Giáo trình môn Sinh học phân tử

Nội dung text: Giáo trình môn Sinh học phân tử

1. Lờ i nói đ ầ u Sinh họ c phân t ử là khoa h ọ c nghiên c ứ u các hi ệ n t ượ ng s ố ng ở m ứ c đ ộ phân t ử . Phạ m vi nghiên c ứ u c ủ a môn h ọ c này có ph ầ n trùng l ặ p v ớ i m ộ t s ố môn h ọ c khác trong sinh họặệ c đ c bi t là di truy ềọ n h c và hóa sinh h ọ c. Sinh h ọ c phân t ửủếậ ch y u t p trung nghiên cứ u m ố i t ươ ng tác gi ữ a các h ệ th ố ng c ấ u trúc khác nhau trong t ế bào, bao gồ m m ố i quan h ệ qua l ạ i gi ữ a quá trình t ổ ng h ợ p c ủ a DNA, RNA và protein và tìm hiể u cách th ứ c đi ề u hòa các m ố i t ươ ng tác này. Hiệ n nay, sinh h ọ c phân t ử và sinh h ọ c t ế bào đ ượ c xem là n ề n t ả ng quan tr ọ ng củ a công ngh ệọờ sinh h c. Nh phát tri ể n các công c ụơảủ c b n c a sinh h ọ c phân t ửư nh các enzyme cắ t h ạ n ch ế , DNA ligase, các vector t ạ o dòng, lai phân t ử , k ỹ thu ậ t PCR sinh họ c phân t ử ngày càng đ ạ t nhi ề u thành t ự u ứ ng d ụ ng quan tr ọ ng. Giáo trình sinh họ c phân t ử này cung c ấ p nh ữ ng ki ế n th ứ c c ơ b ả n cho sinh viên vớ i các n ộ i dung chính sau: - Cấ u trúc và ch ứ c năng c ủ a gen - Cấ u trúc genome - Các quá trình tái bả n, phiên mã và d ị ch mã c ủ a nguyên li ệ u di truy ề n - Điề u hòa bi ể u hi ệ n gen - Sử a ch ữ a và b ả o v ệ gen - Tái tổ h ợ p và chuy ể n gen Do mớ i đ ượ c xu ấ t b ả n l ầ n đ ầ u nên giáo trình này khó tránh kh ỏ i thi ế u sót ho ặ c chư a đáp ứ ng đ ượ c yêu c ầ u b ạ n đ ọ c. Vì th ế , chúng tôi mong nh ậ n đ ượ c nhi ề u ý ki ế n đóng góp để l ầ n xu ấ t b ả n sau đ ượ c hoàn thi ệ n h ơ n. Chúng tôi chân thành cả m ơ n Qu ỹ Nâng cao ch ấ t l ượ ng-D ự án Giáo d ụ c đ ạ i h ọ c đã hỗ tr ợ chúng tôi biên so ạ n giáo trình này, PGS. TS. Nông Văn H ả i đã đ ọ c b ả n th ả o và góp nhiề u ý ki ế n quý báu. Các tác giả
2. Chươ ng 1 Cać đai ̣ phân t ử sinh hoc ̣ I. Nucleic acid Nucleic acid, vâṭ chât ́ mang thông tin di truyên ̀ cua ̉ cac ́ hê ̣ thông ́ sông, ́ la ̀ môt ̣ polymer hinh̀ thanh ̀ t ư cac ́ monomer la ̀nucleotide. Môi ̃ nucleotide gôm ̀ ba thanh ̀ phân: ̀ nhoḿ phosphate, đ ườ ng pentose (đ ườ ng 5 carbon) va ̀môt ̣ nitrogen base. Cac ́ nitrogen base thuôc̣ hai nhom: ́ cac ́ purine gôm ̀ adenine (A) va ̀guanine (G), cac ́ pyrimidine gôm ̀ thymine (T), cytosine (C) và uracil (U). Cac ́ nucleotide đ ượ c nôi ́ v ớ i nhau băng ̀ liên kêt ́ phosphodiester taọ thanh ̀ chuôi ̃ dai. ̀ Nucleic acid gôm̀ hai loai ̣ phân t ử co ́câu ́ tao ̣ rât ́ giông ́ nhau la ̀ deoxyribonucleic acid (DNA) và ribonucleic acid (RNA). 1. Deoxyribonucleic acid Phân tử DNA la ̣̀môt chuôi ̃́́̀ xoăn kep gôm hai s ợơ i đ n. Môi ̃ợợ̀ s i đ n la môt chuôi ̃ nucleotide (Hình 1.1). Môĩ nucleotide gôm ̀ ba thanh ̀ phân: ̀ nhom ́ phosphate, đ ườ ng deoxyribose và môt ̣ trong bôn ́ base (A, C, G và T) (Hình 1.2). Hai s ợ i đ ơ n kêt ́ h ợ p v ớ i nhau nhờ́́ cac liên kêt hydrogen hinh ̀̀ữ́ thanh gi a cac base bô ̉̀sung năm trên hai s ợ̉ i: A bô sung cho T và C bô ̉sung cho G. Môi ̃ s ợ i đ ơ n co ́môt ̣ trinh ̀ t ự đinh ̣ h ướ ng v ớ i môt ̣ đâu ̀ 5’phosphate tự do, đâu ̀ kia la ̀3’ hydroxyl t ự do (quy ướ c la ̀ 5’→3’). Hướ ng cua ̉ hai s ợ i đơ n trong chuôi ̃ xoăn ́ kep ́ ng ượ c nhau, nên đ ượ c goi ̣ la ̀hai s ợ i đôi ́ song. Nhữ ng phân tich ̣̣́́́̃ câu truc hiên đai đa cho thây ́́́̉ câu truc cua DNA không phai ̉ luôn luôn tươ ng ứ ng v ớ i dang ̣ đ ượ c goi ̣ la ̀B ma ̀Watson va ̀Crick đa ̃đ ư a ra. Do s ự tac ́ đông ̣ cuả cac ́ h ợ p chât ́ co ́kh ố i l ượ ng nho ̉hoăc ̣ protein, dang ̣ B co ́thê ̉chuyên ̉ sang dang ̣ A (neń nhiêu ̀ơ h n) hoăc ̣̣̀ la dang Z (xoăn ́́ trai). Chung ́́̉ựậ̣̣́́́ co thê t g p lai hoăc xoăn manh, vi dụ môt ̣ s ợ i đôi DNA co ́đô ̣dai ̀ la ̀20 cm đ ượ c nen ́ trong môt ̣ chromosome co ́kich ́ th ướ c là 5 µm.
3. Hình 1.1. Chuỗ i xo ắ n kép c ủ a DNA Phân tử DNA trong nhiêm ̃́̉̉ săc thê cua sinh vât ̣ eukaryote ợ̉ạ̉̀ dang m ch thăng, con ở̀ớ́̀ phân l n tê bao prokaryote (vi khuân) ̉ phân t ửạ̣́ạ̀ DNA l i co dang m ch vong. Tuy nhiên, dùợ̉̀̀́ dang nao thi cac phân t ử DNA này đêu ̣̀̀ tôn tai theo ki ệ̣̉ u cuôn chăt. Trong tê ́ baò eukaryote, DNA kêt ́ h ợ p chăt ̣ che ̃v ớ i các protein la ̀ histone. DNA eukaryote có kich ́ th ướ c rât ́ l ớ n (Vi ́du: ̣ DNA ở ng ườ i co ́thê ̉dai ̀ đên ́ 1 m) nên vấ n đ ề đăt ̣ ra la ̀phân t ử nay ̀ phai ̉ đ ượ c nen ́ nh ư thê ́nao ̀ trong m ộ t thê ̉tich ́ rât ́ han ̣ chế cua ̉ nhân. Viêc ̣ nen ́ đ ượ c th ự c hiên ̣ ở nhiêu ̀ m ứ c đô, ̣ m ứ c đô ̣thâp ́ nhât ́ la ̀ nucleosome và m ứ c đô ̣cao nhât ́ la ̀câu ́ truc ́ nhiêm ̃ săc ́ chât. ́ Thât ̣ vây, ̣ đ ườ ng kinh ́ cua ̉ chuôi ̃ xoăn ́ DNA chỉ la ̀ 20 , trong khi sợ i nhiêm ̃ săc ́ chât ́ quan sat ́ d ướ i kinh ́ hiên ̉ vi điên ̣ t ử có đườ ng kinh ́ 100 , đôi khi đaṭ 300 . Điêù nay ̀ ch ứ ng to ̉ phân t ử DNA tham gia hinh ̀ thanh̀ nh ữ ng câu ́ truc ́ ph ứ c tap ̣ h ơ n (Hinh ̀ 1.3). Sợ i nhi ễ m s ắ c ch ấ t co ́đ ườ ng kinh ́ 100 là môt ̣ chuôi ̃ ch ứ a nhiêu ̀ nucleosome. Đó̀ữ́́̀̀ựợ la nh ng câu truc hinh thanh t môt s i DNA quân ́ quanh môt ̣̃̀ loi gôm 8 phân t ử histone (mứ c đô ̣tô ̉ch ứ c cao nhât ́ cua ̉ DNA). S ợ i có đ ườ ng kính 100 naỳ có câu ́ truc ́ phứ c tap ̣ h ơ n s ợ i co ́đ ườ ng kinh ́ 300 . Trong nhân tế bào, các s ợ i v ư a k ể trên k ế t h ợ p chặ t ch ẽ v ớ i nhi ề u protein khác nhau và c ả v ớ i các RNA t ạ o thành nhi ễ m s ắ c ch ấ t, mứ c đ ộ t ổ ch ứ c cao nh ấ t c ủ a DNA.
4. Hình 1.2. Cấ u trúc các nucleotide đi ể n hình
5. Hình 1.3. Cấ u trúc nucleosome và nhi ễ m s ắ c th ể . Phân tử DNA đ ượ c cu ộ n l ạ i trên nhi ễ m sắ c th ể làm cho chi ề u dài ng ắ n l ạ i h ơ n 50.000 l ầ n. Cać DNA ở eukaryote co ́đăc ̣ điêm ̉ khac ́ v ớ i DNA prokaryote. Toan ̀ bô ̣phân t ử DNA prokaryote đêù mang thông tin ma ̃hóa cho cac ́ protein trong khi đo ́DNA c ủ a eukaryote bao gôm̀ữ̀ự̃ nh ng trinh t ma hóa (cac ́ exon) xen ke ̃ớữ̀ựv i nh ng trinh t không mã hóa (intron). Cac ́̀ự̃ở trinh t ma hóa eukaryote chim ̣̀ ngâp trong môt ̣́ớ khôi l n DNA ma ̀ cho đêń nay vân ̃ ch ư a ro ̃tac ́ dung ̣ đ ượ c g ọ i là “DNA rác” (junk DNA). Tùy theo m ứ c đô ̣ hiêṇ diên ̣ cua ̉ chung ́ trong nhân, cac ́ trinh ̀ t ự DNA đ ượ c chia lam ̀ ba loai: ̣ - Cać trinh ̀ t ư lăp ̣ lai ̣ nhiêu ̀ lân. ̀ Ví du:̣ợ̉ đông vât ̣́́́̀ự̀ co vu cac trinh t nay chiêm ́ 10-15% genome (hệ gen). Đo ́la ̀nh ữ ng trinh ̀ t ự DNA ngăn ́ (10-200 kb), không ma ̃ hóa, thườ ng tâp ̣ trung ở nh ữ ng vung ̀ chuyên biêt ̣ trên nhiêm ̃ săc ́ thể nh ư ở vung ̀ tâm đông ̣ (trinh̀ự t CEN) hay ở̀́̃́̉̀ự đâu cac nhiêm săc thê (trinh t TEL). Ch ứ c năng cua ̉́̀ự cac trinh t naỳữ́̉́ ch a ro, co thê chung tham gia vao ̀́̀ qua trinh di chuyên ̉ DNA trên thoi vô săc ́̀ (trinh tự CEN) hoăc ̣̀́̀ vao qua trinh sao chep ́̀ộ̀ toan b phân DNA năm ̀ở̀́̃́̉ đâu mut nhiêm săc thê (trinh̀ t ự TEL). - Cać trinh ̀ t ư co ́sô ́lân ̀ lăp ̣ lai ̣ trung binh. ̀ Ví du: ̣ ở genome ng ườ i cac ́ trinh ̀ t ự naỳ chiêm ́ 25-40 %. Chung ́ đa dang ̣ h ơ n va ̀co ́kich ́ th ướ c l ớ n h ơ n (100-1.000 kb) cac ́ trinh̀ự̣̣̀̀́̀ự̀ t lăp lai nhiêu lân. Cac trinh t nay phân b ố trên toan ̣̀ bô genome. Chung ́́̉̀ co thê la
6. nhữ̀ự ng trinh t không ma ̃hóa ma ̀̃́̉̀ữ̀ự̃cung co thê la nh ng trinh t ma hóa cho rRNA, tRNA và 5S RNA. - Cać trinh ̀ t ư duy nhât. ́ Là cać gen ma ̃hóa cho cac ́ protein, co ́trinh ̀ t ự đăc ̣ tr ư ng cho tư ng gen. Môṭ đăc ̣ điêm ̉ cua ̉ phân t ử DNA co ́y ́nghia ̃ rât ́ quan trong ̣ và đ ượ c s ử dung ̣ vao ̀ phươ ng phap ́ lai phân t ử , đó la ̀kha ̉năng biên ́ tinh ́ va ̀hôi ̀ tinh. ́ Biên ́ tinh ́ la ̀hiên ̣ t ượ ng hai sợởử́ờ i đ n cua phân t DNA tach r i nhau khi cac ́́ liên kêt hydrogen gi ữ́ a cac base bổ sung năm̀ trên hai s ợ i bi ̣đ ứ t do cac ́ tac ́ nhân hóa hoc ̣ (dung dich ̣ kiêm, ̀ formamide, urea) hay do tać nhân vât ̣̣́ ly (nhiêt). Sau đo, ́́̀̉ nêu điêu chinh nhiêt ̣̣̣̀̀́́ đô va nông đô muôi thich hợ́ợợ́̉́ợ̉ p, cac s i đ n co thê băt căp tr lai theo nguyên tăc ́̉ bô sung, đê ̉̀̀hinh thanh phân t ử DNA ban đâu,̀ đo ́la ̀s ự hôi ̀ tinh. ́ 2. Ribonucleic acid Phân tử RNA co ́câu ́ tao ̣ t ươ ng t ự DNA ngo ạ i tr ư ba điêm ̉ khac ́ biêt ̣ sau: - Phân tử RNA la ̀chuôi ̃ đ ơ n. - Đườ ng pentose cua ̉ phân t ử RNA la ̀ribose thay vi ̀ deoxyribose. - Thymine (T), môṭ trong bôn ́ loai ̣ base hinh ̀ thanh ̀ nên phân t ử DNA, đ ượ c thay thế băng ̀ uracil (U) trong phân t ử RNA. Câú́̀ứ truc va ch c năng cua ̉ RNA co ́ự̣́̉̃̀ởs biên đôi ro rêt. Vê c ban RNA chi ̉̀́la chât mang thông tin di truyêǹ ở virus, sau đo ́ng ườ i ta ch ứ ng minh răng ̀ no ́không nh ữ ng đonǵ vai tro ̀ởợ̉c ban viêc chuyên ̉ thông tin di truyên ̀̀̀́ ma con co vai tro ̀́́câu truc khi tao ̣ nên phứ c hê ̣ RNA-protein. Theo môṭ ly ́thuyêt ́ tiên ́ hóa ma ̀đai ̣ diên ̣ la ̀Eigen, RNA la ̀chât ́ mang thông tin di truyên,̀̀ thanh viên trung gian cua ̉ự̣̉ s biêu hiên gen, thanh ̣̀̀́̀̀́́́ phân câu tao va la chât xuc tac. Nhoḿợ̉́ứ̉ OH vi tri th hai cua ribose cân ̀́ thiêt cho đa ch ứ c năng lam ̣̀̃ự̣ nhiêu loan s tao thanh̀ s ợ i đôi, qua đo ́lam ̀ tăng đô ̣không bên ̀ v ữ ng cua ̉ liên kêt ́ phosphodieste. Trong tế bao ̀ co ́ba loai ̣ RNA chinh, ́ co ́cac ́ ch ứ c năng khac ́ nhau: 2.1. Cać RNA thông tin (mRNA) mRNA là̉ ban sao cua ̉ữ̀ự̣́ nh ng trinh t nhât đinh trên phân t ử DNA, co ́̀vai tro trung tâm là̉ chuyên thông tin ma ̃ hóa trên phân t ự̉́́̉̃̀ DNA đên bô may giai ma thanh phân t ử protein tươ ng ứ ng. Cac ́ RNA co ́câu ́ truc ́ đa dang, ̣ kich ́ th ướ c nho ̉h ơ n so v ớ i DNA vi ̀ chỉứ ch a thông tin ma ̃hóa cho môt ̣̣̀ hoăc vai protein va ̀̉́̉chi chiêm khoang 2-5% tông ̉́ sô RNA trong tế bao. ̀ Quá trinh ̀ chuyên ̉ thông tin đ ượ c thê ̉hiên ̣ nh ư sau:
7. Ơ E. coli, kich́ th ướ c trung binh ̀ cua ̉ môt ̣ phân t ử mRNA khoang ̉ 1,2 kb. 2.2. RNA vâṇ chuyên ̉ (tRNA) tRNA laṃ̣̣̀̉́ nhiêm vu vân chuyên cac amino acid hoat ̣́ hóa đên ribosome đê ̉̉ợtông h p protein tư cac ́ mRNA t ươ ng ứ ng. Co ́it ́ nhât ́ môt ̣ loai ̣ tRNA cho môt ̣ loai ̣ amino acid. tRNA vâṇ chuyên ̉ ch ứ a khoang ̉ 75 nucleotide (co ́kh ố i l ượ ng khoang ̉ 25 kDa), la ̀ phân tử RNA nho ̉nhât. ́ Cac ́ tRNA co ́câu ́ truc ́ dang ̣ co ̉ba la. ́ Câu ́ truc ́ nay ̀ đ ượ c ôn ̉ đinh ̣ nh ờ cać liên kêt ́̉ bô sung hiên ̣̣ở̀̀̉ diên nhiêu vung cua phân t ử tRNA. Hai vi ̣́tri không co ́ liên kêt́̉ bô sung đong ́ vai tro ̣̣̀đăc biêt quan trong ̣́ớứ đôi v i ch c năng cua ̉ tRNA: - Trinh̀ t ự anticodon gôm ̀ ba nucleotide. - Trinh̀ự t CCA, co ́̉kha năng liên k ệ́ t công hóa tri ̣ợ́v i môt amino acid đăc ̣ư tr ng. 2.3. RNA ribosome (rRNA) rRNA là̀ thanh phân ̀ở̉ c ban cua ribosome, đong ́ vai tro ̀́́̀́́xuc tac va câu truc trong tông̉ h ợ p protein. Tùy theo hệ sô ́lăng ́ rRNA đ ượ c chia thanh ̀ nhiêu ̀ loai: ̣ ở eukaryote co ́ 28S; 18S; 5,8S và 5S rRNA; con ̀ cac ́ rRNA ở E. coli có ba loai: ̣ 23S, 16S va ̀ 5S. rRNA chiêḿ̀́ nhiêu nhât trong ba loai ̣ RNA (80% tông ̉́́̀́́̀ sô RNA tê bao), tiêp đên la tRNA khoả ng 16% va ̀mRNA chi ̉kho ả ng 2%. Ngoài ra, tê ́bao ̀ sinh vât ̣ eukaryote con ̀ chứ a nh ữ ng phân t ử RNA kích th ướ c nho ̉ c ủ a nhân (small nuclear, snRNA) chi ế m khoả ng <1% tham gia vao ̀ ghep ́ nôi ́ cac ́ exon. Ribosome là nh ữ ng phân t ử c ầ n thi ế t cho sựổợ t ng h p protein, ribosome cua ̣̣̉́̀̀̀̉ợ̣̉̀̉ moi tê bao đêu gôm môt tiêu đ n vi nho va môt tiêu đơ n vi ̣l ớ n. Môi ̃ tiêu ̉ đ ơ n vi ̣co ́mang nhiêu ̀ protein va ̀ rRNA (trong đó rRNA là thành phầ n ch ủ y ế u chi ế m kho ả ng 65%) co ́ kich ́ th ướ c khac ́ nhau. Ng ườ i ta cũng th ấ y ribosome trong ty thể , ở đó có s ự t ổ ng h ợ p m ộ t s ố protein ty th ể . Bang̉ 1.1. Cac ́ phân t ư RNA trong E. coli
8. 2.3.1. Ribosome củ a prokaryote Tế bào đ ượ c nghiên c ứ u v ề ribosome nhi ề u nh ấ t là E. coli. Ribosome (70S) củ a E. coli gồ m hai ti ểơịểơịỏ u đ n v : ti u đ n v nh (30S) và ti ểơịớ u đ n v l n (50S). Căn c ứ vào hệ s ố l ắ ng, ng ườ i ta phân bi ệ t ba lo ạ i rRNA: 23S rRNA, 16S rRNA và 5S rRNA. - Tiể u đ ơ n v ị 30S ch ứ a: 1 phân t ử 16S rRNA (có 1540 nu) và 21 ribosomal protein khác nhau. - Tiể u đ ơ n v ị 50S ch ứ a: 1 phân t ử 5S rRNA (có 120 nu), 1 phân t ử 23S rRNA (có 2900 nu) và 34 ribosomal protein. Hai tiểơịỏớ u đ n v nh và l n khi k ếợớ t h p v i nhau s ẽạ t o ra m ộ t rãnh ởỗế ch ti p giáp củ a chúng đ ể cho mRNA đi qua. 2.3.2. Ribosome củ a eukaryote Ribosome củ a eukaryote (80S) l ớ n h ơ n ribosome c ủ a prokaryote cũng bao g ồ m hai tiểơịểơịỏ u đ n v : ti u đ n v nh (40S) và ti ểơịớ u đ n v l n (60S). - Tiể u đ ơ n v ị 40S ch ứ a: 1 phân t ử 18S rRNA (có 1900 nu) và 33 ribosomal protein. - Tiể u đ ơ n v ị 60S ch ứ a: 3 phân t ử rRNA (5S; 5,8S và 28S) và 49 ribosomal protein. Tóm lạ i, tât ́ ca ̉ RNA trong tê ́ bao ̀ đêu ̀ đ ượ c tông ̉ h ợ p nh ờ enzyme RNA polymerase. Enzyme naỳ đoi ̀ hoi ̉ nh ữ ng thanh ̀ phân ̀ sau đây: - Môṭ khuôn m ẫ u, th ườ ng la ̀DNA s ợ i đôi. - Tiêǹ chât ́ hoat ̣ hoa: ́ Bôn ́ lo ạ i ribonucleoside triphosphate: ATP, GTP, UTP va ̀ CTP.
