuclease cắt DNA vi khuẩn chủ thành từng đoạn một cách ngẫu nhiên. Về sau, trong quá trình lắp ráp vỏ protein với DNA phage, có khoảng 10-3 - 10-2 hạt phage con mang đoạn DNA vật chủ. Khi các phage tải nạp này xâm nhập vi khuẩn khác, sẽ xảy ra sự tái tổ hợp tương đồng với NST vật chủ mới. Đoạn gene tải nạp thường chứa khoảng 50 gene và tải nạp có thể được dùng để lập bản đồ gene. * Tải nạp đặc hiệu là trường hợp phage chỉ truyền đi những gene nhất định từ vi khuẩn cho sang vi khuẩn nhận. Kiểu tải nạp này có một số đặc điểm sau: Được thực hiện bởi prophage lambda (λ); Những gene được chuyển nằm sát chỗ prophage xen vào; Do kết quả của sự cắt sai của phage khi tách khỏi NST vật chủ; Các vi khuẩn tái tổ hợp có thể lưỡng bội một phần. Tuy nhiên, do sự cắt sai của phage lambda rất hiếm nên tải nạp đặc hiệu có tần số thấp. 3. Di truyền học vi nấm Sau đây là một vài nét sơ lược về nấm men. Hiện nay, S. cerevisiae và Schizosaccharomyses pombe đang được nghiên cứu rộng rãi ở mức phân tử. Chúng có chu trình sống đơn giản có liên quan tới tất cả pha đơn bội (n) và pha lưỡng bội (2n). Đối với các tế bào (2n) diễn ra những phân chia giảm nhiễm thông thường để tạo ra các bào tử (n). Toàn bộ 4 sản phẩm của giảm phân được bọc bên trong một cái nang dày có chia ô. Điều đó cho phép kiểm tra các đoạn NST trao đổi chéo thuận nghịch riêng biệt. Các tế bào nấm men S. cerevisiae phân chia bằng quá trình nảy chồi làm tách các tế bào cha mẹ ra khỏi các tế bào con (chồi) của chúng. Ngược lại, S. pombe là nấm men phân đôi (fission), các tế bào cha mẹ sinh trưởng và sau đó ngắt đôi tạo ra 2 tế bào giống nhau về hình thái.
30 Trung bình hệ gene đơn bội của nấm men S. cerevisiae có chứa khoảng 14 x 106 cặp base, nghĩa là có hàm lượng DNA lớn hơn E. coli khoảng 3,5 lần, trong khi ruồi giấm Drosophila lớn gấp 25 lần và các tế bào thực vật bậc cao chứa nhiều gấp ít nhất là 1.000 lần. Như vậy, dùng nấm men trong nghiên cứu di truyền nhân chuẩn quả là đơn giản và rẻ hơn. Ở S. cerevisiae DNA được phân phối trong 16 NST với khoảng 5 - 6 ngàn gene, trong khi S. pombe chỉ có 3 NST khác nhau. Tính đến 1996, đã có 6000 gene của S.cerevisiae được lập bản đồ. Điều đáng nói là nhiều tế bào nấm men cũng có các bản sao phức của các DNA-plasmid nội sinh dạng vòng 2 μm (6300 cặp base) có khả năng sao chép độc lập, thường có 50 - 200 bản sao trên một tế bào. Bình thường chúng không mang một gene thiết yếu nào. Đây là loại vector quan trọng trong kỹ thuật di truyền. Trong số rất nhiều loài nấm men đã được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất bia, rượu, nước giải khát, tạo sinh khối , loài S. cerevisiae hiện đang được dùng như một công cụ đắc lực để mang các DNA tái tổ hợp có các gene quan trọng của động vật và người, nhằm sản xuất các protein có hoạt tính sinh học, như: các interferon, insulin, hormon sinh trưởng, hirudin, các kháng nguyên virus v.v dùng trong chăn nuôi, phòng và chữa bệnh. 4. Các sinh vật mang gene tái tổ hợp 4.1. Các vi sinh vật tái tổ hợp Một trong những ứng dụng đầu tiên của kỹ thuật di truyền là tạo ra một chủng Pseudomonas syringae. Chủng hoang dại của vi khuẩn này thông thường chứa một gene tạo băng, gene này kích thích sự tạo băng trên các bề mặt lạnh và ẩm. Sự biến đổi gene này tạo ra một thể tái tổ hợp có khả năng ngăn ngừa sự tạo thành băng. Được tạo ra dưới tên gọi là Frostban, vi khuẩn này đã mang lại một thành công khiêm tốn trong việc chống lại việc tạo thành băng trên các cây dâu tây và khoai tây ngoài đồng ruộng. Pseudomonas fluorescens đã được tái tổ hợp với các gene sản sinh chất diệt côn trùng sinh học của Bacillus thuringiensis. Các vi kuẩn này được thả vào đất, chúng sẽ bám vào rễ và giúp tiêu diệt các côn trùng đang tấn công. Năm 1979 xuất hiện thông báo đầu tiên về sự biểu hiện gene insulin người sau khi được gép vào vi khuẩn E. coli, năm 1982 insulin được sản xuất bằng kỹ thuật này được bán ra trên thị trường với tên thương phẩm Humulin (Human insulin). Hiện nay người ta dần thay thế vi khuẩn E. coli mang gene tái tổ hợp bằng các VSV khác như nấm men thuộc chi Saccharomyces, xạ khuẩn- Streptomyces
31 4.2. Các thực vật tái tổ hợp Tham gia vào hầu hết các thao tác của kỹ thuật di truyền ở thực vật có một loài vi khuẩn hấp dẫn, đó là Agrobacterium tumefacien. Vi khuẩn này là một tác nhân gây bệnh tự nhiên ở thực vật, nó xâm nhập vào rễ và tạo nên một khối u được gọi là bệnh mụn tán. A. tumefacien chứa một plasmid lớn (Ti), nó được gắn vào gene nom của các tế bào rễ bị nhiễm khuẩn và làm biến đổi các tế bào này. Ngay cả khi các vi khuẩn đã bị chết ở trong khối u thì khối u vẫn tiếp tục phát triển. Plasmid này là một vector hoàn hảo để đưa các gene lạ vào gene nom thực vật. Trong đa số trường hợp, Plasmit Ti được lấy ra, ghép vào một gene đã được lựa chọn rồi lại đưa trở lại vào Agrobacterium. Hình 2.10: Khối u thực vật chứa A.tumefacien chứa Ti plasmid Khi thực vật bị nhiễm khuẩn, các vi khuẩn tái tổ hợp sẽ tự động chuyển gene mới vào các tế bào rễ của cây. Việc gắn gene theo cách này lúc đầu được tiến hành ở các cây hai lá mầm như khoai tây, cà chua, thuốc lá và bông. Cho đến nay, các thực vật tái tổ hợp, hay chuyền gene, chủ yếu là các cây bông hoặc thuốc lá đề kháng với chất diệt cỏ, các thực vật có khả năng diệt côn trùng, nhiều loại đề kháng với virus hoặc với nấm và một loại cà chua không chín quá sớm và không bị vỡ khi vận chuyển. 4.3. Các động vật tái tổ hợp Không chỉ virus, vi khuẩn, nấm và thực vật mà cả động vật cũng có thể được thiết kế về mặt di truyền. Trong một số điều kiện động vật cũng có thể biểu hiện các gene được gắn nhân tạo bởi chuyển nhiễm. Các động vật đầu tiên được chuyển gene là những con ruồi giấm mà những khuyết
32 hụt về màu mắt của chúng đã được sửa chữa nhờ việc đưa các gene bình thường vào trứng khiếm khuyết. Chuột là những động vật đặc biệt dễ bảo trong việc chấp nhận gene theo cách này. Phôi của chuột đã thụ tinh được cấy các gene quy định các hocmon sinh trưởng của người đã sinh ra các con chuột khổng lồ lớn gấp hai so với chuột bình thường. Trong một thí nghiệm khác, các hợp tử của chuột do mang một khiếm khuyết di truyền thường làm cho chúng bị bệnh run, đã được sửa chữa nhờ chứa gene bình thường mới được đưa vào. Ngành chăn nuôi đã nhanh chóng tiếp thu một số trong số kỹ thuật này. Năm 1987, phôi lơn đã được cấy bằng gene hormon sinh trưởng của bò trong một thí nghiệm nhằm tăng tốc độ sinh trưởng của lợn và cắt giảm lượng mỡ tạo thành trong khẩu phần thịt. Những con lợn đầu tiên đã có ít mỡ hơn, song thật không may, chúng cũng có những vấn đề về sức khoẻ nghiêm trọng: viêm khớp, bệnh tim và bệnh thận. Khuynh hướng gần đây nhất trong các thí nghiệm chuyển gene là thiết kế trứng đã thụ tinh của các động vật nuôi như lợn, cừu với các gene của người. Các động vật tái tổ hợp này sẽ được dùng làm các hệ thống sống để sản sinh ra một lượng lớn các protein có giá trị của người như hemoglobin, yếu tố đông máu và hormon. Câu hỏi ôn tập 1. Vi sinh vật có những đặc điểm chung nào ? 2. Hãy giải thích tại sao trong thiên nhiên vi sinh vật tăng lên không tương ứng với tốc độ sinh sản vô cùng nhanh chón của nó. 3. Vật liệu di truyền của virus ? Mối quan hệ di truyền giữa virus và tế bào vật chủ ? 4. Vật liệu di truyền ở sinh vật nhân sơ khác với sinh vật nhân chuẩn ở những đặc điểm nào ? 5. Thế nào là tiếp hợp, biến nạp và tải nạp ? Tại sao nói các quá trình này tương đương với sinh sản hữu tính ở sinh vật bậc cao ? Ý nghĩa của việc phát hiện ra hiện tượng biến nạp ở vi khuẩn.
