Giáo trình Công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống

Nội dung text: Giáo trình Công nghệ sinh học trong sản xuất và đời sống

1. Đại học khoa học Đại học Huế GIÁO TRÌNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG
2. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - LỜI NĨI ĐẦU Cĩ thể nĩi rằng, CNSH đặc biệt là cơng nghệ gene thật là kì diệu, đã mở ra một triển vọng lớn lao giúp con người cĩ thể thực hiện được hồi bão to lớn trong một tương lai phát triển. CNSH được Nhà nước Việt Nam ưu tiên phát triển như một trong 4 ngành khoa học cơng nghệ trọng điểm. CNSH được coi là “cơng cụ hiện đại hĩa” của sinh học. Về bản chất, CNSH tự thân phải là một ngành khoa học cơng nghệ hồn chỉnh, cĩ tính độc lập về khoa học và về phạm vi ứng dụng, cĩ sức sống riêng và tồn tại như một lĩnh vực khoa học cơng nghệ hiện đại cùng với cơng nghệ thơng tin, cơng nghệ điện tử đang gĩp phần thúc đẩy sự phát triển kinh tế xã hội. Để đáp ứng được yêu cầu đĩ, CNSH một mặt phải được xây dựng như các ngành khoa học hiện đại, bên cạnh đặc tính liên ngành phải dựa trên nền tảng khoa học riêng vững chắc và đặc thù khơng trùng lặp với các lĩnh vực khoa học cơng nghệ khác. Thật vậy, trong thế kỉ XXI, CNSH ngày càng chứng tỏ là một mũi nhọn của sinh học hiện đại. Trong lịch sử sinh học thế giới chưa bao giờ nhân loại đạt được nhiều thành tựu sinh học mới và cĩ ý nghĩa chiến lược như ngày nay. CNSH cĩ nội dung rất phong phú, đa dạng, ngày càng cĩ những thơng tin đổi mới và cập nhật. Vì vậy, những người viết giáo trình CƠNG NGHỆ SINH HỌC TRONG SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SỐNG này khơng sao thỏa mãn được hết những tri thức đang địi hỏi ở người đọc và cũng khơng sao tránh khỏi được những thiếu sĩt. Rất mong được sự gĩp ý chân thành của đồng nghiệp và bạn đọc. Cuốn sách này được xuất bản với sự tài trợ của Ban Điều phối Dự án Giáo dục thuộc Đại học Huế. Chúng tơi xin chân thành cảm ơn Ban Điều phối Dự án Giáo dục Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho việc ra đời cuốn sách này. Cũng nhân đây, chúng tơi xin chân thành cảm ơn TS. Trần Quốc Dung cán bộ trường Đại học Sư phạm Huế đã viết cho chúng tơi chương 2 ,mục 6: “Cơng nghệ sinh học trong tạo giống vật nuơi cho năng suất cao” và mục 7: Vector virus sống trong tạo vaccine thú y tái tổ hợp. Xin chân thành cảm ơn. Huế, tháng 03 năm 2005 Thay mặt các tác giả biên soạn PGS.TS. Trương Văn Lung Đại học Khoa học-Đại học Huế
3. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung Mở đầu 1. Thế nào là cơng nghệ sinh học (CNSH) Sự bùng nổ của CNSH. Danh từ CNSH xuất hiện vào nửa cuối của thập kỉ 50-70 của thế kỉ XX, hiện nay được dùng khá phổ biến. Cho đến nay, chúng ta khơng biết ai là người đưa ra danh từ này và xuất xứ từ đâu? Cơng nghệ sinh học cĩ thể hiểu một cách đơn giản là cơng nghệ sử dụng các cơ thể sống để sản xuất các sản phẩm hữu ích phục vụ con người. Cũng cĩ nhiều người đưa ra nhiều định nghĩa, song chưa cĩ một định nghĩa nào bao trùm hết ý nghĩa của nĩ. Liên đồn châu Âu về CNSH (European Federation of Biotechnology) định nghĩa: CNSH là sự ứng dụng thực tiễn của các cơ thể sinh học hay thành phần tế bào của chúng để tạo ra những sản phẩm phục vụ cho sản xuất và đời sống, để điều khiển mơi trường sống. Cĩ người lại định nghĩa: CNSH là kĩ thuật cao sử dụng cơ thể sống hay những chất tách từ cơ thể ấy để tạo ra hay sữa đổi một sinh vật, nhất là để nâng cao các đặc tính cĩ giá trị kinh tế của các lồi động thực vật hay tạo ra những vi sinh vật cĩ khả năng tác động đến mơi trường. Vừa qua cĩ người lại cho rằng: CNSH được coi là ngành khoa học cơng nghệ của việc chuyển nạp gene (DNA) vào tế bào hay cơ thể chủ nhằm khai thác một cách cơng nghiệp các sản phẩm của gene đĩ phục vụ đời sống, phát triển kinh tế. Theo những định nghĩa trên cĩ thể hiểu CNSH theo hai nghĩa: Nghĩa rộng: bao gồm nhiều dạng sử dụng các sinh vật vào các mục đích sản xuất như làm rượu, làm men bánh mì, fromage (phomat), làm tương, chao, Nghĩa hẹp: CNSH kĩ thuật cao là CNSH phân tử được sử dụng những kĩ thuật hiện đại tái tổ hợp DNA, biến nạp gene qua con đường vector plasmid, cố định enzyme, gắn enzyme lên một cơ chất nào đĩ, giữ yên để sử dụng nhiều lần . Tùy thuộc vào việc hiểu định nghĩa rộng hay hẹp mà người ta phân ra hai loại: CNSH mới (new biotechnology) và CNSH cổ điển (classical biotechnology). Cơng nghệ sinh học cổ điển cĩ thể coi là CNSH xuất hiện trong lịch sử lồi người rất sớm, cĩ thể cách đây 5.000-8.000 năm, thậm chí 10.000 năm. Trong kinh thánh cũng đã nĩi đến qui trình làm giấm, làm rượu nho, làm dưa, đến nay chúng ta vẫn cịn sử dụng qui trình đĩ.
4. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung Cơng nghệ sinh học mới xuất hiện khi kĩ thuật di truyền ra đời. Chúng ta sẽ cĩ dịp đi sâu vào vấn đề này trong những phần sau. 2. Lịch sử phát triển CNSH Từ sau chiến tranh thế giới lần thứ hai, CNSH phát triển như vũ bão. Cuộc cách mạng khoa học kĩ thuật đã cĩ những thay đổi cơ bản cĩ liên quan đến sự phát triển của vi sinh vật học, hĩa sinh học, lí sinh học, sinh học phân tử, di truyền học phân tử, hĩa sinh học hữu cơ. Nhiều mơ hình nghiên cứu giúp cho việc định hướng đúng đắn sự phát triển của CNSH đặc biệt là sinh học phân tử. Vào năm 1950-1960, trong nghiên cứu đã đạt được nhiều thành tựu to lớn, nổi bật nhất là vấn đề mã di truyền. Đến năm 1960-1962, chứng minh được cơ chế điều hịa hoạt động gene và sau đĩ (1969), tổng hợp được gene là một thành tựu to lớn trong sinh vật học. Sau năm 1972-1975, sự ra đời của kĩ thuật di truyền, tạo ra sự bùng nổ của CNSH, cĩ thể tiến hành những sản xuất sinh học bắt đầu những thao tác trong ống nghiệm (in vitro). Kĩ thuật di truyền đã tạo ra một cuộc cách mạng trong sinh học, đồng thời nĩ đánh dấu một bước phát triển trong sinh học phân tử. Những thành tựu của sinh học phân tử đã dẫn đến những thống nhất trong nghiên cứu sinh học làm sáng tỏ những nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu ứng dụng. Trước khi CNSH ra đời (từ năm 1950-1960) cũng đã cĩ những bước phát triển như sản xuất vaccine, kháng sinh, acid amin. Sự phát triển của CNSH đã lơi kéo, tập trung lớn các vấn đề sinh học. Hầu như những bước tiến lên của sinh học hiện đại lại mở ra những khả năng mới thường là hồn tồn bất ngờ đối với CNSH. Trước hết phải nĩi đến các phương pháp được hồn thiện nhờ cơng nghệ gene (genetic engineering) nhằm cấu trúc lại các chủng vi khuẩn nấm men với các gene lạ và với các đặc tính đã dự kiến trước. Tốc độ phát triển CNSH nhanh chĩng một cách dị thường, thực hiện ở qui mơ cơng nghệ rộng lớn về thức ăn gia súc, về thực phẩm và cả những hormone, peptid, neuropeptid, các chất cao phân tử sinh học phức tạp đến các hợp chất vơ cơ và hữu cơ tương đối đơn giản. Ngày nay, CNSH đĩ là cơng cụ cĩ thể áp dụng cho nhiều ngành kinh tế khác nhau như nơng lâm ngư nghiệp, sản xuất và chế biến thực phẩm, chăn nuơi thú y, y tế và sức khỏe cộng đồng, sản xuất các dược chất, sản xuất năng lượng, chuyển hĩa hĩa chất, chuyển hĩa sản phẩm phụ nơng nghiệp và cơng nghiệp, v.v. Nhờ phương pháp hĩa học dùng polyethylenglycol, phương pháp vật lí xung điện người ta đã dung hợp protoplast, phương pháp ngâm hạt
5. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung phấn vào dung dịch DNA, phương pháp vi tiêm gene, phương pháp dùng súng bắn gene đã chuyển gene trực tiếp vào các tế bào khác nhau ở thực vật. hoặc, người ta đã chuyển gene gián tiếp được thơng qua việc sử dụng các vector plasmid hoặc tạo phơi soma v.v. Cĩ thể nĩi rằng, CNSH đặc biệt là cơng nghệ gene thật là kì diệu, đã mở ra một triển vọng lớn lao giúp con người cĩ thể thực hiện được hồi bão to lớn trong một tương lai phát triển với một thời gian rút ngắn. 3. Hứa hẹn của CNSH với các nước đang phát triển Trước cuộc gặp gỡ với các em học sinh trường PTTH, khi các em hỏi nhà bác học nổi tiếng, viện sĩ trẻ tuổi nhất – phĩ chủ tịch viện Hàn lâm Khoa học Liên Xơ (cũ) Iu. Ovchianhicov: Tại sao viện sĩ lại hiến dâng đời mình cho sinh vật học? Viện sĩ cĩ lấy làm tiếc về điều đĩ khơng? Nhà bác học mỉm cười và nĩi: * Khơng, tơi khơng tiếc Và sau đĩ giải thích: * Vâng, chắc là cĩ những khoa học khơng kém phần quan trọng hơn sinh vật học. Nhưng tơi khơng biết cĩ khoa học nào khác lại quan trọng hơn sinh vật hoc. Câu trả lời hồn tồn đúng đắn và tất nhiên đã chứa đựng trong đĩ lịng say mê và tình yêu của nhà bác học đối với lĩnh vực hoạt động sáng tạo đã được lựa chọn. Viện sĩ đã xác định một cách sâu sắc và rõ ràng vị trí khoa học về sự sống, về tính qui luật vận động vật chất sống trong hệ thống khoa học cơ bản, phức tạp và hiện đại. Cách đây hơn 40 năm, khi trả lời phỏng vấn của nhà khoa học thế giới về tương lai của di truyền một nhà khoa học về sinh học phân tử đã nĩi: “Khĩ mà tiên đốn, nhưng chỉ biết đến năn 2000 trong một buổi sáng mùa xuân, thí sinh của tơi sẽ trả lời được câu hỏi “bằng cách biến đổi di truyền thế nào và chuyển gene ra sao để những cây Đậu Hà Lan đổi chiều cuộn ngược lại từ phải sang trái trên giá đỡ, để sao cho tồn bộ các lá hứng được ánh sáng mặt trời tạo điều kiện cho quang hợp được tốt nhất. Và cũng bằng cách chuyển gene như thế nào để cĩ thể “bốc thuốc gene” chữa cho một hồng tử mắc bệnh tâm thần”. Ngày nay, cơng nghệ gene đã giúp cho việc chuyển gene ưu việt vào việc tạo giống mới, ghép các gene tăng sức đề kháng của cây như tạo ra nhiều chất ức chế sự tiêu hĩa của sâu bọ, người ta cũng đã chuyển gene protein capsid (những kháng thể của cây) cĩ thể chống được các virus.
6. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung Người ta cũng đã dùng súng bắn gene đưa những gene chống chịu điều kiện bất lợi của ngoại cảnh vào cơ thể để chống hạn hán, chống sâu bệnh, v.v. Bằng phương pháp chuyển gene di truyền, người ta biến bị sữa cho bị yaourt, bằng phương pháp dung hợp protoplast người ta đã tạo ra những cây vừa ăn củ (củ khoai tây) vừa ăn quả (quả cà chua), sản xuất vaccine tái hổ hợp, làm phĩng đại gene với kĩ thuật PCR (polymerase chaine reaction) đã thu được nhiều kết quả quí báu. Đặc biệt ngày 26/6/2000, các nhà khoa học thuộc dự án lập bản đồ gene người, một dự án đa quốc gia do Anh, Mĩ tài trợ và cơng ti Celera Genomics (CG) của Craig Venter cùng cơng bố bản đồ gene (BĐG) người và được đánh giá tương đương với việc nhà du hành vũ trụ Mĩ Neil Amstrong đặt bước chân đầu tiên lên mặt trăng vào năm 1969; và hơn cả thành tựu tìm ra thuốc kháng sinh . Đĩ là một thành tựu to lớn nhất trong lịch sử di truyền học, sinh học phân tử và y học phân tử kể từ khi Watson và Crick cơng bố cấu trúc xoắn kép của phân tử DNA năm 1953. Trước đĩ các nhà khoa học ước tính ít nhất phải đến 2005 mới thiết lập được BĐG cho khoảng 80% các gene trong hệ gene người với kinh phí ít nhất là ba tỉ USD. Trong thực tế, các nhà khoa học đã cơng bố BĐG người với 97% và đến năm 2002 người ta đã giải mã hồn tồn BĐG người. Người ta đã phát hiện rằng, trong con người chỉ cĩ 30.000 đến 35.000 gene (trước đây người ta cho rằng trong con người cĩ từ 60.000 đến 100. 000 gene). Một số đối tượng khác lại cịn cao hơn như ở lúa cĩ 50.000 gene. Nhìn chung thì cĩ đến 98% gene tương đồng.
7. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung Bản đồ gene HƯ ggenee ngg­­ êii Tiếp theo đĩ, người ta đã phát hiện nhiều gene cĩ khả năng trị nhiều bệnh hiểm nghèo cho con người. Hơn thế nữa, ngày 27/12/2002 Giám đốc điều hành cơng ti sinh sản vơ tính (SSVT) Clonaid-Brigitte Boisselier cho biết nhĩm nhà khoa học thuộc cơng ti này lần đầu tiên đã thực hiện thành cơng ca SSVT vào ngày 26 tháng 12 năm 2002 và cho ra đời bé gái đặt tên là Eve. Khơng ảnh, khơng băng hình, khơng tiết lộ danh tính người phụ nữ 31 tuổi thực hiện ca SSVT, Boisselier nĩi rằng clonaid sẽ cung cấp chứng cứ bằng mẫu DNA trong 8-9 ngày kể từ ngày cơng bố. Xét ở gĩc độ khoa học, người ta cịn bán tính bán nghi thơng tin trên. Nhưng ở gĩc độ xã hội, sự điên rồ trong ý tưởng được nâng lên tầm “tơn giáo” của Clonaid thì khơng ai ngờ vực.
8. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung Việc nhân bản vơ tính con Cừu Dolly đã nổi tiếng một thời (tháng 2 năm 1997), nay Cừu Dolly đã chết sau 6 năm tuổi (cơng bố ngày 15/2/2003). Phân tích thì thấy nĩ đã 12 năm tuổi vì lấy tế bào từ mẹ nĩ cĩ 6 năm tuổi, sau này người ta cịn nhân bản nhiều động vật khác như chuột, mèo, dê, lợn.Gần đây, ngày 7/8/2003, TS Golli người Italia thực hiện việc nhân bản thêm con ngựa. Việc nhân bản vơ tính các động vật đã mở ra một hướng mới trong việc bảo tồn nguồn gene quí hiếm của các động vật cĩ nguy cơ diệt chủng và đang diệt chủng. Thời gian gần đây người ta cũng đã nuơi cấy tế bào gốc (stem cells) .Khi phơi cịn ở giai đoạn rất sớm mới cĩ 8 tế bào thì một tế bào đều cĩ khả năng phát triển thành một phơi hồn chỉnh hoặc phân hĩa thành bất kì loại tế bào nào của cơ thể sau này. Những tế bào này được gọi là tế bào gốc nguyên phát. Ở nhau thai một số tế bào cũng cịn duy trì được khả năng phân hĩa tiềm năng và cĩ thể nuơi cấy thành dịng tế bào gốc thứ phát. Người ta cũng đã ứng dụng cơng nghệ nano sinh học (bionanotechnology) cho phép thu nhận những thơng tin về hệ thống sinh học ở mức lượng tử, đầu dị kích thước nano tới kích thước một phân tử riêng rẻ dùng trong chẩn đốn bệnh. Cơng nghệ nano là phương pháp in stitu mới để cung cấp thơng tin tốt hơn về chức năng tế bào, là cơng nghệ thao tác cải biến 2 chiều và 3 chiều đối với mơ và tế bào, vận chuyển và phân phối thuốc hoặc gene vào mơ và tế bào thơng qua khống chế kích thước hạt, hoạt hĩa và giải phĩng chất thuốc qua cơ chế và thiết bị như bơm kích thước nano, van tế bào vào cơ quan nhân tạo. Ở Việt Nam, chúng ta cũng đã dùng phương pháp trực tiếp bắn gene và phương pháp gián tiếp chuyển gene bằng con đường plasmid để đưa gene chống chịu rầy nâu vào cây lúa (viện Lúa Đồng bằng sơng Cửu Long), cây mía chịu hạn (viện CNSH Hà Nội) đạt kết quả bước đầu. Xí nghiệp Dược TW cũng đã chuyển nạp gene để chế vaccine cĩ kết quả. Gần đây, ngày 24 tháng 2 năm 2004, tiếp theo viện CNSH Hà Nội, viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cũng đã giải mã thành cơng bộ gene H5N1 (gây bệnh cúm ở người từ gà) để cĩ hướng điều trị bệnh này. Những thành tựu khoa học hiện nay, những kinh nghiệm của thế giới đã chứng minh rằng: người ta ngày nay đã chú ý đến những gì đã xẩy ra trong tồn bộ sinh học và nhất là trong những lĩnh vực riêng của sinh học – CNSH. Ý nghĩa xuất sắc của CNSH là ở chỗ nhờ sức mạnh đa dạng của mình mà nĩ đã mở ra những con đường mới mẻ để giải quyết hàng loạt
9. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung các vấn đề cĩ tính tồn cầu như tính hạn chế và mối đe doạ thực sự của tiêu hao các nguồn năng lượng, thực phẩm truyền thống và cuối cùng là sự ơ nhiễm mơi trường xung quanh. Đối với các nước đang phát triển, CNSH là một vấn đề then chốt, mà vốn các nước này đã bị coi là khác biệt so với các nước cĩ nền cơng nghiệp phát triển. Thời gian qua, trong các nước đang phát triển cĩ một số nước vươn lên và đạt trình độ khoa học cơng nghệ cao. Họ cĩ một nền tảng cơng nghệ vững và một thị trường đủ rộng để đảm bảo làm chủ một số mũi nhọn CNSH hướng chúng vào phục vụ các nhu cầu của nước mình. Tuy nhiên, đa số các nước đang phát triển cịn đang thiếu nguồn vốn để khai thác các cơng nghệ đĩ, thiếu hạ tằng cơ sở cho nhiều nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và thiếu người cĩ trình độ cần thiết cho các ngành cơng nghiệp sinh học. Vì vậy các nước này phải kết hợp hài hịa những tiến bộ của CNSH với tình trạng thiếu vốn nhưng lại dư thừa lao động, những bí quyết của CNSH, qui trình CNSH cổ truyền v.v. Hiện nay các nước nghèo nhất và kém phát triển về mặt cơng nghệ và khoa học cũng cĩ thể thu được một số lợi ích do tiến bộ của CNSH và tham gia vào cuộc “cách mạng CNSH” nhờ các mạng lưới hợp tác quốc tế và khu vực. Riêng khu vực châu Á, một số trung tâm CNSH ra đời như trung tâm Tư liệu Thế giới về các Vi sinh vật MIRCEN ở Nhật Bản, viện CNSH của Đại học Osca, viện Nghiên cứu Khoa học Kĩ thuật Thái Lan (cho vùng Đơng Nam Á), trung tâm New Delhi nghiên cứu về cố định N2 sinh học, tính chống chịu cây lương thực, cải thiện và phân phối chất dinh dưỡng trong thực vật, tăng trưởng và tái sản xuất gia súc, phát vaccine phịng bệnh nhiệt đới. Viện Nghiên cứu Cao su bằng nuơi cấy mơ ở Malaysia (RRIM), cơng ti Mực in và Hĩa chất Dainippon (DIC) Tokyo Nhật Bản chuyên sản xuất các chất sinh học tinh khiết và các chất màu thực phẩm, thức ăn cho cá, mĩ phẩm từ các lồi tảo. v.v. Cơng nghệ sinh học cĩ tầm quan trọng to lớn, vì vậy, CNSH đã trở thành một trong bốn mũi nhọn của thế giới ngày nay (điện tử và tin học, năng lượng, vật liệu mới, cơng nghệ sinh học). Ở Việt Nam, Đảng và Nhà nước ta cũng đã thấy rõ tầm quan trọng của CNSH. Văn kiện Hội nghị lần thứ VII của Ban chấp hành TW Đảng khĩa 2 cũng đã nhấn mạnh: “Ưu tiên và ứng dụng phát triển các cơng nghệ tiên tiến như: cơng nghệ thơng tin phục vụ yêu cầu điện tử hĩa và tin học hĩa nền kinh tế quốc dân; CNSH trước hết phục vụ phát triển nơng, lâm,
10. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH-Mở đầu Trương Văn Lung ngư nghiệp, chế biến thực phẩm, dược phẩm và bảo vệ mơi trường sinh thái; cơng nghệ chế tạo và gia cơng vật liệu, nhất là nguồn nguyên liệu trong nước” (bài phát biểu của đ/c nguyên Tổng Bí thư Đổ Mười tại Hội nghị lần thứ 7 BCH TW Đảng khĩa VII ngày 25/7/1994 trang 84). Trong các Đại hội VIII, IX, Đảng ta cũng rất chú trọng đến vấn đề CNSH. Trong Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc 2003 (ngày 16- 17/12/2003), trong định hướng nghiên cứu và triển khai của viện CNSH thuộc viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam, PGS.TS. Trần Lê Bình Viện trưởng viện CNSH đã đặt vấn đề: CNSH được nhà nước Việt Nam ưu tiên phát triển như một trong 4 ngành khoa học cơng nghệ trọng điểm. CNSH được coi là “cơng cụ hiện đại hĩa” của sinh học trong việc phục vụ phát triển nơng lâm ngư nghiệp, bảo vệ sức khỏe cộng đồng và mơi trường bền vững.Về bản chất, CNSH tự thân phải là một ngành khoa học cơng nghệ hồn chỉnh, cĩ tính độc lập về khoa học và về phạm vi ứng dụng, cĩ sức sống riêng và tồn tại như một lĩnh vực khoa học cơng nghệ hiện đại như cơng nghệ thơng tin, cơng nghệ điện tử đang gĩp phần thúc đẩy sự phát triển kinh tế xã hội. Để đáp ứng được yêu cầu đĩ, CNSH một mặt phải được xây dựng như các ngành khoa học hiện đại, bên cạnh đặc tính liên ngành phải dựa trên nền tảng khoa học riêng vững chắc và đặc thù khơng trùng lặp với các lĩnh vực khoa học cơng nghệ khác như cơng nghệ gene, cơng nghệ tế bào động thực vật và vi sinh vật, cơng nghệ enzyme và protein. Mặt khác, CNSH phải cĩ mục tiêu và nội dung nghiên cứu đặc trưng riêng, đĩ là xây dựng và phát triển ngành Cơng nghiệp sinh học với chủng loại cơng nghệ và hàng hĩa mang dấu ấn đặc thù của CNSH mà những định hướng hồn thiện và chuyển giao cơng nghệ phục vụ sản xuất. Rõ ràng, CNSH là cái chìa khĩa mở đường cho sự phát triển nền kinh tế của đất nước. Cuộc cách mạng khoa học kĩ thuật nĩi chung và cuộc cách mạng CNSH nĩi riêng đã thu hút nhiều người trên trái đất này tham gia vào sự nghiệp cao cả đĩ. Viện sĩ N.N. Semionov đã viết rằng: “Đặc điểm cơ bản của khoa học ở thế kỉ thứ XX là ở chỗ, nĩ khơng cịn là người nữ tì của sản xuất mà trở thành người mẹ của sản xuất. Sinh học đã chiếm một vị trí như thế. Tiếp sau đĩ là vật lí học và hĩa học”.
11. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 9 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung 1 CƠNG NGHỆ SINH HỌC PHỤC VỤ NƠNG LÂM NGƯ NGHIỆP Chương I: Cơng nghệ sinh học với năng lượng 1. Từ năng lượng mặt trời đến năng lượng sinh học. Chúng ta phải mang ơn mặt trời vì tất cả sự giàu cĩ của thế giới hữu cơ quanh ta. Tia sáng mặt trời tương tác với chất diệp lục của cây xanh tạo ra sự kì diệu của quang hợp. Từ các chất vơ cơ đơn giản của tự nhiên như nước, CO2 của khơng khí, muối N2, phosphor, thực vật tạo ra các chất hữu cơ rất phức tạp về cấu trúc (tức là đặc trưng cho cơ thể sống và tham gia vào thành phần của các cơ quan và các mơ của chúng) đĩ là đường, acid amin, nucleotide, vitamin, Như vậy, thực vật hấp thụ năng lượng ánh sáng mặt trời, tạo ra các chất dinh dưỡng, đĩ là hiện tượng quang hợp. Nĩi một cách khác, quang hợp là một quá trình biến quang năng thành hĩa năng và năng lượng đĩ được tích lũy lại trong các hợp chất hữu cơ. Một kg chất khơ hữu cơ cĩ dự trữ trong đĩ 4.000 kcalo,. Tổng lượng chất hữu cơ do thực vật tổng hợp được trên trái đất hàng năm ước độ 4,5.1011 tấn (tính ra bằng đường glucose). Hàng năm con người chỉ sử dụng 3,5% chất hữu cơ do thực vật ở cạn tổng hợp được, cịn chất hữu cơ do thực vật ở nước tổng hợp được, con người sử dụng cịn đang ít. Ngồi ra, trong phản ứng quang hợp cịn giải phĩng ra O2 rất cần cho hơ hấp của mọi sinh vật và cho các quá trình oxyhĩa khác (hàng năm trên trái đất cây thải ra trong khơng khí 15.104 tấn phân tử oxygen). Do đĩ, tia sáng mặt trời là cơ sở năng lượng của mọi sự sống. Mặt trời cung cấp một cách rộng rãi năng lượng cho con tàu vũ trụ của chúng ta – trái đất. Theo tính tốn của các nhà bác học thì hành tinh này mỗi năm nhận được từ mặt trời khoảng 5.1019 kcalo. Số lượng nhiệt năng này đủ sản xuất ra một năng lượng điện khoảng 2.1026 kw/h, tức là bằng số lượng
12. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 10 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung điện tạo ra trong một năm của khoảng 9 triệu nhà máy điện cĩ cơng suất tương đương với nhà máy thủy điện Brataki. Tất cả thế giới cây xanh của trái đất chỉ sử dụng hết cĩ một phần nhỏ do năng lượng mặt trời đưa tới: 1-2%. Các nhà bác học kiên trì tìm kiếm các con đường cho phép nâng cao hiệu suất quang hợp dù chỉ thêm một vài lần (thực tế ở một số nước ở một số cây trồng cũng đã cĩ hệ số sử dụng quang năng trong quang hợp là 2-4%), chắc hẵn là điều đĩ sẽ mang lại những lợi ích khơng thua kém gì việc chiếm lĩnh năng lượng nhiệt hạch. Cũng cần nhấn mạnh rằng, mặc dù trong tương lai chúng ta sẽ khai thác nguồn năng lượng hạt nhân để sử dụng, song mặt trời vẫn là năng lượng chủ yếu đối với sự sống trên trái đất. Đúng như nhà vật lí học người Pháp Pierre Curie đã phát biểu (1949) “Mặc dầu tơi vẫn tin ở tương lai của năng lượng nguyên tử và thấy rõ tầm quan trọng của phát minh này, tuy nhiên, tơi cho rằng cuộc cách mạng thực sự trong năng lượng học sẽ đến chỉ lúc nào mà chúng ta cĩ thể thực hiện được sự tổng hợp hàng loạt các phân tử tương tự như diệp lục hoặc chất lượng cịn tốt hơn. Muốn đạt được mục đích đĩ, trước hết cần nghiên cứu tỉ mỉ kiểu phân tử đĩ và tác dụng của quang hợp”. Ở đây chúng ta chưa kể đến trữ lượng thực vật hĩa thạch cũng rất lớn. Chỉ mới tính riêng dự trữ C trong than đá, dầu hỏa và các khí thắp đã đạt tới 1018 tấn (trung bình 200 tấn/ha vỏ quả đất). Theo thống kê chưa đầy đủ thì dự trữ C trong các chất hữu cơ của sinh vật, trong các cặn bã chất hữu cơ của các sinh vật đã chết, trong hĩa thạch do hoạt động của quang hợp trước đây của thực vật tạo ra cũng đạt tới 6.1015 tấn. 2. Các biện pháp nâng cao hiệu quả sử dụng năng lượng mặt trời và tạo năng lượng bằng biện pháp sinh học Hiện nay chúng ta phải sử dụng một cách khơn ngoan hơn, triệt để hơn các của cải mà quá trình quang hợp đang tạo ra hiện nay và đã tạo ra từ hàng chục, hàng trăm, thậm chí hàng triệu năm trước đây. Những kho báu này khơng đếm xuể. Phần lớn chúng chưa được sử dụng hoặc sử dụng khơng được tốt, nếu tận dụng hết hiệu suất quang hợp thì thực vật ở biển, ở đại dương, sơng ngịi, ở lục địa cũng cĩ thể dùng năng lượng mặt trời để tổng hợp ra một số lượng chất hữu cơ to lớn biết bao (A.A. Nhishiporovitch). Chỉ tính riêng trên cạn (khoảng 1/3 bức xạ chung của mặt trời chiếu xuống hành tinh chúng ta) mỗi năm đã tổng hợp được 53 tỉ tấn chất hữu cơ, trong đĩ trên đồng ruộng: 11 tỉ tấn, trên thảo nguyên và trên đồng cỏ: 6 tỉ tấn và trên rừng: 36 tỉ tấn. Chỉ một phần rất nhỏ khối lượng vật chất thực vật to lớn này được con người dùng làm thức ăn trực tiếp hoặc thức ăn gián tiếp (dưới dạng
13. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 11 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung các sản phẩm cĩ nguồn gốc động vật). Để làm thức ăn cho con người chỉ dùng hết 6% các sản phẩm quang hợp được tạo thành trên đồng ruộng 0,03% sinh khối được tạo ra bởi thực vật trên thảo nguyên và trên đồng cỏ và chỉ khoảng 0,03% sinh khối được tạo ra trên rừng. Ở biển và đại dương nơi nhận 2/3 bức xạ mặt trời đã tổng hợp ra ít nhất cũng khơng kém phần sinh khối ở cạn, nhưng chỉ một phần nhỏ dùng làm thức ăn trực tiếp hoặc thơng qua tơm, cá, động vật mà làm thức ăn cho con người. Ngồi việc sử dụng “cái sẵn cĩ” của vật chất do quang hợp tạo ra, chúng ta cần nâng cao hiệu quả của bộ máy quang hợp như tìm những test thử nhanh để phát hiện những dịng cĩ hiệu quả quang hợp cao trước hết là dùng những lồi vi Tảo. Hoặc, đi sâu vào việc tìm hiểu cơ chế di truyền nhất là di truyền quang hợp ở bộ máy lục lạp hoạt động cĩ hiệu quả cao hơn, bằng những kĩ thuật tưới nước, bĩn phân hợp lí, chọn giống cây trồng cĩ năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu giỏi. Áp dụng các kĩ thuật in vitro để nhân nhanh các giống cây trồng. Theo dự báo của một cơng ti tư vấn khoa học giống cây trồng quốc tế, sản lượng lương thực thế giới sẽ tăng 5-10% trong vịng vài năm tới chỉ riêng nhờ áp dụng CNSH (Withen và Anderson, 1986; Faillin, 1986) Bảng I.1. Sản lượng hiện nay và tương lai của một số cây trồng nơng lâm nghiệp Cây trồng Sản lượng hiện nay Sản lượng tương lai (tấn/ha) (tấn/ha) Mía 70-90 150-200 Sắn 15-20 60-100 Cà chua 20-40 60-100 Cọ dầu 2-5 10-12 Lạc 1,6 4,0 Thầu dầu 0.6 2,5 Thơng (ơn đới) 6,8 20-30 Thơng (nhiệt đới) 12-20 40-60 Cây lá rộng (nhiệt đới) 10-20 40-100 Tre 25 100 Ngồi những cây lương thực thực phẩm cung cấp năng lượng cho con người trong bữa ăn hằng ngày, chúng ta cũng cần tận dụng một số cây khác, cĩ nguồn năng lượng phục vụ cho đời sống xã hội, như những cây cĩ dầu (cây Dừa, Cọ dầu, Jojoba) cây cĩ nhựa mủ dùng làm chất đốt thay dầu mỏ, sinh khối các loại cây lấy mủ này khoảng 10 tấn/năm tương đương 1,5 tấn dầu mỏ, cây lấy tanin (Jojoba). Về tạo nguồn năng lượng những cuộc thí nghiệm tiến hành tại Brazil, Trung Quốc hay Ấn Độ cũng như các nước đang phát triển khác đã
14. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 12 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung cho thấy cĩ thể kết hợp hoặc liên kết việc sản xuất năng lượng với việc sản xuất nơng nghiệp và thực phẩm đã cải thiện điều kiện sinh dưỡng ở nơng thơn bằng biện pháp CNSH. Ở Brazil, chương trình Pro-alcohol phát động từ năm 1975 đã làm tăng trong một thời kì tương đối ngắn sản lượng ethanol chủ yếu từ phương thức cho lên men đường mía. Sản lượng đã đạt tới 8 tỉ lít ethanol hàng năm vào năm 1984 (Larovier, 1985). Mức tiêu thụ trong năm 1985 là 9 tỉ lít và năm 1986 là 12 tỉ lít ethanol (hai triệu bốn trăm nghìn ơ tơ trong số 8.200.000 chiếc đã tiêu thụ loại nhiên liệu chứa 20% ethanol). Việc sản xuất alcohol nguyên liệu chủ yếu là mật rỉ đường, sắn, dịch ép cây cao lương ngọt (Sweet sorghum), củ cải đường. Con đường tạo khí methan (biogas): Ở Trung Quốc sản xuất khí sinh học (biogas) bắt đầu trong những năm 1950 với 5 triệu bể sinh methan được xây dựng ở tỉnh Tứ Xuyên trong tổng số trên 7 triệu bể ở khắp cả nước. Chương trình biogas lúc đầu chỉ nhấn mạnh vào việc thiết kế và việc chế tạo bể hơn là khía cạnh vi sinh vật học (điều kiện lên men vi sinh vật học và những vi khuẩn sinh khí methan và khơng sinh methan). Những nghiên cứu ở Thượng Hải đã sửa chữa những khuyết tật này và tìm ra hướng sử dụng ở nơng thơn (Chiao, 1986, theo [8]). Hội nghị vi sinh vật biogas tổ chức năm 1981 và 1983 đã dành nhiều hơn cho các mặt nghiên cứu cơ bản. Người ta thấy các vi khuẩn sinh hydrogen và nuơi cấy hỗn hợp làm giàu các vi khuẩn methan đã sản sinh ra lượng methan lớn hơn nhiều (Sun et al., 1981, theo [8]). Người ta cũng nhấn mạnh các yếu tố khơng sinh methan giữ vai trị hệ trọng trong việc sản xuất biogas. Hơn nữa, việc tách các chủng tinh khiết của vi khuẩn sinh methan như: Methanosarcina, Methanobrevibacter arboriphilus, Methanobacterium formicium, Methanococcus mazei đã làm rõ hơn việc sản sinh biogas và làm tăng hiệu quả của quá trình (Chiao, 1986, theo [8]). Chương trình biogas Trung Quốc chẳng những làm cải tiến việc sản xuất và tiêu dùng năng lượng cho gia đình mà cịn nhằm kết hợp ngày càng mạnh việc sản xuất lương thực, lặp lại chu trình những thải bã hoa màu và ngăn cản việc gây nhiễm. Các hệ thống phối hợp sản xuất năng lượng và thực phẩm đã được phát triển ở các làng mạc. Tại Xin Bu ở xã Lelin, trên đồng bằng sơng Châu Giang gẩn Quảng Đơng, 1.500 làng đang dùng lị chế tạo đặc biệt để sấy gỗ với nhiệt lượng 35-40% lị đun nước bằng sức nĩng mặt trời, đặt trên mái nhà cung cấp 60-100 lít nước 50oC hàng ngày về mùa đơng và 70oC về mùa hè. Như vậy, tiết kiệm 20-30% methan tùy mỗi gia đình sử dụng. Cĩ nơi dùng biogas làm lị sấy khơ ở các trại nuơi Tằm. Ngồi ra, những cặn bã dư thừa từ việc lên men methan, chất thải được dùng làm phân bĩn để trồng Nấm, dùng làm thức
15. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 13 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung ăn cho cá, gĩp phần làm sạch sản phẩm phụ và loại bỏ các phế thải (Larovier, 1985). Người ta cũng cĩ thể sử dụng Tảo đơn bào để sản xuất hydrocarbur như Botriococcus baurii. Tảo này đã được một số nha khoa học Pháp (ở trường Đại học cao cấp Quốc gia) năm 1976 quan tâm. Trong Tảo cĩ chứa lượng hydrocarbur từ 15-17% trọng lượng khơ. Đây là lồi Tảo nước ngọt, nuơi trồng trong điều kiện mơi trường dung dịch tốt cĩ thể thu được 60 tấn chất khơ/năm, đem nĩ chưng cất nhẹ, cĩ thể dùng như dầu mỏ. Các chất đốt tích lũy ở phần tế bào vỏ, đem li tâm mạnh, các chất này sẽ tách ra, tế bào vẫn cịn sống cĩ thể đem nuơi lại. Hiện nay người ta thấy rằng, vỏ tế bào này chứa những chất tương tự như dầu mỏ nên dùng nĩ làm mơ hình nghiên cứu quá trình tạo thành dầu mỏ. Trên cơ sở nghiên cứu về cơ chế của quá trình quang hợp, đặc biệt là các cấu trúc của lục lạp liên quan đến chức phận của nĩ như thế nào và việc hấp thụ năng lượng ánh sáng mặt trời, biến năng lượng đĩ thành dạng năng lượng hĩa học ra sao (phần này sẽ nĩi rõ ở chuyên đề Quang hợp và năng suất ở thực vật) người ta đã chế tạo ra một số bộ phận (máy mĩc) để sử dụng năng lượng mặt trời như pin sinh học: một hợp chất chứa những sinh vật tạo năng lượng (do Potter chế tạo, 1925). Những điện cực platinum và dịch nuơi cấy yếm khí hoặc nấm men Saccharomyces cerevisiae hoặc E. coli tế bào xuất hiện điện thế âm xuất hiện điện cực dương của platinum. Điện cực dương platinum này được đặt trong mơi trường vơ trùng O2. Nếu cĩ lên men sẽ tạo nên dịng điện cĩ điện thế 0,3- 0,5 volt, cường độ dịng điện 0,02 mA. Năm 1950-60, các nghiên cứu 4ē 4ē này được hồn chỉnh, đến nay 4H+ OH- đã bắt Nămđầu đưa 1950-1960 vào con tàu vũ trụ để sử dụng. 2H2 2H2O → ← Sau này người ta sử H2 O2 dụng những chất khơng tích điện như glucose: Anode Cathode Màng vi sinh vật lên men Pin sinh học đơn giản H2 – O2 Glucose H2 Người ta cũng cĩ thể dùng enzyme để biến đổi một số chất tạo H2.
16. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 14 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung H2 Ngồi việc tạo ra nguồn điện sinh học (pin sinh học ), người ta đang nghiên cứu sử dụng các màng quang hợp. Như ta đã biết, các sinh vật cĩ khả năng tạo năng lượng. Người ta cĩ thể cố định tế bào để thu năng lượng. Ví dụ; những vi khuẩn quang hợp nhờ ánh sáng tạo thành H2 + ATP. Tảo lam Cyanobacteria → H2 + NADPH2 mà NADPH2 là chất tích trữ năng lượng (NADPH2 → NADP cho ta 4ATP). Ở thực vật thượng đẳng trong lục lạp cĩ màng thylakoid là nơi tạo ra H2, H2O2, NADPH2. Cũng đã cĩ nhiều thí nghiệm biến năng lượng mặt trời thành điện năng. Ở Nhật Bản, người ta sử dụng điện cực là oxyd titan. TiO2 được bao bởi hệ thống quang hĩa I (PsI) được chiếu sáng . Chất khử được dùng là ascorbate hay hydroquinon. Phản ứng như sau: + P700 + TiO2 → P 700 + TiO2ē cb (condition barid = dây dẫn) + P 700= + ascorbate → P700 + dehydroascorbate + P 700 + hydroquinon → P700 + quinon Bằng cách này cĩ thể tạo được dịng điện 100 mA. Dịng điện tạo được khơng lớn nên phải sử dụng điện cực tinh vi - điện cực được bọc bằng protein. P700 khá phức tạp nên trong tương lai sẽ cố định màng thylakoid để biến quang năng thành điện năng và sẽ sử dụng trong các dụng cụ tinh vi như máy điện tốn. Về mặt kĩ thuật định hướng cho con người trong tương lai là nghiên cứu sử dụng trực tiếp biến quang năng thành điện năng.
17. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 15 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung Hiện nay, quang năng → hĩa năng (dầu, than đá, khí đốt) → nhiệt năng (đốt nĩng) → cơ năng (quay) → điện năng. Nếu tìm cách chuyển thẳng quang năng → điện năng thì sẽ tiết kiệm rất nhiều và tránh việc tạo nhiệt năng đốt nĩng và sẽ gây ơ nhiễm. Cịn ở quang hợp, thực hiện được như ở thực vật sẽ làm tinh sạch khơng khí. Ngày nay, người ta cũng đang nghiên cứu chế tạo các biosensor, biochip là những protein thu nhận ánh sáng để sử dụng trong máy điện tốn và trong các dụng cụ tinh vi khác.Ví dụ: ở Anh dùng Rhodopsine thu nhận năng lượng lượng tử chuyển vào tế bào thần kinh tạo thành dịng điện sinh lí. Ở vi khuẩn Halobacterium halobium cĩ chất bacteriorhodopsine nằm ở màng ngồi của tế bào. Bacteriorhodopsine hấp thụ lượng tử của năng lượng ánh sáng mặt trời tạo nên những biến đổi làm cho màng cĩ sự chênh lệch gradien làm bơm photon và tạo năng lượng. Chế được loại protein cĩ khả năng thu lượng tử như trên thì tương lai sẽ được chế tạo các bộ phận này để sử dụng trong các máy điện tốn. Đương nhiên, làm được việc này sẽ cĩ sự phối hợp của các nhà sinh vật, hĩa học và điện tốn. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Trương Văn Lung, 1999. Chuyên đề Quang hợp và năng suất ở thực vật. Tủ sách Đại học Khoa học Huế. 2. Trương Văn Lung, Võ Thị Mai Hương, 1999, Giáo trình lí thuyết Sinh lí học thực vật. Tủ sách Đại học Khoa học Huế. 3. Nguyễn Duy Minh, 1981. Quang hợp.Nxb Giáo dục Hà Nội. 4. Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hồng Minh Tấn, 1998. Sinh lí học thực vật. Nxb Giáo dục Hà Nội. 5. G rodzinski A.M., Grodzinski Đ.M., 1964. Sách tra cứu tĩm tắt về Sinh lí thực vật. Nguyễn Ngọc Tân và Nguyễn Đình Huyên dịch năm 1981. Nxb Mir Moskva và Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 6. Heath O. V. S., 1972. Photosynthes. Izd. “Mir”, M. 7. Oparin A.I., 1967. Cơ sở Sinh lí học thực vật. Tập 1. Lê Đức Diên và những người khác dịch năm 1975. Nxb Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 8 Sasson Albert,1988. Biotechnologies and development Cơng nghệ sinh học và phát triển. Người dịch: Nguyễn Hữu Thước, Nguyển Lân Dũng và một số dịch giả khác. Nxb Khoa học & Kỹ thuật Hà Nội.
18. Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - 16 CNSH phục vụ nơng lâm ng ư nhi ệp Truong Văn Lung
19. 16 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Chương II Cơng nghệ sinh học phục vụ nơng lâm ngư nghiệp 1. CNSH cổ truyền trong việc tạo giống mới 1.1. Chọn lọc tự nhiên Từ xa xưa con người cũng đã biết chọn giống cây trồng, ngay cả thời kì ăn lơng ở lỗ, cách đây 5000-6000 năm.Theo tài liệu ghi chép được thì nhà chọn giống đầu tiên cĩ ý thức ở châu Âu là Lecourteur người Pháp ở đảo Gerseille (1 hịn đảo ở giữa Anh và Pháp) vào đầu thế kỉ thứ XIX. Một hơm ơng mời một người bạn ở Espain (Tây Ban Nha), là một nhà thực vật học tên là Lagaska đi tham quan đồng ruộng lúa mì. Ơng bạn thấy lúa mì tuy gieo cùng một giống nhưng lại cĩ cây rất khác nhau. Theo gợi ý của bạn, Lecourteur đem gieo riêng 23 dịng khác nhau. Ơng đã chọn được một giống mới. Đĩ là phương pháp chọn lọc. Bằng phương pháp này, về sau nhiều nhà chọn giống đã chọn được nhiều giống mới đạt với ý muốn của con người. Cơ sở khoa học của việc tạo dịng mới này là qua quá trình phát triển cá thể, trong điều kiện bất lợi của mơi trường cá thể nào khơng chịu đựng đựoc thì bị tiêu diệt. Trong điều kiện bất lợi đĩ cĩ một số đã tạo ra một số chất để chống chịu với mơi trường làm thay đổi cấu trúc và hình thái, cải biến kiểu gene và kiểu hình của quần thể theo hướng thích nghi và tạo ra lồi mới. Học thuyết J.B.Lamark (1744-1829) và nhất là của Ch.Darwyn (1809-1882) về nguồn gốc các lồi là cơ sở “biến dị cá thể”. Quan điểm về sự sống sĩt của những cá thể thích ứng là hạt nhân của thuyết chọn lọc tự nhiên của Darwyn. 1.2. Lai hữu tính Năm 1694, Kameriarux người Đức đã phát hiện ra cây cỏ cũng cĩ giống đực giống cái như động vật. Đến năm 1717, nhà làm vườn người Anh là Fershai đã tạo được giống hoa Cẩm chướng đầu tiên bằng cách lai 2 giống cĩ màu sắc khác nhau. Khoa học về biến dị di truyền được Darwyn (1858) và Mendel (1865) phát hiện ra nhiễm sắc thể, DNA, gene, các nhà khoa học đã cĩ một lí luận vững chắc về di truyền học, làm cơ sở cho việc chọn giống cây trồng. Cho đến nay, các nước tiên tiến cĩ “tập đồn giống”chuyên giữ giống để cung cấp cho các nhà chọn giống làm thực liệu ban đầu. Thường mỗi giống cây trong tập đồn giống chỉ cĩ một vài đặc tính tốt. Do vậy, muốn cĩ 1 giống cây trồng lí tưởng chứa đựng tất cả các gene tốt của nhiều giống phải tốn thời gian mới làm được. Việc tổng hợp gene mang đặc tính tốt của cây trồng thường được làm bằng phương pháp lai và phải
20. 17 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung lai trên nhiều cặp phối hợp với nhau từng đơi một mới mong đạt được kết quả tốt.Người ta cịn áp dụng ưu thế lai đối với cây thụ phấn chéo (thụ phấn khơng phải hạt phấn của mình mà của các cây khác qua việc tạo dịng thuần chủng 6-7 thế hệ.Ví dụ, ngơ từ lai đơn sang lai kép, lai 3: 1 cặp lai đơn lai với 1 dịng tự phối. Sau này các nhà khoa học phát hiện rằng bố và mẹ cĩ đặc tính tốt thì con lai cộng lại cái tốt của bố và mẹ và tốt hơn bố mẹ. Đĩ là tác dụng cộng của gene và nếu con lai thừa hưởng các đặc tính tốt của nhiều bố và nhiều mẹ thì con lai càng tốt hơn - gọi là lai tổng hợp. 1.3. Đột biến De Vrie (1901) nghiên cứu tính đột biến ở thực vật và nhận ra tính vơ hướng của nĩ.Ơng đã tách rời đột biến với ngoại cảnh và đi đến phủ nhận tác dụng tích lũy biến dị của chọn lọc tự nhiên. W. Johnson (1903) chứng minh chỉ cĩ biến đổi trong gene mới di truyền được (đột biến). Biến dị đột biến là do sự biến đổi vật chất di truyền (nhiễm sắc thể- NST, gene) gây nên. Cĩ 3 loại đột biến: đột biến gene, đột biến nhiễm sắc thể và đột biến gene tế bào chất. * Đột biến gene hay đột biến điểm là những biến đổi gene xuất hiện một cách ngẫu nhiên hoặc nhân tạo. Đĩ là sự thay đổi cấu trúc của gene xảy ra theo các kiểu: mất đi một cặp nucleotid, thêm vào một cặp nucleotid và biến đổi trình tự các nucleotid. Biến đổi gene thường cĩ hại, chỉ rất ít trong trường hợp cĩ lợi, sẽ được dùng làm nguyên liệu cho quá trình tiến hĩa. * Đột biến nhiễm sắc thể là loại đột biến ở mọi cơ thể. Cĩ 2 loại đột biến nhiễm sắc thể: đột biến số lượng và đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể. - Đột biến số lượng NST là những loại đột biến về số lượng NST của mọi cơ thể. Nhưng đột biến số lượng cĩ thể xảy ra tồn bộ NST (đột biến đa bội) hay ở một cặp NST nào đĩ. Đột biến đa bội cĩ thể tạo ra cơ thể cĩ bộ NST tăng lên 3n, 4n, 5n, NST. Đột biến một cặp NST ví dụ cặp NST thứ 21 ở người cĩ 3 chiếc gây bệnh Down, đột biến tăng số NST giới tính gây các bệnh vơ sinh. - Đột biến cấu trúc NST là những đột biến trong cấu trúc bộ NST. Những đột biến về cấu trúc NST cĩ thể xảy ra ở các dạng sau: . Mất đoạn: mất đi một đoạn nào đĩ của NST. . Đảo đoạn: hai phần trên cùng một NST đảo vị trí cho nhau. . Thêm đoạn: gắn thêm một đoạn mới vào NST. . Chuyển đoạn: sự trao đổi hai đoạn trên hai NST khơng cùng nguồn cho nhau. * Đột biến gene tế bào chất. Cĩ nhiều trường hợp kiểu gene bình thường mà cĩ biến đổi kiểu hình. Đĩ là do biến đổi gene tế bào chất gây
21. 18 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung nên. Các đột biến gene tế bào chất cĩ những đặc điểm giống đột biến gene trong NST, chúng cũng bền vững và di truyền được cho đời sau. Đột biến gene tế bào chất cĩ thể lặn hoặc trội. Đột biến gene tế bào chất cũng là nguồn nguyên liệu cho chọn giống. Nguyên nhân của sự đột biến là do tác nhân bên trong tế bào và bên ngồi mơi trường gây nên. Các yếu tố bên trong tế bào như quá trình trao đổi chất, hoạt động sinh lí mất bình thường cĩ thể gây đột biến. Các yếu tố bên ngồi như tác nhân vật lí: nhiệt độ cao, siêu âm, tia phĩng xạ, tia tử ngoại, hay tác nhân hĩa học, đặc biệt là colchicine, là các tác nhân gây đột biến quan trọng. Con người cĩ thể sử dụng nĩ để tạo ra các đột biến mong muốn dùng cho chọn giống. Những vấn đề nêu trên tuy gọi là CNSH truyền thống nhưng thực chất cho đến ngày nay người ta vẫn sử dụng nĩ trong việc tạo giống mới. 2. CNSH trong việc cải tạo giống và phát triển cây trồng cho năng suất cao Từ những năm 1960 tiếp sau việc du nhập các giống mới vào châu Á và châu Mĩ Latinh, danh từ “cuộc cách mạng xanh” bao trùm tất cả những cố gắng tăng năng suất nơng nghiệp ở các nước đang phát triển (ĐPT) thơng qua giống mới cao sản đặc biệt là lúa và lúa mì. Sử dụng các giống mới này địi hỏi nhiều loại thuốc trừ sâu, các biện pháp tưới, phân bĩn và chăm sĩc. Lai các giống mới này với các giống chống chịu của địa phương cho phép thu được các giống cĩ năng suất cịn cao hơn và thích nghi tốt hơn. Đồng thời, ngồi lúa và lúa mì, cơng tác nghiên cứu được mở rộng ra kê, lúa miến, ngơ, Triticale và một số cây đậu đỗ (Sasson, 1986). Chỉ trong vịng hơn 10 năm, một nửa diện tích lúa mì và 1/3 diện tích đồng lúa của các nước ĐPT đã gieo bằng giống mới cao sản. Nếu được tưới nước hợp lí, bĩn đủ phân và xử lí thuốc trừ sâu, năng suất cĩ thể tăng gấp đơi đến gấp ba lần giống địa phương. Cuộc “cách mạng xanh” lần thứ hai được nĩi đến vào những năm 1970 là kết quả các cơng trình nghiên cứu lai tạo giống năng suất cao, chống chịu sâu bệnh, hạn hán, cĩ thể phát triển trong điều kiện ít phân bĩn và thuốc trừ sâu hơn. Các cơng trình nghiên cứu này sẽ khơng cịn chỉ dựa trên các kĩ thuật lai, thụ phấn chéo mà dùng kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào cùng với kĩ thuật tái tổ hợp di truyền để nhân nhanh các giống đáng chú ý và tạo ra giống mới (Murashige, 1974; Vasil, 1984;, 1985, 1986,; Arnon, 1985; Mantel et al., 1985; Zaithin et al., 1986; Davies, 1097; Picrik, 1987, ), các kĩ thuật này dựa trên các cơ chế tế bào học và sinh học phân tử quyết định tính đa dạng sinh học (Collins, 1982, 1984; Kosuge et al., 1983; Tudge, 1983; Gelvin và Schilperoot, 1988).
22. 19 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Nhờ tránh được việc lai chéo và vượt qua được trở ngại của tính khơng tương hợp sinh dục (sexual incompatibility) nên tiết kiệm được nhiều thời gian. Kĩ thuật tái tổ hợp DNA và ứng dụng chúng dần dần đối với thực vật cĩ thể giúp loại bỏ hàng rào sinh lí và giải phẫu ngăn cản sự lai khác lồi (Rachie và Lyman, 1981), các kĩ thuật in vitro cũng cho phép tăng sự đa dạng di truyền gần đây bị giảm sút do sự phá hủy các sinh cảnh tự nhiên, làm giảm sự đe dọa do sâu bệnh ở một số cây trồng cĩ nền di truyền quá đơn thuần. Các nước đang phát triển nhất là các nước trong khu vực nhiệt đới cịn đang giữ được sự đa dạng di truyền tương đối rộng trong các hệ sinh thái tự nhiên và hệ sinh thái nơng nghiệp của mình dưới hình thức nhiều lồi hoang dại cĩ quan hệ họ hàng với cây trồng, nhiều giống chống chịu và giống địa phương. Các kĩ thuật nuơi cấy cơ quan, mơ tế bào thực vật và các lĩnh vực nghiên cứu liên quan cĩ thể liên kết việc áp dụng cơng nghiệp theo các con đường sau: - Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng và tái sinh Nhân giống in vitro các cây cây hồn chỉnh và các giống sạch virus - Nuơi cấy tế bào trần protoplast, mơ Cải thiện giống và nhân đơn bội, chọn lọc các biến chứng và giống cây trồng đột biến, dung hợp protoplast và tái sinh cây - Kĩ thuật tái tổ hợp di truyền, cấy Cải thiện giống cây trồng. chuyền gene và tái sinh cây. - Nuơi cấy tế bào qui mơ lớn, chọn đột Sản xuất các loại hoạt chất biến, dung hợp protoplast và kĩ thuật cĩ ích. tái tổ hợp DNA. Tổng hợp các chất mới. - Nuơi cấy tế bào, protoplast, chuyển dạng sinh học. Trên quan điểm kinh tế, chi phí lao động tham gia vào cấy chuyền nhân giống là khoản mục lớn nhất trong giá thành của cây giống in vitro. Người ta đang tiến hành nghiên cứu các máy tự động để cấy chuyền. Năm 1985, một mẫu máy cấy chuyền đã được chế tạo tại Australia cĩ thể cấy được một cây trong một giây. Những thiết bị như vậy cĩ thể làm giá thành cây cấy mơ giảm đi rất đáng kể (Marti, 1986-87). Việc áp dụng kĩ thuật in vitro cĩ thể được xếp thành 3 loại:
23. 20 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung . Các áp dụng cĩ được trong thời gian ngắn (3 năm): nhân giống vơ tính in vitro, sản xuất cây sạch bệnh, bảo quản và trao đổi quĩ gene thực vật. . Các áp dụng trung hạn (3-8 năm): các đột biến soma và đột biến giao tử, cứu phơi, thụ tinh trong ống nghiệm, nuơi cấy túi phấn và sản xuất cây đơn bội. . Các áp dụng dài hạn (8-15 năm): lai tế bào soma, lai xa, dịng tế bào đột biến, chuyển gene, chuyển NST, sản xuất các chất thứ cấp bằng tế bào nuơi cấy in vitro. Việc áp dụng CNSH vào đổi mới thu hoạch mùa màng đang là một trong trong những cuộc cách mạng khoa học và kĩ thuật hiện nay. Việc đổi mới này cĩ thể dựa vào các biện pháp kĩ thuật chính sau: * Sản xuất nhanh và qui mơ lớn những cây trồng cĩ cùng một tính chất di truyền, cho năng suất cao thơng qua kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào. * Tạo những giống mới cĩ năng suất cao thơng qua phương pháp chọn dịng soma trong nuơi cấy mơ tế bào. * Tạo ra những cây lai mới cĩ đặc tính ưu việt bằng kĩ thuật dung hợp protoplast (protoplast fusion). * Tạo ra những đặc tính mới mong muốn qua việc đưa các nguyên liệu di truyền vào tế bào cây trồng bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA 2.1. Sản xuất nhanh và qui mơ lớn những cây trồng cùng cĩ tính chất di truyền cho năng suất cao thơng qua kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào Trong kĩ thuật trồng trọt cĩ nhiều lồi cây cần phải nhân giống vơ tính ở qui mơ lớn. Một số cây trồng cĩ thể tái sản xuất dễ dàng bằng hạt nhưng khả năng nẩy mầm thấp, đặc biệt là các cây lâm nghiệp. Một số khác tuy hạt dễ nẩy mầm nhưng quá trình sản xuất hạt lại quá đắt. Cũng cĩ một số cây lai duy nhất cần được nhân lên vơ tính để giữ lại những đặc tính ưu việt. Trong những năm 1930, việc tái sinh lại chồi và tồn bộ cây trồng đã được tiến hành một cách thuận lợi nhờ xây dựng được kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thành cơng. Ngày nay, hầu hết phịng thí nghiệm nghiên cứu sinh lí hĩa sinh di truyền thực vật đều được trang bị kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào. Kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật bao gồm: * Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy cĩ đủ thành phần cần thiết và nhiều loại, cũng như phải chọn giống đúng cho mơi trường nuơi cấy từng loại mơ, tế bào và thay đổi theo từng thời kì phát triển và phân hĩa của mơ (mơi trường nuơi cấy protoplast khác với mơi trường nuơi cấy callus, mơi trường tạo rễ tạo mầm khác với mơi trường duy trì mơ ở trạng thái callus, v.v.)