9. Sinh tông̉ h ợ p RNA giông ́ DNA ở môt ̣ sô ́ điêm, ̉ th ứ nhât ́ h ướ ng tông ̉ h ợ p la ̀ 5’→3’, thứ̀ớ́̀́ hai la c chê keo dai giông nhau: nhom ́ 3’-OH ở̀́̉ đâu cuôi cua chuôi ̃̉ợ tông h p lạ̀́́́̉ vi tri găn kêt cua nucleoside triphosphate tiêp ́ theo. Th ứự̉ợ̉ ba, s tông h p xay ra do thủ y phân pyrophosphate. Tuy nhiên, khać v ớ i DNA la ̀RNA không đoi ̀ hoi ̉ môi ̀ (primer). Ngoai ̀ ra, RNA polymerase không có hoat ̣ tinh ́ nuclease đê ̉s ử a ch ữ a khi cac ́ nucleotide bi ̣găn ́ nhâm. ̀ Cả ba loai ̣ RNA trong tê ́ bao ̀ đ ượ c tông ̉ h ợ p trong E. coli nhờ môt ̣ loai ̣ RNA polymerase. Ơ đông ̣ vât ̣ co ́vu, ́ cac ́ RNA khac ́ nhau đ ượ c tông ̉ h ợ p băng ̀ cac ́ loai ̣ RNA polymerase khać nhau. II. Protein 1. Câú truc ́ cua ̉ protein Amino acid là đ ơ n vi ̣c ơ s ở (monomer) câu ́ thanh ̀ protein. Tât ́ ca ̉20 amino acid co ́ măṭ trong protein đêu ̀ đ ượ c xây d ự ng theo môt ̣ kiêu ̉ mâu ̃ chung: Công thứ c tông ̉ quat ́ cua ̉ L-α-amino acid Trong đo,́ g ố c R (m ạ ch bên) cung ̃ la ̀phân ̀ khac ́ duy nhât ́ gi ữ a 20 loai ̣ amino acid, quy đinḥ tinh ́ chât ́ cua ̉ t ư ng loai. ̣ Nhoḿ amine (NH2) đinh́ ở nguyên t ử C2, theo tên cũ la ̀ nguyên t ử Cα. Vì vây, ̣ ngườ i ta goi ̣ la ̀nhom ́ α-amine. Cać amino acid tôn ̀ tai ̣ chu ̉yêu ́ trong t ự nhiên co ́nhom ́ amine đứ ng ở bên trai ́ truc, ̣ đ ượ c goi ̣ la ̀amino acid dang ̣ L. Dang̣ D-amino acid chỉ t ồ n tạ i riêng biêt, ̣ vi ́du ̣trong thanh ̀ tê ́bao ̀ vi khuân. ̉ Cać amino acid riêng biêt ̣ co ́nh ữ ng đăc ̣ tinh ́ khac ́ nhau la ̀do g ố c R c ủ a chúng. Nhữ ng amino acid trung tính có m ộ t nhóm amine và m ộ t nhóm carboxyl. Nhữ ng protein chứ a nhi ề u amino acid trung tính là nh ữ ng protein trung tính. Khi chiêu ̀ dai ̀ g ố c R tăng sẽ hình thành đăc ̣ tinh ́ ky ̣n ướ c. Nh ữ ng protein co ́ch ứ a nhiêu ̀ amino acid nh ư valine, leucine, isoleucine có tinh ́ ch ấ t đ ặ c tr ư ng là ky ̣n ướ c. Nh ữ ng amino acid co ́tinh ́ acid trong phâǹ gôc ́ co ́ m ộ t nhom ́ carboxyl. Protein ch ứ a nhiêu ̀ amino acid co ́ tinh ́ acid la ̀ nhữ ng protein acid. T ươ ng t ự nh ư vây ̣ đôi ́ v ớ i protein chu ̉yêu ́ đ ượ c hình thành b ở i nhữ ng amino acid co ́́̀̀ữtinh kiêm la nh ng protein kiêm. ̀̀́̉ Phân gôc R cua amino acid co ́́y
10. nghiạ̃́́ợ́́̉ quyêt đinh đôi v i đăc tinh cua protein ma ̣̀́chung tao nên. Điêu ̀̀ nay không nh ữ ng có́̃́ớ́ y nghia đôi v i tinh chât ́ hóa hoc ̣̀̉́́̉ ma ca câu truc cua protein. Thuỷ phân hoan ̀ toan ̀ protein, thu đ ượ c chu ̉ yêu ́ cac ́ L-α-amino acid. Măc̣ du ̀ protein rât́ đa dang ̣ nh ư ng hâu ̀ hêt ́ chung ́ đêu ̀ đ ượ c câu ́ tao ̣ t ư 20 L-α-amino acid. Dự a vaò đăc ̣ tinh ́ cua ̉ gôc ́ R, amino acid đ ượ c chia lam ̀ b ả y nhom ́ chinh ́ sau đây: - Amino acid trung tinh́ mach ̣ thăng. ̉ Bao gôm̀ glycine, alanine, valine, leucine va ̀ isoleucine. - Cać hydroxyl amino acid mach ̣ thăng. ̉ Bao gôm̀ serine va ̀ threonine. - Amino acid chư a l ư u huynh ̀ mach ̣ thăng. ̉ Bao gôm̀ cysteine và methionine. Khi oxy hóa hai nhoḿ -SH cua ̉ hai phân t ử cysteine tao ̣ thanh ̀ cystine co ́ch ứ a câu ̀ (-S-S-). - Cać amino acid acid va ̀cac ́ amide. Bao gôm̀ aspartic acid và glutamic acid. Trong phân tử̉́́ộ́ cua chung co m t nhom amine va ̀hai nhom ́ carboxyl. Ơộ đ pH sinh ly ́ (6- 7), cać amino acid nay ̀ tich ́ điên ̣ âm. Amine hóa nhom ́ carboxyl ở mach ̣ bên cua ̉ aspartate và glutamate tao ̣ thanh ̀ cac ́ amide t ươ ng ứ ng la ̀asparagine va ̀ glutamine. - Cać amino acid kiêm ̀ . Bao gôm̀ lysine va ̀ arginine. - Iminoacid. Proline. - Cać amino acid th ơ m va ̀ di ̣ vong. ̀ Bao gôm̀ phenylalanine, tyrosine va ̀ tryptophan. Do cóứ̀ơ ch a vong th m nên cac ́ amino acid nay ̣̀́́̉ự́ co môt sô phan ng đăc trư ng. Cać amino acid đ ượ c nôi ́ v ớ i nhau b ở i cac ́ liên kêt ́ peptide, liên kêt ́ nay ̀ đ ượ c hinh ̀ thanh̀ do s ự kêt ́ h ợ p nhom ́ amine cua ̉ môt ̣ amino acid v ớ i nhom ́ carboxyl cua ̉ amino acid kế tiêp. ́ Phan ̉ ứ ng kêt ́ h ợ p giai ̉ phong ́ m ộ t phân t ử H2O. Peptide là môt ̣ chuôi ̃ nôi ́ tiêp ́ nhiêu ̀ amino acid (sô ́l ượ ng it ́ h ơ n 30). V ớ i sô ́l ượ ng amino acid lớ n h ơ n chuôi ̃ đ ượ c goi ̣ la ̀polypeptide. Môi ̃ polypeptide co ́hai đâu ̀ tân ̣ cung, ̀ môṭ đâu ̀ mang nhom ́ amine t ự do, đâu ̀ kia mang nhom ́ carboxyl t ự do. Protein đ ượ c dung̀̉̉ợứ đê chi đ n vi ch c năng, nghia ̣̃̀́́ự́ la môt câu truc ph c tap trong không gian ch ứ không phaỉ đ ơ n thuân ̀ la ̀môt ̣ trinh ̀ t ự amino acid. Chuôĩ polypeptide co ̣́̉́̀́́̀ưthê uôn thanh câu truc hinh gây nh trong cac ́ protein hinh ̀ sợ i hay câu ́ trúc khôi ́̀ư câu nh trong cac ́ protein dang ̣̀ câu hay môt ̣́́̀̉ câu truc gôm ca hai dang̣ trên. Môt ̣ protein co ́thê ̉đ ượ c hinh ̀ thanh ̀ t ư nhiêu ̀ chuôi ̃ polypeptide. Ngườ i ta th ườ ng phân biêt ̣ câu ́ truc ́ cua ̉ phân t ử protein thanh ̀ b ố n bâc ̣ nh ư sau (Hình 1.4): - Câú truc ́ bâc ̣ 1. Là trinh ̀ t ự săp ́ xêp ́ cac ́ gôc ́ amino acid trong chuôi ̃ polypeptide. Câú truc ́ nay ̀ đ ượ c gi ữ v ữ ng nh ờ liên kêt ́ peptide (liên kêt ́ công ̣ hóa tri). ̣ Vị̀̃ môi môt amino acid co ́́́gôc khac nhau, cac ́́̀́ự̃́ gôc nay co nh ng đăc tinh hóa hoc ̣ khać nhau, nên môt ̣̃ chuôi polypeptide ở́ờ̉ cac th i điêm khác nhau co ́ự̃́nh ng đăc tinh hóa hoc̣ rât ́ khac ́ nhau. Tuy nhiên, vê ̀tông ̉ quat ́ thi ̀tât ́ ca ̉cac ́ chu ỗ i polypeptide đ ượ c xây
11. dự̣̣́́́ứ́ ng môt cach co hê thông t cac nhom nguyên t ử CO, CH va ̀NH. Vi ệ c xây d ự̣́ ng co hê thônǵ nay ̀ la ̀c ơ s ở đê ̉tao ̣ nên câu ́ truc ́ bâc ̣ hai. Hình 1.4. Các mư c đ ộ t ổ ch ư c c ủ a phân t ư protein - Câú truc ́ bâc ̣ 2. Là t ươ ng tac ́ không gian gi ữ a cac ́ gôc ́ amino acid ở gân ̀ nhau trong chuỗ i polypeptide. Câu ́ truc ́ đ ượ c bên ̀ v ữ ng chu ̉yêu ́ nh ờ liên kêt ́ hydrogen hình thanh̀ữ́ gi a cac liên kêt ́ peptide ở̀̀ kê gân nhau, cach ́ nhau nh ữ ng khoang ̣̉́ xac đinh. Câú truc ́ bâc ̣ 2 cua ̉ phân t ử protein: xoăn ́ α (α-helix), lá phiên ́ β và xoăn ́ collagen. Loaị α-helix làợợ̉ s i dang xoăn ́́ộ ôc, cu n xung quanh môt ̣̣̃̀ truc, môi vong xoăn ́́ co 3,6 gôc ́ amino acid. Nhữ ng s ợ i collagen chay ̣ song song tao ̣ nên nh ữ ng bo ́s ợ i dai cua ̉ gân. Collagen cung̃ co ́trong x ươ ng va ̀trong cac ́ mô nôi. ́ Elastin la ̀môt ̣ protein, gôm ̀ nh ữ ng s ợ i protein tươ ng đôi ́ ngăn, ́ găn ́ kêt ́ v ớ i nhau nh ờ liên kêt ́ c ộ ng hóa tri. ̣ Nh ữ ng chu ỗ i polypeptide quay theo dang̣ xoăn ́ ôc, ́ t ự duôi ̃ xoăn ́ khi co ́ap ́ l ự c. - Câú truc ́ bâc ̣ 3. Là t ươ ng tac ́ không gian gi ữ a cac ́ gôc ́ amino acid ở xa nhau trong chuôĩ polypeptide, la ̀dang ̣ cuôn ̣ lai ̣ trong không gian cua ̉ toan ̀ chu ỗ i polypeptide. Nhiêùỗ chu i polypeptide trong c ợ̉́̀ thê sông tôn tai không phai ̉ợ̉̉̀ấ dang thăng ma g p khuć̣̀́́́ va qua đo tao nên câu truc không gian ba chiêu. ̀ Tuy nhiên, câu ́́̀̀̀ truc nay hoan toan xać đinh, ̣ chu ̉ yêu ́ la ̀ do trinh ̀ t ự cac ́ amino acid va ̀ môi tr ườ ng. Khi môt ̣ chu ỗ i polypeptide tach́ ra khoi ̉ ribosome sau khi tông ̉ h ợ p va ̀đ ượ c đ ư a vào trong tê ́bao ̀ chât ́ như la ̀môi tr ườ ng tao ̣ hinh ̀ thi ̀no ́s ẽ hinh ̀ thanh ̀ nên câu ́ truc ́ t ự nhiên rât ́ nhanh, đăc ̣ biêt ̣
12. đôíớ́́̀̀ v i câu truc hinh câu, đem lai ̣ cho protein nh ự̃́ ng đăc tinh sinh ly ́quan trong. ̣́̉ Co thê do chuyêṇ̉ đông nhiêt ̣̉́ỗ cua cac chu i polypeptide ma ̀́́̉́́cac nhom cua cac gôc amino acid tiêṕ́ớ xuc v i nhau, dân ̃́́̉́ợớ đên co thê kêt h p v i nhau. Trong nhiêu ̀ protein hinh ̀̀́ câu co chứ́́ a cac gôc cysteine, s ự̣̀́ tao thanh cac liên kêt ́ disulfite gi ữ́́ a cac gôc cysteine ở xa nhau trong chuôĩ polypeptide s ẽ̀ lam cho chu ộ̣̣̃́̉́ i bi cuôn lai đang kê. Cac liên kêt ́́ư khac, nh liên kêt́ Van der Waals, liên kêt ́ tinh ̃ điên, ̣ phân c ự c, ky ̣n ướ c va ̀hydrogen gi ữ a cac ́ mach ̣ bên cuả́́ cac gôc amino acid đêu ̀ tham gia lam ̀̀ự̃́́́́̀̀̉ bên v ng câu truc bâc 3. Câu truc hinh câu cua protein đượ c goi ̣ la ̀câu ́ truc ́ bâc ̣ ba, đó chính la ̀câu ́ truc ́ cua ̉ enzyme. - Câú truc ́ bâc ̣ 4. Là tươ ng tac ́ không gian gi ữ a cac ́ chuôi ̃ c ủ a các phân t ử protein gồ m hai hay nhi ề u chu ỗ i polypeptide hình c ầ u. Môi ̃ chuôi ̃ polypeptide nay ̀ đ ượ c goi ̣ la ̀ mộểợ t ti u đ n vi (subunit). S ự́ợữ́ kêt h p gi a cac phân t ử̀̉ẻ̀̉́̀ nay long l o va chu yêu la do liên kêt́ hydrogen va ̀ky ̣n ướ c. Băng ̀ cach ́ nay ̀ hai phân t ử xac ́ đinh ̣ co ́ thê ̉ kêt ́ h ợ p v ớ i nhau taọ thanh ̀ m ộ t dimer. Ch ẳ ng h ạ n: hemoglobin đ ượ c tao ̣ nên t ư hai chuôi ̃ α vớ i môi ̃ chuôĩ co ́141 g ố c amino acid va ̀hai chuôi ̃ β vớ i môi ̃ chuôi ̃ la ̀146 gôc ́ amino acid. Câụ̣́́̉̀̃ truc cua môt hoăc nhiêu chuôi polypeptide co ́́̃y nghia quan trong ̣́ợ́ đôi v i đô hòa tan và ch ứ c năng cua ̉ chung. ́ Câu ́ truc ́ protein đ ượ c hiêu ̉ la ̀s ự săp ́ xêp ́ cua ̉ nh ữ ng chuỗ i riêng l ẻ hoăc ̣ nhiêu ̀ chu ỗ i. Chung ́ phu ̣thuôc ̣ nhiêu ̀ vao ̀ đô ̣pH cua ̉ môi tr ườ ng. Protein và chuôi ̃ polypeptide hòa tan tôt ́ khi nh ữ ng nhom ́ ư a n ướ c h ướ ng ra phia ́ ngoai, ̀ nhoḿ ky ̣n ướ c h ướ ng vao ̀ bên trong. Khi môt ̣ protein thay đôi ̉ câu ́ truc ́ thi ̀nh ữ ng nhom ́ kỵ n ướ c quay ra ngoai, ̀ protein mât ́ kha ̉năng hòa tan trong n ướ c, vi ́du ̣tr ườ ng h ợ p kêt ́ tuả không ở dang ̣ tinh thê ̉cua ̉ protein s ữ a trong môi tr ườ ng chua. Lactic acid đ ượ c san ̉ sinh do vi khuân̉ lam ̀ giam ̉ pH s ữ a, lam ̀ thay đôi ̉ protein s ữ a. Nhiêu ̀ nhom ́ ky ̣n ướ c đ ượ c hướ ng ra bên ngoai, ̀ protein mât ́ kha ̉năng tan trong n ướ c. Vi ̀v ậ y, vi ệ c th ườ ng xuyên duy trị̀́ gia tri pH trong tê ́̀́́bao chât rât quan trong, ̣̀̉́ựứ vi chi co nh vây ch c năng hoat ̣̣ đông cuả cac ́ enzyme trong tê ́bao ̀ chât ́ m ớ i đ ượ c đam ̉ bao. ̉ 2. Chứ c năng cua ̉ protein Môị̣̣̃ môt hoat đông trong tê ̣̣̣̣́̀̀̀bao phu thuôc vao môt hoăc nhiêu phân t ử protein đăc ̣ hiêu.̣̣ Môt trong cac ́́ cach phân loai ̣ protein la ̀ự̀ứd a vao ch c năng sinh hoc ̣̉́ cua chung. Bả ng 1.2 tom ́́ự tăt s phân loai ̣ protein theo ch ứ c năng va ̀ưđ a ra môt ̣̣̣̣́́ sô vi du đai diên cho môĩ loai. ̣ Bả ng 1.2. Các chư c năng sinh h ọ c c ủ a protein và m ộ t s ố ví d ụ
13. 2.1. Chứ c năng enzyme Phâǹ l ớ n protein la ̀enzyme. Hiên ̣ nay, co ́h ơ n 3.000 loai ̣ enzyme đa ̃ đ ượ c biêt. ́ Enzyme là chât ́ xuc ́ tac ́ sinh hoc ̣ co ́vai tro ̀lam ̀ tăng tôc ́ đô ̣phan ̉ ứ ng. Môi ̃ môt ̣ b ướ c trong trao đôỉ chât ́ đêu ̀ đ ượ c xuc ́ tac ́ b ở i enzyme. Enzyme co ́thê ̉lam ̀ tăng tôc ́ đô ̣phan ̉ ứng lên 1016 lâǹ so v ợ́́̉ứ i tôc đô phan ng không xuc ́́ự́ợữ tac. S kêt h p gi a enzyme va ̀ơc chât́ xay ̉ ra ở vi ̣tri ́hoat ̣ đông ̣ cua ̉ enzyme. 2.2. Protein điêù khiên ̉ Môṭ́ sô protein không th ự̣́̀ự́̉ c hiên bât ky s biên đôi hóa hoc ̣̀ nao, tuy nhiên no ́̀điêu khiên̉́ cac protein khac ́ự̣ứ th c hiên ch c năng sinh hoc, ̣ẳạ ch ng h n insulin điêu ̀̉̀ khiên nông độ đ ườ ng glucose trong mau. ́ Đo ́ la ̀ môt ̣ protein nho ̉ (5,7 kDa), gôm ̀ hai chuôi ̃ polypeptide nôí v ớ i nhau băng ̀ cac ́ liên kêt ́ disulfite. Khi không đu ̉insulin thi ̀s ự tiêp ́ nhâṇ đ ườ ng trong tê ́bao ̀ bi ̣han ̣ chê. ́ Vi ̀vây, ̣ m ứ c đ ườ ng trong mau ́ tăng va ̀dân ̃ đên ́ s ự thaỉ đ ườ ng manh ̣ me ̃qua n ướ c tiêu ̉ (bênh ̣ ti ể u đ ườ ng). Môṭ nhom ́ protein khac ́ tham gia vao ̀ s ự điêu ̀ khiên ̉ biêu ̉ hiên ̣ gen. Nh ữ ng protein naỵ̀́́̀́̀ữ̀ự co đăc tinh la găn vao nh ng trinh t DNA hoăc ̣̣̉ đê hoat hóa hoăc ̣ứ́ự c chê s phiên mã thông tin di truyên ̀ sang mRNA, vi ̣́́ứ́du chât c chê (repressor) đinh ̀̉ự chi s phiên ma. ̃ 2.3. Protein vâṇ chuyên ̉ Lam̀ nhiêm ̣̣̣ vu vân chuyên ̣̣̉́ự́̀ chât đăc hiêu t vi tri nay sang vi ̣̣̣́́́tri khac, vi du vân chuyên̉ O2 tử́́ phôi đên cac mô do hemoglobin hoăc ̣̣̉ vân chuyên acid beo ́ưựữ t mô d tr đêń cac ́ c ơ quan khac ́ nh ờ protein trong mau ́ la ̀ serum albumin. Cać chât ́ đ ượ c vân ̣ chuyên ̉ qua mang ̀ đ ượ c th ự c hiên ̣ băng ̀ cac ́ protein đăc ̣ hiêu, ̣ chẳ ng h ạ n vân ̣ chuyên ̉ glucose hoăc ̣ cac ́ amino acid qua mang ̀ (Hinh ̀ 1.5). 2.4. Protein dự tr ữ Cać protein la ̀ nguôn ̀ cung câp ́ cac ́ chât ́ cân ̀ thiêt ́ đ ượ c goi ̣ la ̀ protein d ự tr ữ . Protein là polymer cua ̉ cac ́ amino acid va ̀nitrogen th ườ ng la ̀yêu ́ tô ́han ̣ chê ́ cho sinh trưở ng, nên c ơ thê ̉phai ̉ co ́protein d ự tr ữ đê ̉cung câp ́ đây ̀ đu ̉nitrogen khi cân. ̀ Ch ẳ ng hạ n, ovalbumin la ̀protein d ự tr ữ trong long ̀ trăng ́ tr ứ ng cung câp ́ đu ̉ nitrogen cho phôi phat́̉ triên. Casein la ̀protein s ữ a cung câp ́ nitrogen cho đông ̣̣́́̀ vât co vu con non. Hat ̣ở