33 Chương 3 Sự phân loại sản phẩm I.Phân loại theo tính chất thương mại Theo Thomas D. Brock (1995), các sản phẩm vi sinh vật có ý nghĩa công nghiệp được phân thành 5 loại chính: - Bản thân các tế bào vi sinh vật (sinh khối) là các sản phẩm mong muốn. - Các enzyme do vi sinh vật tạo nên: amylase, protease, lipase - Các dược phẩm: các chất kháng sinh và các alcaloit. - Các hoá chất đặc biệt và các chất điều vị thực phẩm: bột ngọt nhân tạo aspartam là một dipeptide giữa aspartic và phenylalanin; acid glutamic, lysine và triptophan, một số vitamin. - Các hoá chất thông dụng được sản xuất bằng con đường vi sinh vật bao gồm ethanol, acid acetic, acidlactic và glycerine 1. Sinh khối tế bào Đó là các trường hợp của nấm men dùng cho mục đích dinh dưỡng và làm nở bột mỳ, trường hợp các nấm ăn dùng làm thức ăn. Các vi khuẩn và vi tảo cũng được nuôi cho mục đích dinh dưỡng, song cho đến nay chưa có ý nghĩa lớn về mặt thương mại. Ở đây cần phân biệt hai trường hợp: Thuật ngữ ''protein đơn bào'' (SCP) thường được dùng để chỉ các tế bào các vi sinh vật như là các sản phẩm công nghiệp với lý do là hàm lượng protein trong chúng cao và được quan tâm về mặt thương mại. Còn ''giống khởi động'' (starter culture) là các sản phẩm công nghiệp trong đó bản thân các tế bào vi sinh vật được dùng làm nguyên liệu cấy. Chẳng hạn các giống vi khuẩn lactic được bán ra dưới dạng các nguyên liệu cấy (inoculants) để sản xuất các sản phẩm sữa lên men và xúc xích. 2. Các enzyme do vi sinh vật tạo nên Nhiều enzyme quan trọng có ý nghĩa thương mại đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp nhờ vi sinh vật, bao gồm các enzyme phân giải tinh bột (các amylase), các enzyme phân giải protein- protease, các enzyme phân giải chất béo (các lipase) Một enzyme quan trọng về mặt công nghiệp là gluco-isomerase được sử dụng với số lượng lớn để sản xuất fructose có độ ngọt cao hơn glucose. Một enzyme vi sinh vật quan trọng khác là penicillin -acilase được sử dụng trong công nghệp sản xuất các penicillin tổng hợp.
34 3. Các dược phẩm Các chất kháng sinh và các alcaloid nằn trong nhóm các sản phẩm bậc 2. Đó là các hợp chất không được tạo thành trong pha sinh trưởng đâu tiên mà vào lúc sinh trưởng đã bước vào pha cân bằng. Việc hiểu biết bản chất của sự trao đổi chất bậc hai có tầm quan trọng trong trong việc phát triển các quá trình sản xuất mới. Công ty Công nghiệp hoá chất Takeda (Nhật Bản) sản xuất và cung cấp loại thuốc kháng sinh validacina dùng để phòng trừ nhiều loại bệnh hại cây trồng do nấm gây ra. Validacina đặc biệt có hiệu lực với bệnh khô vằn lúa, trực tiếp bảo vệ, làm tăng năng suất và chất lượng lúa. Thuốc không gây bất cứ hiện tượng ngộ độc nào cho cây trồng, rất an toàn cho người, vật nuôi, cá và những động vật có ích khác; không tồn dư trong đất và nông sản sau khi thu hoạch. Validacina có thể hỗn hợp với hầu hết các loại thuốc khác để phun. Thuốc validacina có các dạng thương phẩm: Validacin 3L, Validacin 5L, Validacin 5SP. 4. Các hóa chất đặc biệt và các chất điều vị thực phẩm Chất điều vị thực phẩm: bột ngọt nhân tạo aspartam là một dipeptide giữa acid aspartic và phenylalanin, cả hai amino acid này đều được sản xuất bằng con đường lên men vi sinh vật. các amino acids khác cũng được sản xuất bằng con đường này là: acid glutamic, lysine và tryptophan. Một số vitamin cũng được sản xuất bằng con đường vi sinh vật, đó là riboflavin, vitamin B12 và acid ascorbic (vitamin C). 5. Các hóa chất thông dụng là những chất có giá thành thấp và do vậy được bán ra với số lượng lớn. Các hóa chất thường được dùng làm nguyên liệu khởi đầu để tổng hợp hóa học các phân tử phức tạp hơn. Các hóa chất thông dụng được sản xuất bằng con đường vi sinh vật bao gồm ethanol, acid acetic, acid lactic và glycerol. Trong số này ethanol là sản phẩm quan trọng nhất. Ethanol được sản xuất nhờ nấm men, bọn này có thể tạo ra một sản lượng ethanol và CO2 từ đường. Hiện nay ethanol được dùng để làm nguyên liệu tổng hợp hóa học và làm nhiên liệu chạy các động cơ (gazohol). II. Sự phân loại sản phẩm theo sinh lý trao đổi chất Khác với sự phân chia sản phẩm mang tính thương mại (Fritsche, 1978) chia các sản phẩm của vi sinh công nghiệp thành 3 loại. 1. Vật chất tế bào (sinh khối) bao gồm các loại protein đơn bào và các loại giống khởi động như men bánh mì các vi khuẩn lactic.
35 Bảng 3.1: Một số enzyme công nghệp và ứng dụng Enzyme Nguồn Ứng dụng chính Aspergillus, Bacillus, Bổ sung vào bột, công nghệp Amylase Rhizopus dệt, trợ giúp tiêu hóa Phòng oxy hóa thực phẩm, Catalase Micrococcus, Aspergillus sản xuất phomat Thủy phân gỗ, trợ giúp tiêu Cellulase Aspergillus,Trichoderma hóa Loại glucose hoặc oxy trong Glucooxydase Aspergillus thực phẩm, xác định glucose lâm sàng Làm trong vang, dấm, bia, Pectinase Aspergillus, Sclerotinia dịch quả Loại penicillin trong nghiên Penicillinase Aspergillus cứu Aspergillus, Bacillus, Làm trong sake, chế biến thịt, Protease Streptomyces loại gelatin Làm lành các vết thương vết Streptokinase Streptococcus bỏng 2. Các sản phẩm trao đổi chất bao gồm: - Các sản phẩm lên men. Ví dụ ethanol, acid lactic, methane, acetol- butanol - Các chất trao đổi bậc 1: Ví dụ amino acids, nucleotide, vitamins, đường, - Các chất trao đổi bậc 2: Ví dụ chất kháng sinh, alcaloid, gibberellin, IAA - Các loại enzyme: Ví dụ các enzyme ngoại bào như protease, amylase; các enzyme nội bào như asparaginase, penicillinase. 3. Các sản phẩm chuyển hoá Các sản phẩm chuyển hoá bao gồm steroids và các sản phẩm của sự oxi hoá không hoàn toàn như sự tạo thành acid acetic và socbose. II. Sinh trưởng và sự tạo thành sản phẩm Trong điều kiện nuôi cấy tĩnh, quá trình sinh trưởng của một quần thể VSV trải qua 4 giai đoạn (Tiềm phát → logarit → cân bằng động → suy vong). Toàn bộ quá trình nuôi gắn liền với sự thay đổi kéo dài của các