24. 21 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung * Điều kiện vơ trùng phải nghiêm ngặt, kể từ khi chuẩn bị mơi trường đến khi xử lí mơ. Vì vậy, phải cĩ buồng cấy vơ trùng và tủ cấy Laminaire, cũng như các thao tác dụng cụ đều phải tuân theo nguyên tắc vơ trùng triệt để. * Chọn lựa mơ phải cĩ đủ điều kiện để phát triển mạnh và phải cĩ đủ khả năng để tạo thành callus trong mơi trường chứa chất dinh dưỡng thích hợp. Thường người ta chọn mơ phân sinh ngọn hay chồi nách. * Điều kiện xử lí mơ phải thích hợp. Tuy các mơ trên cùng một cây cùng một lượng thơng tin di truyền như nhau nhưng cho các callus phát triển hồn tồn khác nhau trong khả năng tái sinh chồi, phát triển rễ hay thành cây hồn chỉnh. Đĩ là do xử lí chất điều hịa sinh trưởng (ĐHST) khác nhau, xử lí nhiệt độ và ánh sáng khác nhau. Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật là phương pháp nhân giống lí tưởng khơng chỉ do địi hỏi ít diện tích, nhanh, mà cịn giữ nguyên được tính ưu việt của giống cây ban đầu. Nhân giống và nhân dịng vơ tính cĩ ý nghĩa đặc biệt đối với cây nhiệt đới vì chúng cĩ độ dị hợp cao, thường nhiễm nhiều loại virus. Các cây trồng sau đều cĩ thể đưa vào nhân giống vơ tính in vitro với mục tiêu thương mại hĩa trên qui mơ lớn: Atiso, măng tây, củ cải đường, tỏi, gừng, khoai tây, Raspberry, dâu tây, mía đường, khoai lang, khoai nước, dứa dại, hạnh nhân, táo tây, chuối, cam, chanh, dừa, anh đào, kiwi, cọ dầu, đu đủ, lê, dứa, chuối bột, nho, hạt dẻ, tre, lim, bạch đàn, vả, cẩm chướng, cúc, Iris, Gerbera, huệ, lan, Pelagonium, đỗ quyên, hoa hồng, Một số cây đang được tái sinh trong phịng thí nghiệm: cây bơ, ca cao, cà phê, Jojoba, cao su, chà là, thuốc lá, cà rốt, Endive, cải dầu, ngơ, đậu, củ từ, đậu nành, (theo tài liệu Zimmerman, 1986; Ketchum, 1987; Picrik, 1987). Ỏ Trung Mĩ và Nam Mĩ, kĩ thuật nuơi cấy mơ được áp dụng nhằm tạo giống cây sạch bệnh và nhân giống vơ tính cây cọ dầu (Brazil, Colombia, Costa Rica, Cộng hịa Dominique), cam, chanh, khoai tây, dâu tây (Brazil), cà phê (Costa Rica và Mexico). Nhiều cơng ti tư nhân cũng đã dùng kĩ thuật này để tăng sản lượng cọ dầu (Costa Rica, Cộng hịa Dominique), chuối (Honduras), lan (Brazil) cẩm chướng, cúc, dứa cảnh (Colombia, Costa Rica). Năm 1987, Ở khoa Sinh học Đại học Maranhão đã thành lập một phịng thí nghiệm cấy mơ để thực hiện chương trình chọn giống các cây ăn quả nhiệt đới: dừa hột, và các cây gỗ cung cấp lương thực khác. Các cơng ti tư nhân Brazil Biomatris S.A. (Rio de Janeo) là chi nhánh của cơng ti giống khổng lồ AGROCERES đang tham gia vào các nghiên cứu triển khai việc nhân giống in vitro khoai tây, cây ăn quả ơn đới
25. 22 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung và nhiệt đới, cây cảnh. Cơng ti trải rộng trên tồn lãnh thổ Brazil và sản lượng hàng năm của nĩ tới 2,4 triệu cây giống (Biotechnologia Fundacão). Ở Việt Nam, Trung tâm Thực nghiệm Sinh học tại thành phố Hồ Chí Minh (1979-1980) cũng đã nhân giống vơ tính in vitro giống khoai tây để phục vụ cho các hợp tác xã sản xuất ở thành phố Đà Lạt. Ở Viện Khoa học Việt Nam ở Hà Nội (nay là Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) cũng đã thí nghiệm nhân giống vơ tính in vitro các cây khoai tây, cà, lúa, thuốc lá từ năm 1974-1975. Cho đến nay, ở đây cũng đã nhân nhiều giống cây trồng như mía, ngơ, dứa sợi, lúa, thuốc lá, cĩ khả năng chống chịu để phục vụ cho việc trồng trọt ở địa bàn miền Bắc. Ở Đại học Nơng nghiệp I, viện Di truyền Nơng nghiệp TW, cũng bằng nhân giống vơ tính và kĩ thuật dung hợp protoplast tạo ra nhiều giống cây trồng phục vụ cho sản xuất nơng nghiệp. Việc nhân giống và khai thác cây chịu hạn (serophyte) đã mang lại nhiều mối lợi cho các nước ĐPT ở vùng khơ hạn hoặc bán khơ hạn. Trong số 350.000 lồi thực vật được các nhà thực vật học mơ tả, con người mới chỉ thử trồng khoảng 3.000 lồi làm lương thực, lấy sợi, làm thuốc hoặc thu nguyên liệu. Chỉ cĩ khoảng 100 lồi được trồng diện rộng và 90% lương thực của lồi người do khoảng 10 lồi cung cấp, trong đĩ khơng cĩ lồi nào thuộc cây chịu hạn. Vì vậy, cần thiết phải tìm ra các lồi cây chịu hạn cĩ khả năng cho sản phẩm dồi dào ở các vùng khơ hạn chiếm hơn 1/3 diện tích của quả đất. Các nguồn nước tưới ngày nay đang trở thành một nhân tố hạn chế trong sự phát triển của nơng nghiệp. Vì vậy, tìm cây chịu hạn cĩ ý nghĩa quan trọng trong sản xuất. Năm 1960, Viện Nghiên cứu ứng dụng, Đại học Ben. Gurion ở Negev, Israel đã được thành lập với mục đích du nhập và phát triển các cây thích nghi với điều kiện khơ hạn và bán khơ hạn. Lúc đầu viện thực hiện cái gọi là “nơng nghiệp sa mạc” nghĩa là du nhập và phát triển những cây từ vùng khơ cằn, các lồi sử dụng rất ít nước mưa (lượng mưa dưới 200 mm), chỉ cần bổ sung nước tối thiểu. Sau đĩ, các nhà khoa học Israel chuyển sang “làm nơng nghiệp trên sa mạc”, nghĩa là làm cho những người định cư trên vùng khơ cằn cĩ thu nhập cao để đủ cho họ cĩ mức sống khá. Người ta đã đưa vào sử dụng việc tưới nước lợ hay mặn (nước này cĩ ở vùng sa mạc Negev). Viện Rodolph và Rhoda Boyko (Viện Nghiên cứu Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng) của Israel đã tiến hành nhiều chương trình nghiên cứu nhằm áp dụng các tiến bộ nơng học và CNSH vào vùng sa mạc Negev và các vùng khơ hạn nĩi chung (chương trình cĩ sự tham gia của Israel, Mĩ, Ai Cập, Hà Lan, Cộng hịa Liên bang Đức) theo tài liệu của Raz, 1987). Người ta đã trồng những cây chịu hạn nhiều năm trong đĩ cĩ cây cao và
26. 23 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung cây bụi Atriplex mummularia (Saltbusch) Atriplex canescens và Cassia sturtii) đã cho các kết quả đặc biệt tốt. Qua nghiên cứu so sánh 120 lồi cây chịu hạn thì Atriplex nummularia, Atriplex barclayama và Atriplex lentiformis là cây chịu mặn cho năng suất cao và dùng làm thức ăn gia súc. Cây Distchlis spicata (cỏ chịu mặn) cũng cĩ thể sống trong điều kiện cực khơ hoặc mặn dùng phủ xanh và cải thiện ơ nhiễm vùng Texcoco (Mexico). Cây Jojoba (Simmondsia chinensis) là loại cây bụi cĩ lá thường xuyên thuộc họ Buxaceae (cao đến 5 m) tìm thấy ở tây bắc Mexico trong sa mạc Sonora và cả ở vùng khơ cằn bang California và Arizona của Mĩ (cĩ thể mọc ở sa mạc cĩ lượng nước mưa 75 mm vẫn cho quả tuy cây cĩ thấp). Cây Jojoba cĩ bộ lá dày, thơ, chịu nhiệt độ 50oC nhờ bộ rễ ăn sâu 30 m. Từ xa xưa, dầu Jojoba dùng bơi tĩc và xử lí da súc vật (thổ dân Apaches sử dụng). Hạt Jojoba (bằng hạt Lạc) chứa một loại sáp lỏng chiếm 30-60% màu hơi vàng, cĩ mùi, thành phần khơng chứa glyceride mà chứa một hỗn hợp các rượu và ester của các acid béo mạch dài từ 20- 22 nguyên tử C. Dầu Jojoba thay thế dầu cá voi dùng bơi trơn trục chuyền thủy lực và hộp số xe đua ở áp suất và nhiệt độ cao, dùng trong cơng nghiệp da, cơng nghiệp mĩ phẩm, cơng nghiệp dược, chất chống bọt lên men vi sinh vật, sáp bĩng phủ các loại giấy carbon đặc biệt. Khơ dầu chứa dầu dư và khoảng 30% protein, xơ, tannin và các chất khác. Cây Guayule (Parthenium argentatum) là cây lấy nhựa mủ tự nhiên làm cao su. Cây Crambe (Crambe abyssinia) thuộc họ Thập tự Cruciferae chứa một lượng lớn acid erucic cĩ thể thay thế cải dầu. Cây bí trâu Cucurbita foetidissima (Buffalo gourd) cĩ hạt giàu dầu và protein, rễ chứa nhiều tinh bột. Sau 4-5 năm sinh trưởng, thân, lá, rễ đã nặng 40 kg trong đĩ cĩ 20% là tinh bột, chi Grindelia gồm nhiều lồi dùng làm nhựa dẻo. Cây Ocnothera spp. là cây làm thuốc, hạt cĩ nhiều acid γ-linoleic được dùng như chất bổ sung dinh dưỡng và làm mĩ phẩm. Những cây đã nêu trên, người ta dùng CNSH nuơi cấy mơ và tế bào để nhân giống và trồng ở qui mơ rộng, vừa chịu hạn, chịu mặn, chịu nĩng, chịu nghèo dinh dưỡng mà đạt năng suất cao và dùng trong nhiều ngành cơng nghiệp khác nhau, phục vụ cho đời sống. Đối với cây rừng, xuất khẩu gỗ giữ vai trị quan trọng đối với các nước ĐPT. Theo số liệu thống kê của bộ Nơng nghiệp Pháp: năm 1984-85, mậu dịch gỗ nhiệt đới là 35.236 triệu m3 trong đĩ châu Phi: 35%, châu Á: 60%, Trung và Nam Mĩ: 5%.
27. 24 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Nhân giống vơ tính in vitro các cây rừng lấy gỗ hay làm bột giấy cĩ ý nghĩa kinh tế rất lớn. Chi bạch đàn (Eucalyptus) cĩ nhiều lồi đặc hữu ở Australia, Timor, Tân Guinê, Philippinnes. Bạch đàn đã du nhập và trồng ở Nam Mĩ, châu Phi, Spain, Portugan, châu Á, Trung Cận Đơng và Bắc Mĩ. Các phương pháp nhân giống vơ tính truyền thống như giâm cành, chiết cành, ghép đối với bạch đàn đều khơng cho hiệu quả. Người ta tạo callus từ những phần khác nhau của các lồi bạch đàn và cây con tái sinh từ callus từ các bộ phận khác nhau của bạch đàn chanh Ecalyptus citriodova và bạch đàn trắng E. alba. Từ năm 1970, đã nuơi cấy thành cơng mảnh lá, đoạn thân, rễ bạch đàn. Các nhà nghiên cứu Mĩ đã thu nhận cây con nuơi cấy đoạn thân các lồi: E. grandis, E. gunni, E. dalrrympleana, E. pauciflora, E. ficifolia. Từ năm 1973, AFOCEL (Association Franҫaise Forêt-cellulose) đã khởi sự nhân vơ tính in vitro cây bạch đàn nhằm mục tiêu sản xuất lớn các dịng vơ tính chịu lạnh và năng suất gỗ cao. Từ năm 1975, bắt đầu trồng ngồi đất cứ mỗi tháng trồng 20.000 cây bao gồm 18 dịng vơ tính. Hartney (1982) đã nhân vơ tính thành cơng các giống E. camadulensis, E. curtisi, E. ficifolia, E. grandis, E. obtusifolia và E. rudis, bằng cách nuơi cấy chồi nách và từ cây con.Mchra-Palta (1982) đã thành cơng trong tạo chồi phụ từ lá mầm và trên đoạn thân bạch đàn E. nova angelica và E.viminalis trong điều kiện in vitro. Diallo và Duhoux (1984) làm việc tại phịng thí nghiệm Sinh lí thực vật Đại học Dacar, Senegal đã nuơi cấy lá mầm và tạo thành cơng chồi cây E. camaldulensis, trên mơi trường cĩ chứa NAA (naphtalen acetic acid là một auxin) và 6.BA (6-benzylaminopurine là một loại cytokinine) kĩ thuật này cho phép tạo ra 200 cây từ 1 cây con trong 2 tháng và 1013 cây trong 1 năm, trong khi kĩ thuật cắt đoạn của Gupta chỉ đạt 106 cây/năm. Davies (1984) làm việc tại phịng thí nghiệm của Dhoux đã phát triển kĩ thuật nhân vơ tính cây Faidherbia (Acacia albida). Cây họ Đậu này mọc ở hầu hết các vùng khơ hạn ở châu Phi, đặc biệt là ở Tây Phi. Chúng đĩng vai trị quan trọng đối với kinh tế đồng cỏ vùng Sudan Sahel. Chúng cố định N2 và rụng lá vào mùa mưa. Lá và quả dùng làm thức ăn cho đại gia súc vào mùa khơ. Acacia albida tạo mơi trường thuận lợi cho các cây kê, lúa miến, lạc mọc dưới tán lá cây của chúng vào mùa mưa. Hai cây rừng khác cĩ khả năng cố định N2: cây họ Đậu Acacia senegalensis và cây khơng họ Đậu Casuarina equisetifolia cũng đã được quan tâm nghiên cứu nuơi cấy mơ.
28. 25 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung  Nghiên cứu tạo phơi soma Một hướng khác được tổ chức trồng trọt là việc tạo phơi soma. Theo như mơ tả của Steward và cộng sự, sự chuyển sang mơi trường cĩ nồng độ auxin thấp đã gây ra sự sinh trưởng tế bào trong phơi. Chúng cũng trải qua tất cả các giai đoạn phát triển bào thai của một hợp tử nhưng tạo thành từ tế bào soma chứ khơng phải là sản phẩm hịa hợp của 2 giao tử đực và cái. Sự nuơi cấy phơi của tế bào soma cĩ một số tiến bộ: * Phơi phát triển cả hai hướng đem đến cả rễ, chồi và phát triển thành cây tồn vẹn ngay từ đầu. * Nuơi cấy phơi cĩ thể tạo ra một hướng lớn các cây hơn cả con đường nuơi cấy mơ. * Khi lớn lên trong mơi trường nước thì phơi tách ra thành những phơi khác và bơi tự do, do đĩ, khơng cần nhiều thiết bị. Hàng ngàn phơi phát triển trong bình nuơi cấy cổ thắt và cũng cĩ tốc độ sinh trưởng nhanh khơng kém tốc độ sinh trưởng khi nuơi cấy vi sinh vật. Ngồi cà rốt, cần tây, những cây khác như đậu, chanh, cà phê, chà là, kê cũng được nuơi cấy phơi tế bào soma. Sự chín phơi tế bào soma cĩ thể được cải biến bằng những chất ĐHST đặc biệt dùng acid abscicic và thay đổi mơi trường. Cơng nghệ hiện nay hồn tồn cho phép nhân lên những phơi soma cho một số lớn các lồi cây thu hoạch quan trọng. Một vài cây trồng đã được tái sinh thành cơng bằng nuơi cấy phơi soma: cà rốt, cần tây, đậu, cà phê, chanh, cọ dầu, v.v. Thí dụ: cọ dầu tạo từ phơi soma cĩ thể thực hiện trực tiếp từ callus sơ cấp trên mơi trường chứa auxin, cytokinine và than hoạt tính. Các thể phơi hình thành 6 tháng sau khi đưa các phân đoạn của lá và nuơi cấy. Cĩ thể thu được tới 500.000 thể phơi từ 1 mẫu lá trong vịng 1 năm. Các thể phơi đã thành thục, được tách ra và tạo cây, các phơi non dùng để tiếp tục nhân (Noirel, 1984-85). Chúng ra cĩ thể phân biệt 2 giai đoạn trong nhân giống in vitro cọ dầu: giai đoạn thứ nhất: từ lúc tạo callus rút ngắn cịn 6 tháng hay ít nhất tùy tốc độ tạo phơi soma, giai đoạn hai: thường kéo dài 4 tháng trong đĩ phơi tự nhân lên và hình thành cây. Việc chuyển vận thể phơi từ Pháp đến Malaysia hoặc Indonesia khơng cĩ gì khĩ khăn. Giữ đơng lạnh thể phơi đã được thực hiện tại phịng thí nghiệm Nghiên cứu Sinh lí các cơ quan thực vật Sau thu hoạch CPOVAR của viện Nghiên cứu Khoa học Quốc gia Pháp CNRS. Phơi được bảo quản ở -196oC trong thời gian rất dài. Người ta đã nhận thấy rằng các cây cọ dầu xuất xứ từ các phơi đơng lạnh sau 15 tháng trồng trên đồi khơng cĩ biến dị hình thái nào. Vì vậy, Viện Nghiên cứu dầu và cây cĩ dầu Pháp (IRHO) đã đề xuất kĩ thuật này cho các khách
29. 26 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung hàng hải ngoại. Kĩ thuật này rất thích hợp đối với các lồi khơng thích hợp với nhiệt độ bảo quản của các cây ơn đới (0-5oC). Hơn nữa nĩ cĩ thể giảm thiểu các hiểm họa tiềm tàng nếu số lần cây chuyền để nhân giống tăng lên quá lớn (Biofuture, 1987, số 56). Dầu cọ là loại dầu ăn được sử dụng nhiều nhất trên thế giới, chỉ đứng hàng thứ 2 sau dầu đậu tương và chiếm 17% tổng sản lượng dầu béo và mỡ (3-11 tấn/ha/năm), nên cần cĩ giống cọ dầu để trồng, nhất là các nước cận xích đạo. Về cây dừa, từ năm 1981 các nhà khoa học Pháp thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học vì Sự phát triển (ORSTOM) và IRHO cũng đã bắt đầu các thí nghiệm nuơi cấy mơ dừa nhằm tạo phơi soma. Các cây nuơi cấy mơ được tạo từ mơ của phần lá non của các cây dừa 5 tuổi trồng trong nhà kính thuộc giống PB-121 con lai giữa giống lùn vàng Malaysia (Malaysia Yellow Drafs) và giống cao Tây Phi được chọn lai tại Cơte d’Ivoire. Các thể phơi thu được sau 6 tháng nuơi cấy. Các nghiên cứu tạo cây hồn chỉnh từ phơi được tiến hành từ năm 1984 (Pannetier và Noirel, 1984). Theo các nhà khoa học Pháp, quá trình phát sinh phơi soma cĩ thể xuất hiện trong một giai đoạn ngắn từ mơ lá non của cây dừa từ 2 đến 5 tuổi và cĩ thể thu được với cây trưởng thành . Bằng phương pháp này, dừa cho năng suất cao hơn (số quả và sản lượng cơm dừa) cĩ thể gấp 5 lần. Đối với cây cà phê, các nhà nghiên cứu Pháp ở GERDAT (Groupement d’Etude et de Recherche d’Agronomie Tropical), Montpellier đã nuơi cấy mơ cà phê từ năm 1978-1979 và năm 1981 đã thành cơng trong thu nhận phơi soma trực tiếp từ mơ cấy ban đầu mà khơng phải thơng qua giai đoạn tạo callus trung gian (Dublin, 1982). Các phơi vơ tính được hình thành từ các bĩ mạch của phiến lá đem nuơi cấy trên bề mặt mơi trường. Từ một mảnh lá duy nhất cĩ thể tạo ra hơn 1.000 cây con. Qua một vài ví dụ cụ thể nêu trên cho thấy rằng, việc nghiên cứu tạo phơi soma là một trong các biện pháp kĩ thuật cĩ triển vọng của CNSH, nhằm nhân nhanh các giống cây trồng nơng lâm nghiệp ở qui mơ rộng.  Nghiên cứu nhân giống cây sạch virus. Để tiến hành tạo cây sạch bệnh virus bằng kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào, người ta thường dùng mơ phân sinh ở đỉnh chồi. Những mơ này chứa những tế bào sinh trưởng và được bao một lớp vỏ cutin. Sự hình thành mới các cơ quan của thực vật bắt đầu trong các mơ phân sinh ở đỉnh chồi này. Các mơ đĩ phân hĩa ngay từ những giai đoạn đầu của phơi và giữ lại trong suốt quá trình sống của cây. Mơ phân sinh là vùng khỏe mạnh nhất của cây, vì người ta thấy rằng, quá trình sinh tổng hợp DNA của virus