14. thự c vât ̣ bâc ̣ cao cung ̃ ch ứ a môt ̣ l ượ ng protein d ự tr ữ l ớ n (khoang ̉ 60%), cung câp ́ đu ̉ nitrogen cho quá trinh ̀ nay ̉ mâm ̀ c ủ a h ạ t. Hình 1.5. Hai kiể u v ậ n chuy ể n c ơ b ả n. (a): vậ n chuy ể n bên trong ho ặ c gi ữ a các t ế bào ho ặ c mô. (b): vậ n chuy ể n vào ho ặ c ra kh ỏ i t ế bào. Protein cung̃ co ́̉ựữ́́́thê d tr cac chât khac ngoai ̀̀ thanh phân ̀ amino acid (N, C, H, O vạ̀́ S), vi du ferritin la ̀protein tim ̀́ thây trong mô đông ̣̣́ợớ vât kêt h p v i Fe. Môt ̣ử phân t ferritin (460 kDa) găń v ớ i 4.500 nguyên t ử Fe (chiêm ́ 35% kh ố i l ượ ng). Protein co ́ vai
15. tròự̃ gi lai kim loai ̣̀́ự̉ợữ Fe cân thiêt cho s tông h p nh ng protein có ch ứ a Fe quan trong ̣ như hemoglobin. 2.5. Protein vâṇ đông ̣ va ̀co rut ́ Môṭ́ sô protein mang lai ̣́̀̉ cho tê bao kha năng vân ̣̣́̀ đông, tê bao phân chia va ̀ơco c . Cać protein nay ̣̀́̉ co đăc điêm: chung ́ợ̉ợ̣̣ dang s i hoăc dang polymer hóa đê ̣̉ợẳtao s i, ch ng hạ n actin và myosin. Tubulin la ̀̀̀ở̉thanh phân c ban cua thoi vô săc ́ợ̣́ (s i xuât hiên khi phân chia cać nhiêm ̃ săc ́ thê ̉vê ̀cac ́ c ự c). 2.6. Protein câú truc ́ Có chứ c năng tao ̣̣̣́̀̉́̀ đô chăc va bao vê tê bao và mô. Ch ẳạ ng h n: α-keratin là protein không tan, câú tao ̣ nên toc, ́ s ư ng va ̀mong. ́ Collagen la ̀protein hinh ̀ s ợ i co ́trong x ươ ng. Ơ đông ̣ vât ̣ collagen chiêm ́ 1/3 protein tông ̉ sô. ́ Fibroin (β-keratin) là thanh ̀ phân ̀ c ơ ban ̉ cuả ken ́ tăm. ̀ Môṭứ ch c năng phô ̉́́̉biên khac cua protein la ̣̀́câu tao nên mang ̀ sinh hoc. ̣ 2.7. Protein baỏ vê ̣ Trong việ c giai ̉ đôc ̣ các kim loai ̣ năng, ̣ phytochelatin co ́môt ̣ y ́nghia ̃ quan trong, ̣ đây làữ nh ng polypeptide đ ở́̀́ư n gian co nguôn gôc t glutation va ̀́ứco công th c chung nh ư sau: (γ -glutamyl-cysteinyl)n-glycine Do có̀́ nhiêu nhom SH nên chung ́́̉ co kha năng kêt ́ợ̣ớ́ h p chăt v i cac kim loai ̣̣ năng, lam̀ cho nh ữ ng kim loai ̣̣̀ năng nay không thê ̣̉́ gây rôi loan trao đôi ̉́ự̉ợ chât. S tông h p phytochelatin đượ c kich ́ thich ́ b ở i nh ữ ng kim loai ̣ năng ̣ nh ư Cd, Cu, Ag, Bi va ̀ Au. Protein baọ̉́̀ vê co vai tro quan tr ọ ng trong các ph ảự̣̣́̃́ n ng miên dich. Đông vât co xươ ng sông ́ co ́môt ̣ c ơ chê ́ph ứ c tap ̣ và phat ́ triên ̉ cao đ ể ngăn ng ư a nh ữ ng tac ́ nhân vi sinh vâṭ gây bênh. ̣ Ch ứ c năng nay ̀ co ́liên quan đên ́ đăc ̣ tinh ́ cua ̉ chuôi ̃ polypeptide. Khi môṭ protein la ̣ồố(có ngu n g c virus, vi khuân ̉ặ́ ho c nâm) xâm nhâp ̣̣̀́̀ vao mau hoăc vao mô thì ph ả n ứ ng t ự vê ̣c ủ a c ơ th ể s ẽ xu ấ t hi ệ n r ấ t nhanh. Protein la ̣đ ượ c goi ̣ la ̀ kháng nguyên (antigen) chự́̀ a môt vung có trât ̣ự̣́́ t xac đinh cac nguyên t ử có th ể́ợớ́ kêt h p v i tê baò lympho va ̀́́́̀̀̉kich thich tê bao nay san sinh khang ́̉ữ́̀ thê. Nh ng tê bao lympho tôn ̣̀ tai trong hệ thông ́ miên ̃ dich ̣ v ớ i sô ́l ượ ng 109 và trên bê ̀măt ̣ cua ̉ no ́có nh ữ ng vung ̀ nhân ̣ biế t n ơ i ma ̀kháng nguyên s ẽ đ ượ c kêt ́ h ợ p (Hinh ̀ 1.6). Nh ữ ng vung ̀ nhân ̣ bi ế t nay ̀ rât ́ khać nhau va ̀ặệưạđ c hi u cho t ng lo i kháng nguyên. Trong c ơệ̉́̃ th luôn co săn môt lượ ng l ớ n cac ́ tê ́bao ̀ lympho khac ́ nhau và chung ́ co ́thê ̉tông ̉ h ợ p rât ́ nhanh các khang ́
16. thểặệ đ c hi u khi khang ́ nguyên xuât ̣̣́̃ hiên. Môi loai kháng th ệ̣̉́́́ợ co môt vi tri kêt h p duy nhâṭ́ướ đăc tr ng v i kháng nguyên. Kha ̉năng b ảệụ̣̉̃̃̀ o v c a hê miên dich đa lam cho protein lạ cua ̉ tac ́ nhân gây bênh ̣ tr ở thanh ̀ vô hai. ̣ Nh ữ ng khang ́ thê ̉nay ̀ đ ượ c goi ̣ la ̀ globulin miêñ dich. ̣ Chung ́ chiêm ́ khoang ̉ 20% protein tông ̉ sô ́trong mau. ́ Môṭ nhom ́ protein bao ̉ vê ̣khac ́ la ̀protein lam ̀ đông mau ́ thrombin va ̀ fibrinogen, ngăn can̉ s ự mât ́ mau ́ cua ̉ c ơ thê ̉khi bi ̣th ươ ng. Cá ở cac ́ vùng c ự c c ủ a Trái đ ấ t co ́protein ch ố ng đông (antifreeze protein) co ́tac ́ dung̣ bao ̉ vê ̣mau ́ khi nhiêt ̣ đô ̣xuông ́ d ướ i 0oC. 2.8. Protein lạ /ngo ạ i lai Ví du ̣monellin la ̀môt ̣ loai ̣ protein đ ượ c tim ̀ thây ́ ở môt ̣ loai ̣ cây ở châu Phi, đ ượ c coi là chât ́ ngot ̣ nhân tao ̣ cho con ng ườ i. Ơ môt ̣ sô ́sinh vât ̣ biên ̉ nh ư ho ̣Trai tiêt ́ ra loai ̣ protein keo (glue protein), cho phep ́ nó găn ́ chăt ̣ lên bê ̀măt. ̣ III. Lipid Măc̣ du ̀không mang hoat ̣ tinh ́ sinh hoc ̣ cao nh ư protein nh ư ng lipid cung ̃ đong ́ môt ̣ vai trọ̣̀ đăc biêt trong hê ̣́́thông sông. Chung ́̀ la nhân tô ̣́́chinh tao nên cac ́̀ mang sinh hoc ̣ mạ̣̣̀́́̀̉ nêu thiêu thi moi hoat đông cua protein se ̃không thê ̉́ợ̣̀phôi h p nhip nhang. Đơ n vi ̣câu ́ truc ́ cua ̉ lipid la ̀cac ́ acid beo. ́ Môi ̃ acid beo ́ đ ượ c câu ́ tao ̣ t ư môt ̣ mach ̣ carbohydrate (gôm̀́ cac nguyên t ử̀́ợ́́ C va H) găn v i môt nhom carboxyl co ́́tinh acid. Cac ́ acid beó khac ́ nhau b ở i đô ̣dai ̀ cua ̉ chung, ́ b ở i sô ́l ượ ng va ̀vi ̣tri ́cac ́ liên kêt ́ đôi. Cac ́ acid beó không co ́liên kêt ́ đôi đ ượ c goi ̣ la ̀các acid béo bao ̃ hòa, cac ́ acid beo ́ không bao ̃ hòa có it ́ nhât ́ môt ̣ liên kêt ́ đôi.
17. Hình 1.6. Sơ đ ồ bi ể u di ễ n c ủ a kháng th ể và kháng nguyên. a: kháng thể g ồ m 4 chu ỗ i polypeptide. b: kháng thể k ế t h ợ p v ớ i kháng nguyên. c: k ế t h ợ p gi ữ a kháng nguyên và kháng thể . Mang̀ sinh hoc ̣́ứ co ch c năng la ̀ợ́ữ̀gi i han nh ng vung trao đôi ̉́̀ chât va tham gia vao ̀ viêc̣̣ vân chuyên ̉́́̀ cac chât. Mang sinh hoc ̣̃́̉ cung co kha năng chuyên ̉ự̃́ đi nh ng tin hiêu. Protein mang̀ cung ̃ co ́thê ̉la ̀cac ́ enzyme. Ch ứ c năng nay ̀ đ ượ c thê ̉hiên ̣ ở mang ̀ trong cua ̉ ty thệ̉̀̉̀ va lap thê. Mang sinh hoc ̣ bao gôm ̀ớ́ l p kep lipid v ớữ i nh ng protein phân bô ́ở trong đo ́(Hinh ̀ 1.7) Cać lipid mang ̀ đ ượ c hinh ̀ thanh ̀ t ư môt ̣ chuôi ̃ dai ̀ acid beo ́ nôi ́ v ớ i nh ữ ng nhom ́ co ́ đăc̣ tinh ́ ư a n ướ c cao va ̀đ ượ c goi ̣ la ̀nh ữ ng phân t ử l ươ ng c ự c vi ̀môt ̣ đâu ̀ t ươ ng tac ́ v ớ i nướ c, con ̀ đâu ̀ kia thi ̀ky ̣n ướ c. Bang̉ 1.3. Câú truc ́ môt ̣ sô ́acid beo ́ tiêu biêu ̉ trong hê ̣thông ́ sông ́
18. Hình 1.7. Sơ đ ồ bi ể u di ễ n m ộ t đo ạ n c ắ t c ủ a màng sinh h ọ c IV. Polysaccharide Cać polysaccharide co ́nhiêu ̀ ch ứ c năng quan trong ̣ trong tê ́bao, ̀ chung ́ tham gia vaò câu ́ tao ̣ tê ́bao ̀ va ̀la ̀nguôn ̀ d ự tr ữ năng l ượ ng chu ̉yêu. ́ Cac ́ polysaccharide đ ượ c hinh̀ thanh ̀ t ư nhiêu ̀ monomer, la ̀cac ́ đ ườ ng đ ơ n gian ̉ (monosaccharide) nôi ́ v ớ i nhau băng̀ liên kêt ́ glycoside. Liên kêt ́ nay ̀ đ ượ c hinh ̀ thanh ̀ t ư s ự kêt ́ h ợ p gi ữ a C1 cuả môt ̣ phân tử đ ườ ng v ớ i nhom ́ hydroxyl cua ̉ phân t ử kê ́tiêp. ́ Nguôǹựữ d tr tinh bôt ̣ợ̣̉́́̀̀ cac tê bao đông vât la glycogen, trong khi đo ́ởự̣̀ th c vât la tinh bôt.̣̣ Môt polymer khac ́̉ cua glucose la ̀cellulose thi ̣̀tao nên thành tê ́̀ự̣̀bao th c vât va là h ợ p chât ́ h ữ u c ơ hi ệ n din ̣ nhiêu ̀ nhât ́ trong sinh quyên. ̉ Chunǵử ta v a điêm qua riêng re ̃ự̀̀́́̀́t ng thanh phân câu tao tê bao chinh. Trong th ự c tê,̣̣́̉́́ợ̣́ớ hoat đông cua chung phôi h p mât thiêt v i nhau. Cac ́ nucleic acid trong tê ́̀ bao thườ ng kêt ́ h ợ p chăt ̣ che ̃ v ớ i cac ́ protein tao ̣ thanh ̀ nucleoprotein. DNA cua ̉ tê ́ bao ̀
19. eukaryote thì đ ượ c boc ̣ b ở i nh ữ ng protein đăc ̣ hiêu ̣ la ̀cac ́ histone. Mang ̀ tê ́bao ̀ cung ̃ không phaỉ̉́ chi co phospholipid, chinh ́́ cac protein găn ́ trong mang ̣̀̃ự̃ đa tao ra nh ng đăc trư ng riêng cua ̉̀ mang sinh hoc. ̣̣̉̀ứ̀́ứ́̀́́ Môt điêm cân l u y la nêu nh câu truc va cac tinh chât ́ hóa lý cua ̉ nucleic acid, lipid va ̀polysaccharide t ươ ng đôi ́ đông ̀ nhât ́ thi ̀cac ́ protein lai ̣ hêt́ s ứ c đa dang ̣ ca ̉vê ̀câu ́ truc ́ va ̀ch ứ c năng. Môt ̣ phân t ử protein th ườ ng bao gôm ̀ nhiêu ̀ vung̀ mang nh ữ ng đăc ̣ tinh ́ khac ́ nhau: vung ̀ ư a n ướ c hay ky ̣ n ướ c, vung ̀ găn ́ m ộ t đườ ng, vung ̀ co ́hoat ̣ tinh ́ xuc ́ tac, ́ vung ̀ liên kêt ́ v ớ i nucleic acid hay v ớ i môt ̣ protein khac.́ữứ T môi ch c năng cua ̉́̀ưự̣̀̀́ tê bao, t s hinh thanh vât chât mang thông tin di truyên, ̀ truyêǹ đat ̣ thông tin di truyên, ̀ s ự chuyên ̉ hóa năng l ượ ng, s ự liên lac ̣ gi ữ a cac ́ tê ́bao ̀ đêù́ự co s tham gia cua ̉́ cac protein. Điêu ̣̀̀̉ự̣̣̣́̀̀́ ky diêu cua s sông la toan bô cac hoat đông vô cung̀ đa dang ̣ ây ́ đ ượ c th ự c hiên ̣ b ở i môt ̣ phân t ử duy nhât. ́ Tài liệ u tham kh ả o/đ ọ c thêm 1. Hồ Huỳnh Thùy D ươ ng. 1998. Sinh họ c phân t ử . NXB Giáo dụ c, Hà Nộ i. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA. 3. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK. 4. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5th ed. WH Freeman and Company, New York, USA. 5. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Loscik R. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin Cummings/Cold Spring Habor Laboratory Press, San Francisco, CA, USA. 6. Weaver RF. 2003. Molecular Biology. 2nd ed. McGraw-Hill Company Inc. New York, USA. 1S (Svedberg): đơị n v đo v ậốắ n t c l ng. H ệốắ s l ng c ủộểơịụộ a m t ti u đ n v ph thu c không nhữ ng vào kh ốượủểơị i l ng c a ti u đ n v đó mà còn ph ụộ thu c vào hình d ạ ng và đ ộắủ r n c a nó, điề u này gi ả i thích t ạựếợủ i sao s k t h p c a hai ti ểơị u đ n v 50S và 30S l ạạộ i t o ra m t ribosome 70S. Chươ ng 2 Cấ u trúc genome Genome (hệ gen, b ộ gen) là thu ậ t ng ữ đ ượ c dùng v ớ i các nghĩa khác nhau nh ư sau:
20. - Nguyên liệ u di truy ềủộơể n c a m t c th : 1) nhi ễắể m s c th trong t ế bào vi khu ẩ n (hoặộ c m t trong m ỗạễắểếơộạ i lo i nhi m s c th n u h n m t lo i có m ặ t, ví d ụ : các nhi ễ m sắ c th ể l ớ n ho ặ c bé c ủ a Vibrio cholerae), 2) DNA hoặ c RNA trong m ộ t virion, 3) nhiễ m s ắ c th ể cùng v ớ i m ọ i plasmid đ ượ c k ế t h ợ p (ví d ụ : nhi ễ m s ắ c th ể và hai plasmid nhỏ trong vi khu ẩ n Buchnera). - Tấ t c ả các gen (khác nhau) trong t ế bào ho ặ c virion. - Bộ nhi ễ m s ắ c th ể đ ơ n b ộ i ho ặ c genome đ ơ n b ộ i trong t ế bào. Chuỗ i genome hoàn ch ỉ nh (nghĩa là trình tự hoàn ch ỉ nh c ủ a các nucleotide trong genome) đã đượ c công b ố cho m ộ t s ố loài vi khu ẩ n. Các trình t ự khác cũng đã đ ượ c công bố , ví d ụ genome c ủ a cây cúc d ạ i (Arabidopsis thaliana) và genome ngườ i. Genome chứ a toàn b ộ thông tin di truy ề n và các ch ươ ng trình c ầ n thi ế t cho c ơ thể ho ạ t đ ộ ng. Ơ các sinh v ậ t nhân th ậ t (eukaryote), 99% genome n ằ m trong nhân t ế bào và phầ n còn l ạằ i n m trong m ộốơ t s c quan t ửưểạểố nh ty th và l p th . Đa s genome vi khuẩ n và ph ầ n genome ch ứ a trong các c ơ quan t ử th ườ ng có kích th ướ c nh ỏ và ở dạ ng vòng khép kín. Ng ượ c l ạ i, ph ầ n genome trong nhân th ườ ng r ấ t l ớ n và phân b ố trên các nhiễ m s ắ c th ể d ạ ng th ẳ ng. Dư án genome là dự án xác đ ị nh c ấ u trúc di truy ề n chính xác c ủ a m ộ t genome c ơ thểố s ng, nghĩa là trình t ựủấả DNA c a t t c các gen c ủự a nó. D án genome c ủộố a m t s sinh vậ t mô hình (model organisms) đã đ ượ c hoàn thành nh ư sau: - Các genome vi khuẩ n. Các trình t ự hoàn ch ỉ nh c ủ a genome Escherichia coli đã đượ c xác đ ị nh theo ph ươ ng th ứ c t ổ h ợ p/t ậ p h ợ p (consortium) c ủ a các phòng thí nghiệ m. Năm 1995, hai trình t ự genome hoàn ch ỉ nh c ủ a vi khu ẩ n Haemophilus influenzae và Mycoplasma genitalium cũng đượ c hoàn thành. Loài M. genitalium có mộ t genome đơ n gi ả n (kho ả ng 580.067 base), do nó d ự a vào v ậ t ch ủ đ ể v ậ n hành nhi ề u b ộ máy trao đổ i ch ấ t c ủ a mình. Loài H. influenzae là mộ t vi khu ẩ n đ ặ c tr ư ng h ơ n, và có genome khoả ng 1.830.121 base v ớ i 1.749 gen. - Chuỗ i genome hoàn ch ỉ nh c ủ a n ấ m men Saccharomyces cerevisiae đã đượ c hoàn chỉ nh trong năm 1996, nh ờ m ộ t consortium c ủ a các phòng thí nghi ệ m. Genome củ a chúng dài 12.146.000 base. - Các dự án genome ở đ ộ ng v ậ t nh ư : chu ộ t, c ư u, l ợ n, giun tròn (Caenorhabditis elegans), ruồ i gi ấ m (Drosophila melanogaster) , hoặ c ở th ự c v ậ t nh ư : lúa n ướ c, lúa mì, ngô, táo, cúc dạ i , mà n ổ i b ậ t nh ấ t trong s ố đó là d ự án genome ng ườ i cũng đã đượ c th ự c hi ệ n. Ngày 12. 2. 2001 genome ngườ i đã đ ượ c công b ố v ớ i kho ả ng 30.000 gen, ít h ơ n nhiề u so v ớ i d ự ki ế n tr ướ c đây (hàng trăm ngàn gen), và ch ỉ g ấ p hai l ầ n giun tròn ho ặ c ruồ i gi ấ m. Ng ườ i ta đã xác đ ị nh h ệ gen ng ườ i gi ố ng 98% so v ớ i tinh tinh và có đ ế n 99% là giố ng nhau gi ữ a các dân t ộ c, các cá th ể . Do đó, v ấ n đ ề hình thành và phát tri ể n
21. nhân cách, chỉố s thông minh ph ảủế i ch y u trên c ơởộự s xã h i và s rèn luy ệủ n c a tư ng ng ườ i đ ể phát tri ể n ti ề m năng sinh h ọ c c ủ a b ả n thân. Trình tự genome c ủ a nh ữ ng sinh v ậ t mô hình r ấ t có ý nghĩa trong nh ữ ng nghiên cứ u c ủ a m ộ t chuyên ngành khoa h ọ c m ớ i đó là genome h ọ c (genomics). D ự a vào đây, các nhà sinh họ c phân t ử có th ể phân tích c ấ u trúc, ho ạ t đ ộ ng và ch ứ c năng c ủ a các gen, làm sáng tỏ đ ượ c vai trò c ủ a DNA l ặ p l ạ i, DNA không ch ứ a mã di truy ề n, DNA nằ m gi ữ a các gen Đi ề u đ ặ c bi ệ t có ý nghĩa là khi so sánh các genome v ớ i nhau, có thể hi ể u đ ượ c ho ạ t đ ộ ng c ủ a genome trong các c ơ th ể s ố ng, m ố i quan h ệ gi ữ a chúng, sự đa d ạ ng sinh h ọ c và m ứ c đ ộ ti ế n hóa. Kế t qu ả b ướ c đ ầ u so sánh genome gi ữ a các loài sinh v ậ t v ớ i nhau đã cho th ấ y có ba đặ c đi ể m n ổ i b ậ t: 1) các gen phân b ố trong genome không theo qui lu ậ t, 2) kích thướ c c ủ a genome thay đ ổ i không t ỷ l ệ thu ậ n (t ươ ng quan) v ớ i tính ph ứ c t ạ p c ủ a loài, 3) số l ượ ng nhi ễ m s ắ c th ể cũng r ấ t khác nhau ngay gi ữ a nh ữ ng loài r ấ t g ầ n nhau. I. Thành phầ n và đ ặ c đi ể m c ủ a genome Genome chứ a m ọ i thông tin di truy ề n đ ặ c tr ư ng cho t ư ng loài, th ậ m chí cho t ư ng cá thể trong loài. Genome có th ể bao g ồ m các phân t ử DNA ho ặ c RNA. Đ ố i v ớ i sinh vậ t b ậ c cao, kích th ướ c genome thay đ ổ i t ư 109 bp (độ ng v ậ t có vú) đ ế n 1011 bp (thự c vậ t). Khác v ớ i t ế bào ti ề n nhân (prokaryote), các gen trong genome c ủ a eukaryote thườ ng t ồ n t ạ i nhi ề u b ả n sao và th ườ ng b ị gián đo ạ n b ở i các đo ạ n mã mù không mang thông tin di truyề n (các intron). Vì v ậ y, m ộ t trong nh ữ ng v ấ n đ ề đang đ ượ c quan tâm là cầ n ph ả i bi ế t s ố l ượ ng các gen khác nhau có m ặ t trong genome cũng nh ư s ố l ượ ng các gen hoạ t đ ộ ng trong t ư ng lo ạ i mô, t ư ng giai đo ạ n phát tri ể n và t ỷ l ệ các gen so v ớ i kích thướ c genome 1. Genome củ a c ơ quan t ử Hầ u h ế t genome c ủ a c ơ quan t ử , nh ư ng không ph ả i luôn luôn, có d ạ ng phân t ử DNA mạ ch vòng đ ơ n c ủ a m ộ t chu ỗ i duy nh ấ t. Genome củ a c ơ quan t ử mã hóa cho m ộ t s ố , không ph ả i t ấ t c ả , các protein đ ượ c tìm thấ y trong c ơ quan t ử . Do có nhi ề u c ơ quan t ử trong m ộ t t ế bào, cho nên có nhi ề u genome củ a c ơ quan t ử trên m ộ t t ế bào. M ặ c dù b ả n thân genome c ủ a c ơ quan t ử là duy nhấ t. Nh ư ng nó c ấ u t ạ o g ồ m m ộ t chu ỗ i l ặ p l ạ i1 liên quan vớ i m ọ i chu ỗ i không lặ p l ạ i2 củ a nhân. V ề nguyên t ắ c, các gen c ơ quan t ử đ ượ c phiên mã và d ị ch mã b ở i các cơ quan t ử . 1.1. Genome củ a ty th ể DNA ty thể (mitochondrial DNA-mtDNA) là m ộ t genome đ ộ c l ậ p, th ườ ng là mạ ch vòng, đ ượ c đ ị nh v ị trong ty th ể .
22. - DNA ty thể c ủ a t ế bào đ ộ ng v ậ t mã hóa đ ặ c tr ư ng cho 13 protein, 2 rRNA và 22 tRNA. - DNA ty thể c ủ a n ấ m men S. cerevisiae dài hơ n mtDNA c ủ a t ế bào đ ộ ng v ậ t năm lầ n do s ự có m ặ t c ủ a các đo ạ n intron dài. Các genome ty thể có kích th ướ c t ổ ng s ố r ấ t khác nhau, các t ế bào đ ộ ng v ậ t có kích thướ c genome nh ỏ (kho ả ng 16,5 kb ở đ ộ ng v ậ t có vú) (Hình 2.1). Có kho ả ng m ộ t vài trăm ty thể trên m ộ t t ế bào. M ỗ i ty th ể có nhi ề u b ả n sao DNA. S ố l ượ ng t ổ ng s ố củ a DNA ty th ể so v ớ i DNA nhân là r ấ t nh ỏ (<1%). Trong nấ m men S. cerevisiae, genome ty thể có kích th ướ c khá l ớ n (kho ả ng 80 kb) và khác nhau tùy thuộ c vào t ư ng ch ủ ng. Có kho ả ng 22 ty th ể trên m ộ t t ế bào, tươ ng ứ ng kho ả ng 4 genome trên m ộ t c ơ quan t ử . Ơ nh ữ ng t ế bào sinh tr ưở ng, t ỷ l ệ mtDNA có thể cao h ơ n (kho ả ng 18%). Kích thướ c c ủ a genome ty th ể ở các loài th ự c v ậ t là r ấ t khác nhau, t ố i thi ể u khoả ng 100 kb. Kích th ướ c l ớ n c ủ a genome đã gây khó khăn cho vi ệ c phân l ậ p nguyên vẹ n DNA, nh ư ng b ả n đ ồ c ắ t h ạ n ch ế (restriction map) trong m ộ t vài loài th ự c v ậ t đã cho thấ y genome ty th ể th ườ ng là m ộ t chu ỗ i đ ơ n, đ ượ c c ấ u t ạ o nh ư m ộ t m ạ ch vòng. Trong mạ ch vòng này có nh ữ ng chu ỗ i t ươ ng đ ồ ng ng ắ n và s ự tái t ổ h ợ p gi ữ a chúng đã sinh ra các phân tử ti ể u genome (subgenome) m ạ ch vòng nh ỏ h ơ n, cùng t ồ n t ạ i v ớ i genome “chủ ” (master genome) hoàn ch ỉ nh, đã gi ả i thích cho s ự ph ứ c t ạ p c ủ a các DNA ty thể ở th ự c v ậ t. Hình 2.1. DNA ty thể c ủ a ng ườ i. Bao gồ m 22 gen tRNA, 2 gen rRNA, và 13 vùng mã hóa protein.
23. Bả ng 2.1 tóm t ắ t s ự phân công c ủ a các gen trong m ộ t s ố genome ty th ể . T ổ ng s ố gen mã hóa protein là khá ít, và không tươ ng quan v ớ i kích th ướ c c ủ a genome. Ty th ể độ ng v ậ t có vú s ử d ụ ng các genome 16 kb c ủ a chúng đ ể mã hóa cho 13 protein, trong khi đó ty thể n ấ m men S. cerevisiae dùng các genome tư 60-80 kb mã hóa cho kho ả ng 8 protein. Thự c v ậ t v ớ i genome ty th ể l ớ n h ơ n nhi ề u mã hóa cho nhi ề u protein h ơ n. Các intron đượ c tìm th ấ y trong h ầ u h ế t các genome c ủ a ty th ể , nh ư ng l ạ i không có trong các genome rấ t nh ỏ c ủ a đ ộ ng v ậ t có vú. Hai rRNA chính luôn đượ c mã hóa b ở i genome ty th ể . S ố l ượ ng các tRNA đ ượ c mã hóa bở i genome ty th ể dao đ ộ ng t ư không cho đ ế n đ ầ y đ ủ (25-26 trong ty th ể ). Nhiề u protein ribosome đ ượ c mã hóa trong genome ty th ể c ủ a th ự c v ậ t và sinh v ậ t nguyên sinh, như ng ch ỉ có m ộ t ít ho ặ c không có trong genome c ủ a n ấ m và đ ộ ng v ậ t. Bả ng 2.1. Các genome ty th ể có các gen mã hóa cho các protein, rRNA và tRNA 1.2. Genome củ a l ạ p th ể DNA lạ p th ể (chloroplast DNA-ctDNA) cũng là m ộ t DNA genome đ ộ c l ậ p, thườ ng là m ạ ch vòng, đ ượ c tìm th ấ y trong l ạ p th ể c ủ a th ự c v ậ t. - Genome củ a l ạ p th ể r ấ t khác nhau v ề kích th ướ c, nh ư ng đ ủ l ớ n đ ể mã hóa cho khoả ng 50-100 protein cũng nh ư rRNA và tRNA. - DNA lạ p th ể dài t ư 120-190 kb. Các genome c ủ a l ạ p th ể đã đ ượ c phân tích trình tự cho th ấ y có kho ả ng 87-183 gen. B ả ng 2.2 mô t ả các ch ứ c năng đ ượ c mã hóa bở i genome l ạ p th ể ở cây tr ồ ng. Bả ng 2.2. Genome c ủ a l ạ p th ể ở các cây tr ồ ng mã hóa cho 4 rRNA, 30 tRNA và kho ả ng 60 protein
24. Nói chung, các đặ c đi ể m c ủ a genome l ạ p th ể t ươ ng t ự ở ty th ể , ngo ạ i tr ư l ạ p thể mang nhi ề u gen h ơ n. Genome l ạ p th ể mã hóa cho t ấ t c ả các lo ạ i rRNA và tRNA cầ n thi ế t trong t ổ ng h ợ p protein, và cho kho ả ng 50 protein, bao g ồ m c ả RNA polymerase và các protein ribosome. Các intron trong lạ p th ể đ ượ c chia thành hai nhóm: 1) nh ữ ng intron ở trên các gen tRNA thườ ng (m ặ c dù không ch ắ c ch ắ n) đ ượ c đ ị nh v ị trong vòng anticodon, gi ố ng như các intron đ ượ c tìm th ấ y trong các gen tRNA c ủ a nhân n ấ m men S. cerevisiae; 2) nhữ ng intron trong các gen mã hóa protein t ươ ng t ự v ớ i các intron c ủ a các gen ty th ể . Vai trò củ a l ạ p th ể là th ự c hi ệ n quá trình quang h ợ p. Do đó, nhi ề u gen c ủ a nó mã hóa cho các protein củ a các ph ứ c h ợ p đ ị nh v ị trong các màng thylakoid. M ộ t vài ph ứ c hợ p protein c ủạểố a l p th gi ng các ph ứợ c h p protein c ủ a ty th ể : có m ộốểơị t s ti u đ n v đượ c mã hóa b ở i genome c ủ a c ơ quan t ử và m ộ t s ố khác đ ượ c mã hóa b ở i genome c ủ a nhân. Như ng các ph ứ c h ợ p còn l ạ i đ ượ c mã hóa hoàn toàn b ở i genome l ạ p th ể . 2. Độ ng h ọ c c ủ a ph ả n ứ ng lai DNA Bả n ch ấ t chung c ủ a eukaryotic genome đ ượ c ph ả n ánh qua đ ộ ng h ọ c c ủ a s ự tái liên kế t các DNA (DNA reassociation kinetics) b ị bi ế n tính. S ự tái liên k ế t gi ữ a các chuỗ i DNA b ổ sung x ả y ra nh ờ b ắ t c ặ p base, ng ượ c l ạ i v ớ i quá trình bi ế n tính (denaturation) mà nhờ đó chúng đ ượ c tách r ờ i (Hình 2.2) đ ể th ự c hi ệ n s ự tái b ả n ho ặ c
25. phiên mã. Độ ng h ọ c c ủ a ph ả n ứ ng tái liên k ế t ph ả n ánh s ự khác nhau c ủ a các chu ỗ i hiệ n di ệ n, vì th ế ph ả n ứ ng này có th ể đ ượ c dùng đ ể đ ị nh l ượ ng các gen và các s ả n phẩ m RNA c ủ a chúng. Bả ng 2.3 mô t ả ph ả n ứ ng tái liên k ế t. S ự h ồ i tính c ủ a DNA (renaturation) ph ụ thuộ c vào s ự va ch ạ m ng ẫ u nhiên c ủ a các chu ỗ i b ổ sung. Ph ả n ứ ng c ủ a các DNA riêng biệ t có th ể đ ượ c mô t ả b ằ ng các đi ề u ki ệ n c ầ n thi ế t cho s ự hoàn thành m ộ t n ử a (half- completion). Đây là tích số c ủ a C0× t1/2 và đượ c g ọ i là C0t1/2. Giá trị này t ỷ l ệ ngh ị ch v ớ i hằ ng s ố t ố c đ ộ . Do C0t1/2 là tích số c ủ a n ồ ng đ ộ và th ờ i gian yêu c ầ u cho m ộ t n ử a đườ ng, nên m ộ t giá tr ị C0t1/2 lớ n h ơ n d ẫ n đ ế n m ộ t ph ả n ứ ng ch ậ m h ơ n. Bả ng 2.3. M ộ t ph ả n ư ng tái liên k ế t c ủ a DNA đ ượ c mô t ả b ở i C0t1/2
26. Sự h ồ i tính c ủ a DNA th ườ ng có d ạ ng đ ườ ng cong C0t, đườ ng cong bi ể u di ễ n đ ồ thị phân s ố c ủ a DNA đ ượ c tái liên k ế t (1-C/C0) theo log củ a C0t. Hình 2.3 trình bày đườ ng cong C0t củ a m ộ t s ố genome đ ơ n gi ả n. Các đ ườ ng cong có d ạ ng t ươ ng t ự nhau, như ng giá tr ị C0t1/2 củ a m ỗ i đ ườ ng là khác nhau. Các genome trong hình 2.3 đạ i di ệ n cho các ngu ồ n DNA khác nhau (PolyU:PolyA, thự c khu ẩ n th ể MS2, th ự c khu ẩ n th ể T4 và vi khu ẩ n E. coli). C0t1/2 liên quan trự c ti ế p v ớ i l ượ ng DNA trong genome. Đi ề u này ph ả n ánh tình tr ạ ng khi genome trở nên ph ứạơ c t p h n, thì s ẽ có thêm m ộốả t s b n sao c ủộ a m t vài chu ỗặệ i đ c bi t trong mộ t l ượ ng DNA có tr ướ c. Ví d ụ : n ế u C0 củ a DNA là 12 pg, thì nó s ẽ ch ứ a kho ả ng 3.000 bả n sao c ủ a m ỗ i trình t ự trong genome vi khu ẩ n.