36 điều kiện nuôi. Chất dinh dưỡng giảm đi, số lượng tế bào tăng lên rồi giảm dần, đồng thời hoạt tính trao đổi chất cũng thay đổi. Sự liên quan của các sản phẩm trao đổi chất với tế bào có thể phân biệt thành 2 nhóm: các sản phẩm bậc một và các sản phẩm bậc hai. Một chất trao đổi bậc một là một chất được tạo thành trong pha sinh trưởng đầu tiên của VSV trong khi một chất trao đổi bậc hai là một chất được tạo thành gần vào lúc kết thúc của pha sinh trưởng, thường là vào gần chính pha cân bằng. Hình 3.1: Động học của sự sinh trưởng và tạo thành sản phẩm ở VSV a. Sinh trưởng và tạo sản phẩm diễn ra đồng thời b. Sự tạo thành sản phẩm bắt đầu sau khi sinh trưởng đã kết thúc *Đặc điểm của sản phẩm trao đổi bậc hai: - Các sản phẩm bậc 2 chỉ được tạo thành bởi một số tương đối ít cơ thể và dường như không cần thết cho sinh trưởng và sinh sản. - Sự tạo thành các sản phẩm bậc hai phụ thuộc vào các điều kiện sinh trưởng, đặc biệt là thành phần của môi trường. - Chúng thường được tạo thành dưới dạng một nhóm các chất có cấu trúc gần gũi. Chẳng hạn, một chủng Streptomyces đã sản sinh ra 32 chất kháng sinh antracyclin khác nhau nhưng có cấu trúc gần giống nhau. - Thường có thể nhận được sự tổng hợp thừa đột ngột mạnh các sản phẩm bậc hai, điều này thường không gặp ở các sản phẩm bậc một là loại sản phẩm có liên quan chặt chẽ đến pha sinh trưởng. Trong trao đổi chất bậc hai có hai pha trao đổi chất khác biệt nhau được gọi là pha sinh trưởng (trophophase) và pha sản xuất (idiophase). Nếu chúng ta định sản xuất các sản phẩm bậc hai thì chúng ta phải đảm bảo rằng các điều kiện thích hợp cần được tạo ra trong pha đầu để sinh
37 trưởng diễn ra tối ưu và các điều kiện phải được thay đổi đúng lúc để sự tạo thành sản phẩm có thể diễn ra tối ưu. Trong trao đổi chất bậc hai, sản phẩm mong muốn có thể không bắt nguồn từ cơ chất sinh trưởng ban đầu mà từ một sản phẩm được tạo thành từ cơ chất sinh trưởng ban đầu. Như vậy, nói chung sản phẩm bậc hai được sinh ra từ một số sản phẩm trung gian tích luỹ trong môi trường nuôi cấy hoặc trong tế bào trong quá trình trao đổi chất bậc một. Một trong các đặc điểm đặc trưng của các chất trao đổi bậc hai là các enzyme tham gia vào sự tạo thành chúng được điều hoà một cách độc lập với các enzyme của trao đổi chất bậc một. 3. Sinh tổng hợp thừa Quá trình lên men công nghệp đòi hỏi sự tạo thành sản phẩm mong muốn với lượng cao nhất. VSV tồn tại trong tự nhiên sinh ra các sản phẩm trao đổi chất và các thành phần tế bào chỉ ở mức độ cần thiết cho sự sinh sản tối ưu và cho sự duy trì loài. Có nghĩa là, trong tự nhiên không có sự sản sinh dư thừa các sản phẩm trao đổi chất bậc 1, bậc 2. Bởi vậy những thí nghiệm nhằm phân lập các chủng có khả năng sinh tổng hợp dư thừa từ nơi sống tự nhiên thường không đem lại kết quả mong muốn. Chỉ khi nào những cơ thể thích hợp thu được do xử lý bằng các tác nhân gây đột biến định hướng, được chọn lọc trong điều kiện phòng thí nghiệm về những khả năng nhất định, thì ta mới có thể thu được các chủng tổng hợp thừa bị sai hỏng trong cơ chế điều hoà. Những chủng này được coi là những chủng có năng suất cao để dùng trong công nghiệp. 3.1. Những nguyên tắc điều hoà trao đổi chất - Điều hoà hoạt tính enzyme nhờ ức chế bằng sản phẩm cuối cùng hay còn gọi là sự kìm hãm do liên hệ ngược; - Sự cảm ứng và ức chế quá trình tổng hợp enzyme; - Điều hoà tổng hợp enzyme nhờ sự kiềm chế bằng sản phẩm cuối cùng và sự giải kiềm chế; - Điều hoà tổng hợp enzyme nhờ sự kiềm chế dị hoá. 3.2. Những sai hỏng di truyền của điều hoà trao đổi chất và hiện tượng tổng hợp thừa Các cơ chế điều hoà trao đổi chất có thể bị thay đổi do những đột biến dẫn đến sự sinh tổng hợp thừa các chất trao đổi. Toàn bộ những sai hỏng có thể biểu hiện ở sự cảm ứng enzyme. Nhờ những sai hỏng mà các enzyme cảm ứng trở thành các enzyme cấu trúc, nghĩa là chúng tồn tại trong tế bào không phụ thuộc vào cơ chất.
38 Nhiều hoạt tính của các chủng sản xuất là do sai hỏng di truyền. Việc lựa chọn các chủng sản xuất trước hết là theo kinh nghiệm. Những thành tựu của sinh học phân tử như chủ động gây đột biến định hướng, chuyển gép gen tạo điều kiện cho việc lựa chọn định hướng hơn và do đó có hiệu quả cao hơn. 4. Công nghệ DNA tái tổ hợp Như đã biết, hai sự kiện nổi bật nhất trong giai đoạn đầu của Sinh học phân tử là sự khám phá ra cấu trúc phân tử DNA năm 1953 bởi James Watson và Francis Crick (nhận giải Nobel-1962) và sự giải mã thành công hệ thống mật mã di truyền năm1966 bởi Marsall Nirenberg và Har Gobind Khorana nhận giải Nobel-1968 cùng với nhiều nhà khoa học khác. Giai đoạn tiếp theo của đỉnh cao phát triển sinh học phân tử là sự ra đời của Công nghệ DNA tái tổ hợp (recombinant DNA technology), vào giữa thập niên 1970, với các tên gọi khác như: công nghệ gen, kỹ thuật di truyền (genetic engineering). Công nghệ DNA tái tổ hợp bắt đầu như một khoa học từ 7/1972 khi nhóm nghiên cứu của Paul Berg (Viện hàn lâm khoa học quốc gia Mỹ) hoàn thành việc chế tạo bộ gen lai giữa virus SV40 của khỉ với phage lambda. Lần đầu tiên kết nối hai virus khác nhau hoàn toàn về mặt di truyền thành một chỉnh thể và được nhân lên dưới dạng plasmid trong tế bào vi khuẩn. Phân tử DNA lai chứa các thông tin di truyền của virus SV40, thông tin điều khiển quá trình tự sao của DNA phage lambda cũng như toàn bộ chức năng của operon galactosidase của vi khuẩn E. coli. 1 2 3 4 Hình 3.2: 1. Har Gobind Khorana (1922-); 2. Temin, Howard Martin (1934-1994); 3. Daniel Nathans (1928-1999); 4. Paul Berg (1926-) 4.1. Khái niệm công nghệ DNA tái tổ hợp
39 Đó là công nghệ bao gồm một tập hợp các kỹ thuật như phân cắt và lai ghép các phân tử nucleic acid nhờ các enzyme giới hạn, ligase nhân dòng DNA trong các plasmid hoặc virus được tăng cường ở vi khuẩn hoặc tế bào nấm men; xác định trình tự nucleotide DNA ở đoạn được nhân dòng; biểu hiện của gen được nhân dòng dưới dạng sản phẩm protein Sự ra đời của công nghệ DNA tái tổ hợp và gần đây là công nghệ chíp DNA, sinh tin học, nuôi cấy tế bào gốc, công nghệ nano gắn liền với các sự kiện khoa học sau: - 1965, Xác lập được các gen kháng thuốc ở vi khuẩn nằm trong các plasmid. - 1967, SB Zimmerman và cộng sự tách chiết thành công DNA- ligase. - 1970, Hamilton Smith và các cộng sự đã phân lập được enzyme giới hạn đầu tiên từ vi khuẩn Haemophylus influenzae được gọi là Hind II. -1970, Har Gobind Khorana tổng hợp được một gen nhân tạo đầu tiên đó là gen mã hóa việc tổng hợp tRNAala vận chuyển amino acid alanine ở nấm men. Gene này dài 77 cặp nucleotide, không có các trình tự điều hòa và vì thế không có hoạt tính, đến 1973 một gen nhân tạo khác có thể hoạt động bình thường trong tế bào sống, đó là gene mã hóa tRNAtyr vận chuyển cuả tyrosin ở E. coli có chiều dài khoảng 200 cặp nucleotide. - 1972, Paul Berg kiến tạo được phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên trong ống nghiệm. - 1973, H. Boyer, S. Cohen, A. Chang và R. Helling - lần đầu sử dụng plasmid để tạo dòng DNA ở E. coli. -1975, Temin, Howard Martin, phát hiện ra enzyme phiên mã ngược (reversetranscriptase) mở ra sự tổng hợp gene nhân tạo. - 1977, Đề xuất các phương pháp hóa học (Maxam và Gilbert) và phương pháp enzyme học (Frederick Sanger và cộng sự) xác định trình tự nucleotide của nucleic acid. - 1977, Thành lập hãng công nghệ gen đầu tiên ở Mỹ (Genetech) để sản xuất các chế phẩm y học bằng phương pháp DNA tái tổ hợp.