30. 27 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung thực vật khơng xẩy ra được ở vùng này – do một cơ chế gì hiện nay chưa rõ, thậm chí cả cây bị bệnh virus nhưng phần này vẫn khơng bị nhiễm virus. Vì mơ phân sinh cĩ các tế bào phơi nên khi nuơi cấy tạo nên callus. Dùng các chất ĐHST khác nhau như gibbrelline, auxin, cytokinine, v.v. để kích thích khối tế bào khơng phân hĩa này đâm chồi. Từ đĩ hình thành nên những cây con khỏe mạnh khơng bị virus. Bằng cách đĩ người ta sản xuất ra dâu tây, khoai tây, đu đủ, khoai mỡ, sắn và nhiều cây cảnh sạch bệnh virus.  Nhân giống bằng sản xuất hạt nhân tạo. Ngày nay người ta đã dùng kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào thực vật để sản xuất hạt nhân tạo. Tế bào thực vật cĩ đặc trưng là khơng chỉ trở thành tế bào sinh dưỡng mà cịn trở thành tế bào phơi mầm, chỉ cần điều khiển chúng bằng các chất ĐHST thích hợp. Do vậy, người ta cho vào bình dung dịch dinh dưỡng cĩ chất ĐHST nhất định thì tế bào cĩ thể trở thành tế bào phơi. Các tế bào phơi trong bình đĩ sẽ sinh sản rất nhiều và tụ họp lại. Các phơi này được bao bọc bởi một chất keo - gồm hỗn hợp các chất dinh dưỡng và gọi là các hạt nhân tạo. Khi gieo các hạt này xuống đất sẽ mọc thành cây bình thường. Việc sản xuất các hạt nhân tạo như thế rất cần thiết trong nơng lâm nghiệp. Bởi vì, trong cải tạo giống nhiều khi tạo ra được giống cĩ năng suất cao và chống chịu giỏi nhưng lại khơng cĩ hạt hoặc rất ít hạt để cĩ thể gieo trồng lại. Bằng phương pháp nĩi trên, người ta cĩ thể sản xuất hạt nhân tạo bằng các tế bào bình thường của cây này với một lượng lớn trong các nồi lên men. Một loạt các vấn đề lí thú về hạt nhân tạo ở đây là: * Khi cịn trong các bình nuơi cấy lên men rất tiện lợi cho người ta xử lí nhiệt các mơ để làm sạch hết virus, tạo ra các hạt sạch bệnh. * Người ta cũng cĩ thể đưa vào vỏ hạt nhân tạo các lồi vi khuẩn cố định N2 thì khi cây trưởng thành, vi khuẩn này sẽ lấy N2 từ khơng khí để cung cấp phân đạm cho cây đĩ. * Cũng bằng cách tương tự như trên, người ta đưa một lượng thuốc trừ sâu hoặc trừ cỏ dại vào vỏ hạt nhân tạo để bảo vệ cây khỏi bị sâu và cỏ dại phá hoại. * Hạt nhân tạo cũng là đối tượng dễ dàng để nạp các gene lạ vào để tạo ra các giống mới cĩ đặc tính mong muốn. Rất mừng là hiện nay trên thị trường thế giới cĩ bán nhiều hạt nhân tạo với các tính ưu việt nĩi trên, trong đĩ cĩ hạt lúa mì, hạt lúa, là những hạt lương thực sống cịn đối với cuộc sống con người. 2.2. Tạo giống mới cĩ năng suất cao thơng qua phương pháp tạo dịng soma trong nuơi cấy mơ tế bào
31. 28 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Soma là tên gọi các tế bào cơ thể (sinh dưỡng), nĩ khác với tế bào sinh dục. Chúng ta biết rằng, từ các tế bào soma cĩ thể tạo nên bất kì bộ phận nào của cây. Đĩ là đặc điểm tồn năng của tế bào thực vật. Từ callus cĩ thể khơi phục lại một bộ phận nào đĩ: rễ, thân lá hoặc tạo thành một cây hồn chỉnh đều dựa trên đặc điểm tồn năng này. Cĩ điều callus được cấy đi cấy lại nhiều lần thường xẩy ra những biến đổi di truyền. Những cây lớn lên từ những tế bào biến đổi ấy cho các hạt. Những hạt này lại mọc thành cây cho những đặc tính quí mà ta mong muốn. Như vậy, chính lúc này những cây đĩ sẽ là nguồn ban đầu để nhân lên và những thế hệ sau được tạo ra mà ta gọi là các dịng soma. Phương pháp tạo giống kiểu này gọi là phương pháp tạo dịng soma. Cơ sở khoa học của việc chọn giống đĩ là hiện tượng biến dị soma - tức là biến đổi di truyền khơng phải ở tế bào sinh dục mà ở tế bào cơ thể (sinh dưỡng) của cây. Cĩ ba cách: * Biến đổi NST kiểu đa bội thể (polyploid) như ở cà chua, đậu, cây cảnh. * Biến đổi NST kiểu thêm, bớt một vài NST trong bộ NST tế bào. * Biến đổi kiểu đột biến ở một số gene nhất định ở NST hoặc gene của ti thể, lạp thể (lục lạp). Cĩ nhiều kiểu biến đổi: . Sự biến dị tự nhiên: thường rất thấp, chỉ một trong hàng triệu tế bào. . Bằng biện pháp chọn lọc cổ điển (sau lai ghép và đột biến) thì khĩ cĩ được sư phối hợp giữa cái cũ và cái mới. . Biến đổi dịng tế bào soma, đặc biệt là từ những tế bào callus trong nuơi cấy thì tần số xảy ra rất nhiều. Khoai tây tái sinh từ callus đã được thử nghiệm, trong đĩ cĩ 13 biến dị gene đơn giản đã được phát hiện trong 230 cây khoai tây tái sinh. Tỉ lệ biến đổi dịng soma ở đây là 1/18, cĩ nghĩa là từ 18 cây tái sinh thì cĩ một cây biến dị. Tỉ lệ biến dị này thật quá lớn. Một số biến dị gene đơn giản xẩy ra ở cà chua cũng đã được xác định và một trong những biến dị đĩ nằm ở cánh tay dài của NST 10 trong bản đồ gene. Vừa qua đã đạt được một số kết quả về biến dị soma trong số cây trồng đã kích thích sự áp dụng phương pháp chọn lọc dịng soma vào việc đổi mới cây trồng. Bằng phương pháp chọn dịng soma, người ta đã tạo nên được giồng lúa vừa chín sớm vừa cĩ hạt dạng dài nhằm vừa tăng năng suất thu hoạch lại vừa tạo được chất xanh làm thức ăn cho gia súc.
32. 29 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Về cây mía, phương pháp chọn dịng soma này đã tạo ra được giống mía chống được một số bệnh virus như bệnh fip, nấm lơng, bệnh than, và bệnh đột mắt. Ta biết rằng cây Mía là cây bát bội (octoploid) hoặc thập bội (decaploid) và rất dị hợp tử. Điều này gây trở ngại cho việc mơ hình hĩa lí thuyết và các phân tích di truyền. Heinz, 1977 ở Hawaii và sau đĩ các nhà khoa học Đài Loan, Pháp, Cuba, Argenetina, đã thành cơng trong tái sinh mía từ callus, từ nuơi cấy túi phấn đã tạo được cây đơn bội cĩ năng suất cao hơn trong điều kiện tự nhiên so với cây bố mẹ, hoặc phương pháp chọn lọc dịng soma cho phép phân lập được các dịng kháng bệnh. Bằng phương pháp chọn dịng soma, các nhà nghiên cứu cũng đã thực nghiệm chống bệnh tàn lụi cây cà chua, chống virus khảm thuốc lá trên cây thuốc lá. Từ những biến đổi dịng soma, cũng đã phát hiện những quả to nhỏ khác nhau, từ đĩ áp dụng vào việc chọn lọc cây ăn quả như bưởi, cam, để thu được những đặc tính quí. Đối với cây cọ dầu, khi tái sinh từ callus, cây khơng giống nhau mà xuất hiện một số đột biến soma (Jones, 1983). Những biến dị soma này theo Cocking ở Đại học Tổng hợp Notlingham, cĩ nguyên nhân di truyền và do cả điều kiện nuơi cấy tạo nên (Cocking, 1981). Nĩi tĩm lại, trong nuơi cấy mơ và tế bào thực vật, người ta đã thừa nhận cĩ sự biến đổi di truyền. Sự biến đổi như vậy cĩ thể cĩ ích đối với thu hoạch của con người. Trong quá trình nghiên cứu cơ sở di truyền của sự biến đổi tế bào thực vật nuơi cấy, người ta đã nhận thấy rằng, cơng nghệ nuơi cấy tế bào in vitro cho chúng ta một lợi khí quan trọng để làm thay đổi giống cây trồng theo hướng cĩ lợi. Đĩ là những biến đổi dịng soma giúp ta tạo ra nhiều giống cây mới với đặc tính ưu việt. 2.3. Tạo ra những cây lai mới cĩ tính ưu việt bằng kĩ thuật protoplast Protoplast là tế bào trần. Thành tế bào cellulose đã bị tiêu hủy bởi enzyme cellulase hay drilselase, nĩ chỉ cịn màng sinh chất bao quanh. Protoplast cĩ khả năng dung hợp (fusion) với nhau để tạo thành các thể lai vơ tính dưới tác dụng của một tác nhân hĩa học hay vật lí để làm các màng kết dính lại với nhau và gây ra sự chuyển vận các đại phân tử DNA, các protein, các bào tử từ tế bào nọ sang tế bào kia. Dung hợp là quá trình hợp nhất 2 protoplast lại làm một. Hiện tượng này phổ biến. Sự thật con người sinh ra cũng là kết quả một sự dung hợp giữa tinh trùng và nỗn trứng, tạo thành hợp tử cĩ dấu hiệu di truyền của cả 2 tế bào hợp lại. Chỉ cĩ điều quá trình đĩ gọi là lai hữu tính. Các tế bào thực vật cĩ khả năng dung hợp dưới dạng protoplast. Hai protoplast
33. 30 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung dung hợp lại cĩ thể sinh ra một cây con hồn chỉnh dưới dấu hiệu di truyền của hai tế bào hợp lại. Nhưng quá trình này là quá trình lai vơ tính (somatic hybridization). Ngày nay nhờ lai vơ tính mà người ta cải tạo được nhanh chĩng bộ máy di truyền tế bào nhằm tạo những giống mới cĩ năng suất cao. Sử dụng kĩ thuật protoplast, người ta đã lai tạo giữa cây trồng với cây hoang dại để đề kháng một số trạng thái trong mơi trường bất thuận như tạo ra những cây chịu hạn cao, chịu rét giỏi, chống chịu sâu bệnh, phèn, mặn, v.v. Kĩ thuật nuơi cấy và dung hợp protoplast đến nay khơng những đã thực hiện tốt đối với cây 2 lá mầm mà ngay cây cĩ một lá mầm như lúa, thậm chí các lồi rong, tảo. Kĩ thuật protoplast trong tạo giống mới của thực vật gồm 2 giai đoạn chính sau: a. Giai đoạn tách và nuơi cấy protoplast. Ở giai đoạn này người ta cĩ thể tách tế bào để xử lí tạo thành protoplast từ tất cả các thành phần của cây như rễ, thân lá, nốt sần rễ, lá mầm, hạt phấn, callus v.v. nhưng hay dùng cả là từ mơ lá. Giai đoạn này gồm các bước sau đây: + Xử lí mẫu cho sạch và vơ trùng bằng cồn 70o, sau đĩ bằng calcium hypochloride, cuối cùng bằng nước cất vơ trùng. + Cắt mẫu. Mẫu được cắt nhỏ thành mảnh 0,5×2 cm hoặc thành sợi. + Xử lí mẫu bằng enzyme. Sử dụng enzyme hỗn hợp như pectinase, cellulase. Onozuka R10 trong mannitol pH=5,8 ở một thời gian trong điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tối ưu. + Tách, làm sạch protoplast bằng phương pháp lọc và li tâm. Các bước chung là như vậy, song chi tiết mỗi lồi cây địi hỏi một loại enzyme để tách protoplast, nồng độ enzyme cũng như nồng độ chất gây co nguyên sinh chất khác nhau để cĩ lượng tế bào protoplast cao nhất. b. Giai đoạn dung hợp protoplast. Trong giai đoạn này người ta sử dụng một trong hai phương pháp sau đây để dung hợp: * Phương pháp sử dụng tác nhân hĩa học: sử dụng chất polyethylene glycol (PEG). Chất này gây nên kết dính 2 protoplast và tạo điều kiện để các phân tử DNA cũng như các thành phần khác dễ đi qua màng. * Phương pháp sử dụng tác nhân vật lí: các xung điện (electroporation) để tạo những lỗ nhỏ của màng, tạo điều kiện cho các đại phân tử đi qua. Thực chất những vấn đề chính của kĩ thuật dung hợp
34. 31 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung protoplast là việc phân biệt và tách thể lai thơng qua mắt thường, dùng gene đánh dấu, dùng mơi trường chọn lọc, dùng phản ứng màu enzyme, dùng protoplast từ các loại mơ khác nhau, hoặc được nhuộm bằng các chất phát huỳnh quang. Quá trình dung hợp cĩ thể thực hiện các bước sau: + Hai tế bào protoplast sạch của 2 loại cây định lai cho tiếp xúc nhau theo tỉ lệ nhất định rồi nhỏ các giọt dịch hỗn hợp đĩ lên đĩa nhựa trong petri. + Nhỏ nhẹ nhàng PEG lên đỉnh mỗi giọt dịch chứa protoplast hỗn hợp đĩ, ủ một thời gian ở nhiệt độ phịng rồi nhắc lại vài lần như thế. + Rửa sạch PEG và cho vào mơi trường nuơi cấy cĩ chứa muối ammonium để phục hồi tế bào sau quá trình tách và dung hợp. + Độ vài ngày sau, tế bào phân chia, cấy chuyền sang mơi trường chọn lọc và như vậy cấy chuyền một vài lần nữa trong mơi trường chứa những chất ĐHST thích hợp để tạo callus, tạo chồi, tạo cây và rễ,v.v. + Cĩ thể thử phản ứng enzyme trên mẫu lá cây lai cắt nhỏ để cĩ thể nhận ra được cĩ sự lai tạo hay khơng. Ngày nay người ta đang sử dụng kĩ thuật dung hợp protoplast để tạo ra những cây lai mới. Chẳng hạn, lai khoai tây trồng và khoai tây hoang dại. Gene cây hoang dại giúp cây trồng chống bệnh virus Người ta lai cây cà chua với cây khoai tây (họ hàng chúng xa nhau) cho cây lai mang quả cà chua và củ khoai tây. Bằng cách này, người ta tạo ra cây lai giữa cà rốt và rau mùi, cam và chanh, Đối với cọ dầu, từ protoplast và sử dụng kĩ thuật tái tổ hợp gene cĩ thể nâng cao hiệu quả, chọn lọc các dịng cĩ dầu cĩ năng suất cao. Hình II.1. Cây Khoai-Cà (Pomato) Đối với mía, dung hợp protoplast cĩ ý nghĩa lớn đối với việc phổ biến các giống mía khơng ra hoa (trốn cờ) hoặc bất thụ. Các kết quả nghiên cứu của CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) và CEBTEC (Divisão de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) ở Brazil cho thấy, dung hợp
35. 32 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung protoplast cây mía cĩ thể giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu cĩ từ dịng mía này qua dịng mía khác. Dung hợp protoplast cĩ thể chọn giúp các dịng cà phê kháng bệnh và các độc tố do nấm tiết ra để đưa vào mơi trường nuơi cấy nhằm chọn ra các dịng tế bào kháng độc tố cho cà phê. Năm 1987, ở Costa Rica cũng đã tái sinh cây cà phê vối từ protoplast được tách từ phơi vơ tính hình thành từ huyền phù tế bào callus lá. Sau khi nuơi cấy protoplast vài lần trên mơi trường chứa 0,5 mg/l kinetine, 0,5 mg/l 2,4D. 0,5 mg/l NAA, các tác giả thu được callus nhỏ. Khi cấy chuyền sang mơi trường khơng cĩ chất sinh trưởng các callus phát triển thành phơi và phát triển thành cây hồn chỉnh. Người ta cũng dung hợp protoplast cao su từ các tế bào phơi vơ tính. Đến nay đã cĩ hơn 70 lồi cây cũng đã được sinh ra từ protoplast. Khi dung hợp protoplast, người ta cịn tạo ra được giống lai giữa tế bào thực vật và vi khuẩn. Sự dung hợp protoplast giữa tế bào tảo lam (vừa cĩ đặc tính quang hợp vừa cĩ đặc tính cố định N2 trong khơng khí) với callus thực vật làm kích thích sự phát triển của chúng. Cũng với kĩ thuật trên, người ta cịn cĩ thể dung hợp được các tế bào soma với tế bào sinh dục (hạt phấn) để tạo ra cây lai giữa các họ với nhau. Tĩm lại, kĩ thuật dung hợp protoplast hiện tại đang mở ra một khả năng rộng lớn trong việc tạo ta những giống cĩ thể tập hợp được nhiều đặc tính tốt từ các cây khác nhau. Hơn nữa, nhờ việc tạo thành protoplast (bĩc trần vỏ tế bào), nĩ trở thành cơng cụ nghiên cứu các quá trình sinh hĩa, đặc biệt là acid nucleic và protein trong tế bào, dùng mơ hình nghiên cứu di truyền phân tử, nghiên cứu sự xâm nhập của vi khuẩn vào tế bào, nghiên cứu quá trình cộng sinh vi khuẩn trong cây bộ Đậu, nghiên cứu các enzyme, nghiên cứu cơ chế của quá trình quang hợp v.v. làm cơ sở khoa học cho việc nghiên cứu ứng dụng phục vụ cho đời sống của con người. 2.4. Tạo ra những đặc tính mới mong muốn qua việc đưa các nguyên liệu di truyền vào tế bào cây trồng bằng kĩ thuật tái tổ hợp DNA (DNA recombination) Việc cải tiến đưa các gene vào tế bào thực vật qua cách đưa nguyên liệu di truyền ngoại lai vào bằng con đường tái tổ hợp DNA hiện nay đang mở ra nhiều triển vọng tốt đẹp: Cách thứ nhất: chuyển gene trực tiếp . Phương pháp hĩa học polyethylene glycol. . Phương pháp vật lí xung điện dung hợp protoplast. . Phương pháp ngâm hạt phấn vào dung dich DNA.