27. Hình 2.3. C0t1/2 phụ thu ộ c vào đ ộ ph ư c t ạ p c ủ a genome. PolyU:PolyA, thự c khu ẩ n th ể MS2, thự c khu ẩ n th ể T4 và vi khu ẩ n E. coli. 3. Kích thướ c c ủ a genome Không phả i t ấ t c ả các đo ạ n DNA trong genome đ ề u t ươ ng ứ ng v ớ i các gen (mã hóa cho protein hoặộảẩầế c m t s n ph m c n thi t cho ho ạộốủế t đ ng s ng c a t bào). T ư nhữ ng năm 1970, b ằ ng các thí nghi ệ m gây bão hòa đ ộ t bi ế n ng ườ i ta đã có th ể xác đị nh đ ượ c s ố gen n ằ m trên m ộ t đo ạ n nhi ễ m s ắ c th ể . Ngày nay, nh ờ các k ỹ thu ậ t phân tích DNA và RNA hiệ n đ ạ i (Southern blot, Northern blot, microarray ) các nhà khoa họ c có th ểịố xác đ nh s gen ho ạộ t đ ng trong m ộế t t bào. Ví d ụởếấ : t bào n m men S. cerevisiae (sinh vậ t eukaryote b ậ c th ấ p) có kho ả ng 4.000 gen ho ạ t đ ộ ng, còn t ế bào độ ng v ậ t có vú kho ả ng 10.000-15.000 gen. Nh ư v ậ y, n ế u đ ộ dài trung bình c ủ a m ộ t gen khoả ng 10 kb thì t ổ ng s ố chi ề u dài các gen ho ạ t đ ộ ng trong m ộ t t ế bào cũng ch ỉ chiế m 1-2% genome. Hay nói cách khác, ch ỉ m ộ t ph ầ n r ấ t nh ỏ genome mang thông tin di truyềầế n c n thi t cho ho ạộốủế t đ ng s ng c a t bào. V ậầ y ph n genome còn l ạ i có vai trò gì, và tính phứ c t ạ p c ủ a loài có liên quan gì v ớ i kích th ướ c genome hay không? Để làm sáng t ỏ v ấ n đ ề trên, chúng ta c ầ n xem xét kích th ướ c genome c ủ a m ộ t s ố loài gầ n nhau trong b ậ c thang ti ế n hóa (có đ ộ ph ứ c t ạ p loài t ươ ng t ự nhau) cũng nh ư genome củ a nh ữ ng loài xa nhau (có tính ph ứ c t ạ p khác nhau). Ch ẳ ng h ạ n: - Genome củ a ng ườ i có kích th ướ c kho ả ng 3,3× 109 bp, trong khi đó genome củ a nhữ ng loài l ươ ng c ư dài kho ả ng 3,1× 109 bp hoặ c th ự c v ậ t có th ể lên đ ế n 1011 bp. Như vậ y, có ph ả i là các loài l ươ ng c ư có tính ph ứ c t ạ p t ươ ng t ự c ơ th ể chúng ta? - Hay là ngay trong cùng mộ t lo ạ i, chúng ta cũng nh ậ n th ấ y có s ự mâu thu ẫ n v ề kích thướ c genome? Ví d ụ : ru ồ i nhà (Musca domestica) có genome khoả ng 8,6× 108 bp, lớ n g ấ p sáu l ầ n kích th ướ c genome c ủ a ru ồ i gi ấ m kho ả ng 1,4× 108bp. Ngoài ra, trong các loài lươ ng c ư kích th ướ c genome c ủ a chúng cũng thay đ ổ i khá l ớ n t ư 109-1011 bp. Vì sao ngay trong cùng mộ t lo ạ i mà kích th ướ c genome l ạ i bi ế n thiên nhi ề u nh ư v ậ y, có phảồ i ru i nhà có c ấạứạơề u t o ph c t p h n nhi u so v ớồấ i ru i gi m?
28. Tưữữệ nh ng d li u trên, chúng ta có th ểậịằ nh n đ nh r ng tính ph ứạủ c t p c a loài không liên quan đế n kích th ướ c c ủ a genome. Tuy nhiên, vai trò c ủ a ph ầ n genome còn lạ i (ph ầ n không mã hóa) đ ế n nay v ẫ n ch ư a đ ượ c bi ế t nhi ề u. 4. Tổ ng s ố gen đ ượ c bi ế t ở m ộ t s ố loài eukaryote Có 6.000 gen ở n ấ m men S. cerevisiae, 18.500 gen ở giun tròn, 13.600 gen ở ru ồ i giấ m, 25.000 gen ở Arabidopsis, và có khả năng 30.000 gen ở chu ộ t và < 30.000 gen ở ngườ i. Như chúng ta đã bi ế t, m ố i quan h ệ gi ữ a kích th ướ c genome và s ố l ượ ng gen đã không còn nữ a. Genome c ủ a các sinh v ậ t eukaryote đ ơ n bào có cùng ph ạ m vi kích thướ c v ớ i genome c ủ a vi khu ẩ n l ớ n nh ấ t. Các eukaryote b ậ c cao có nhi ề u gen h ơ n, như ng s ố l ượ ng không t ươ ng quan v ớ i kích th ướ c genome. Hình 2.4 cho thấ y genome c ủ a loài n ấ m men S. cerevisiae dài 13.500 kb và loài nấ m men S. pombe là 12.500 kb, có khoả ng 6.000 gen và 5.000 gen t ươ ng ứ ng. Khung đọ c m ở trung bình kho ả ng 1,4 kb, vì th ế kho ả ng 70% genome đ ượ c chi ế m gi ữ b ở i các vùng mã hóa. Sự khác nhau ch ủ y ế u gi ữ a chúng là ch ỉ 5% gen c ủ a S. cerevisiae có intron, so vớ i 43% c ủ a S. pombe. Genome củ a giun tròn có kho ả ng 18.500 gen. M ặ c dù genome c ủ a ru ồ i gi ấ m l ớ n hơ n genome c ủ a giun tròn, nh ư ng chúng l ạ i có s ố gen ít h ơ n. Đ ế n nay, chúng ta ch ư a hiểạ u t i sao ru ồấộơểứạơềỉ i gi m-m t c th ph c t p h n nhi u-ch có 70% s ố gen so v ớ i giun tròn. Điề u này đã cho th ấ y không có m ộ t m ố i quan h ệ chính xác gi ữ a s ố gen và tính phứ c t ạ p c ủ a c ơ quan. Hình 2.4. Số l ượ ng gen c ủ a sinh v ậ t eukaryote r ấ t khác nhau. Thay đổ i t ư 6.000-40.000 như ng không t ươ ng quan v ớ i kích th ướ c genome ho ặộứạủơể c đ ph c t p c a c th .
29. Cây Arabidopsis có kích thướ c genome trung gian gi ữ a giun tròn và ru ồ i gi ấ m, nhưạốớơả ng l i có s gen l n h n c hai (25.000). Đi ề u này m ộầữ t l n n a cho th ấ y không có mộệ t quan h rõ ràng, và cũng nh ấạặệủựậ n m nh nét đ c bi t c a th c v t, là có th ểề có nhi u gen hơ n (do s ự nhân đôi c ủ a ông bà t ổ tiên truy ề n l ạ i) các t ế bào đ ộ ng v ậ t. Đa s ố genome Arabidopsis đượ c tìm th ấ y trong các đo ạ n đ ượ c nhân đôi, g ợ i ý r ằ ng có m ộ t sự nhân đôi xa x ư a trong genome (t ạ o ra m ộ t d ạ ng t ứ b ộ i). Ch ỉ 35% các gen c ủ a Arabidopsis hiệ n di ệ n nh ư các b ả n sao đ ơ n. Genome củ a lúa l ớ n h ơ n Arabidopsis khoả ng 4 l ầ n, nh ư ng s ố gen ch ỉ l ớ n h ơ n khoả ng 50%, có kh ả năng kho ả ng 40.000 gen. DNA l ặ p l ạ i chi ế m kho ả ng 42-45% genome. Hơ n 80% gen tìm th ấ y trong Arabidopsis đượ c hi ệ n di ệ n trong lúa. Trong s ố nhữ ng gen chung này, kho ả ng 8.000 có trong Arabidopsis và lúa như ng không th ấ y ở bấ t kỳ genome đ ộ ng v ậ t ho ặ c vi khu ẩ n nào (nh ữ ng gen đã đ ượ c phân tích trình t ự ). Có khả năng đây là t ậ p h ợ p các gen mã hóa cho các ch ứ c năng đ ặ c tr ư ng c ủ a th ự c v ậ t, chẳ ng h ạ n nh ư quang h ợ p. II. Tính phư c t ạ p c ủ a genome Kế t qu ả nghiên c ứ u đ ộ ng h ọ c c ủ a các ph ả n ứ ng lai đ ượ c ti ế n hành gi ữ a genomic DNA vớ i cDNA (complementary DNA-DNA b ổ sung), gi ữ a DNA v ớ i mRNA cho thấ y h ầ u h ế t các gen ho ạ t đ ộ ng đ ề u n ằ m trong thành ph ầ n DNA không lặ p l ạ i. Nh ư v ậ y, thành ph ầ n này có ý nghĩa r ấ t quan tr ọ ng trong vi ệ c đánh giá tính phứ c t ạ p c ủ a genome. Hay nói cách khác, d ự a vào thành ph ầ n DNA không l ặ p l ạ i có thể bi ế t đ ượ c kích th ướ c genome cũng nh ư m ứ c đ ộ ti ế n hóa c ủ a loài. N ế u nh ư kích thướ c genome ( ở tr ạ ng thái đ ơ n b ộ i) đ ượ c coi là m ộ t thông s ố đ ộ ng h ọ c (ký hi ệ u C), thì giá trị này đ ặ c tr ư ng cho t ư ng loài và không ph ả i luôn luôn t ỷ l ệ thu ậ n v ớ i tính phứ c t ạ p c ủ a loài. Ng ượ c l ạ i, giá tr ị C ph ả n ánh các đ ặ c đi ể m sau: - Số l ượ ng DNA mã hóa cho các s ả n ph ẩ m c ầ n thi ế t đ ố i v ớ i ho ạ t đ ộ ng s ố ng c ủ a cơ th ể r ấ t nh ỏ so v ớ i s ố l ượ ng DNA có trong genome. - Có sựếổấớủ bi n đ i r t l n c a giá tr ịữộố C gi a m t s loài mà tính ph ứạủ c t p c a chúng không khác nhau nhiề u. Genome vi khuẩ n đ ượ c xem là ch ỉ ch ứ a các đo ạ n DNA không l ặ p l ạ i và các gen thườ ng t ồ n t ạ i b ả n sao đ ơ n. Ng ượ c l ạ i, genome c ủ a eukaryote th ườ ng ch ứ a các gen có hai hoặ c nhi ề u b ả n sao. H ơ n n ữ a, trình t ự nucleotide c ủ a các b ả n sao này có th ể không giố ng nhau hoàn toàn m ặ c dù s ả n ph ẩ m protein mà chúng mã hóa có cùng m ộ t ch ứ c năng. Các bả n sao t ươ ng đ ồ ng c ủ a m ộ t gen đ ượ c x ế p chung vào m ộ t nhóm g ọ i là m ộ t họ gen (gene family). Nh ư v ậ y, ngoài các gen có m ộ t b ả n sao gi ố ng nh ư ở vi khu ẩ n, genome củ a eukaryote còn ch ứ a các h ọ gen. H ầ u h ế t các gen mã hóa cho protein đã đượ c phân l ậ p đ ề u n ằ m trong các h ọ gen khác nhau. Các gen trong m ộ t h ọ th ườ ng hoạ t đ ộ ng theo th ờ i gian và không gian. Đi ề u đó có nghĩa, m ỗ i thành viên trong h ọ thườ ng ho ạ t đ ộ ng ở m ộ t th ờ i đi ể m nh ấ t đ ị nh trong quá trình hình thành và phát tri ể n
30. cá thể ho ặ c ho ạ t đ ộ ng trong các mô chuyên bi ệ t. Khi m ộ t thành viên trong h ọ b ị đ ộ t biế n (b ấ t ho ạ t) thì thành viên khác có th ể ho ạ t đ ộ ng thay th ế . Khái niệ m v ề gen đ ượ c hình thành khi các nhà di truy ề n h ọ c c ổ đi ể n nghiên c ứ u biể u hi ệ n các tính tr ạ ng m ớ i do gây đ ộ t bi ế n DNA c ủ a genome vi khu ẩ n hay th ự c khuẩ n th ể (bacteriophage). M ộ t gen đ ượ c xem là m ộ t đo ạ n DNA mà b ấ t c ứ đ ộ t bi ế n nào xả y ra trên đó đ ềẫếấệ u d n đ n xu t hi n tính tr ạớề ng m i. Đi u này d ễểốớ hi u đ i v i nhữ ng genome ch ỉ ch ứ a các gen có m ộ t b ả n sao (nh ư genome c ủ a prokaryote). Tuy nhiên, ở genome c ủ a eukaryote, khi có nhi ề u gen cùng qui đ ị nh m ộ t tính tr ạ ng ho ặ c các gen tươ ng đ ồ ng trong m ộ t h ọ có th ể ho ạ t đ ộ ng h ỗ tr ợ thay th ế nhau thì đ ộ t bi ế n trên mộ t gen không ph ả i lúc nào cũng quan sát đ ượ c ở m ứ c đ ộ phenotype. M ặ t khác, các đoạ n DNA t ươ ng ứ ng v ớ i trình t ự mã hóa (coding sequence, exon) cho m ộ t protein thườ ng b ị ng ắ t quãng b ở i các đo ạ n DNA không ch ứ a thông tin di truy ề n (non-coding sequence, intervening sequence, intron). Các intron đượ c phiên mã cùng v ớ i các exon sang phân tử RNA g ọ i là phân t ử ti ề n thân mRNA (pre-mature mRNA hay pre-mRNA) như ng sau đó chúng b ị lo ạ i b ỏ và các exon đ ượ c n ố i l ạ i v ớ i nhau t ạ o thành phân t ử mRNA hoàn chỉ nh (mature mRNA hay mRNA) đ ượ c dùng cho quá trình sinh t ổ ng h ợ p protein. Quá trình cắ t các intron, n ố i exon không tuân theo m ộ t tr ậ t t ự b ắ t bu ộ c mà biế n hóa đa d ạ ng t ạ o ra các phân t ử mRNA khác nhau t ư m ộ t phân t ử pre-mRNA (Hình 2.5). Bên cạ nh mRNA, các phân t ử rRNA và tRNA cũng đ ượ c hình thành t ư các phân tử ti ề n thân ch ứ a intron. Ngoài ra, còn có hi ệ n t ượ ng mã di truy ề n c ủ a gen này n ằ m xen kẽ v ớ i các mã di truy ề n c ủ a gen khác (các gen n ằ m g ố i lên nhau-overlapping) ho ặ c trườ ng h ợ p d ị ch chuy ể n khung đ ọ c ngay trên m ộ t đo ạ n DNA. Chúng ta đã biế t đ ế n ch ứ c năng c ủ a các phân t ử RNA trong ho ạ t đ ộ ng s ố ng c ủ a tế bào. Bên c ạ nh ba lo ạ i RNA đã đ ượ c nghiên c ứ u khá k ỹ (mRNA, rRNA và tRNA), vai trò củ a m ộ t s ố lo ạ i RNA khác m ớ i đ ượ c phát hi ệ n vào nh ữ ng năm cu ố i th ế k ỷ 20. Chúng kiể m soát s ự ho ạ t đ ộ ng c ủ a gen (hi ệ n t ượ ng b ấ t ho ạ t gen-gene silencing), tham gia phả n ứ ng đ ọ c s ử a thông tin di truy ề n trên phân t ử mRNA (hi ệ n t ượ ng RNA editing) hay quyế t đ ị nh tính b ề n v ữ ng c ủ a mRNA (các ribonuclease) Th ậ m chí có nhữ ng phân t ử pre-mRNA đ ượ c t ổ ng h ợ p không ph ả i mã hóa cho protein mà v ớ i m ụ c đích phân cắ t t ạ o ra nh ữ ng phân t ử RNA có kích th ướ c nh ỏ h ơ n tham gia quá trình kiể m soát ho ạ t đ ộ ng c ủ a các gen khác. Đ ộ t bi ế n ở nh ữ ng đo ạ n DNA mã hóa cho t ấ t cả các lo ạ i RNA này th ườ ng g ắ n li ề n v ớ i vi ệ c xu ấ t hi ệ n tính tr ạ ng m ớ i. Do đó, c ầ n xem xét các đoạ n nucleotide đó nh ư các gen m ặ c dù chúng không mã hóa cho protein.
31. Hình 2.5. Các gen bị gián đo ạ n đ ượ c bi ể u hi ệ n thông qua RNA ti ề n thân. Các intron đượ c loạỏ i b , trong khi đó các exon đ ượốạớ c n i l i v i nhau. mRNA ch ỉ có các trình t ựủ c a exon đ ượ c dị ch mã thành chu ỗ i polypeptide. Ngày nay, theo quan điể m c ủ a sinh h ọ c phân t ử , m ộ t gen đ ượ c xem là m ộ t đo ạ n DNA mã hóa cho mộả t s n ph ẩầ m c n thi ếốớạộố t đ i v i ho t đ ng s ng c ủế a t bào. Rõ ràng rằ ng không ph ả i ch ỉ có DNA mã hóa cho protein mà c ả các DNA mã hóa cho rRNA, tRNA và các loạ i RNA khác tham gia vào nh ữ ng ph ươ ng th ứ c ki ể m soát ho ạ t đ ộ ng củ a genome cũng đ ượ c xác đ ị nh là gen. III. Thay đổ i tr ậ t t ư c ủ a các đo ạ n DNA trong genome-Transposon 1. Sự thay đ ổ i tr ậ t t ự c ủ a các đo ạ n DNA trong genome Như đã bi ế t kích th ướ c và c ấ u trúc genome c ủ a các loài r ấ t khác nhau. Nguyên nhân củ a s ự đa d ạ ng này là do: 1) trao đ ổ i chéo gi ữ a các c ặ p nhi ễ m s ắ c th ể t ươ ng đồ ng x ả y ra trong phân bào gi ả m nhi ễ m đã d ẫ n đ ế n s ự đa d ạ ng trong loài; 2) trong genome trậ t t ự các đo ạ n DNA cũng nh ư c ấ u trúc các gen đ ượ c s ắ p x ế p l ạ i, đ ặ c tr ư ng cho tư ng cá th ể . Chính các y ế u t ố di truy ề n có kh ả năng di chuy ể n gi ữ a các v ị trí trong mộ t genome ho ặ c gi ữ a các genome khác nhau đã góp ph ầ n làm đa d ạ ng di truy ề n gi ữ a các cá thể trong loài.
32. Các yế u t ố di truy ề n có kh ả năng di chuy ể n đ ượ c x ế p vào ba nhóm chính tùy thuộ c vào tính đ ộ c l ậ p c ủ a chúng: - Nhóm thứ nh ấ t g ồ m các y ế u t ố có kh ả năng di chuy ể n gi ữ a các v ị trí khác nhau trong genome. - Nhóm thứ hai g ồ m các y ế u t ố có kh ả năng ghép vào và tách ra kh ỏ i genome đ ể tồ n t ạ i đ ộ c l ậ p trong t ế bào (các episome nh ư plasmid F, bacteriophage). - Nhóm thứ ba ch ỉ di chuy ể n d ướ i s ự ki ể m soát c ủ a t ế bào ở nh ữ ng giai đo ạ n sinh trưở ng phát tri ể n nh ấ t đ ị nh đ ể s ắ p x ế p kh ở i đ ộ ng m ộ t s ố gen đ ặ c bi ệ t (hình thành cassette hoạ t đ ộ ng ở n ấ m men S. cerevisiae, ký sinh trùng đơ n bào Trypanosome). Sự di chuy ểủếốở n c a các y u t nhóm th ứ hai và th ứ ba liên quan t ớổợ i tái t h p tươ ng đ ồ ng ho ặ c tái t ổ h ợ p ở các v ị trí đ ặ c hi ệ u. M ặ c dù không có kh ả năng t ồ n t ạ i độ c l ậ p bên ngoài genome, nhóm th ứ nh ấ t t ự ki ể m soát s ự di chuy ể n c ủ a chúng trong genome và không đòi hỏ i s ự t ươ ng đ ồ ng gi ữ a chúng v ớ i v ị trí ghép vào. Do đó, có th ể nói chúng di chuyể n m ộ t cách t ự do trong genome và đ ượ c g ọ i tên chung là các y ế u t ố di chuyể n (transposable elements, transposons). Trong khi th ự c khu ẩ n th ể λ đượ c xem là episome, thì thự c khu ẩ n th ể Mu và mộ t s ố retrovirus ở eukaryote đ ượ c xem là transposable elements. 2. Các transposon Các yế u t ố di chuy ể n có th ể đ ượ c chia làm hai lo ạ i d ự a vào cách th ứ c di chuy ể n củ a chúng: - Loạ i th ứ nh ấ t đ ượ c g ọ i là retroelement, chúng ph ả i tr ả i qua hình th ứ c trung gian RNA trong quá trình di chuyể n (RNA genome đ ượ c sao chép nh ờ reverse transcriptase tạ o ra cDNA đ ể ghép vào v ị trí m ớ i) (Hình 2.6). - Loạ i th ứ hai là các đo ạ n DNA ho ặ c b ị tách ra ho ặ c đ ượ c tái b ả n t ạ o thêm b ả n sao để ghép vào v ị trí m ớ i. Thông th ườ ng, lo ạ i th ứ hai này đ ượ c g ọ i là transposon.