40 - 1978, Giải thưởng Nobel đầu tiên trong lĩnh vực khám phá và sử dụng enzyme giới hạn được trao cho Daniel Nathans; Werner Arber; Hamilton Othanel Smith. - 1983, Giải thưởng Nobel được trao cho bà Barbara McClintock phát hiện ra yếu tố di truyền vận động hay gen nhảy. - 1986, Binnig, Gerd Karl (Nhà khoa học Đức, giải Nobel 1986) khám phá ra loại kính hiển vi hoạt động không theo nguyên tắc quang học, mở đầu cho công nghệ nano. - Tháng 4 năm 1996, men nở bột mỳ S.cerevisiae đã giải mã xong gồm 6.000 gene - Tháng 12/ 2002, tập đoàn Genome Sequencing Chuột quốc tế hoàn thành một bản thảo genome chuột và so sánh với genome người có khoảng 3.000 gene chung. - Năm 2003, giải Nobel được trao cho hai nhà bác học Paul C. Lauterbur và Peter Mansfield đã có công phát minh những ứng dụng của hiện tượng cộng hưởng từ (magnetic resonance). - Năm 2005, giải Nobel Y học 2005 được trao cho hai nhà khoa học Australia - Barry J. Marshall và J. Robin Warren - do đã khám phá ra vi khuẩn Helicobacter pylori và vai trò của chúng trong bệnh viêm loét hệ tiêu hoá (chứng viêm dạ dày, loét dạ dày hoặc tá tràng 1 2 3 4 Hình 3.3: 1. Frederick Sanger (1918-); 2. Barbara McClintock (1902-1992); 3. Binnig, Gerd Karl (1947- ); 4. Paul C. Lauterbur (1929-) 4.2. Các enzyme thông dụng trong kỹ thuật di truyền Năm 1962, Werner Arber lần đầu tiên chứng minh rằng có những enzyme đặc biệt hoạt động trong tế bào vi khuẩn, chúng có khả năng phân biệt DNA "của mình" và DNA "lạ" của phage. Các enzyme này có khả năng hạn chế sự nhân lên của phage lạ trong tế bào vi khuẩn bằng cách phân hủy chúng một cách đặc hiệu, do đó được gọi là "restriction
41 enzyme". Chữ restrion (hạn chế) có nguồn gốc lịch sử từ đó và được dùng đến nay. Thông thường, khi đề cập đến các enzyme được sử dụng trong kỹ thuật di truyền, chủ yếu là nói đến các enzym giới hạn (restriction endonuclease, hay gọi tắt là restrictase), tức các enzyme từ vi khuẩn có khả năng nhận biết và cắt DNA tại những vị trí xác định và ngoài ra là nhóm hỗn hợp các polymerase, ligase và nuclease. Nhìn chung, có hai kiểu cắt: cắt thẳng và cắt so le. + Kiểu cắt thẳng tạo ra các đầu bằng (blunt ends): Một số enzyme giới hạn cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm, ví dụ: AluI, SmaI (Bảng 3.2). + Kiểu cắt so le tạo ra các đầu dính (cohesive ends): Một số enzyme giới hạn cắt đoạn DNA nhận biết tại vị trí so le trên hai mạch. Kết quả là tạo ra các đầu sợi đơn chứa vài base bổ sung có thể dính chập trở lại. Các enzyme này được sử dụng rộng rãi trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Ví dụ: BamHI, EcoRI, XmaI (Bảng 3.2). Bảng 3.2 : Một số enzyme giới hạn và đoạn nhận biết của chúng (mũi tên chỉ vị trí cắt) Vi sinh vật Enzym giới hạn Đoạn 5/→3/ nhận biết 3/←5/ ↓ Arthrobacter luteus AluI AGCT TCGA ↑ ↓ Bacillus BamHI GGATCC amylolyquefaciens H CGTAGG ↑ ↓ Escherichia coli RY13 EcoRI GAATTC CTTAAG ↑ ↓ Serratia marcescens Sb SmaI CCCGGG GGGCCC ↑ ↓ Xanthomonas XmaI CCCGGG malvaccarum GGGCCC ↑
42 * Các enzyme thông dụng khác Trong kỹ thuật di truyền, bên cạnh sử dụng các enzyme giới hạn như “con dao mổ tinh vi”, còn phải dùng tới nhóm enzyme sau: - Các DNA- và RNA-polymerase: xúc tác các phản ứng tổng hợp DNA và RNA. Chúng được dùng khi cần thiết tạo ra một số lượng lớn các bản sao acid nucleic (để tạo các mẫu dò, để xác định trình tự nucleotide ). Trong đó phải kể đến DNA polymerase I của E. coli, enzyme phiên mã ngược từ các retrovirus, enzyme transferase đầu cùng. - Các DNA- và RNA-ligase xúc tác phản ứng nối hai đầu của các đoạn DNA hoặc RNA thường dùng trong tạo dòng. - Các nuclease. Đây là nhóm enzyme phân cắt DNA (DNase) và RNA(RNase) không mang tính chuyên biệt cao như các enzyme giới hạn. 4.3. DNA tái tổ hợp và các vector 4.3.1. Khái niệm DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp là phân tử DNA được tái tạo trong ống nghiệm bằng cách kết hợp DNA từ các nguồn khác nhau theo một qui trình kỹ thuật nhất định. Thông thường, một phân tử DNA tái tổ hợp gồm một DNA của plasmid hoặc phage nguyên vẹn (gọi là vector) có mang một đoạn DNA cần cho nghiên cứu (gọi là DNA ngoại lai). 4.3.2. Khái niệm vector: Vector (thể tải, thể truyền) là một phân tử DNA đóng vai trò là vật trung gian mang một đoạn DNA cần nhân dòng có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ và mượn bộ máy tế bào chủ để tạo ra nhiều bản sao của vector. Các ứng dụng chủ yếu của vector là: - Tạo dòng nhằm khuyếch đại số bản sao của một đoạn DNA xác định (nhiều bản sao giống nhau). - Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự của DNA. - Đưa gen vào tế bào hay cơ thể (nhằm biến đổi đặc tính di truyền mong muốn ở sinh vật được truyền gen). - Sản xuất RNA với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng. - Sản xuất protein với số lượng lớn từ DNA được tạo dòng.4.3.3. Các đặc tính của một vector - Có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ và tồn tại được qua nhiều thế hệ. - Có khả năng tự sao chép mạnh và độc lập với sự tái bản của bộ gen tế bào chủ.
43 - Phải có các đặc tính (được mã hóa bởi các gen chọn lọc) cho phép dễ dàng phát hiện tế bào chủ có chứa chúng. Chẳng hạn, nếu vector là plasmid thì tế bào chủ có thể được phát hiện theo kiểu hình của plasmid có mặt trong tế bào chủ, tức đặc tính kháng thuốc giúp vi khuẩn sống được trên môi trường có chất kháng sinh tương ứng. 4.3.4. Các loại vector chuyển gen Hình 3.4: Bản đồ enzyme hạn chế của plasmid pBR322 cải biến, mang hai gen kháng thuốc (tetR đề kháng tetracycline và ampR đề kháng ampicillin) và một loạt vị trí cắt của enzyme hạn chế trong đó mỗi enzyme này chỉ có một vị trí phân cắt, nhờ vậy plasmid vector này áp dụng được với nhiều DNA khác nhau. Có nhiều loại vector được sử dụng trong kỹ thuật di truyền: plasmid, phage M13, cosmid, vector là virus của eukaryotes, YAC (nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men). * Cosmid là vector được cấu tạo nên từ plasmid có gắn thêm gene cos của phage λ. Gene cos giúp cho DNA của phage λ từ dạng thẳng nối đầu lại thành dạng vòng. Cosmid có khả năng chứa đoạn gene lạ dài đến 45kb hiện được dùng để lập thư viện gene ở ruồi dấm, chuột, người. * Phage M13 là phage thể sợi có DNA mạch đơn dùng làm vector nhằm: + Xác định trình tự nucleotide của gene; + Sản xuất các mẫu thử (hay mẫu dò); + Thực hiện đột biến điểm định hướng.
44 * Phagemid là vector được cấu tạo từ plamid gắn thêm một đoạn DNA của phage M13. Việc lựa chọn loại vector tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA cần tạo dòng và mục đích tạo dòng, ở đây chỉ đề cập hai loại vector thông dụng: plasmid và phage. - Các plasmid nói chung có kích thước 2-5kb, nên chỉ chứa rất ít gene chọn lọc và chỉ có thể nhận 8-9 kb DNA cần tạo dòng. - Các phage là những virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn chủ. Việc sử dụng phage làm vector có nhiều ưu điểm hơn vector plasmid ở chỗ hiệu quả xâm nhiễm mạnh và khả năng sinh sôi nảy nở nhanh; kích thước đoạn DNA mà vector có thể tiếp nhận được là lớn hơn rất nhiều. Tuy nhiên, thao tác trên phage thì phức tạp hơn trên plasmid. Trong số các phage được sử dụng làm vector, phần lớn bắt nguồn từ phage lambda (hệ gene chứa 48.502 cặp base, được giải xong năm 1983; nó có hai đầu dính tự nhiên khoảng 12 cặp base, cho phép DNA-λ đóng vòng sau khi xâm nhập vào tế bào chủ). 4.4. Các phương pháp thành lập phân tử DNA tái tổ hợp 4.4.1. Phương pháp sử dụng các đầu dính Bất kỳ đoạn DNA nào nếu được cắt bởi cùng một loại enzyme giới hạn (ví dụ EcoRI) tạo các đầu dính thì có thể dính líp lại với nhau và được nối bởi DNA ligase (hình 3.4). Năm 1973, H. Boyer và tập thể của S. Cohen đã tạo ra được phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên gồm vector là plasmid nhỏ pSC101 của E. coli và DNA “ngoại lai” là một plasmid khác. Chính sự kiện này đặt ra triển vọng to lớn cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp sau này. 4.4.2. Phương pháp nối trực tiếp hoặc tổng hợp các đầu bổ sung Đối với các đoạn DNA được tạo ra bằng việc sử lý enzyme giới hạn cắt thẳng, như HindII chẳng hạn, thì việc nối các đoạn DNA đầu bằng được thực hiện theo một trong hai cách sau: (1) Nối trực tiếp nhờ DNA-ligase của phage T4 (2) Tổng hợp bổ sung các đầu dính vào các đầu 3’ một số nucleotid, ví dụ: poly (dA) vào đầu 3’ của đoạn này và poly (dT) vào đầu 3’ của đoạn kia, nhờ enzyme transferase đầu mút. Sau đó các đoạn này được nối lại nhờ xúc tác của DNA-ligase vi khuẩn. 4.5. Tạo dòng DNA tái tổ hợp Mục đích của việc tạo dòng là nhằm thu được một số lượng lớn bản sao của một đoạn DNA xác định.
45 Về nguyên tắc, một quy trình kỹ thuật DNA tái tổ hợp (tạo dòng) gồm các bước cơ bản sau : Bước 1: Tách DNA và plasmid ra khỏi tế bào, chọn lọc và xử lý DNA thuộc các nguồn khác nhau, một làm vector và một cần cho tạo dòng. Đối với vector, việc chọn lọc tùy thuộc nhiều yếu tố: kích thước đoạn cần tạo dòng, mục đích tạo dòng Đối với DNA cần tạo dòng, cần chọn sơ khởi các đoạn có kích thước gần nhau và tương ứng với loại vector. Sau đó, xử lý cả hai loại DNA trên bởi cùng một loại enzyme giới hạn (ví dụ: EcoRI) để tạo ra các đầu (dính) so le. Bước 2: Kiến tạo phân tử DNA tái tổ hợp trong ống nghiệm. Trộn chung vector và DNA cần tạo dòng đã được xử lý theo một tỷ lệ nhất định với sự có mặt của ligase. Nhờ sự xúc tác của DNA-ligase mà vector tái tổ hợp sẽ được tạo thành; sau đó được tinh sạch qua tách chiết và tủa. Hình 3.4: Sơ đồ minh họa các bước cơ bản của kỹ thuật di truyền Bước 3: Đưa vector tái tổ hợp vào tế bào chủ. Có hai loại tế bào chủ thông dụng nhất là: (1) Tế bào vi khuẩn, thường là E. coli; (2) Tế bào sinh vật nhân chuẩn, ví dụ nấm men S. cerevisiae hoặc tế bào động-thực vật nuôi cấy. Tùy loại tế bào chủ mà sử dụng kỹ thuật biến nạp thích hợp. Nói chung, mục đích của bước này là lợi dụng đặc tính sinh sôi nẩy nở nhanh của tế bào chủ và sử dụng bộ máy tế bào chủ để tái bản vector tái tổ hợp thành một số lượng lớn bản sao hoặc có thể cho biểu hiện gen (protein) mong muốn.