36. 33 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung . Phương pháp vi tiêm gene. . Phương pháp bắn gene. Cách thứ hai: chuyển gene gián tiếp qua sử dụng các vector, đặc biệt là vector plasmid pBI12A chứa sẵn một gene khởi đầu promoter mạnh nhất và gene CaMV35S (Cauliflower mosaic virus) gene kết thúc và gene đánh dấu GUS-A. Plasmid này được gắn thêm các gene lạ cĩ đặc tính mong muốn đưa vào vi khuẩn hay ở thực vật dùng Agrobacterium tumefaciene để đưa vào cây. Người ta cĩ thể đưa gene ngoại lai vào qua con đường vector plasmid: DNA được đánh dấu phĩng xạ rồi đưa vào hạt phấn, chồi non, các tế bào nuơi cấy protoplast hay nhân tế bào được tách ra. DNA ngoại lai dễ nhận cảm với sự tiêu hĩa của enzyme nuclease vật chủ. Phải đưa DNA vào lyposome, sau đĩ dung hợp vào protoplast để làm giảm tác dụng tấn cơng của nuclease tế bào chủ. Dần dà người ta nghiên cứu đưa DNA ngoại lai vào qua con đường vector plasmid. DNA plasmid được tìm thấy ở ti thể của động vật bậc cao. Những plasmid đĩ cĩ thể là một hệ thống duy nhất của sự chuyển gene. Chúng sao chép một cách tự quản trong ti thể. Plasmid cũng được tìm thấy trong nhiều vi khuẩn. Những plasmid đĩ thường được liên kết với vi khuẩn bệnh lí và được dùng để kiểm tra sự sinh bệnh của một tác nhân gây bệnh cây trồng. Vai trị plasmid Ti của Agrobacterium tumefaciens trong sự hình thành khối u ngày nay đã được sử dụng phổ biến để chuyển gene thực vật. Agrbacterium gồm các lồi A. tumefaciens và A. rhizogenes. A. tumefaciens là vi khuẩn đất gram âm, hình que. Vi khuẩn này cĩ ở họ Rhizobiaceae cĩ khả năng gây u ở thực vật. Nĩ là một plasmid dài vào khoảng 120-150 kb, cĩ tính chất gây u nên gọi là plasmid Ti. Ti bắt nguồn từ chữ đầu của tumer inducing. Cịn A. rhizogenes là plasmid cĩ khả năng gây bệnh rễ tĩc (hairy root) và gọi là plasmid Ri. Ri bắt nguồn từ chữ đầu của root inducing tức là sinh rễ. Kích thước plasmid này tương tự plasmid Ti. Đối với các cây trồng, người ta cĩ thể tạo ra giống mới cũng cĩ những đặc tính mong muốn qua việc chuyển gene. Các gene đĩ cĩ thể từ một cây khơng cĩ quan hệ họ hàng hoặc từ động vật, Cơn trùng, nấm men, hoặc từ các vi sinh vật. Các cây được nhận gene bằng nhiều cách khác nhau nhưng gần đây nhờ hệ thống vi khuẩn Agrobacterium cĩ đặc tính sẵn cĩ trong tự nhiên là chuyển được gene của chúng vào cây cối thơng qua một phần T-DNA của plasmid Ti hoặc Ri. Chính T-DNA của vi khuẩn
37. 34 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung được gắn vào bộ gene của thực vật sẽ làm xuất hiện khối u hoặc rễ tĩc vì chúng chứa oncogene. Hình II.2. Mơ hình plasmid Ti T-DNA cĩ kích thước 25 kb trong đĩ chứa gene mã hĩa cho sinh tổng hợp auxin, cytokinine, opine và các gene gây khối u (oncogene). Trong plasmid Ti, vị trí của T-DNA được giới hạn bằng bờ phải và bờ trái. Ngồi plasmid Ti cịn cĩ các vùng DNA mã hĩa cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lây nhiễm (vùng vir) và chuyển nạp, cho việc tiêu hĩa opine. Trong các vùng DNA của plasmid Ti, ngồi T-DNA được nghiên cứu nhiều hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm cịn gọi là vùng vir. Sản phẩm hoạt động của các gene nằm trong vùng vir được tác động kích thích của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loại protein đặc biệt như vir E2, vir B, vir D, vir D2, vir C1 Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là cây 2 lá mầm), kích thích sinh sản ra các đoạn T-DNA bao bọc che chở các đoạn DNA này và giúp chúng tiếp cận với hệ gene của cây chủ một cách an tồn. Khi cây nhiễm bệnh do T-DNA nạp vào trong hệ gene của cây chủ bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinine và opine, tồn bộ sinh trưởng của cây bị rối loạn, các tế bào phân chia vơ tổ chức và tạo ra các khối u. Opine được vi khuẩn sử dụng như một loại “thức ăn” nhờ gene chuyển hĩa opine trên plasmid Ti. Cơ chế lây nhiễm của A. rhizigenes đối với cây 2 lá mầm cũng tương tự nhưng trong vùng T-DNA của A. rhizogenes chỉ cĩ gene sản sinh ra auxin, vì thế sự thay đổi hình thái chính của thực vật là chúng tạo ra rất nhiều rễ tĩc khi bị nhiễm bệnh.
38. 35 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Trên thực tế bệnh cây, Agrobacterium chỉ gây hại ở cây 2 lá mầm. Vì vậy, người ta cho rằng chúng chỉ cĩ thể nạp T-DNA vào hệ gene các cây 2 lá mầm . Gần đây nhiều tác giả đã chứng minh khi nhiễm vi khuẩn, các cây 1 lá mầm cũng cĩ thể sản xuất opine và cĩ thể khai thác khả năng biến nạp gene của Agrobacterium ở cây 1 lá mầm. Nhưng nếu phần T-DNA bị cắt thì plasmid Ti này vẫn giữ nguyên khả năng chuyển gene lạ vào thực vật. Do đĩ, plasmid Ti hiện nay trở thành một cơng cụ sắc bén theo đặc tính gây u vào các cây trồng. Việc chuyển gene lạ được tiến hành theo những bước sau: * Tách plasmid Ti từ vi khuẩn A. tumefaciens * Cắt bỏ phần T-DNA của plasmid đi * Chuẩn bị gene lạ chứa di truyền mong muốn, chẳng hạn gene độc tố của Bacillus thuringiensis để tiêu diệt sâu bọ hại cây trồng. * Chuẩn bị gene đánh dấu để theo dõi việc chuyển gene lạ vào thực vật cĩ thành cơng hay khơng? Chẳng hạn, gene mã hĩa cho một enzyme cĩ phản ứng màu mà ở thực vật ít cĩ như gene mã hĩa enzyme β- glucuronidase gọi tắt là GUS-A tạo ra màu xanh da trời đặc trưng với cơ chất 5-bromo-4-chloro-3-indolyl, β-galactopyranoside được kí hiệu là X- gluc. Đơi khi người ta sử dụng khả năng đánh dấu của gene mã hĩa luciferase - một enzyme của Đom đĩm phát sáng trong tối ở các mơ được chuyển gene. Cũng cĩ khi sử dụng những gene kháng kháng sinh kanamycine - một chất ức chế sinh trưởng thực vật. * Gắn gene lạ và gene đánh dấu vào plasmid Ti thay thế vào chỗ T- DNA đã bị cắt bỏ rồi đưa vào vi khuẩn Agrobacterium. *Chuẩn bị tế bào vật chủ tiếp nhận vi khuẩn Agrobacterium chứa plasmid cĩ gene lạ như chuẩn bị các protoplast từ các thể mơ, các đĩa lá. * Nuơi cấy chung vật chủ với vi khuẩn A. tumefaciens chứa plasmid Ti gắn gene lạ một thời gian vài ngày ở nhiệt độ ánh sáng thích hợp. * Loại bỏ vi khuẩn bằng dùng các kháng sinh đặc hiệu như carbenicilline. * Chuyển nguyên liệu thực vật vào mơi trường dinh dưỡng nuơi cấy tế bào và mơ để tái sinh cĩ thêm những chất kích thích sinh trưởng như 2,4 D, auxin khác v.v. * Cây tái sinh được nuơi trong vườn ươm và cuối cùng trồng ra đất. * Theo dõi các đặc tính của gene lạ biểu hiện ở cây trồng. Cần chú ý: - Cây được biến đổi di truyền cần phải được trồng trong vài vụ;
39. 36 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung - Cây chủ của vi khuẩn Agrobacterium cĩ thể làm hạn chế sự biến đổi trong nhiều vụ thu hoạch. - Muốn chuyển gene thành cơng cần phải phân tích mở rộng bộ gene thực vật, biết rõ tổ chức phân tử của gene đưa vào và mối quan hệ giữa nĩ với tổ chức cấu trúc di truyền và điều hịa di truyền. Đối với sự chuyển gene thực vật, virus thực vật chứa DNA cũng được coi là vector. Loại virus khảm thực vật của hoa súp lơ (Cauliflower mosaic virus: CaMV) là một ví dụ hấp dẫn. Đĩ là một vector cĩ thể dùng để chuyển gene, vì DNA ngoại lai cĩ thể chuyển vào thực vật qua sự gây nhiễm lá bởi virus. Thêm vào đĩ CaMV cĩ thể nhân lên trong bào tương và loại trừ khả năng gây trở ngại cho các chức phận của tế bào chủ. S.H. Howell và cộng sự năm 1987, đã gài được phân tử linker EcoRI gồm 8 đơi base vào vùng “intergeneic” của virus khảm hoa súp lơ mà khơng làm suy yếu sự lây nhiễm của chúng. Khả năng CaMV như một vector chuyển gene đã được chứng minh bởi Cronenbor và cộng sự khi đưa vào lá củ cải đoạn operator của operon lac E. coli và khi DNA của virus được tách từ những cây bị nhiễm đã thấy chứa đoạn operator lac. CaMV cĩ một số hạn chế: chỉ gây nhiễm cho họ cải như bắp cải, xải xoăn, cải Bauxel. Thứ 2 là chỉ một lượng nhất định DNA ngoại lai được gài vào (khoảng 250 đơi base). Việc dùng hệ vi khuẩn Agrobacterium đã được hàng trăm cơ sở cơng nghiệp và phịng thí nghiệm trên thế giới sử dụng. Chỉ ở Monsanto đã cĩ hơn 45.000 dịng thực vật chuyển gene tự do đã được sản xuất theo kiểu này. Tuy vậy, đối với các cây lúa, ngơ, lúa mì vẫn phải là cây chủ tự nhiên đối với Agrobacterium. Do đĩ, phải đưa DNA ngoại lai vào protoplast thực vật. Song, khả năng này lai tạo được rất thấp và mặt khác lại khơng được nguyên vẹn, phải phá vỏ tế bào để lai ghép. Do đĩ, người ta cĩ một biện pháp đơn giản hơn là tiêm DNA ngoại lai trực tiếp vào tế bào. Song cũng vấp phải một điều là tiêm trực tiếp như vậy khĩ cĩ hiệu quả cao là do: . kim nhỏ dễ gãy và tắc; cơng việc buồn tẻ, tỉ lệ DNA ngoại lai là tổ hợp vào bộ gene tế bào chủ rất thấp. Tiêm khoảng 10.000 tế bào mới hi vọng được 1 tế bào cĩ gene mới để nâng cao hiệu quả tổ hợp gene. Joh Sanford ở trường Đại học Tổng hợp Cornell đã đề nghị dùng biện pháp bắn phá liên tục các nguyên liệu gene vào các tế bào thực vật. Tác giả đã dùng viên đạn kim loại cĩ đường kính 1-2 µ cĩ phủ DNA ngoại lai. Làm tăng nhanh dần tốc độ những viên đạn kim loại này xuyên vào thành tế bào nguyên vẹn và phân tán DNA trong bào tương. Năm 1987, họ đã cải tiến bằng viên đạn bạch kim để bắn vào tế bào thực vật và sau đĩ họ dùng đạn bằng vàng và đẩy đi bởi sự bốc hơi của giọt nước.
40. 37 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Việc bắn DNA vào tế bào tuy chỉ là giai đoạn đầu của việc làm thay đổi cây trồng nhưng trước đĩ phải kết cấu cho được 3 vùng quan trọng của gene. Đĩ là: * Vùng promotor – vùng phát động biểu hiện gene. * Vùng mã hĩa - tạo ra những protein mong muốn để thu hoạch tốt mùa màng. * Vùng poly A (polyadenine hĩa) – vùng tham gia mở đầu sao chép RNA thơng tin. Cơng nghệ gene cũng cĩ khả năng tạo ra những thức ăn trong sạch. Các gene đối với những protein cĩ phẩm chất dinh dưỡng siêu đẳng được tách ra, sau đĩ, gài gene đĩ vào cây. Cây này cĩ thể sản xuất ra những chất hĩa học đặc biệt như tinh bột, dầu cơng nghiệp, các enzyme, các dược chất . Hơn 400 phép thử đồng ruộng của những cây trồng được cơng nghệ hĩa ở Mĩ, châu Âu. Những thử nghiệm đĩ đã xác nhận hiệu quả kinh tế. những cây trồng cĩ dấu hiệu tốt đĩ triển khai ra đồng ruộng từ năm 1990. Tuy nhiên, trong cơng nghệ gene cũng cĩ một số hạn chế như: chỉ cải tiến một số điểm biểu hiện khơng quá 3-5 gene. Một vài cây trồng khơng thích ứng phương pháp chuyển gene hiện hành. Sự tách gene cĩ ích để chuyển cũng cĩ gặp những khĩ khăn nhất định. Việc sử dụng gene trong việc tạo giống mới những cây, hoa, quả, , G. Glili đã dùng vi khuẩn E. coli để chiết xuất lấy gene mã hĩa loại enzyme tổng hợp lysine, sau đĩ đưa vào khoai tây và thuốc lá làm cho khoai tây lượng lysine tăng ở củ 5 lần, ở lá 4 lần và ở thân 3 lần. Người ta cũng đưa 9 acid amin khác vào khoai tây làm cho chất lượng của chúng trở nên quí giá. Ở Mĩ cũng vừa thành cơng những quả cà chua chín mọng mọc trên cành nho. Cà chua loại này ít thối hỏng. Người ta cũng tạo ra bơng cĩ màu sắc tự nhiên bằng CNSH. Ở Pháp mới đây, người ta cũng đã tạo cây bắp cải to cao hơn người bằng thao tác di truyền. Trong 20-30 năm lại đây, CNSH đang làm đổi mới nền nơng nghiệp trên tồn thế giới nhờ kĩ thuật nuơi cấy mơ và tế bào, phương pháp chọn lọc dịng soma, kĩ thuật dung hợp protoplast và đặc biệt sử dụng cơng nghệ gene trong tái tổ hợp DNA, người ta đã đưa vào cây trồng những nguyên liệu di truyền mới, những gene cĩ ích để làm thay đổi cơ bản những lồi cây trồng, tạo ra một loạt các giống mới cĩ năng suất cao, phẩm chất tốt, chống chịu giỏi trong điều kiện bất lợi của mơi trường ở từng khu vực, đã cĩ những hứa hẹn mùa màng tốt đẹp trong hiện tại và khơng ngừng phát triển trong tương lai khơng xa.