33. Hình 2.6. Retroelement Sự̣̀̉́ tôn tai cua cac transposon (còn g ọ i là gen nh ạ̉̀́ử́̀ y) la net đăc tr ng cua tê bao thự c vât. ̣ Ơ sinh v ậ t eukaryote, các transposon còn đ ượ c g ọ i là y ế u t ố ki ể m soát (controlling elements). Transposon có thê ̉di chuyên ̉ t ư nhiêm ̃ săc ́ thê ̉nay ̀ sang nhiêm ̃ săc ́ thệ̉́ợ̉́́́ khac hoăc cac vi tri khac nhau trên cung ̀ộ̃́̉́́̉̉ m t nhiêm săc thê. Chung co thê “nhay” vaò gi ữ a day ̃ ma ̃cua ̉ m ộ t gen đang hoat ̣ đông ̣ lam ̀ cho gen nay ̀ bât ́ hoat ̣ hoăc ̣ ng ượ c lai. ̣ Ơ cây ngô, ng ườ i ta đa ̃phat ́ hiên ̣ 10 nhom ́ transposon và môt ̣ sô ́trong chúng đa ̃đ ượ c giaỉ ma. ̃ T ấ t c ả chung ́ đêu ̀ co ́kich ́ th ướ c kho ả ng 4.200 nucleotide va ̀khac ́ nhau chu ̉yêu ́ ở đoan ̣ ma ̃tân ̣ cung ̀ cua ̉ gen. Khi di chuyể n, các transposon gây ra vi ệ c s ắ p x ế p và t ổ ch ứ c l ạ i genome c ủ a tư ng cá th ể nh ư t ạ o các đo ạ n DNA m ớ i ở v ị trí chúng ghép vào và tách ra. Chúng có thểểớịấ di chuy n t i v trí b t kỳ và hoàn toàn không c ầộốệữị n m t m i quan h nào gi a hai v trí mớ i và cũ. Khi tách ra transposon có th ể mang theo các đo ạ n DNA bên c ạ nh, gây ra sự m ấ t đo ạ n t ạ i v ị trí cũ. Ng ượ c l ạ i, khi ghép vào v ị trí m ớ i, chúng gây ra hi ệ n t ượ ng thêm đoạ n ho ặ c chuy ể n đo ạ n ở v ị trí m ớ i. Do đó, transposon gi ố ng nh ư các vector chuyên chở DNA t ư n ơ i này sang n ơ i khác trong m ộ t genome ho ặ c t ư genome này sang genome khác. Ngoài ra, trao đổ i chéo gi ữ a các transposon t ươ ng đ ồ ng ở hai v ị trí khác nhau trên mộ t ho ặ c trên hai nhi ễ m s ắ c th ể cũng t ạ o ra nh ữ ng bi ế n đ ổ i t ươ ng t ự . Nh ữ ng bi ế n đổẫếệắếạ i đó d n đ n vi c s p x p l i genome, t ạ o ra tính đa d ạữ ng gi a chúng và tính đ ặ c thù riêng củ a t ư ng cá th ể . Đ ặ c bi ệ t, s ự thay đ ổ i v ị trí c ủ a các transposon còn có th ể ảnh h ưở ng đ ế n ho ạ t đ ộ ng c ủ a các gen phân b ố xung quanh ngay khi chúng không làm thay đổ i tr ậ t t ự nucleotide ở nh ữ ng gen này. T ầ n s ố ghép c ủ a các transposon vào
34. genome khoả ng 10-5-10-7 sau mỗ i th ế h ệ . Ng ượ c l ạ i, t ầ n s ố tách ra kho ả ng 10-6 đế n 10- 10. Các transposon có thể chia làm hai nhóm d ự a vào kh ả năng di chuy ể n đ ộ c l ậ p hay phả i ph ụ thu ộ c vào s ự có m ặ t c ủ a transposon khác: - Nhóm thứ nh ấ t g ồ m các đo ạ n DNA có kh ả năng di chuy ể n đ ộ c l ậ p. Chúng chứ a gen mã hóa cho các protein đi ề u khi ể n quá trình đó, ví d ụ nh ư enzyme nh ậ n bi ế t hai đầ u transposon đ ể tách chúng ra kh ỏ i v ị trí cũ và ghép vào v ị trí m ớ i. Do đó, quá trình này đượ c th ự c hi ệ n hoàn toàn đ ộ c l ậ p. Nh ờ kh ả năng này, chúng t ạ o ra các đ ộ t biế n không b ề n v ữ ng. - Nhóm thứ hai g ồ m các transposon không có kh ả năng t ự ho ạ t đ ộ ng, t ứ c là chúng không có khả năng di chuy ể n do không mang đ ủ thông tin di truy ề n mã hóa cho các enzyme cầ n thi ế t. Vì v ậ y, các transposon lo ạ i này t ạ o ra nh ữ ng đ ộ t bi ế n gen m ộ t cách tự phát nh ư ng là đ ộ t bi ế n b ề n v ữ ng. Vi ệ c di chuy ể n c ủ a transposon ở nhóm này phụ thu ộ c vào s ự có m ặ t c ủ a transposon có kh ả năng ho ạ t đ ộ ng đ ộ c l ậ p cùng nhóm. Hai transposon có thể x ế p vào cùng nhóm khi chúng có c ấ u trúc t ươ ng đ ồ ng nhau, đ ặ c biệ t là các đo ạ n oligonucleotide phân b ố ở hai đ ầ u transposon. Đây là v ị trí đ ể enzyme nhậ n bi ế t và c ắ t n ố i transposon ở v ị trí đi và đ ế n. Các transposon đơ n gi ả n nh ấ t ở vi khu ẩ n đ ượ c g ọ i là IS (insertion sequences). Chúng có thể n ằ m trên chromosome ho ặ c trên các plasmid. Transposon vi khu ẩ n không giữ m ộ t ch ứ c năng nào trong t ế bào. Trình t ự nucleotide ở m ộ t đ ầ u IS th ườ ng l ặ p l ạ i như ng ng ượ c chi ề u so v ớ i đ ầ u kia (inverted repeat). Ví d ụ nh ư GGTAT-Xn-ATACC. Do đó, khi sợ i đôi IS tách thành hai s ợ i đ ơ n thì m ỗ i s ợ i này có kh ả năng hình thành liên kế t b ổ sung t ạ i hai đ ầ u c ủ a IS t ạ o c ấ u trúc thân-quai/cán-thòng l ọ ng (stem-loop). Transposon thườ ng mã hóa cho các enzyme transposase làm nhi ệ m v ụ nh ậ n bi ế t chuỗ i nucleotide l ặ p l ạ i ng ượ c chi ề u (inverted repeat) đ ể c ắ t transposon và di chuy ể n. Khi mộ t IS đ ượ c ghép vào v ị trí b ấ t kỳ c ủ a genome thì m ộ t đo ạ n ng ắ n DNA t ạ i v ị trí này đượ c nhân đôi, t ứ c là hai đ ầ u c ủ a IS đ ượ c ch ặ n b ở i các nucleotide gi ố ng nhau, s ắ p xế p theo cùng m ộ t chi ề u. Vì v ậ y, đo ạ n ng ắ n DNA này đ ượ c g ọ i là “l ặ p l ạ i xuôi chiề u” (direct repeat). Chi ề u dài c ủ a chúng th ườ ng kho ả ng 9 bp (Hình 2.7). D ự a vào s ự có mặ t c ủ a các đo ạ n cùng chi ề u và ng ượ c chi ề u có th ể xác đ ị nh đ ượ c v ị trí transposon ghép vào hoặ c chuy ể n đi. Ngoài các IS, ở vi khu ẩ n còn có các đo ạ n DNA có kh ả năng di chuy ể n v ớ i kích thướ c dài h ơ n, g ọ i là Tn. Các Tn thườ ng phân b ố trên plasmid (phân t ử DNA d ạ ng vòng, kích thướ c th ườ ng không l ớ n) và có kh ả năng chèn vào b ấ t kỳ v ị trí nào trong genome. Chúng thườ ng mang thông tin di truy ề n mã hóa cho các protein kháng kháng sinh. Giữ a IS và Tn có mố i quan h ệ v ề trình t ự các nucleotide. Các Tn thườ ng đ ượ c gi ớ i hạ n ở hai đ ầ u b ở i m ộ t lo ạ i IS nào đó. Quá trình di chuyể n c ủ a m ộ t transposon t ư v ị trí cũ (v ị trí cho, donor) sang v ị trí mớ i (v ị trí nh ậ n, recipient) x ả y ra theo hai c ơ ch ế khác nhau:
35. - Cơ ch ế sao y b ả n chính (transposon có m ặ t ở c ả hai v ị trí). Theo cơ ch ế này, phiên bả n sau khi đ ượ c sao chép t ư v ị trí cho s ẽ đ ượ c ghép vào v ị trí nh ậ n. Nh ư vậ y, m ỗ i l ầ n di chuy ể n thì s ố l ượ ng b ả n sao đ ượ c tăng lên. Quá trình này liên quan đế n hai lo ạ i enzyme: transposase (tác đ ộ ng vào hai đ ầ u b ả n g ố c transposon) và resolvase (tác độ ng lên b ả n sao). - Cơ ch ế tách ra kh ỏ i v ị trí cũ di chuy ể n đ ế n v ị trí m ớ i. Theo cơ ch ế này, mộ t transposon có th ể tách ra kh ỏ i v ị trí cũ và ghép vào v ị trí m ớ i. Nh ư v ậ y, s ố l ượ ng transposon không thay đổ i. Ki ể u di chuy ể n này ch ỉ c ầ n enzyme transposase. Khi transposon chuyể n đi, v ị trí cũ b ị gãy và nó đ ượ c n ố i l ạ i nh ờ c ơ ch ế s ử a ch ữ a DNA trong tế bào. Hình 2.7. Mộ t transposon có đo ạ n l ặ p l ạ i ng ượ c chi ề u g ồ m 9 nucleotide (123456789) gắ n vào v ị trí có 5 nucleotide (ATGCA). Đoạ n ng ắ n ATGCA có m ặ t ở cả hai đ ầ u c ủ a IS và có trình t ự nucleotide s ắ p x ế p theo cùng m ộ t chi ề u. Khi transposon ghép vào vị trí m ớ i, m ộ t đo ạ n nucleotide ng ắ n ở đó đ ượ c sao thành hai bảỗảằởộầủ n, m i b n n m m t đ u c a transposon (direct repeat). T ạịậ i v trí nh n, mỗ i s ợ i đ ơ n DNA b ị c ắ t l ệ ch nhau vài nucleotide. Transposon n ố i vào các đ ầ u c ắ t, t ạ o ra hai khoả ng tr ố ng (gaps). Chúng đ ượ c s ử a ch ữ a theo nguyên t ắ c t ạ o c ặ p b ổ sung. Do đó, đoạ n nucleotide n ằ m gi ữ a hai v ế t c ắ t đ ượ c sao chép thành hai b ả n, m ỗ i b ả n ở m ộ t
36. đầ u và trình t ự s ắ p x ế p các nucleotide gi ố ng nhau. Vì v ậ y, chúng đ ượ c g ọ i là l ặ p l ạ i xuôi chiề u. IV. Tươ ng tác c ủ a T-DNA v ớ i genome th ự c v ậ t Sự di chuy ể n DNA t ư genome vi khu ẩ n sang genome th ự c v ậ t đ ượ c nghiên c ứ u khá kỹ đ ố i v ớ i t ươ ng tác gi ữ a Argobacterium tumefaciens hoặ c A. rhizogenes vớ i h ầ u hế t các cây hai lá m ầ m. Hi ệ n t ượ ng di chuy ể n DNA này gây nh ữ ng bi ế n đ ổ i v ề m ặ t di truyề n, bi ể u hi ệ n ở vi ệ c xu ấ t hi ệ n các kh ố i u trên thân cây (A. tumefaciens) hoặ c m ọ c rấ t nhi ề u r ễ t ơ (A. rhizogenes) tạ i n ơ i b ị nhi ễ m vi khu ẩ n. A. tumefaciens và A. rhizogenes là hai loai ̀ vi khuân ̉ gây bênh ̣ ở thự c v ậ t. Tuy nhiên, sau đó bệ nh đ ượ c duy trì l ạ i không ph ụ thu ộ c s ự t ồ n t ạ i c ủ a vi khu ẩ n. Đó là do mộ t s ố gen c ủ a vi khu ẩ n đã đ ượ c chuy ể n vào genome cây ch ủ và ho ạ t đ ộ ng gây b ệ nh. Các gen vi khuẩ n có kh ả năng di chuy ể n và ho ạ t đ ộ ng trong t ế bào th ự c v ậ t n ằ m trên Ti-plasmid (tumor inducing plasmid) củ a A. tumefaciens hoặ c trên Ri-plasmid (hairy-root inducing plasmid) củ a A. rhizogenes. Cũng như các kh ố i u đ ộ ng v ậ t, các t ế bào thự c v ậ t có DNA vi khu ẩ n ghép vào genome b ị chuy ể n sang tr ạ ng thái m ớ i, ở đó sự phát tri ể n và bi ệ t hóa c ủ a chúng hoàn toàn khác v ớ i các t ế bào bình th ườ ng. Đó là do hoạ t đ ộ ng c ủ a các gen vi khu ẩ n trong genome c ủ a th ự c v ậ t. Bình th ườ ng, nh ữ ng gen này có mặ t trong genome vi khu ẩ n nh ư ng chúng ch ỉ đ ượ c ho ạ t đ ộ ng (m ở ) sau khi hợ p nh ấ t vào genome th ự c v ậ t và ch ị u s ự ki ể m soát c ủ a t ế bào cây ch ủ . Quá trình này có tính chấặệậủứ t đ c hi u v t ch , t c là m ộạ t lo i vi khu ẩỉ n ch có kh ả năng gây kh ố i u trên mộ t s ố lo ạ i cây ch ủ này mà không t ươ ng tác đ ượ c v ớ i các lo ạ i cây khác. Việ c t ạ o kh ố i u hay th ự c hi ệ n quá trình chuy ể n gen t ư vi khu ẩ n sang genome thựậẫếếổạ c v t d n đ n bi n đ i tr ng thái sinh lý c ủế a t bào th ựậ c v t đòi h ỏ i các đi ềệ u ki n sau: - Phả i có ho ạ t đ ộ ng c ủ a các gen trên ba vùng chvA, chvB, pscA nằ m trên nhi ễ m sắ c th ể c ủ a vi khu ẩ n đ ể kh ở i đ ộ ng vi ệ c bám dính vi khu ẩ n vào thân cây. - Ti-plasmid hoặ c Ri-plasmid ph ả i mang vùng vir (nằ m ngoài vùng T-DNA). Vùng này mang các gen cầ n thi ế t cho vi ệ c tách và v ậ n chuy ể n T-DNA sang t ế bào thự c v ậ t. - Các gen trên vùng T-DNA củ a Ti-plasmid ho ặ c Ri-plasmid đ ượ c ghép vào genome thự c v ậ t gây bi ế n đ ổ i tr ạ ng thái các t ế bào này. 1. Ti-plasmid và Ri-plasmid Plasmid là cac ́ vong ̀ DNA t ự sinh san ̉ đôc ̣ lâp ̣ ở bên ngoài nhân. Ơ vi khuân ̉ và độự̣ ng-th c vât, plasmid liên quan t ớ́́ớ́̉́̀́̉ i yêu tô gi i tinh cua tê bao, đên kha năng chông ́ chiụ̣́́ cac loai khang sinh Đăc ̣̉ điêm quan trong ̣̉ cua plasmid la ̀́́̉́̀chung co thê liên kêt vao nhiêm̃́̉ự̃́̉̀ săc thê nh ng cung co thê tôn tai bên ngoai ̣̣̣̀̃́̉́ nhiêm săc thê môt cach đôc lâp.
