›
›

Công nghệ Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng của CNSH động vật, người và y sinh

pdf 208 trang vanle 2921
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Công nghệ Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng của CNSH động vật, người và y sinh", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfcong_nghe_sinh_hoc_chuong_iii_cac_phuong_phap_va_ung_dung_cu.pdf

Nội dung text: Công nghệ Sinh học - Chương III: Các phương pháp và ứng dụng của CNSH động vật, người và y sinh

  1. CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƢƠNG (SH3014) Giảng viên: BM CNSH TV – Khoa CNSH 1
  2. CHƢƠNG III: CÁC PHƢƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG CỦA CNSH ĐỘNG VẬT, NGƢỜI VÀ Y SINH (8 TIẾT) 3.1. Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật 3.2. Công nghệ tế bào gốc 3.3. Công nghệ nhân bản động vật 3.4. Kỹ thuật chuyển gen vào tế bào động vật 3.5. Công nghệ vacxin tái tổ hợp và sản xuất kháng thể đơn dòng 3.6. Dự án genom ngƣời và các ứng dụng 3.7 Công nghệ hỗ trợ sinh sản BM CNSH TV – Khoa CNSH 2
  3. 3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (kiến thức cần nhớ) Đặc điểm của tế bào động vật 10-100 microns Có hình cầu trong dung dịch Không có thành tế bào Màng plasma mỏng, dễ vỡ và dễ bị biến đổi Bề mặt tích điện âm Sinh trƣởng trên bề mặt tích điện dƣơng ví dụ: Collagen • BM CNSH TV – Khoa CNSH 3
  4. 3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (kiến thức cần nhớ) G1 Phase: ·Tế bào bƣớc vào pha tổng hợp hoặc ·Thoát khỏi chu kỳ tế bào để tiến hành phân hoá (reversible or irreversible) ·Các tế bào rất nhạy cảm để tác động điều khiển ở thời điểm này S Phase: Tổng hợp DNA • G2 Phase: Tế bào chuẩn bị cho nguyên phân Mitosis Chu kỳ tế bào BM CNSH TV – Khoa CNSH 4
  5. 3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 3.1.1 KHÁI NIỆM Là nuôi cấy mô, tế bào tách rời khỏi cơ thể nếu đƣợc đặt trong môi trƣờng đảm bảo dinh dƣỡng và nhiệt độ thích hợp thì tế bào sẽ sống và tiếp tục phân chia. Quá trình có thể diễn ra liên tục nếu sau từng thời gian nhất định tiến hành rửa và bổ sung dung dịch nuôi cấy mới. Các mô, tế bào động vật hay sử dụng trong nuôi cấy: phôi ngƣời, phôi gà, thận khỉ, phôi lợn, màng ối ngƣời 3.1.2 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY • NUÔI CẤY CƠ QUAN • NUÔI CẤY MÔ • NUÔI CẤY TẾ BÀO BM CNSH TV – Khoa CNSH 5
  6. 3.1 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Nuôi cấy cơ quan (Organ Culture): là quá trình nuôi cấy toàn bộ phôi, cơ quan hoặc mô đƣợc cắt ra khỏi cơ thể bằng giải phẫu mẫu sống (vivisection) hoặc ngay sau khi não dừng hoạt động . Đặc điểm: Kiến trúc và các chức năng sinh lý bình thƣờng đƣợc duy trì. Các tế bào vẫn ở trạng thái phân hóa (fully differentiated). Tốc độ sinh trƣởng chậm. Cần mẫu tƣơi cho mỗi lần thí nghiệm. Hạn chế khi nuôi cấy trên quy mô lớn. Nuôi cấy mô (Tissue Culture): Nuôi cấy những mẩu cắt ra từ các mô cắt rời Đặc điểm: Một số chức năng bình thƣờng có thể vẫn đƣợc duy trì. Tổ chức ban đầu của mô bị phá huỷ. Có thể ứng dụng cho nuôi cấy quy mô lớn BM CNSH TV – Khoa CNSH 6
  7. 3.1 PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT Nuôi cấy tế bào (Cell Culture): Mô hoặc một phần của mẫu đƣợc làm tan rã ra, chủ yếu là bằng xử lý enzyme, thành dịch huyền phù tế bào. Nguồn nguyên liệu này đƣợc sử dụng cho nuôi cấy đơn lớp hoặc nuôi cấy huyền phù. Đặc điểm: Phát triển dòng tế bào qua một số thế hệ Có thể nuôi cấy trên qui mô lớn Các tế bào có thể bị mất đi một số đặc tính phân hoá. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 7