46 Bước 4: Phát hiện dòng DNA tái tổ hợp đặc hiệu. Để phát hiện dòng cần tìm, người ta có thể sử dụng công cụ là mẫu dò (probe). Mẫu dò có thể là một kháng thể đặc trưng cho protein được mã hóa bởi gen cần tìm hoặc một đoạn DNA hoặc RNA bổ sung cho gen cần tìm. 4.6. Ứng dụng của công nghệ DNA tái tổ hợp Trong suốt hai thập kỷ qua, công nghệ DNA tái tổ hợp đã mang lại những tiến bộ to lớn cho sinh học. Những ứng dụng chủ yếu của nó là: - Sản xuất các protein, enzyme, vaccine hữu ích; tạo ra các vi khuẩn, nấm men có khả năng tổng hợp các chất có ý nghĩa về mặt kinh tế. - Gây ra những biến đổi kiểu gen ở các cơ thể sinh vật liên quan đến những đặc tính mong muốn. Tạo nguồn DNA và RNA cho các nghiên cứu. - Tạo ra khả năng sửa chữa các khuyết tật di truyền ở động vật và người (liệu pháp gen hình 3.5) - Chèn gene khoẻ vào trong ribonucleic acid (RNA)của Retroviruses;- Cho restrovirus tiếp cận tế bào bị bệnh; - Thêm gene khoẻ vào deoxyribonucleic acid ( DNA) tế bào bị bệnh; - Tiêm vào bệnh nhân. Công nghệ DNA tái tổ hợp mở ra một triển vọng to lớn trong tương lai gần để giúp con người khám phá bí ẩn của cơ thể vi sinh vật và con người, trên cơ sở đó có thể nâng cao năng suất vật nuôi, cây trồng và bảo vệ sức khỏe con người. Hình 3.5: Phương pháp chữa bệnh bằng gen Câu hỏi ôn tập
47 1. Các kiểu phân loại sản phẩm hiện nay ? Theo anh (chi) kiểu phân loại nào hợp lý nhất ? Vì sao ? 2. Đặc điểm của sản phẩm bậc hai ? 3. Ý nghĩa thực tiễn của việc nghiên cứu sinh tổng hợp thừa ? 4. Thế nào là enzyme hạn chế ? Chúng có các vai trò và tính chất nào được coi là quan trọng đối với kỹ thuật DNA tái tổ hợp ? 5. Bằng hai ví dụ về enzyme cắt hạn chế, hãy chứng tỏ rằng ít nhất có hai phương pháp thành lập các phân tử DNA tái tổ hợp trong ống nghiệm (in vitro). 6. Thế nào là phân tử DNA tái tổ hợp, vector tách dòng ? Hãy nêu các bước của quy trình tạo dòng và cho sơ đồ minh họa. 7. Anh (chị) hãy nêu một số ứng dụng khác nhau của công nghệ DNA tái tổ hợp.
48 Chương 4 Các phương pháp và kĩ thuật lên men I. Quá trình lên men 1. Quy trình lên men (hình 4.1) Giống đông khô Chế tạo môi trường Nguyên liệu (C,N,P,K) dinh dưỡng dầu phá bọt, muối khoáng, nước Giống thạch nghiêng Khử trùng Khử trùng thiết bị, môi trường hệ thống đường ống, hệ lọc khí Giống nuôi trên máy lắc Cung cấp không khí Lên men vô trùng Nhân giống trong nồi nhân giống Thu hoạch tinh chế tạo thành phẩm Hình 4.1 Sơ đồ quá trình lên men 2. Chủng giống Để chọn được giống vi sinh vật thuần chủng, bước đầu tiên phải phân lập chúng từ các nguồn tự nhiên như nước, không khí, đất, các vật liệu hữu cơ, vô cơ đã bị phân hủy Từ những kĩ thuật vi sinh vật học cổ điển từ thời L. Pasteur và R. Koch đề ra, nhiều phương pháp đặc biệt dùng để phân lập chủng giống thuần khiết dùng cho công nghiệp đã được phát triển, nhất là trong việc tìm chủng sản xuất những chất kháng sinh mới. Từ những ổ sinh thái tự nhiên sẽ phân lập được các chủng hoang dại. Các chủng này có một số hoạt tính sinh enzyme, tích tụ các chất trao đổi bậc 1, bậc 2 nhưng thường cho năng suất thấp. Theo kĩ thuật vi sinh vật cổ điển việc phân lập các chủng thuần khiết mất nhiều công sức và chậm. Ngày nay, người ta dùng phương pháp sàng lọc vừa nhanh vừa có hiệu quả. Phương pháp sàng lọc chủ yếu được sử dụng trong việc tìm chủng sản các chất kháng sinh. Từ nguyên lí cơ bản
49 phương pháp đã được cải tiến ngày một phong phú. Để chọn các chủng sản sinh aminoacidngười ta đã sử dụng kiểu chọn lọc theo kĩ thuật penicillin. Trong phương pháp này các điều kiện được lựa chọn sao cho các tế bào hoang dại có thể phát triển trong môi trường dinh dưỡng thiếu một aminoacidnào đó và bị giết chết bằng penicillin. Các tế bào cần aminoacid(tự dưỡng acid amin) không sinh trưởng được nên sẽ sống sót. Đối với vi khuẩn không mẫn cảm với penicillin thì dùng chất kháng sinh khác, như canamycin hay xycloserin, đối với nấm men thì dùng nystatin là thích hợp. Để phân lập những chủng có tính chất đặc biệt, ví dụ như chuyển hóa steroid, người ta dùng hỗn hợp của nhiều chủng vi sinh vật đem nuôi cấy trong cùng một môi trường có chất mà ta muốn thực hiện sự biến đổi. Sau khi nuôi, chiết xuất và tách sản phẩm phân tích theo phương pháp sắc kí. 3. Nguyên liệu cấy Giống sản xuất thường được bảo quản để tránh giảm hoạt tính. Do đó, việc cấy giống trên môi trường thạch nghiêng trước khi nhân giống là việc làm rất cần thiết. Có thể coi đây là việc “đánh thức” chủng giống đồng thời để kiểm tra hoạt tính của giống sau một thời gian bảo quản ở nhiệt độ thấp. Từ những những tế bào hoặc bào tử riêng rẽ của chủng bảo quản, cấy ra một số culture, những culture này được nhân giống trong phòng thí nghiệm và được kiểm tra hoạt tính. Nếu có sự khác nhau thì dùng culture có hoạt tính mạnh nhất để gây nguyên liệu cấy và tạo thành chủng mới. 4. Nhân giống Cũng giống như trong phòng thí nghiệm và qui mô pilot, muốn thực hiện một quá trình lên men ở qui mô công nghiệp phải tiến hành nhân giống, đảm bảo số lượng tế bào với tuổi sinh lí đang ở thời kỳ hoạt động mạnh nhất để cấy vào môi trường lên men. Nhân giống ở đây có thể phải qua 2-3 bước, ta thường gọi là nhân giống cấp 1, cấp 2, cấp 3 v.v tuỳ thuộc vào quy mô sản xuất. Việc nhân giống thường diễn ra bằng cách nuôi chìm. Các điều kiện nuôi được lựa chọn sao cho chỉ xảy ra sự sinh trưởng chứ không xảy ra sự tạo thành sản phẩm. Khi sử dụng nấm sinh bào tử và xạ khuẩn, trước khi nuôi chìm, người ta thực hiện nhân bào tử trên môi trường đặc như môi trường cám, bột ngô Nhân giống cấp 1 được tiến hành trên máy lắc với nhiệt độ và thời gian tuỳ thuộc vào nồi nhân giống (tương tự nồi lên men) có sục khí và ổn nhiệt. Tỷ lệ nhân giống từ ống nghiệm vào bình tam giác có thể chỉ một vòng que cấy hoặc cả dịch huyền phù của một ống giống. Từ nhân giống cấp 1 sang cấp 2 (hoặc từ cấp 2 sang cấp 3) tỉ lệ giống thường là 1- 10%
50 thể tích dịch lên men hoặc là cao hơn, từ dịch nhân giống cuối cùng vào nồi lên men khoảng 0,5-10% tuỳ thuộc vào đặc tính từng chủng vi sinh vật. Hình 4.2: Máy lắc ổn nhiệt (Personal-11 , TAITEC) Thành phần môi trường nhân giống và môi trường lên men gần giống nhau. Thông thường thì hàm lượng carbon ở môi trường nhân giống thấp hơn môi trường lên men, nhưng các thành phần khác thì giàu hơn, đặc biệt là các chất sinh trưởng để phục vụ cho sinh sản và phát triển của giống vi sinh vật. Chế độ nuôi đặc biệt là nhiệt độ giữa nhân giống và lên men cũng khác nhau (nếu cùng chế độ nhiệt độ thì không cần phải quan tâm lắm). Nhưng nếu nhiệt độ lên men thấp (như lên men bia) thì cần phải nhân giống với nhiệt độ giảm dần để khi vào lên men, giống không bị choáng sốc. Chế độ sục khí ở các công đoạn này cũng khác nhau, thường thì trong thời gian nhân giống nhu cầu về ôxy cao như trong pha sinh trưởng của lên men hoặc cao hơn. Nói chung một chủng vi sinh vật nhân giống để đưa vào lên men đảm bảo các yêu cầu công nghệ như sau: - Dịch giống không được tạp nhiễm, đặc biệt là thực khuẩn thể (Bacteriophage). - Các tế bào đảm bảo ở độ tuổi sinh lí ở thời gian sinh trưởng tốt nhất, có hoạt tính cao nhất, thường là nữa sau của pha chỉ số. - Các thông số kĩ thuật như OD, pH, màu sắc, mùi vị đúng như quy định của từng dây chuyền công nghệ.