37. Cać plasmid cua ̉ Agrobacterium mang các vùng T-DNA, vir (virulence region), gen chuyể n hóa opine, và vùng ori khở i đ ầ u sao chép trong t ế bào v ậ t ch ủ . Sự khác nhau gi ữ a Ti-plasmid và Ri-plasmid ở ch ỗ , vùng T-DNA c ủ a Ti-plasmid chứ a các gen t ổ ng h ợ p auxin, cytokinin và opine. Trong khi đó, vùng T-DNA c ủ a Ri- plasmid chỉ mang gen t ổ ng h ợ p auxin và opine. Đây là đi ể m khác nhau gây ra hi ệ u qu ả tác độ ng khác nhau lên th ự c v ậ t. C ơ chê ́gây bênh ̣ cua ̉ cac ́ Agrobacterium là sau khi xâm nhiêṃ̃̀́̀́́ vao tê bao, chung găn đoan T-DNA vao ̣̀́ bô may di truyên ̀̉́̀ự̣ cua tê bao th c vât, làm rôí loan ̣ cac ́ chât ́ sinh tr ưở ng nôi ̣ sinh, tao ̣ ra khôi ́ u (tr ườ ng h ợ p A. tumefaciens) hoăc̣ rê ̃ tơ (tr ườ ng h ợ p A. rhizogenes). Khả năng chuyên ̉ các gen nay ̀ đa ̃ đ ượ c khai thac ́ đê ̉ chuyên̉ gen ngoai ̣ lai vao ̣̀́ bô may di truyên ̀̉́̀ự̣ cua tê bao th c vât theo y ́́muôn. 2. T-DNA Vùng T-DNA đượ c nghiên c ứ u rât ́ ky. ̃ Đo ́la ̀m ộ t đoan ̣ DNA co ́kich ́ th ướ c 25 kb trong đó ch ứ a gen ma ̃hoa ́ cho sinh tông ̉ h ợ p auxin, cytokinin và opine (tr ườ ng h ợ p Ti- plasmid) hoặ c auxin và opine (tr ườ ng h ợ p Ri-plasmid). Trong plasmid, vi ̣tri ́cua ̉ T-DNA đượ c gi ớ i han ̣ băng ̀ biên ph ả i (right border-RB) và biên trái (left border-LB), m ỗ i biên có chiề u dài 25 bp. 3. Vùng vir Trong cać vung ̀ DNA cua ̉ Ti-plasmid và Ri-plasmid, ngoai ̀ T-DNA, đ ượ c nghiên cứ̀ở̀̀ u nhiêu h n ca la vung DNA phu ̣́̉ trach kha năng lây nhiêm ̣̃̀̀ con goi la vùng vir (virulence). San̉ phâm ̉ hoat ̣ đông ̣ cua ̉ cac ́ gen năm ̀ trong vung ̀ vir dướ i tac ́ đông ̣ kich ́ thich́ cua ̉ cac ́ h ợ p chât ́ phenol tiêt ́ ra t ư vêt ́ th ươ ng la ̀m ộ t loat ̣ các protein đăc ̣ hiêu ̣ nh ư virA, virE2, virB, virD, virD2, virC1 Cać protein nay ̀ nhân ̣ biêt ́ cac ́ vêt ́ th ươ ng ở cac ́ cây chủ́ợ̀́̀ thich h p (hâu hêt la cây hai la ́̀́́̉mâm), kich thich san sinh ra cac ̣́ đoan T-DNA, bao boc̣ che ch ợ̉́ cac đoan DNA nay ̣̀̀́́́ớ va giup chung tiêp cân v i genome cua ̉ cây chu ̣̉môt cach́ an toan. ̀ 4. Quá trình chuyể n T-DNA vào t ế bào th ự c v ậ t Quá trình cắ t đo ạ n T-DNA ra kh ỏ i plasmid và v ậ n chuy ể n nó vào t ế bào th ự c v ậ t trướ c h ế t ph ụ thu ộ c vào s ả n ph ẩ m c ủ a các gen vir. Vi khuẩ n xâm nhi ễ m t ạ i b ấ t kỳ v ị trí tổ n th ươ ng nào trên thân cây. Cây có v ế t th ươ ng do s ự h ỏ ng ng ẫ u nhiên c ủ a màng tế bào th ự c v ậ t ho ặ c do vi khu ẩ n ti ế t ra h ỗ n h ợ p nh ữ ng ch ấ t đ ượ c mã hóa b ở i các gen vir. Hoạ t đ ộ ng c ủ a các gen này đ ượ c ho ạ t hóa b ở i h ợ p ch ấ t phenolic c ủ a cây (ví d ụ như acetosyringone, catechol, các d ẫ n xu ấ t c ủ a chalcone ). Ngoài ra, các monosaccharide như glucose, arabinose có m ặ t trong môi tr ườ ng cũng làm tăng kh ả năng gây cả m ứ ng nhóm gen vir. Protein VirA đóng vai trò quan trọ ng trong vi ệ c quy ế t đ ị nh lo ạ i cây ch ủ b ị nhi ễ m bở i Agrobacterium. Trong thự c t ế , Agrobacterium không có khả năng xâm nh ậ p vào cây mộ t lá m ầ m, có th ể protein VirA không nh ậ n bi ế t các tín hi ệ u do cây m ộ t lá m ầ m tiế t ra. Nói chung, Agrobacterium chỉ gây hai ̣ ở cây hai la ́mâm, ̀ vi ̀vây ̣ ng ườ i ta cho răng ̀
38. chunǵ̉́̉ư chi co thê đ a T-DNA vao ̣̀́ hê gen cac cây hai la ́̀mâm. Tuy nhiên, gân ̀ đây nhiêu ̀ tać̉̃ứ gia đa ch ng minh khi nhiêm ̃ vi khuân, ̉́ cac cây m ộ́̀̃́̉̉́ t la mâm cung co thê san xuât opine và vì th ế co ́thê ̉khai thac ́ kha ̉năng biên ́ nap ̣ gen cua ̉ Agrobacterium vào cây mộ t lá mâm. ̀ Hi ệ n nay, ng ườ i ta cũng đã thành công trong vi ệ c chuy ể n gen vào m ộ t s ố cây mộ t lá m ầ m nh ư lúa, mía qua trung gian A. tumefaciens. Khi cây nhiêm̃ A. tumefaciens, do T-DNA hợ p nh ấ t vao ̀ trong genome cua ̉ cây chu ̉ băt́ đâu ̀ hoat ̣ đông ̣ va ̀san ̉ xu ấ t ra auxin, cytokinin va ̀opine, toan ̀ bô ̣sinh tr ưở ng cua ̉ cây bị rôi ́ loan, ̣ cac ́ tê ́bao ̀ phân chia vô tô ̉ch ứ c va ̀tao ̣ ra cac ́ khôi ́ u. Opine đ ượ c vi khuân ̉ s ử dung̣ nh ư m ộ t loai ̣ “th ứ c ăn” nh ờ gen chuyên ̉ hoa ́ opine trên Ti-plasmid. C ơ chê ́ lây nhiêm̃ cua ̉ A. rhizogenes đôí v ớ i cây hai la ́ mâm ̀ cung ̃ t ươ ng t ự , nh ư ng trong vung ̀ T- DNA cuả A. rhizogenes chỉ co ́gen san ̉ sinh ra auxin, vi ̀thê ́s ự thay đôi ̉ hinh ̀ thai ́ chinh ́ cuảự̣̣̀́ th c vât la chung tao ra rât ́ nhiêu ̀̃ơ rê t khi bi ̣̣̃nhiêm bênh. Để g ắ n T-DNA vào t ế bào th ự c v ậ t, đ ầ u tiên vi khu ẩ n A. tumefaciens phả i ti ế p xúc vớ i thành t ế bào th ự c v ậ t b ị t ổ n th ươ ng. Quá trình này đ ượ c th ự c hi ệ n nh ờ các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa mộ t protein liên quan đ ế n hình thành β-1,2 glucan mạ ch vòng, trong khi đó gen chvA xác đị nh m ộ t protein v ậ n chuy ể n, đ ị nh v ị ở màng trong củ a t ế bào vi khu ẩ n. Protein v ậ n chuy ể n giúp v ậ n chuy ể n β-1,2 glucan vào khoả ng gi ữ a thành t ế bào và màng sinh ch ấ t. β-1,2 glucan giữ vai trò quan tr ọ ng đ ể vi khuẩ n Agrobacterium tiế p xúc v ớ i thành t ế bào th ự c v ậ t. N ế u không có s ự ti ế p xúc này, sẽ không có s ự d ẫ n truy ề n T-DNA. Các sả n ph ẩ m protein c ủ a vùng vir có tác dụ ng cho vi ệ c d ẫ n truy ề n T-DNA t ư vi khuẩ n vào t ế bào th ự c v ậ t. Các lo ạ i protein đó r ấ t c ầ n thi ế t cho quá trình c ắ t T-DNA khỏ i plasmid, c ả m ứ ng thay đ ổ i màng t ế bào th ự c v ậ t mà chúng ti ế p xúc, tham gia di chuyểầ n ph n T-DNA qua màng vi khu ẩớếấủếựậậ n t i t bào ch t c a t bào th c v t, v n chuyể n t ớ i nhân r ồ i cu ố i cùng xâm nh ậ p vào genome c ủ a cây ch ủ . Thự c ch ấ t, ch ỉ riêng T-DNA c ủ a plasmid đ ượ c chuy ể n vào genome t ế bào th ự c vậ t, mà không còn ph ầ n nào khác. Quá trình d ẫ n truy ề n ch ỉ do s ả n ph ẩ m c ủ a các gen vir và gen chv quyế t đ ị nh mà không liên quan đ ế n các gen khác trên T-DNA. Tuy nhiên, chuỗ i DNA 25 bp (RB và LB c ủ a T-DNA) có vai trò là v ị trí c ả m ứ ng cho các s ả n phẩ m c ủ a t ổ h ợ p các gen vùng vir, đặ c bi ệ t là protein t ư gen virE mang chúng dẫ n truyềếựậ n vào t bào th c v t. Chúng ho ạộư t đ ng nh các tín hi ệậếởộ u nh n bi t và kh i đ ng quá trình dẫ n truy ề n. Tr ướ c h ế t gen virA trong tổ h ợ p gen vùng vir đượ c phosphoryl hóa nhờ tác đ ộ ng c ủ a các h ợ p ch ấ t phenol nh ư acetosyringone gi ả i phóng ra t ư các t ế bào thự c v ậ t t ổ n th ươ ng. S ả n ph ẩ m c ủ a quá trình này l ạ i ti ế p t ụ c phosphoryl hóa gen virG. Sả n ph ẩ m c ủ a gen virG liên tiế p làm ho ạ t hóa toàn b ộ các gen vir còn lạ i, mà hai gen cuố i cùng đ ượ c ho ạ t hóa là gen virB và virE. Trướ c đó, khi gen virD đượ c ho ạ t hóa, sả n ph ẩ m c ủ a nó c ả m ứ ng nh ậ n bi ế t RB và LB c ủ a T-DNA và làm đ ứ t ph ầ n T- DNA ra khỏ i DNA c ủ a plasmid thành các s ợ i đ ơ n. Đ ồ ng th ờ i, quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổ i th ẩ m su ấ t màng t ế bào th ự c v ậ t, màng t ế bào b ị m ề m ra và b ị
39. thủ ng. Các s ợ i đ ơ n T-DNA đ ượ c g ắ n vào protein do gen virE tổ ng h ợ p và d ị ch chuy ể n về phía màng t ế bào vi khu ẩ n. Ngay sau đó, s ợ i T-DNA đ ượ c tr ượ t t ư vi khu ẩ n vào t ế bào thựậầố c v t. C u n i chính là s ựếợ ti p h p (conjugation) gi ữế a hai t bào do c ảứ m ng sả n ph ẩ m gen virB mà thành. Khi T-DNA đã đượ c chuy ể n giao vào t ế bào th ự c v ậ t, chúng nhanh chóng hợ p nh ấ t vào genome t ế bào th ự c v ậ t đ ượ c ổ n đ ị nh và di truy ề n như các gen bình th ườ ng khác. V. Sắ p x ế p và khu ế ch đ ạ i các gen trong genome 1. Sắ p x ế p l ạ i các gen Nói chung, genome có cấ u trúc và t ổ ch ứ c b ề n v ữ ng. DNA c ủ a genome th ườ ng không bịếổởự bi n đ i b i s phát tri ể n vô tính, nh ưỉả ng th nh tho ng các trình t ựủ c a chúng cũng có thểịểỗ b chuy n ch trong gen, b ịảế c i bi n, khu ếạặậ ch đ i ho c th m chí bi ếấ n m t, như là m ộ t tr ườ ng h ợ p t ự nhiên. Trao đổ i chéo trong phân bào gi ả m nhi ễ m là m ộ t trong nh ữ ng nguyên nhân gây ra biế n đ ổ i c ủ a genome. Tuy nhiên, đi ề u này x ả y ra ch ủ y ế u trong t ế bào sinh d ụ c mà không có trong các tế bào soma. Vi ệ c s ắ p x ế p l ạ i genome s ẽ d ẫ n đ ế n nh ữ ng thay đ ổ i sau: - Tạ o ra các gen m ớ i c ầ n thi ế t cho s ự bi ể u hi ệ n trong các tr ườ ng h ợ p đ ặ c bi ệ t. - Sự tái s ắ p x ế p có th ể đáp ứ ng cho vi ệ c m ở ho ặ c đóng gen. Đây cũng chính là cơ ch ế c ủ a s ự đi ề u hòa bi ể u hi ệ n gen. Mộ t ví d ụ đi ể n hình là hi ệ n t ượ ng s ắ p x ế p l ạ i các gen trong genome c ủ a n ấ m men S. cerevisiae và củ a ký sinh trùng Trypanosome châu Phi khi gây chứ ng ng ủ li bì ở vậ t ch ủ . 1.1. Chuyể n đ ổ i d ạ ng giao ph ố i c ủ a n ấ m men Nấ m men có th ể t ồ n t ạ i ở c ả hai d ạ ng đ ơ n b ộ i ho ặ c l ươ ng b ộ i. Các d ạ ng l ươ ng bộ i là d ị h ợ p t ử ở tr ườ ng h ợ p locus ki ể u giao ph ố i, và các t ế bào đ ơ n b ộ i có th ể ho ặ c là MATa hoặ c MATα. Việ c chuy ể n đ ổ i tr ạ ng thái đ ượ c thông qua giao ph ố i, k ế t h ợ p các bào tử đ ơ n b ộ i thành l ươ ng b ộ i và qua vi ệ c tái t ạ o giao t ử m ớ i. Tuy nhiên, giao phố i ch ỉ x ả y ra gi ữ a hai lo ạ i t ế bào đ ơ n b ộ i a và α. Các tế bào đ ơ n b ộ i cùng lo ạ i không thể k ế t h ợ p v ớ i nhau t ạ o thành t ế bào l ươ ng b ộ i. MAT (mating type locus) là vị trí ho ạ t đ ộ ng hay cassette ho ạ t đ ộ ng: m ộ t vùng đặệủễắểốứ c bi t c a nhi m s c th s 3 ch a các gen qui đ ịạ nh d ng giao ph ố i (a và α). Các gen này còn tồ n t ạ i ở hai v ị trí khác trong genome. Tuy nhiên, ở đó chúng đ ề u b ị b ấ t hoạ t. Hai v ị trí này đ ượ c g ọ i là hai v ị trí tĩnh (hay cassette tĩnh HML và HMR). M ỗ i v ị trí tĩnh chỉ mang các gen qui đ ị nh cho m ộ t d ạ ng giao ph ố i. Khi các gen đ ượ c sao chép tư m ộ t v ị trí tĩnh vào v ị trí ho ạ t đ ộ ng thì mRNA m ớ i đ ượ c t ổ ng h ợ p t ư các gen đó.
40. Như v ậ y, quá trình sao chép quy ế t đ ị nh d ạ ng giao ph ố i c ủ a n ấ m. B ả n g ố c luôn đ ượ c bảồởị o t n v trí tĩnh và b ảứ n th hai xu ấệởị t hi n v trí ho ạộ t đ ng. Nế u v ị trí tĩnh có mang đ ộ t bi ế n thì chúng s ẽ đ ượ c sao chép vào v ị trí ho ạ t đ ộ ng. Tuy nhiên, nế u x ả y ra đ ộ t bi ế n ở cassette MAT thì tính tr ạ ng m ớ i xu ấ t hi ệ n không bềộạ n. M t khi d ng giao ph ốểổ i chuy n đ i thì các gen cũ ởị v trí MAT b ịếở thay th b i bảủị n sao c a v trí tĩnh khác. Lúc đó, đ ộếịạ t bi n b lo i đi và tính tr ạớẽếấ ng m i s bi n m t. So sánh giữ a các d ạ ng cùng s ợ i n ấ m (homothallic) và khác s ợ i n ấ m (heterothallic) ngườ i ta nh ậ n th ấ y d ạ ng heterothallic có gen HO hoạ t đ ộ ng và có th ể chuyểổựộữ n đ i t đ ng gi a các ki ể u giao ph ố i, và vì th ếộ m t bào t ửơ đ n có th ể làm tăng quầ n th ể t ự ph ố i, trong khi d ạ ng homothallic không có gen HO và duy trì cùng mộ t kiể u giao ph ố i trong su ố t chu trình sinh tr ưở ng đ ơ n b ộ i. Phân tích di truyề n cho th ấ y các gen sau đây c ầ n cho vi ệ c chuy ể n đ ổ i ki ể u giao phố i: - MAT - HO, mã hóa cho enzyme endonuclease - HMLα (cho MATa chuyể n thành MATα) - HMRa (cho MATα chuyể n thành MATa) Trình tự các nucleotide ở v ị trí tĩnh và v ị trí ho ạ t đ ộ ng ch ỉ khác nhau m ộ t đo ạ n ngắ n ký hi ệ u là Ya và Yα (Hình 2.8). Enzyme HO-endonuclease nh ậ n bi ế t v ị trí đ ặ c hiệ u t ạ i ranh gi ớ i phân cách gi ữ a Z và Y và c ủ a cassette ho ạ t đ ộ ng MAT và c ắ t c ả hai sợ i DNA t ạ i đó. Đi ề u đ ặ c bi ệ t là enzyme này không c ắ t DNA khi chúng hi ệ n di ệ n ở cassette tĩnh. Sau khi đoạ n Y c ủ a vùng MAT b ị phân h ủ y h ế t, đo ạ n Y c ủ a m ộ t trong hai cassette tĩnh đượ c dùng làm khuôn m ẫ u đ ể sao chép vào v ị trí b ị phân h ủ y (Hình 2.8). Nếộếấệở u đ t bi n xu t hi n vùng MAT (đo ạ n Y), tính tr ạớỉểệạờ ng m i ch bi u hi n t m th i. Mộ t khi d ạ ng giao ph ố i chuy ể n đ ổ i, các gen bình th ườ ng đ ượ c sao chép vào vùng MAT và độ t bi ế n b ị lo ạ i đi. 1.2. Chuyể n đ ổ i gen ở Trypanosome Trypanosome có khả năng l ẩ n tránh đ ượ c h ệ th ố ng mi ễ n d ị ch c ủ a v ậ t ch ủ thườ ng b ằ ng cách thay đ ổ i kháng nguyên b ề m ặ t (surface antigen) c ủ a chúng. M ỗ i lo ạ i kháng nguyên đượ c t ổ ng h ợ p nh ờ ho ạ t đ ộ ng c ủ a m ộ t gen t ươ ng ứ ng t ạ i v ị trí ho ạ t độ ng. Gen này có th ể b ị thay th ế b ở i m ộ t gen mã hóa cho lo ạ i kháng nguyên khác n ằ m ở m ộ t v ị trí tĩnh nào đó trong genome. M ỗ i v ị trí tĩnh ch ứ a m ộ t gen ở tr ạ ng thái không hoạ t đ ộ ng. Gen này ch ỉ đ ượ c m ở khi chuy ể n đ ế n v ị trí ho ạ t đ ộ ng. Trong genome c ủ a Trypanosome, có rấ t nhi ề u v ị trí tĩnh nh ư ng ch ỉ có m ộ t v ị trí ho ạ t đ ộ ng.
41. Hình 2.8. Quá trình chuyể n đ ổ i d ạ ng giao ph ố i t ừ a sang α nh ờ trao đ ổ i gen gi ữ a vùng MATa và HMLα trên nhiễ m s ắ c th ể s ố 3 Bình thườ ng, Trypanosome sẽ tr ả i qua m ộ t s ố l ầ n bi ế n đ ổ i hình thái khi đ ượ c truyề n t ư ru ồ i châu Phi sang v ậ t ch ủ . B ề m ặ t c ủ a t ế bào Trypanosome đượ c bao b ọ c mộ t l ớ p đ ơ n g ồ m 5×106 phân tử c ủ a m ộ t lo ạ i glycoprotein (VSG-variable surface glycoprotein). Đây chính là kháng nguyên bề m ặ t c ủ a Trypanosome khi chúng xâm nhậ p vào v ậ t ch ủ . Đi ề u đáng chú ý là chúng có kh ả năng thay đ ổ i kháng nguyên b ề mặ t, do đó tránh đ ượ c ph ả n ứ ng mi ễ n d ị ch c ủ a t ế bào v ậ t ch ủ . Quá trình thay th ế kháng nguyên bề m ặ t ph ụ thu ộ c vào s ự chuy ể n đ ổ i các gen mã hóa cho chúng x ả y ra ở mộ t v ị trí đ ặ c bi ệ t trong genome (v ị trí ho ạ t đ ộ ng). Chuy ể n đ ổ i gen mã hóa kháng nguyên bề m ặ t nh ằ m m ụ c đích ho ạ t hóa gen mã hóa kháng nguyên b ề m ặ t m ớ i thay thế cho kháng nguyên t ồ n t ạ i tr ướ c đó. Khi m ộ t gen đang ho ạ t đ ộ ng b ị thay th ế b ở i mộ t gen khác s ẽ t ươ ng ứ ng v ớ i vi ệ c xu ấ t hi ệ n kháng nguyên m ớ i và lo ạ i b ỏ kháng nguyên cũ. - Cấ u trúc c ủ a m ộ t VSG ở Trypanosome Cấ u trúc chung c ủ a m ộ t VSG đ ượ c mô t ả trên hình 2.9 và 2.10. M ộ t VSG v ư a đượ c t ổ ng h ợ p dài kho ả ng 500 amino acid g ồ m tín hi ệ u N-terminus, ti ế p theo là đo ạ n peptide quyế t đ ị nh tính kháng nguyên; đo ạ n peptide b ả o th ủ gi ữ a các VSG và đuôi k ỵ nướ c. Phân t ử này đ ượ c t ổ ng h ợ p d ướ i d ạ ng protein ti ề n thân (pre-protein). Do đó,
42. chúng phả i tr ả i qua bi ế n đ ổ i ở hai đ ầ u NH2 và COOH để tr ở thành d ạ ng protein hoàn chỉ nh (mature form). D ạ ng này đ ượ c đính vào màng t ế bào ở đ ầ u COOH. Mộ t lo ạ i Trypanosome có thể t ạ o ra ít nh ấ t kho ả ng 100 VSG t ư khi nhi ễ m cho đế n khi gây ch ế t v ậ t ch ủ . S ố gen mã hóa cho VSG có th ể nhi ề u h ơ n 1.000 gen, t ấ t c ả các gen này đề u n ằ m trong genome. Tuy nhiên, t ạ i m ộ t th ờ i đi ể m b ấ t kỳ ch ỉ có m ộ t gen hoạ t đ ộ ng t ổ ng h ợ p nên m ộ t lo ạ i VSG. Do đó, s ự thay đ ổ i kháng nguyên t ươ ng ứng v ớ i s ự thay đ ổ i ho ạ t đ ộ ng c ủ a gen. Khi m ộ t gen m ớ i đ ượ c m ở , gen ho ạ t đ ộ ng trướ c nó ph ả i b ị ứ c ch ế hoàn toàn. Lúc đó, m ộ t kháng nguyên m ớ i s ẽ thay th ế kháng nguyên tồ n t ạ i tr ướ c nó. Hình 2.9 cho thấ y chu ỗ i polypeptide ch ứ a kho ả ng 500 amino acid. N-terminus chứ a m ộ t peptide tín hi ệ u cho s ự v ậ n chuy ể n qua ER (l ướ i n ộ i sinh ch ấ t, endoplasmic reticulum) và tớ i màng plasma, đ ượ c tách ra kh ỏ i protein hoàn ch ỉ nh. Vùng bi ế n thiên là khác nhau ở m ỗ i VSG, đi ề u đó cho th ấ y các VSG có ít ho ặ c không có tính đ ồ ng nh ấ t. Hướ ng t ớ i ph ầ n C-terminus, chu ỗ i polypeptide đ ượ c b ả o toàn t ố t h ơ n và ph ầ n này đượ c g ọ i là vùng t ươ ng đ ồ ng. Đuôi k ỵ n ướ c ch ứ a m ộ t tín hi ệ u nh ậ n bi ế t đ ể g ắ n v ớ i mỏ neo glycolipid (glycolipid anchor) (Hình 2.10). Khi m ỏ neo đ ượ c g ắ n thì 20 amino acid cuố i cùng s ẽ đ ượ c tách ra. Glycoprotein biế n đ ổ i b ề m ặ t (VSG) đ ượ c g ắ n v ớ i màng thông qua m ộ t m ỏ neo glycolipid chứ a ethanolamine, m ộ t c ấ u trúc glycan mang m ộ t s ố g ố c mannose (mannose moiety), mộ t glucosamine và m ộ t phosphoinositol liên k ế t v ớ i 1,2- dimyristoyglycerol có gai trong màng plasma. Gố c glycolipid là y ế u t ố quy ế t đ ị nh ph ả n ứng lai (cross-reacting) (CRD) đ ượ c nh ậ n bi ế t b ằ ng các kháng th ể ph ả n ứ ng v ớ i t ấ t c ả dạ ng bi ế n đ ổ i c ủ a VSG, nh ư ng ch ỉ khi VSG đ ượ c phóng thích kh ỏ i màng. Màng liên kế t v ớ i VSG không đ ượ c nh ậ n bi ế t b ở i các kháng th ể anti-CRD. S ự phóng thích VSG đượ c xúc tác b ở i ho ạ t tính c ủ a trypanosome-specific phospholipase C đ ượ c gi ả đ ị nh là hiệ n di ệ n ở m ặ t bên trong (inner face) c ủ a màng plasma. Ng ườ i ta không bi ế t r ằ ng enzyme có thể c ắ t liên k ế t phosphoester trên m ặ t khác c ủ a màng nh ư th ế nào. Hình 2.9. Sơ đ ồ minh h ọ a chu ỗ i protein c ủ a m ộ t VSG đ ặ c tr ư ng
43. Hình 2.10. Cấ u trúc c ủ a m ỏ neo glycolipid c ủ a VSG - Hoạ t đ ộ ng c ủ a gen VSG Gen mã hóa cho mộ t VSG đ ượ c g ọ i là b ả n gen g ố c (basic copy gene). Các gen này đượ c phân thành hai nhóm tùy thu ộ c vào v ị trí c ủ a chúng trên nhi ễ m s ắ c th ể . + Các gen nằ m ở telomere (kho ả ng 5-15 kb)>200 gen. + Các gen nằ m cách telomere h ơ n 50 kb. Tươ ng t ự nh ư ở n ấ m men, các gen mã hóa cho VSG n ằ m r ả i rác trong genome và ở tr ạ ng thái không ho ạ t đ ộ ng. M ộ t gen b ấ t kỳ đ ượ c ho ạ t hóa ch ỉ khi nó đ ượ c sao chép vào vị trí ho ạ t đ ộ ng (expression site) trong khi nguyên b ả n c ủ a nó v ẫ n đ ượ c b ả o t ồ n ở vị trí tĩnh. B ả n sao c ủ a b ả n gen g ố c vào v ị trí ho ạ t đ ộ ng đ ượ c g ọ i là ELC (b ả n sao hoạ t đ ộ ng-expression linked copy). V ị trí ho ạ t đ ộ ng n ằ m ở g ầ n telomere. Nh ư v ậ y, việọộả c ch n m t b n gen g ốể c đ sao chép t ạả o b n sao ho ạộẽụộ t đ ng s ph thu c vào v ị trí củ a b ả n gen g ố c ở telomere ho ặ c n ằ m phía trong telomere. Có hai gi ả thi ế t đ ể m ộ t gen trở nên ho ạ t hóa nh ư sau: - Vị trí ho ạ t đ ộ ng không thay đ ổ i mà ch ỉ có các ELC thay th ế cho nhau. B ả n sao củộả a m t b n gen g ốẽ c s thay th ếả cho b n sao c ủộ a m t gen khác ởạị t i v trí đó, đi ề u này xả y ra t ươ ng t ự nh ư các gen ở cassette tĩnh đ ượ c sao chép vào cassette ho ạ t đ ộ ng trong trườ ng h ợ p v ớ i n ấ m men. - Vịạộ trí ho t đ ng thay đ ổ i, khi c ầổợộ n t ng h p m t VSG m ớởịạ i, gen v trí ho t độ ng cũ b ị ng ư ng và gen ở m ộ t v ị trí khác (g ầ n telomere) đ ượ c kh ở i đ ộ ng.