  8. NUÔI CẤY ĐƠN LỚP Ƣu điểm: Dễ dàng thay đổi môi trƣờng và rửa tế bào trƣớc khi bổ sung môi trƣờng mới Các tế bào liên kết nhau thể hiện dễ dàng hơn Linh hoạt (Flexible) và có thể sử dụng đối vơi tất cả các loại tế bào Nhƣợc điểm: Khó triển khai trên qui mô lớn Cần nhiều không gian hơn so với nuôi cấy huyền phù Khó định lƣợng các thông số cho mẫu để điều khiển sự sinh trƣởng tế bào Việc đo Oxygen và pH gặp khó khăn BM CNSH TV – Khoa CNSH 8
  9. Nuôi cấy các tế bào phát triển theo kiêu liên kết bám dính (Anchorage Dependent Cultures) Đặc điểm: - Sự nhân lên của các tế bào liên kết bám dính chỉ có thể xảy ra khi tạo đƣợc bề mặt nuôi cấy phù hợp. - Quá trình liên kết của các tế bào liên quan một loạt các bƣớc: • Sự bám của các yếu tố dinh kết với bề mặt nuôi cấy (Cold insoluble globulin or other attachment glycoproteins) • Sự liên kết giữa tế bào với bề mặt nuôi cấy • Sự dính kết các tế bào với bề mặt đƣợc bao phủ. (các chất heparan sulfate đa dạng được tổng hợp bởi tế bào ) • Sự phát triển lan rộng của các tế bào đã liên kết - Bề mặt nuôi cấy phải có tính hút nƣớc và đƣợc tích điện tối ƣu trƣớc khi qúa trình dính kết xảy ra. BM CNSH TV – Khoa CNSH 9
  10. NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO Đặc điểm: Có khả năng sinh trƣởng và phân hoá mà không cần quá trình gắn kết các tế bào với nhau. Có thể sử dụng các thiết bị nuôi cấy trên qui mô lớn Spinner Flasks, Stirred-Tank Bioreactors, Air lift Bioreactors BM CNSH TV – Khoa CNSH 10
  11. Phƣơng pháp nuôi cấy BM CNSH TV – Khoa CNSH 11
  12. Một số khái niệm dòng tế bào Dòng tế bào (Cell Lines) – là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu Dòng tế bào liên tục (Continuous Cell Lines) –là dòng tế bào nuôi cấy trong điều kiện in vitro qua nhiều thế hệ và có khả năng duy trì khả năng phân bào trong thời gian rất dài hoặc vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 12
  13. Sự sinh trƣởng của tế bào nuôi cấy BM CNSH TV – Khoa CNSH 13
  14. Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật BM CNSH TV – Khoa CNSH 14
  15. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Thành phần : các muối vô cơ, pH dinh dƣỡng, các chất đệm Hầu hết tế bào sinh trƣởng tốt ở (phenol red). pH 7.4 Một số fibroblasts cần pH 7.4-7.7 Các muôí vô cơ (Na, K, Ca, Mg, Cl, P), vi lƣợng (iron, zinc, Các tế bào biến nạp pH 7.0-7.4 selenium), Đƣờng (glucose là Các tế bào Epidermal đôi khi cần phổ biên nhât), Axit amin, vitamin pH 5.5 Huyết thanh Sử dụng chỉ thị Phenol Red Kháng sinh – Có mầu tím ở pH 7.8 – Mầu hồng ở pH 7.6 – Mầu đỏ ở pH 7.4 – Da cam ở pH 7.0 – Vàng ở pH 6.5 BM CNSH TV – Khoa CNSH 15
  16. Ví dụ về nuôi cấy mô não chuột
  17. ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT • Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh • Sản xuất các hợp chất sinh học + Vacxin virus + Hoạt chất sinh học + Interferon + Kháng thể đơn dòng • Tạo các nguyên liệu cấy ghép • Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy • Sản xuất các virus diệt côn trùng +Bacolovirus BM CNSH TV – Khoa CNSH 17