51 5. Nồi lên men Các nồi lên men được thiết kế và chế tạo sao cho có thể tạo được những điều kiện tối ưu cho từng quá trình lên men. Những yêu cầu có thể đạt được hoạt tính tối đa của vi sinh vật được thực hiện thông qua một số nguyên tắc kĩ thuật. Nồi lên men chứa môi trường nuôi có khả năng tạo thành sản phẩm với năng suất cao. Trong qúa trình lên men cần theo dõi liên tục sự tạo thành sản phẩm và trạng thái vô trùng để dừng quá trình đúng vào thời điểm thu hoạch tốt nhất. Hình 4.3: Nồi lên men 75 lít ở Trung tâm CNSH-ĐHQGHN 6. Thu nhận sản phẩm và xử lí sau thu hoạch Việc thu nhận sản phẩm được bắt đầu bằng cách tách riêng tế bào ra khỏi môi trường dinh dưỡng. Nếu là những cơ thể có dạng hệ sợi thì người ta thường lọc, còn đối với vi khuẩn và nấm men thì li tâm. Việc xử lý tiếp theo là tuỳ theo sản phẩm được tiết ra môi trường dinh dưỡng hay tồn tại trong tế bào. Bản chất hoá học của sản phẩm quy định các biện pháp xử lý tiếp theo. Các biện pháp được sử dụng là chiết rút, hấp phụ, sàng phân tử và kết tủa. Các bước tinh chế tiếp theo được tiến hành kế tiếp ngay sau bước tách sản phẩm thường phải qua nhiều cấp, trước khi sản phẩm cuối cùng được đóng gói. Việc thu nhận sản phẩm với hiệu suất cao có ý nghĩa quyết định đối với tính kinh tế của một phương pháp. Bởi vậy, vấn đề tách và cô lập sản phẩm phải được chú ý ngay từ khi chọn chủng và chọn dịch dinh dưỡng. Việc tối ưu hoá phương pháp có liên quan đến tất cả các bước. Việc loại
52 bỏ và sử dụng các phế và phụ phẩm cũng cần được chú ý tránh gây ô nhiễm môi trường. Hình 4.4: Máy li tâm ( centrifuge) II. Vi sinh vật 1. Sinh vật nhân chuẩn 1.1. Nấm men Nấm men (Yeast, Levure) thường tồn tại ở dạng đơn bào, đa số sinh sản theo lối nảy chồi, cũng có khi theo hình thức phân cắt tế bào, nhiều loại có khả năng lên men đường và thích nghi với môi trường chứa đường cao, có tính acid cao. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có chứa đường, có pH thấp, chẳng hạn như trong hoa quả, rau dưa, rỉ đường, trong đất trồng các loại cây ăn quả, trong đất có nhiễm dầu mỏ. Nhiều loài nấm men có ứng dụng cao trong sản xuất công nghiệp như lên men bia rượu, glycerine, sản xuất nấm men bánh mì, thức ăn gia súc 1.2. Nấm sợi Nấm sợi (Microfilamentous fungi) là tất cả các nấm không phải nấm men và cũng không sinh mũ nấm. Nấm sợi còn gọi là nấm mốc, có dạng sợi phân nhánh, không hoặc có vách ngăn, lối sống hiếu khí, chủ yếu là hoại sinh. Nấm sợi phân bố rộng rãi trong tự nhiên, tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn. Rất nhiều loài nấm được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp enzyme, công nghiệp dược phẩm, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng thực vật Nhiều nấm sợi kí sinh trên người, động vật và thực vật gây ra các bệnh nấm nguy hiểm. Một số nấm sợi phát triển nhanh trên các chất hữu cơ gây hư hỏng lương thực, thực phẩm, nguyên vật liệu
53 1.3. Tảo (Algae) Vi tảo (Microalgae) gồm các đại diện có khả năng quang hợp, có dạng đơn bào sống thành tập đoàn, phân bố chủ yếu ở môi trường nước ngọt, nước mặn và ở đất ẩm. Vi tảo có thể sinh sản theo hình thức dinh dưỡng, vô tính và hữu tính. Nhiều loài vi tảo có ứng dụng trong sản xuất và đời sống như thu sinh khối giàu protein làm thức ăn cho người và gia súc (Chlorella), nuôi tảo silic (Skeletonema costatum) làm thức ăn cho ấu trùng tôm, tách acid béo không no. Sử dụng vi tảo cho xử lí môi trường (Scenedesmus) hoặc làm sinh vật chỉ thị trong môi trường nghèo calcium (calcium) (tảo lục Desmid). 1.4. Nấm quả thể Nhiều loài nấm có quả thể được sử dụng để làm thực phẩm, do nấm giàu protein, chất khoáng, các vitamin A, B1, B2, C, D, E. Ngoài ra chúng còn có nhiều đặc tính của biệt dược, có khả năng phòng và chữa bệnh hạ huyết áp, chống béo phì, đường ruột, hỗ trợ chữa ung thư. Đa số nấm ăn thuộc ngành nấm đảm (Basidiomycota), thường gặp nấm ăn thuộc bộ Agaricales như nấm rơm Volvariella volvaceae, Agaricus bisporus Ngoài giá trị tài nguyên, thực phẩm và dược phẩm, nhiều loài nấm có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và đời sống do chúng có khả năng sản sinh ra nhiều chất có ích như eter, acid acetic, acid tanic, các chất kháng sinh Nhiều loài nấm có khả năng hấp thụ và đào thải các chất phóng xạ, một số loài nấm được sử dụng để phân giải các chất thải độc hại và các nguồn phế liệu gây ô nhiễm môi trường. 2. Sinh vật nhân sơ 2.1.Vi khuẩn Vi khuẩn (Bacteria) có nhiều hình thái và cách sắp xếp khác nhau, kích thước khá nhỏ so với nấm sợi và nấm men. Phần lớn vi khuẩn thuộc nhóm dị dưỡng, đời sống có thể hiếu khí, kị khí hoặc là dạng sống tuỳ nghi. Nhiều vi khuẩn có ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Điển hình như các loài vi khuẩn lên men các acid hữu cơ (lactic, propionic ), sản sinh enzyme, acid acetic, acid glutamic, lysine, vitamin, lên men methane, sản xuất phân bón, thuốc trừ sâu sinh học 2.2. Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Phần lớn xạ khuẩn là hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ti). Xạ khuẩn là một trong những nhóm vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên. Chúng tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong tự nhiên. Trên 80%
54 chất kháng sinh được phát hiện là do xạ khuẩn sinh ra. Xạ khuẩn còn được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme, vitamin, acid hữu cơ 2.3. Vi khuẩn lam Trước đây vi khuẩn lam (Cyanobacteria) được gọi là tảo lam (Cyanophyta) hay tảo lam lục. Thực ra đây là một nhóm vi sinh vật nhân nguyên thủy thuộc vi khuẩn thật. Vi khuẩn lam có khả năng tự dưỡng quang năng nhờ có chứa sắc tố quang hợp. Vi khuẩn lam phân bố rộng rãi trong tự nhiên, nhiều loài có ý nghĩa trong sản xuất sinh khối giàu protein, cố định đạm hay sử dụng trong công nghiệp xử lí nước thải 3. Các tiêu chuẩn của một vi sinh vật dùng trong công nghiệp 3.1. Khả năng sử dụng nguyên liệu Tính kinh tế của một quá trình sản xuất đòi hỏi phải sử dụng các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, đơn giản và các chủng vi sinh vật không đòi hỏi quá cao về nhu cầu dinh dưỡng. Thông thường, nguồn carbon và nitơ (nitrogen) dùng cho sản xuất là những nguồn thông dụng như các loại rỉ đường, tinh bột, dịch kiềm sulfid, nguồn nitơ kĩ thuật như cao ngô, bột đậu tương. 3.2. Tính chất sản phẩm phụ Yêu cầu các chủng vi sinh vật dùng trong sản xuất là không tạo thành các sản phẩm phụ không mong muốn. Thực ra thì trong quá trình sống vi sinh vật luôn tạo thành nhiều sản phẩm trao đổi chất tích luỹ trong môi trường, một số sản phẩm trao đổi chất có thể không có lợi cho chính trao đổi chất của tế bào và có thể gây ức chế tế bào. Sự tích luỹ nhiều các sản phẩm phụ trong môi trường một mặt làm giảm hiệu suất tạo thành sản phẩm chính, mặt khác gây nhiều khó khăn cho quá trình thu nhận và tinh khiết sản phẩm. 3.3. Mức độ mẫn cảm với sự lây tạp và khả năng tách sản phẩm khỏi môi trường Trong quá trình lên men thường bị nhiễm các vi sinh vật lạ. Nguồn lây nhiễm có thể từ nguyên liệu, không khí hay từ thiết bị lên men. Nếu các vi sinh vật lạ cũng thích nghi với điều kiện sống trong môi trường lên men thì chúng sẽ cạnh tranh với chủng sản xuất đồng thời tạo ra các chất có tác dụng ức chế hoặc gây chết đối với chủng sản xuất. Do đó, các chủng sản xuất phải được lựa chọn sao cho không mẫn cảm với sự tạp nhiễm do các vi sinh vật lạ và đặc biệt là với bacteriophage. Trong trường hợp bị nhiễm bacteriophage lượng giống trong môi trường lên men có thể giảm rất nhanh. Ví dụ trong môi trường bị nhiễm vi khuẩn butiric có thể