44. Mộ t s ố phân t ử mRNA t ươ ng ứ ng v ớ i các VSG khác nhau đ ượ c phân l ậ p và đượ c xác đ ị nh trình t ự nucleotide (thông qua cDNA). Đi ề u ng ạ c nhiên là ph ầ n oligonucleotide ở đ ầ u 3’ c ủ a m ọ i gen VSG đ ề u khác v ớ i ph ầ n 3’ c ủ a các mRNA đ ượ c phiên mã tư các gen đó. M ặ t khác, các gen này không có ph ầ n 5’ gi ố ng nh ư các mRNA. Như v ậ y, các mRNA không đ ượ c t ổ ng h ợ p hoàn toàn trên khuôn m ẫ u các gen này. Phầ n 3’ c ủ a các mRNA t ươ ng ứ ng v ớ i ph ầ n 3’ c ủ a v ị trí ho ạ t đ ộ ng ELC, trong khi phầ n 5’ (g ồ m 35 nucleotides) đ ượ c t ổ ng h ợ p t ư nh ữ ng đo ạ n DNA khác và đ ượ c g ắ n vào mRNA (hiệ n t ượ ng trans-splicing). 2. Khuế ch đ ạ i các gen Số l ượ ng b ả n sao c ủ a m ộ t s ố gen cũng có th ể đ ượ c tăng lên t ạ m th ờ i trong quá trình phát triể n các t ế bào soma. Vi ệ c tăng s ố l ượ ng c ủ a m ộ t gen đ ặ c bi ệ t nào đó ph ụ thuộ c vào t ưềệụểủế ng đi u ki n c th c a t bào và x ả y ra không ph ổế bi n. Các b ả n sao có thể n ằ m t ậ p trung thành m ộ t nhóm g ồ m b ả n sao này n ố i ti ế p b ả n sao khác ho ặ c có thểồạưữạ t n t i nh nh ng đo n DNA có kh ả năng tái b ảộậẳạ n đ c l p. Ch ng h n: - Sự nhân b ả n c ủ a gen mã hóa cho rRNA ở tr ứ ng ế ch. Tr ứ ng ế ch có đ ườ ng kính khoả ng 2-3 mm, d ự tr ữ r ấ t nhi ề u rRNA. Chúng đ ượ c phiên mã t ư r ấ t nhi ề u gen rDNA. Các gen này đượ c nhân lên (kho ả ng 2.000 l ầ n) theo c ơ ch ế “vòng tròn quay” (xem chươ ng 4) trong quá trình phát tri ể n và t ồ n t ạ i d ướ i d ạ ng các vòng tròn khép kín. - Khi nuôi cấ y các t ế bào đ ộ ng v ậ t có vú trong môi tr ườ ng đ ặ c bi ệ t, DNA t ạ i mộ t s ố v ị trí trong genome đ ượ c nhân lên. Ví d ụ : nuôi c ấ y các t ế bào ung th ư trong môi trườ ng ch ứ a đ ộ c t ố methotrexate. Ch ấ t này ứ c ch ế ho ạ t tính c ủ a enzyme dihydrofolate reductase (DHFR) giữ vai trò trong t ổ ng h ợ p các nucleotide c ủ a DNA. Các t ế bào ung thư nuôi c ấ y trong môi tr ườ ng có ch ấ t đ ộ c này phát tri ể n thành các qu ầ n l ạ c t ế bào kháng lạ i đ ộ c t ố . Khi n ồ ng đ ộ ch ấ t đ ộ c tăng d ầ n, n ồ ng đ ộ DHFR cũng tăng theo, có thể đ ạ t t ớ i 1.000 l ầ n l ớ n h ơ n m ứ c bình th ườ ng. N ồ ng đ ộ enzyme tăng do s ố l ượ ng các gen mã hóa cho chúng tăng. Cơ ch ế chính xác c ủ a hi ệ n t ượ ng này ch ư a rõ ràng, nh ư ng có thể x ả y ra theo hai cách: - Trao đổ i chéo không cân b ằ ng gi ữ a hai nhi ễ m s ắ c t ử (chromatid) c ủ a nhi ễ m sắ c th ể d ẫ n đ ế n m ộ t s ố t ế bào không có gen dhfr và mộ t s ố khác có hai b ả n sao c ủ a gen này. Trong môi trườ ng có đ ộ c t ố , trao đ ổ i chéo không cân b ằ ng đ ượ c l ặ p đi l ặ p l ạ i và các tế bào ch ứ a nhi ề u gen dhfr vẫ n phát tri ể n t ố t trong môi tr ườ ng này. - Các đoạ n DNA (100-1.000 kb) ch ứ a 2-4 gen dhfr (~31 kb/gen) đượ c sao chép t ư nhiễ m s ắ c th ể bình th ườ ng t ạ o ra các nhi ễ m s ắ c th ể r ấ t nh ỏ , không có tâm đ ộ ng. Các nhiễ m s ắ c th ể nh ỏ này ghép vào các nhi ễ m s ắ c th ể bình th ườ ng khác. Quá trình này lặ p đi l ặ p l ạ i và qua m ộ t s ố l ầ n phân bào nguyên nhi ễ m, t ế bào nào mang s ố l ượ ng
45. lớ n các gen dhfr càng có điề u ki ệ n phát tri ể n thu ậ n l ợ i trong môi tr ườ ng có ch ứ a đ ộ c tố . 3. Biế n n ạ p gen Mộ t ph ươ ng th ứ c tăng kh ả năng di truy ề n là ứ ng d ụ ng các t ươ ng tác v ậ t ch ủ cộ ng sinh-ký sinh, trong đó DNA l ạ đ ượ c chuy ể n vào t ế bào v ậ t ch ủ t ư m ộ t vi khu ẩ n. Cơ ch ế này t ươ ng t ự v ớ i s ự ti ế p h ợ p c ủ a vi khu ẩ n. S ự bi ể u hi ệ n c ủ a DNA vi khu ẩ n trong vậủớủẽ t ch m i c a nó s làm thay đ ổể i ki u hình c ủế a t bào. Ví d ụể đi n hình là vi khuẩ n A. tumefaciens cả m ứ ng t ạ o kh ố i u ở t ế bào th ự c v ậ t b ị chúng xâm nhi ễ m. Khi DNA lạ đ ượ c đ ư a vào t ế bào eukaryote, nó có th ể t ồ n t ạ i ngoài nhi ễ m s ắ c thể ho ặ c đ ượ c h ợ p nh ấ t trong genome. N ế u x ả y ra theo tr ườ ng h ợ p th ứ hai, genome sẽ mang nh ữộế ng đ t bi n di truy ề n và nhi ề u khi DNA l ạẫếụạộ v n ti p t c ho t đ ng làm xuấ t hi ệ n các tính tr ạ ng m ớ i. Vi ệ c đ ư a các gen l ạ vào t ế bào soma ho ặ c t ế bào sinh dụ c mà v ẫ n duy trì ho ạ t đ ộ ng c ủ a nh ữ ng gen đó đ ượ c g ọ i là chuy ể n nhi ễ m (transfection). Cá thểểệ bi u hi n tính tr ạớờạộủ ng m i nh ho t đ ng c a gen l ạư đ a vào t ế bào sinh dụ c đ ượ c g ọ i là cá th ể chuy ể n gen. Quá trình này có th ể làm thay đ ổ i s ự ổ n đị nh c ủ a genome. DNA sau khi đ ượ c tiêm vào trong các t ế bào tr ứ ng đ ộ ng v ậ t có th ể đượ c h ợ p nh ấ t trong genome và truy ề n cho th ế h ệ sau nh ư m ộ t thành ph ầ n di truy ề n bình thườ ng. Kh ả năng đ ư a m ộ t gen ch ứ c năng đ ặ c tr ư ng có th ể tr ở thành m ộ t k ỹ thuậ t y h ọ c s ử d ụ ng cho vi ệ c ch ữ a b ệ nh di truy ề n. Tài liệ u tham kh ả o/đ ọ c thêm 1. Võ Thị Th ươ ng Lan. 2002. Sinh họ c phân t ử . NXB Đạ i h ọ c Qu ố c gia Hà N ộ i, Hà Nộ i. 2. Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K and Watson JD. 2002. Molecular Biology of the Cell. 3rd ed. Garland Publishing, Inc. New York, USA. 3. Cantor CR and Smith CL. 1999. Genomics. John Wiley & Sons, Inc. New York, USA. 4. Dale JW and Von Schanzt M. 2002. From Gene to Genome. John Wiley & Sons, Ltd. West Sussex, UK. 5. Lewin B. 2000. Gene VII. Oxford University Press, Oxford, UK. 6. Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL and Darnell J. 2004. Molecular Cell Biology. 5th ed. WH Freeman and Company, New York, USA. 7. Watson JD, Baker TA, Bell SP, Gann A, Levine M and Loscik R. 2004. Molecular Biology of the Gene. The Benjamin Cummings/Cold Spring Habor Laboratory Press, San Francisco, CA, USA.
46. 8. Weaver RF. 2003. Molecular Biology. 2nd ed. McGraw-Hill Company Inc. New York, USA. 1DNA lặ p l ạ i mô t ả các chu ỗ i hi ệ n di ệ n h ơ n m ộ t b ả n sao trong m ỗ i genome. 2DNA không lặ p l ạ i ch ứ a các chu ỗ i duy nh ấ t: ch ỉ có m ộ t b ả n sao trong genome đ ơ n b ộ i. Chươ ng 3 Cấ u trúc và ch ư c năng c ủ a gen I. Đị nh nghĩa gen Chúng ta có thể đi ể m qua nh ữ ng m ố c chính trong l ị ch s ử nghiên c ứ u v ề gen nh ư sau: Mendel (1865) là ngườ i đ ầ u tiên đ ư a ra khái ni ệ m nhân tố di truy ề n. Johansen (1909) đã đề xu ấ t thu ậ t ng ữ gen (tư genos, nghĩa là sả n sinh, ngu ồ n g ố c) đ ể ch ỉ nhân tố di truy ề n xác đ ị nh m ộ t tính tr ạ ng nào đó. Sau đó, Morgan trong nh ữ ng năm 1920 đã cụể th hóa khái ni ệề m v gen, kh ẳị ng đ nh nó n ằ m trên nhi ễắểếộ m s c th và chi m m t locus nhấ t đ ị nh, gen là đ ơ n v ị ch ứ c năng xác đ ị nh m ộ t tính tr ạ ng. Vào nhữ ng năm 1940, Beadle và Tatum đã ch ứ ng minh gen ki ể m tra các ph ả n ứng hóa sinh và nêu gi ả thuy ế t mộ t gen-m ộ t enzyme. Tuy nhiên, trườ ng h ợ p hemoglobin là mộ t protein nh ư ng l ạ i g ồ m hai chu ỗ i polypeptide do hai gen xác đ ị nh, do đó giả thuy ế t trên bu ộ c ph ả i đi ề u ch ỉ nh l ạ i là mộ t gen-m ộ t polypeptide. Vào nhữ ng năm 1950, DNA (deoxyribonucleic acid) đ ượ c ch ứ ng minh là v ậ t ch ấ t di truyề n. Mô hình cấ u trúc DNA củ a Watson và Crick đ ượ c đ ư a ra và lý thuyế t trung tâm (central dogma) ra đờ i. Gen đ ượ c xem là m ộ t đo ạ n DNA trên nhi ễ m s ắ c th ể mã hóa cho mộ t polypeptide hay RNA. Cuố i nh ữ ng năm 1970, vi ệ c phát hi ệ n ra gen gián đo ạ n ở sinh v ậ t eukaryote cho thấ y có nh ữ ng đo ạ n DNA không mã hóa cho các amino acid trên phân t ử protein. Vì thế , khái ni ệ m v ề gen l ạ i đ ượ c ch ỉ nh lý m ộ t l ầ n n ữ a: Gen là m ộ t đo ạ n DNA đ ả m b ả o cho việ c t ạ o ra m ộ t polypeptide, nó bao g ồ m c ả ph ầ n phía tr ướ c là vùng 5’ không d ị ch mã (5’ untranslation) hay còn gọ i là vùng ng ượ c h ướ ng (upstream) và phía sau là vùng 3’ không dị ch mã (3’ untranslation) hay còn g ọ i là vùng cùng h ướ ng (downstream) c ủ a vùng mã hóa cho protein, và bao gồ m c ả nh ữ ng đo ạ n không mã hóa (intron) xen gi ữ a các đoạ n mã hóa (exon). Hiệ n nay, có th ể đ ị nh nghĩa gen m ộ t cách t ổ ng quát nh ư sau: Gen là đ ơ n v ị ch ứ c năng cơởủộ s c a b máy di truy ềếộ n chi m m t locus nh ấị t đ nh trên nhi ễắể m s c th và xác đị nh m ộ t tính tr ạ ng nh ấ t đ ị nh. Các gen là nh ữ ng đo ạ n v ậ t ch ấ t di truy ề n mã hóa cho nhữ ng s ả n ph ẩ m riêng l ẻ nh ư các mRNA đ ượ c s ử d ụ ng tr ự c ti ế p cho t ổ ng h ợ p các
47. enzyme, các protein cấ u trúc hay các chu ỗ i polypeptide đ ể g ắ n l ạ i t ạ o ra protein có hoạ t tính sinh h ọ c. Ngoài ra, gen còn mã hóa cho các tRNA, rRNA và snRNA Bả ng 3.1. Tóm t ắ t l ị ch s ư nghiên c ư u v ề di truy ề n h ọ c II. Lý thuyế t trung tâm 1. Sự xác đ ị nh di truy ề n c ấ u trúc b ậ c m ộ t c ủ a protein Cấ u trúc không gian c ủ a chu ỗ i polypeptide đ ượ c xác đ ị nh b ở i trình t ự s ắ p x ế p củ a các amino acid t ứấ c c u trúc b ậộưậặ c m t. Nh v y, m c dù có nhi ềứộấ u m c đ c u trúc không gian khác nhau, như ng c ấ u trúc b ậ c m ộ t t ứ c trình t ự s ắ p x ế p các amino acid chi
48. phố i toàn b ộ các m ứ c đ ộ c ấ u trúc khác. Vi ệ c xác đ ị nh di truy ề n phân t ử protein ở trạ ng thái t ự nhiên có đ ầủạ y đ ho t tính sinh h ọỉụạủếởịấ c ch quy t l i ch y u xác đ nh c u trúc bậ c m ộ t là đ ủ . 2. Các enzyme mấ t ho ạ t tính do đ ộ t bi ế n Nhiề u nghiên c ứ u cho th ấ y, vi ệ c m ấ t ho ạ t tính enzyme nhi ề u khi không ph ả i do vắ ng m ặ t c ủ a enzyme, mà ch ỉ do các bi ế n đ ổ i trên phân t ử (modification). Có tr ườ ng hợộếẫếữ p đ t bi n d n đ n nh ng thay đ ổ i tinh vi, enzyme v ẫ n có ho ạ t tính nh ưẽể ng s bi u hiệ n khác n ế u thay đ ổ i đi ề u ki ệ n. Ch ẳ ng h ạ n: Ơ n ấ m m ố c Neurospora crassa, enzyme tyrosinase do gen T xác đị nh, xúc tác cho phả n ứ ng chuy ể n hóa tyrosine thành dihydroxyphenylalanine. Alelle T+ củ a dòng hoang dạ i s ả n xu ấ t tyrosinase có ho ạ t tính ở nhi ệ t đ ộ bình th ườ ng và c ả ở 60oC. Mộ t đ ộ t biế n TS sả n xu ấ t tyrosine có ho ạ t tính ở nhi ệ t đ ộ bình th ườ ng, nh ư ng l ạ i m ấ t ho ạ t tính ở 60oC. Như v ậ y, trong đa s ố tr ườ ng h ợ p, đ ộ t bi ế n c ủ a m ộ t gen không làm bi ế n m ấ t enzyme mà chỉếổấ bi n đ i c u trúc d ẫế n đ n thay đ ổạ i ho t tính. Các đ ộếủ t bi n c a cùng mộ t gen có th ể gây ra nh ữ ng bi ế n đ ổ i khác nhau trên enzyme. Các hi ệ n t ượ ng đó chứỏằấ ng t r ng c u trúc c ủ a enzyme ch ịựể u s ki m soát tr ựếủ c ti p c a gen. 3. Bả n ch ấ t các bi ế n đ ổ i di truy ề n c ủ a protein Bả n ch ấ t đó chính là quan h ệ m ộ t gen-m ộ t polypeptide. Như đã nêu trên, ng ườ i ta khám phá ở ng ườ i có nh ữ ng gen t ạ o ra hemoglobin (Hb) khi biế n d ị s ẽ t ạ o ra nh ữ ng hemoglobin b ấ t th ườ ng do sai h ỏ ng ở các chu ỗ i polypeptide α hoặ c β (B ả ng 3.2 và 3.3) và gây ra các b ệ nh di truy ề n. Bả ng 3.2. Các lo ạ i hemoglobin ở chu ỗ i polypeptide α