41. 38 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Ở nước ta, Đảng và Nhà nước đang quan tâm đến vấn đề khoa học và cơng nghệ, đặc biệt ưu tiên CNSH (nằm trong 4 ưu tiên chung: tin học, CNSH, vật liệu mới và hiện đại hĩa nền cơng nghiệp). Với khoảng 20 triệu lao động nơng nghiệp, cĩ nhiệm vụ sản xuất ra 20-25 triệu tấn lương thực hàng năm, Việt Nam đứng hàng thứ 2, thứ 3 trong xuất khẩu gạo thế giới, muốn làm cho nền nơng nghiệp khơng ngừng tăng lên, việc tạo giống mới cây trồng đặt ra cho các nhà khoa học một nhiệm vụ nặng nề và vinh quang. Dưới đây chúng tơi xin giới thiệu 2 phương pháp tạo giống mới hiện đại để chúng ta tham khảo: Hình II.3. Bằng phương pháp trực tiếp (dùng súng bắn gene) và phương pháp gián tiếp (Agrobacterium) để chuyển gene vào tế bào thực vật 3. CNSH trong việc bảo vệ cây trồng. Hàng ngàn năm nay, người nơng dân luơn luơn thay đổi cây trồng, thay đổi lối canh tác để cĩ những tiến bộ trong thu hoạch. Họ tuyển chọn
42. 39 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung những giống cây trồng ngày càng cĩ năng suất cao phẩm chất tốt hơn. Phẩm chất càng tốt thì đĩ là mĩn ăn ngon lành cho muơn vàn vi sinh vật, sâu bọ. Theo thống kê, sâu bọ gây thiệt hại lớn cho mùa màng khoảng 20- 40%. Năng suất mùa màng càng cao thì thiệt hại càng lớn. Người nơng dân từ xưa đến nay, qua kinh nghiệm thực tế cũng đã cĩ nhiều biện pháp phịng trừ như xới xáo, chăm sĩc bắt sâu bọ, thay đổi vụ trồng hợp lí, trồng thảm xen kẽ, phun thuốc trừ sâu v.v. Riêng nước Mĩ, mỗi năm mất đi 2,5 tỉ USD về thuốc trừ sâu để bảo vệ mùa màng. Nhưng việc sử dụng thuốc trừ sâu bệnh, thuốc trừ cỏ dại (herbicide), ví dụ, thuốc trừ nấm chỉ được phun trừ sâu trên các vùng trồng chuối ngọt (sweet banana) nơi chỉ sản xuất khoảng 10% sản lượng chuối để đưa vào thị trường quốc tế, 90% sản lượng chuối cịn lại là chuối bột (platain), một trong các nguồn lương thực của nhiều nước nhiệt đới thì chủ yếu trồng ở các qui mơ gia đình rải rác. Vì vậy khĩ sử dụng thuốc trừ nấm và giá thành khơng kinh tế. Hơn nữa thuốc trừ sâu bệnh đã để lại hậu quả khơn lường, người bị ngộ độc, thậm chí ung thư, động vật cĩ thể chết. Vì vậy, cơng tác bảo vệ cây trồng theo hướng CNSH là tốt hơn cả. Người ta đã nuơi cấy đỉnh sinh trưởng của khoai tây, dâu tây, khoai mỡ (Yam) cịn gọi là khoai Ấn Độ, để làm sạch virus. Nuơi cấy đỉnh sinh trưởng cũng giúp tạo ra các giống sắn sạch bệnh. Kĩ thuật nuơi cấy mơ in vitro cũng giúp giải phĩng cây sừa khỏi bệnh virus và Mycoplasma rất nghiêm trọng đối với dừa, chà là (Date palm), kháng bệnh hoặc ít nhiễm bệnh nấm hoa từ nhân vơ tính, đặc biệt là chống chịu bệnh bayoud do nấm (Fusarium oxyporum f-sp-albidinis) gây ra là bệnh gây tổn thất nghiêm trọng cho chà là. Viện IRAT (Institute de Recherches Agronomiques Tropicales et des Cultures vivrieres: Viện Nghiên cứu Nơng nghiệp nhiệt đới và Các cây lương thực) của Pháp đã xây dựng được phương pháp cấy tác nhân gây bệnh vào cây con đang tái sinh từ callus, Việc sàng lọc các tế bào của những cây con này cĩ thể cho phép phân lập được các dịng kháng bệnh, kháng 3 loại bệnh quan trọng: sinut, ieafscala và bệnh rỉ sắt. Tương tự như vậy, người ta cĩ thể tách được các dịng tế bào kháng mặn, kháng phèn và độc tố của nấm (Helminthosporium sacchari). Các kết quả nghiên cứu của CENA (Centre de Nuclear Energy in Agriculture) và CEBTEC (Divisão de Biotechnology de Plantas et Centro de Biotechnologia Agricola) ở Brazil cho thấy dung hợp protoplast cây Mía cĩ thể giúp chuyển gene kháng thuốc trừ sâu cĩ từ dịng mía này qua dịng mía khác. Từ năm 1985, ở phịng Hiển vi Điện tử của CENA đã bắt đầu chương trình nghiên cứu cấy chuyền gene kháng bệnh khuẩn và virus vào tế bào cây trồng, sau đĩ tách protoplast và dung hợp chúng trong điện trường.
43. 40 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Ở Mexico, các tác giả Merino và Madrigal ở trường Đại học Chapingo cộng tác với các nhà nghiên cứu của Đại học Purduc (Mĩ) đã thử tách các dịng biến dị kháng 2 nịi rỉ sắt đang gây hại ở châu Mĩ Latinh trên đối tượng cây cà phê. Dung hợp protoplast đã giúp cho cà phê kháng bệnh và người ta cũng đã dùng độc tố do nấm này tiết ra để dưa vào mơi trường nuơi cấy nhằm chọn các dịng tế bào kháng độc tố. Ngày nay cơng nghệ gene đã được dùng để tạo các giống cây chống các bệnh virus, đề kháng các cơn trùng cĩ hại, tạo giống mới chống cỏ dại, chống hư hại mùa vụ cây trồng. Roger Beachy trường Đại học Tổng hợp Washington và Stephen Roger ở Monsanto đã áp dụng cơng nghệ gene cấu trúc nên một vector gene để dưa vào cây thuốc lá và cây cà chua một protein phủ mặt ngồi của virus khảm thuốc lá (tobacco mosaic virus: TMV). Những cây đĩ đã được đối kháng rất mạnh mẽ với nhiễm trùng và như vậy xác định giả thuyết ban đầu của Beachy là đúng - một thành phần đơn giản của virus cĩ thể sử dụng để bảo vệ được sự tấn cơng của virus. Ngày nay, sự biểu hiện một protein phủ mặt ngồi của virus nào đĩ cĩ thể sử dụng để chống virus đĩ ở thực vật đã trở thành một cơ chế chung để bảo vệ cây trồng khỏi bệnh virus. Trong vịng 30 năm qua, người nơng dân và các nhà làm vườn tin tưởng về vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) vì chúng sản xuất ra protein chống Cơn trùng. Vi khuẩn này đã làm chết hàng loạt sâu tơ, Sâu rĩm ở vùng Thuringi. Các chế phẩm Bt đặc hiệu cao với các cơn trùng thuộc lồi bướm. Cơ chế hoạt động phân tử Bt như sau: protein Bt liên kết với những proceptor đặc hiệu được khu trú trên màng ruột của những cơn trùng gây hại. Sự liên kết đĩ gây cản trở cho dịng vận chuyển ion vào trong tế bào biểu mơ ruột và như vậy làm mất khả năng ăn uống dinh dưỡng của cơn trùng. Những thuốc trừ sâu thiên nhiên này khơng gây độc hại cho người và động vật, thậm chí ngay cả các lồi cơn trùng khác. Mặt khác, tính chất cĩ ích của thuốc trừ sâu Bt thường bị hạn chế vì dễ dàng bị rửa sạch khỏi cây, nhưng hiệu quả của chúng trên đồng ruộng thường được kéo dài. Giữa những năm 1980, cơng nghệ gene của một vài hãng lớn như hãng Hệ thống gene thực vật ở Belgium, hãng Di truyền Nơng nghiệp ở Middleton v.v. đã thành cơng trong việc tách rời các gene vi khuẩn mã hĩa các protein thuốc trừ sâu. Họ đã dùng súng cĩ Agrobacterium tumefaciens được gắn những gene tách nĩi trên để bắn vào khoai tây, và chua và bơng. Lúc đầu những gene này biểu hiện nghèo nàn. Những protein Bt được cây trồng sản xuất ra chỉ giết được những cơn trùng phịng thí nghiệm nhạy cảm.
44. 41 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung Các nhà khoa học ở Monsanto như David Fichhoff và Frédrick Perlak đã cải tiến. Họ xem xét kĩ lại gene vi khuẩn nguyên thủy để bắt chước chặt chẽ hơn đoạn DNA thực vật. Một sự cải tiến nhỏ đĩ đã làm tăng lên sự kiểm tra cơn trùng một cách mạnh mẽ. Hai năm thử nghiệm trên đồng ruộng đã xác định rằng sự cĩ mặt của các gene Bt đĩ trong cây bơng đã kiểm tra một cách cĩ hiệu quả tất cả những hư hại của đại bộ phận các lồi bướm sâu bao gồm các màng trứng của chúng. Những cây bơng được thực hiện cơng nghệ gene đĩ đã làm giảm hẳn việc sử dụng thuốc trừ sâu từ 40 đến 60%. Các nhà khoa học đã sàng lọc một cách mở rộng đối với những dịng Bacillus thuringiensis tự nhiên. Những dịng đĩ cĩ hiệu quả trên các cơn trùng khác hơn là lồi bướm. Họ đã chọn được một dịng cĩ một gene cĩ hiệu quả chống lại lồi gián cánh cứng phá hoại khoai tây: Colorado. Mùa xuân năm 1991, Russet Burbank đã ghép gene kiểm tra lồi cánh cứng này trên khoai tây và đã thử một vài nơi ở Maine và Oregon. Khoai tây miễn dịch được lồi cánh cứng này. Các nhà khoa học ở tổ hợp Mycogene San Diego đã phát hiện một gene Bt chồng Giun trịn kí sinh thực vật và một gene chống Muỗi. Hiện nay đang cố gắng sản xuất protein trừ Muỗi (mosquitocidal protein) ở Tảo để sử dụng vào biện pháp chống sốt rét. Tính đặc hiệu của protein Bt và sự khu trú của nĩ trong các mơ nĩi trên là protein này chỉ chống lại bọn Cơn trùng tấn cơng. Protein khu trú nội bào này chắc chắn khơng bị rửa sạch và thuộc loại thuốc trừ sâu an tồn nhất. Bên cạnh việc đề kháng virus, Cơn trùng gây hại các cây trồng cịn phải chống đối các lồi cỏ dại. Cỏ dại làm giảm sản lượng mùa màng cĩ khi tới 70%. Trước đây người ta phối hợp thuốc diệt cỏ với việc làm cỏ để hạn chế cỏ dại. Vì trong thuốc diệt cỏ cĩ phổ hạn chế trong hoạt động, nĩ chỉ gây ảnh hưởng rất nhỏ đối với cỏ dại. Cơng nghệ gene cĩ thể dùng để kiểm tra một cách hữu hiệu cỏ dại. Vấn đề là ở chỗ tạo ra cho cây trồng cĩ thể sản xuất thuốc trừ cỏ dại với phổ rộng, đơn giản và an tồn cho mơi trường. Nếu sử dụng được cơng nghệ vào cho cây trồng sẽ làm cho nơng nghiệp giảm một lượng lớn thuốc trừ cỏ dại. Cĩ 3 hướng cơng nghệ để tạo ra thuốc trừ cỏ dại: * Các nhà nghiên cứu ở Monsanto, Calgene, California đã dùng thuốc trừ cỏ dại tên là Roundup. Roundup là thành phần phổ rộng trừ cỏ dại lá to và mọc dày. Roundup ức chế hoạt động enzyme tổng hợp EPSP – enzyme này tham gia vào việc tạo acid amin thơm cần cho sự sinh trưởng
45. 42 Simpo PDF Merge and Split Unregistered Version - CNSH phục vụ nơng lâm ngư nghiệp Trương Văn Lung của cỏ dại. Roundup khơng làm ảnh hưởng tới động vật (động vật khơng tiến hành tạo acid amin thơm). Hơn nữa, Roundup lại thĩai hĩa nhanh chĩng trong mơi trường để trở thành vơ hại. Năm 1983, Luca Comai và David Stalker ở Calgene, Roger và Ganesh Kishore ở Monsanto đã tách được gene của enzyme tổng hợp EPSP từ vi khuẩn và cây trồng. Sau đĩ các nhà khoa học đã tạo những gene đã sản xuất ra lượng protein đĩ lớn hơn lên trong cây trồng rồi đưa vào cà chua, đậu, bơng, cải dầu, và một số cây khác, các cây trồng cĩ thể trừ được cỏ dại một cách cĩ hiệu quả. * Các nhà nghiên cứu ở Du Pont đã dùng kĩ thuật nghiên cứu tương tự để tiến hành cơng nghệ gene hĩa những cây trồng cĩ thể khơng dùng thuốc diệt cỏ sulffonylurea. * Các nhà khoa học ở Hệ thống di truyền thực vật và hãng Hoechst - Đức đã cĩ hướng tìm kiếm khác để loại trừ thuốc diệt cỏ. Từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus đã tách ra một gene để enzyme đĩ ức chế chất diệt cỏ được gọi là Basta. Basta ảnh hưởng tới việc tổng hơp glutamine của enzyme trong cỏ dại và làm cho cỏ dại khơng lớn lên được. Nhưng trước khi gây hại, cĩ thể xảy ra ở những cây trồng cĩ gene làm ức chế Basta. Trong bảo vệ quả ít bị hư hại, cơng nghệ gene cũng đang phát huy tác dụng. Người ta đã xác định và tách một số gene đĩng vai trị trong sinh tổng hợp ethylene - một phân tử liên quan đến sự chín của hoa quả. Sự chín kéo chậm lại để kịp thu hoạch và tạo mùi tốt hơn làm phẩm chất tăng lên. Cĩ 2 phương pháp di truyền để tăng nguồn thu hoạch quả. Một là gài đoạn dịch mã antisen của gene chín để liên kết với RNA thơng tin làm tắt gene. Athanosios theologis ở California và Don Grierson trường Đại học Tổng hợp Nottingham đã chứng minh rằng, các quả Cà chua cĩ những gene antisen đã chống sự làm mềm. Thứ hai là đưa gene vào để tạo enzyme làm thĩai hĩa thành phần tiền chất hình thành ethylene, như vậy sẽ làm chậm sự chín và hư hỏng (cơng trình của Kishora và Harry Klee ở Monsanto). Gần đây các nhà khoa học Mĩ cấy vào cây 1 gene vi khuẩn sản sinh ra 1 chất chitinase tiêu diệt các tế bào của nấm (cấy vào cà chua, khoai tây, rau diếp và các giống cây tương tự nhưng chưa làm được đối với lúa, lúa mì, ngơ và các cây cĩ hạt khác). Ngồi CNSH ra, hiện nay người ta cịn dùng 1 số biện pháp sinh học để thay thế thuốc trừ sâu hĩa học như; nuơi ong mắt đỏ để diệt Sâu đay, dùng hạt cây sầu đâu để diệt gần 2000 lồi sâu hại (trong sầu đâu cĩ azadirachitine cĩ tác dụng diệt cơn trùng mạnh). Ấn Độ đã xây dựng nhà