55 ảnh hưởng mạnh đến sức sống của giống bởi vì một lượng nhỏ của acid butiric tạo thành đã gây độc đối với tế bào. Ngoài các chỉ tiêu trên, khả năng tách sản phẩm ra khỏi môi trường lên men cũng là một tiêu chuẩn để chọn chủng vi sinh vật cho sản xuất, bởi vì có nhiều quá trình sản xuất cho sản phẩm nhiều nhưng việc tách sản phẩm khó thực hiện và hiệu quả kinh tế thấp. III. Cơ chất dinh dưỡng 1. Nguyên tố đại lượng C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe Môi trường dinh dưỡng phải chứa tất cả các nguyên tố cần thiết cho sinh trưởng và tạo thành sản phẩm. Các môi trường để nuôi cấy vi sinh vật cần thiết bổ sung các nguyên tố khoáng. Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật đòi hỏi phải được cung cấp với liều lượng lớn được gọi là các nguyên tố đại lượng, bao gồm các nguyên tố như C, O, N, H, P, S, Mg, Ca, Fe. Nhu cầu về chất khoáng của vi sinh vật khác nhau phụ thuộc loài, giai đoạn sinh trưởng phát triển. Nồng độ cần thiết về muối khoáng của các nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn thường thay đổi trong các phạm vi sau (bảng 4.1). 2. Nguyên tố vi lượng Mn, Na, B, Mo, Zn, Cu, Ni, Va, Cl, Si Bảng 4.1: Nồng độ cần thiết về muối khoáng của nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn Nồng độ cần thiết (g/l) Muối khoáng Đối với nấm và xạ Đối với vi khuẩn khuẩn K2HPO4.3H2O 0,2 - 0,5 1 - 2 KH2PO4 0,2 - 0,5 1 - 2 MgSO4.7H2O 0,1 - 0,2 0,2 - 0,5 MnSO4.4H2O 0,005 - 0,01 0,02 - 0,1 FeSO4.7H2O 0,005 - 0,01 0,05 - 0,2 Na2MoO4 0,001 -0,005 0,01 - 0,02 ZnSO4.7H2O - 0,02 - 0,1 CoCl2 tới 0,03 tới 0,06 CaCl2 0,01 - 0,03 0,02 - 0,1 CaSO4.5H2O 0,001 - 0,005 0,01 - 0,05 Những nguyên tố khoáng mà vi sinh vật chỉ đòi hỏi với liều lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng, bao gồm các nguyên tố như Mn, Na, B, Mo, Zn, Cu, Ni, Va, Cl, Si Nồng độ cần thiết của từng nguyên tố vi lượng trong môi trường thường chỉ vào khoảng 10-6 - 10-8 M.
56 Thông thường, khi chế tạo môi trường nuôi cấy vi sinh vật không cần bổ sung các nguyên tố vi lượng vì trong các thành phần khoáng đại lượng hoặc trong nguyên liệu hay nước để pha chế môi trường đã có đủ thành phần vi lượng. Ngoại trừ một số trường hợp như bổ sung Zn vào môi trường nuôi cấy nấm mốc, Co vào môi trường nuôi cấy vi khuẩn sinh tổng hợp vitamin B12 nhưng với hàm lượng thấp (khoảng 3-5 µg/l). 3. Dịch dinh dưỡng cho các vi sinh vật dị dưỡng Trong quá trình lên men, một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng giống vi sinh vật. Những chủng vi sinh vật dùng cho công nghiệp đều là các giống dị dưỡng, trừ các chủng tảo thuộc giống tự dưỡng. Các chủng của tảo thường được nuôi cấy trong các quá trình khử bẩn cho nước thải hoặc nuôi tảo thu sinh khối. Những vi sinh vật dị dưỡng chỉ sản sinh năng lượng trong ATP dùng cho sinh trưởng nhờ quá trình ôxy hoá những hợp chất hữu cơ. ATP là thành phần quan trọng nhất mà tế bào dùng để vận chuyển năng lượng. Trong những phản ứng không thuận lợi về phương diện nhiệt động, ATP cho phép thực hiện những phản ứng với tốc độ thích hợp. Trong công nghệ vi sinh, môi trường nuôi cấy những chủng dị dưỡng thường có các thành phần như sau: 3.1. Nguồn carbon và năng lượng Nguồn carbon và năng lượng thường được sử dụng là tinh bột, mật rỉ, saccharose, glucose, dịch đường thuỷ phân từ bột hoặc gỗ v.v Một số loài vi sinh vật có khả năng sử dụng cellulose, hemicellulose đặt biệt là carbuahydro (alkan, methane). Chủ yếu nguồn carbon sử dụng là carbohydrate. Lượng carbon được bổ sung vào môi trường tuỳ thuộc chủng giống vi sinh vật. Một số chủng hiếu khí sử dụng khoảng 50% cơ chất, còn các chủng kỵ khí tuỳ tiện chỉ dùng tới 10% cho sinh trưởng. 3.2. Nguồn nitơ Nguồn nitơ chủ yếu trong công nghệ lên men là nước amoniac và muối ammon. Dùng vào mục đích này còn có các nguồn nitơ hữu cơ như cao ngô, dịch thuỷ phân nấm men, thuỷ phân khô lạc, đậu tương, hạt bông, các bã thải của công nghệ bia (dịch ngâm malt hoặc rễ mầm malt), bã thải rau quả, khoai tây, sữa loại bỏ mỡ, phụ phẩm khi chế biến pho mát, thịt cá Các nguồn nitơ hữu cơ với vai trò làm nguồn nitơ và cả nguồn carbon, đồng thời còn cung cấp các chất sinh trưởng. Vì vậy, khi sử dụng các nguồn nitơ hữu cơ, vi sinh vật thường phát triển mạnh hơn. 3.3. Nguồn phospho (phosphorus)
57 Nguồn phospho cung cấp cho môi trường lên men ở dạng muối phosphate hoặc acid phosphoric. Phospho hữu cơ (phytin) còn có trong cao ngô, bột đậu tương, trong các loại cám 3.4. Các nguồn khoáng khác - Nguồn lưu huỳnh bổ sung vào dịch lên men ở dạng muối sulfate. - Nguồn Mg và K thường được đưa vào dưới dạng cation của muối phosphate và sulfate. Trong một số quá trình lên men, calcium được đưa vào môi trường ở dạng muối carbonate để duy trì pH ở vùng trung tính hoặc gần trung tính khi acid được tạo thành (ví dụ như lên men tạo các acid hữu cơ) - Nguồn Fe: thông thường trong các nguyên liệu sử dụng đã có đủ sắt, nên ít khi phải bổ sung. 3.5. Vitamin và các yếu tố sinh trưởng khác Trong các môi trường dinh dưỡng dùng cho công nghiệp, vitamin và các yếu tố sinh trưởng thường được bổ sung ở dạng nguyên liệu làm giàu vitamin như cao ngô, rỉ đường, cao nấm men. Chúng chứa hỗn hợp các acid amin, vitamin và cả một số yếu tố khác chưa biết rõ, ví dụ như các dịch chiết động vật hay thực vật. Lượng có ích của các yếu tố đặt biệt đó đôi khi chỉ cần rất ít. Ví dụ α - alanine có hiệu lực ở nồng độ 1/100.000.000, còn acid pantotenic có hiệu lực ở nồng độ 1/50.000. Những yếu tố chưa biết rõ đó gọi chung là các yếu tố sinh trưởng. Cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân từ nguồn protein thực vật, động vật vừa đóng vai trò là nguồn nitơ hữu cơ vừa là nguồn cung cấp các chất sinh trưởng cần thiết. Ngoài ra, trong công nghệ vi sinh còn dùng nước chiết cám, dịch ép khoai tây, dịch ép giá đậu, dịch ép cà chua, bắp cải hoặc một số rau quả khác cũng chứa nhiều vitamin và dùng làm nguồn kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy vi sinh vật. Dịch dinh dưỡng chứa các chất dinh dưỡng ở một nồng độ đủ đảm bảo suốt quá trình nuôi. Như vậy, nguồn carbon và năng lượng được đưa vào ở phạm vi 10-100g/l. Ở nhiều cơ thể, nồng độ cần thiết để duy trì tốc độ sinh trưởng cực đại là rất nhỏ; đối với đường thì khoảng 1-10mg/l. Với aminoacid và vitamin thì tế bào chỉ cần nồng độ 1-100 μg/l. Các trị số có tính đặc hiệu cơ thể và đặc hiệu quá trình. Dịch dinh dưỡng dùng trong lên men chứa các thành phần cần thiết thường không ở một tỷ lệ cân đối mà sinh trưởng đòi hỏi. Nhờ những điều kiện như tỷ lệ C : N cực trị hoặc sự thiếu phosphate mà trao đổi chất có thể được điều khiển theo hướng có ý nghĩa cho việc tổng hợp sản phẩm mong muốn. Điều đó đúng với các nguyên tố đại lượng cũng như vi lượng. Chẳng hạn bằng cách đưa Co vào
58 mà đạt được thu hoạch cao về vitamin B12, hay sự thiếu sắt kích thích quá trình tổng hợp acid citric. 4. Nguồn carbon kĩ thuật và nguồn nitơ kĩ thuật 4.1. Rỉ đường Trong công nghiệp đường thường thu được mật rỉ là dịch đường sau khi đã kết tinh. Các loại mật rỉ gồm có: - Mật rỉ hydrol: dịch thu được sau khi kết tinh glucose ở các xí nghiệp thủy phân bột bằng acid để sản xuất glucose. Trong hydrol có tới 40 - 50% glucose và có một hàm lượng đáng kể NaCl. - Rỉ đường: ở các nhà máy đường sản xuất saccharose có một phụ phẩm với tỉ lệ khá lớn, đó là rỉ đường. Đây là một loại nước cốt được tách ra sau khi kết tinh đường. Có hai loại rỉ đường là rỉ đường củ cải và rỉ đường mía (tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu của nhà máy đường). Cả hai loại rỉ này đều có màu nâu sẩm do được nấu và cô nhiều lần nên có nhiều caramen và melanoid tạo thành. Trong rỉ đường có tới 70 - 80% chất khô, trong đó chủ yếu là đường saccharose 46 - 54%, đường khử 6 - 9%, rafinose 1- 2%, N tổng 0,45 - 2,88% và chất khoáng 3 - 4%. Các chất hữu cơ có trong rỉ đường là các acid, rượu, acid amin, purine và các vitamin. Hàm lượng các muối phosphate trong rỉ đường thường rất thấp. Phần lớn các hợp chất phospho nằm ở phần cặn lắng. Do đó, khi dùng rỉ đường đã xử lí và loại bỏ cặn thì nhất thiết phải bổ sung nguồn phospho vào môi trường dinh dưỡng. Trong rỉ đường có chứa các hợp chất có tác dụng kích thích sinh trưởng vi sinh vật, nhưng nếu dùng rỉ đường với nồng độ cao thì sinh trưởng của các chủng sản xuất sẽ bị kìm hãm, vì trong rỉ đường có chứa các chất có tác dụng ức chế như SO2, hydroxy-methyl-fucfural hay kalium - imido - disulfonate, chất này có thể sinh ra từ sulfate và nitrate do vi khuẩn tạo thành. Trong rỉ đường có chứa hàm lượng lớn biotine (vitamin H) là chất sinh trưởng rất cần thiết đối với nhiều loài vi sinh vật và là chất điều hòa trong quá trình sinh tổng hợp acid amin, hàm lượng khoảng 20 - 120 mg/kg trong rỉ đường mía và 0,01 - 0,13 mg/kg trong rỉ đường củ cải. Các vitamin trong rỉ đường ngoài biotine còn có vitamin B1, B2, PP, acid pantotenic 4.2. Dịch kiềm sulfid Trong công nghiệp men còn sử dụng dung dịch thủy phân từ gỗ - dịch kiềm sulfid là phế thải của công nghiệp giấy. Thành phần chính của dịch kiềm sulfid là linhosunfonate và các đường pentose. Thành phần của dịch kiềm sulfid từ gỗ của cây lá bản và cây lá kim là khác nhau. Ngoài ra,
59 thành phần này cũng thay đổi nhiều tuỳ theo mức độ khai thác. Dịch kiềm sulfid của gỗ cây lá bản chiếm tỉ lệ cao các đường pentose (khoảng 80% đường) thường sử dụng để nuôi cấy thu sinh khối nấm men. Còn dịch kiềm sulfid gỗ cây lá kim thì các hexose lại chiếm ưu thế (khoảng 70% đường) dùng để lên men thu rượu. Việc tiền xử lý chất thải này trước lên men là tối thiểu. Bơm hơi nước hoặc thông khí ở pH 1,5 - 3,0 là cần thiết để loại SO2 là chất vốn kìm hãm sinh trưởng của vi sinh vật. Sau đó pH sẽ được điều chỉnh tới tối ưu (pH khoảng 5) và môi trường được bổ sung các chất dinh dưỡng chứa nitơ và phosphate. 4.3. Các nguyên liệu thủy phân tinh bột Để cung cấp nguồn carbon chủ yếu là glucose thì bột sắn có lẽ là nguồn nguyên liệu tốt nhất. Trong bột sắn chứa chủ yếu là tinh bột, hàm lượng N hữu cơ, chất khoáng, vitamin có với lượng rất nhỏ. Thủy phân các loại tinh bột thường thực hiện theo hai cách: - Thủy phân bằng acid với áp lực dư. Dịch thủy phân thu được qua trung hòa bằng Na2CO3 hoặc NaOH, nếu dùng H2SO4 làm tác nhân thủy phân thì có thể dùng CaCO3 hoặc nước vôi để trung hòa, sau đó đem lọc qua lọc ép khung bản với than hoạt tính khử màu. Dịch thủy phân này chứa chủ yếu là đường glucose, một lượng nhỏ các acid amin, có mặt các chất bẩn, khoáng được dùng để chuẩn bị môi trường nuôi cấy hoặc đem cô đặc tới 60 - 70% chất khô để sử dụng dần. - Thủy phân bằng enzyme: Các chế phẩm enzyme chủ yếu là từ nấm mốc được nuôi cấy bề mặt hoặc bề sâu, dùng với tư cách là phức hệ amylase gồm có α, β - amylase và glucoamylase. Sản phẩm thu được là hỗn hợp maltose và glucose. Cũng có trường hợp dùng phối hợp chế phẩm enzyme từ mốc và chế phẩm enzyme từ vi khuẩn nuôi bề sâu (α - amylase chịu nhiệt) nên hiệu quả của quá trình sẽ cao hơn. Phương pháp thủy phân các loại bột (bột sắn, gạo, ngô, bột mì, cao lương, khoai tây) bằng các chế phẩm enzyme này được dùng trong công nghiệp sản xuất rượu cồn. 4.4. Hạt và bột ngũ cốc Các loại bột ngũ cốc thường được dùng là bột gạo, bột ngô được tách phôi, bột mỳ, bột đại mạch Ngoài thành phần chủ yếu là tinh bột, các loại bột này còn chứa khoảng vài phần trăm các hợp chất protein, các chất xơ (chủ yếu là cellulose) và các chất khoáng. Bột sắn là loại nguyên liệu khá rẻ tiền so với các loại bột khác hiện nay đang được sử dụng nhiều cho công nghệ lên men đặc biệt là lên men cồn.
60 Các nguyên liệu tinh bột trong lên men có thể dùng trực tiếp làm thành phần của môi trường dinh dưỡng cho các chủng sinh ra enzyme amylase ngoại bào, đặc biệt là trong phương pháp nuôi cấy bề mặt. Ngoài ra, nguồn nguyên liệu này còn qua một giai đoạn thủy phân thành dung dịch các loại đường rồi mới dùng chuẩn bị môi trường dinh dưỡng. Ngoài ra, các parafin có mạch từ C8 - C18, khí methane có thể được sử dụng làm nguồn carbon nuôi cấy vi sinh vật thu cồn hoặc protein đơn bào cho sản xuất thức ăn gia súc. 4.5. Nguồn nitơ kĩ thuật - Bột đậu tương được dùng như là một nguồn nitơ kĩ thuật tương đối phổ biến trong nhiều môi trường dinh dưỡng. Trong bột đậu tương có tới gần 40% là protein và khoảng 19% chất béo, có đủ các acid amin. Đối với sinh tổng hợp nhiều chất kháng sinh không những chỉ có các hợp chất protein mới có tác dụng mà còn phải kể đến các chất béo có trong đậu tương. Cùng với bột đậu tương hoặc khô dầu đậu tương người ta còn dùng bột khô lạc (lạc sau khi ép dầu), bột hoặc khô dầu các loại hạt bông, hạt hướng dương vào trong mục đích này. - Nước chiết ngô và cao ngô là sản phẩm phụ trong công nghiệp chế biến bột ngô. Trước khi xay, ngô được ngâm với dung dịch natrium sulfid. Trong khi ngâm, các acid amin, vitamin được chiết ra và hòa tan vào dung dịch. Nước chiết ngô có thể dùng trực tiếp để pha chế môi trường dinh dưỡng, nhưng thông thường người ta cô trong điều kiện chân không tới 50% chất khô ở dạng sệt gọi là cao ngô. Trong cao ngô có 6,4 - 8% N tổng số, khoảng một phần nửa là các acid amin, phần còn lại là peptide và protein, hàm lượng carbohydrate dao động trong phạm vi khá rộng do có liên quan đến lên men lactic, hàm lượng tro 15 - 20%, nhiều vitamin đặc biệt là vitamin nhóm B và biotine. - Nước chiết nấm men và cao nấm men: sinh khối men bia hoặc men rượu được rửa sạch và cho tự phân ở 48 – 520C trong 2 - 3 ngày, lọc bỏ bã, thu được dịch thủy phân gọi là nước chiết nấm men, cô đặc có cao nấm men. Các sản phẩm này giàu acid amin, peptid cùng nhiều vitamin nhóm B và các chất khoáng. Trong cao nấm men có 40 - 50% chất khô, 0,6 - 1,5 N tổng số, 0,3 - 0,5 N - amin (trong đó có mặt 18 loại acid amin). - Dịch thủy phân các loại khô dầu (đậu tương, lạc, bông, hướng dương) và thịt, cá giàu nitơ hữu cơ, nhiều acid amin. Nếu thủy phân bằng acid thì nhiều vitamin và một hay hai aminoacidbị phá hủy (như triptophan và một phần cysteine), còn thủy phân bằng enzyme thì các thành phần này đầy đủ hơn. Dùng các dịch thủy phân này làm nguồn nitơ