  18. 3.2 CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GỐC 3.2.1 KHÁI NIỆM Là các tế bào có khả năng phân chia liên tục trong nuôi cấy và phát triển thành các tế bào chuyên hoá. 3.2.2 ĐẶC TRƢNG CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO GỐC – có khả năng tự tái tạo mới – có thể biệt hoá thành những tế bào và tổ chức chuyên biệt đảm nhiệm những chức năng đặc biệt. – có thể phân lập và duy trì đƣợc ở trạng thái chƣa bịêt hoá. – có thể tăng sinh và biệt hoá khi đƣợc chuyển vào động vật có hệ thống miễn dịch đã bị tổn thƣơng. BM CNSH TV – Khoa CNSH 18
  19. PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo tiềm năng biệt hóa) • 1 2 3 Tế bào hợp tử và các TB phôi ở giai TB có khả năng các tế bào phôi ở đoạn tiếp sau giai phân hóa thành một giai đoạn 4-8 tế đoạn nêu trên (nút loại hay một họ các bào. phôi và dưỡng TB chuyên hóa xác Có thể phát triển phôi). Phân hóa định thành cơ thể hoàn thành các TB vài chỉnh tiềm năng TB đa tiềm năng TB vài tiềm năng (TB mầm) TB toàn năng BM CNSH TV – Khoa CNSH 19
  20. Day 3-4 Day 1 Multi-cell embryo Fertilized egg Day 5-6 Day 11-14 Blastocyst Tissue Differentiation
  21. PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo nguồn gốc) Tế bào gốc phôi (Embryogenic Stem Cells) Tế bào gốc trƣởng thành (Adult/Mature Stem Cells) BM CNSH TV – Khoa CNSH 21
  22. ĐẶC ĐiỂM CỦA ASC VÀ ESC Tế bào gốc trƣởng thành Tế bào gốc của phôi/ bào thai có mặt trong nhiều tổ chức của cơ thể chỉ có ở một số vị trí, trong một số tổ mặc dù với một số lƣợng rất ít. mature body tissues, umbilical cord, chức nhất định của phôi, phôi nang và placenta bào thai có khả năng biệt hoá thấp hơn và chỉ có thể tạo nên những cụm tế bào có sản xuất ra những tế bào đặc hiệu thể biệt hoá tự nhiên tạo ra nhiều cho loại tổ chức cội nguồn của loại tế bào (toàn năng, đa năng). chúng. Đƣợc phân lần đầu năm 1960s Phân lập lần đầu năm 1998 Đã áp dụng trị liệu thành công trên Chỉ nên áp dụng trên động vật bệnh nhân BM CNSH TV – Khoa CNSH 22
  23. TẾ BÀO GỐC PHÔI Có hai loại: * Tế bào gốc bào thai (ES embryonic stem cell) lấy từ khối tế bào nội phôi * Tế bào mầm bào thai(EG embryonic germ cell) lấy từ rãnh sinh dục của bào thai ES phân chia 300-450 lần/2 năm EG 40-80 lần /2năm BM CNSH TV – Khoa CNSH
  24. NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI phôi thụ tinh in vitro phôi nạo BM CNSH TV – Khoa CNSH
  25. NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI chuyển nhân soma BM CNSH TV – Khoa CNSH
  26. ƢU ĐiỂM CỦA TẾ BÀO GỐC PHÔI •Có thể tạo thành tất cả các loại tế bào trong cơ thể •Nếu lấy từ phôi nhân bản không có phản ứng đào thải của hệ miễn dịch •Có thể duy trì thời gian dài trong nuôi cấy BM CNSH TV – Khoa CNSH
  27. HẠN CHẾ CỦA TẾ BÀO GỐC PHÔI •Nếu lấy từ IVF, có thể bị đào thải •Khó điều khiển quá trình phân hoá •Yêu cầu nhiều bƣớc trung gian để định hƣớng sinh ra loại tế bào mong muốn BM CNSH TV – Khoa CNSH
  28. TẾ BÀO GỐC TRƢỞNG THÀNH Có nhiều trong tổ chức của động vật và ngƣời: não, tuỷ xƣơng, máu, tuỷ răng, tuỷ sống, võng mạc, gan BM CNSH TV – Khoa CNSH
  29. TẾ BÀO GỐC TRƢỞNG THÀNH • Mục đích: –Chữa và điều trị bệnh –Khai thác khả năng tự sửa chữa của gen • Ứng dụng: –Bệnh nhân có thể dùng tế bào gốc của bản thân để trị bệnh. –Không cần tìm ngƣời hiến tƣơng thích (Giống trƣờng hợp cấy ghép nhƣng không bị đào thải) BM CNSH TV – Khoa CNSH
  30. • Không có quá trình thụ tinh • Đƣợc nuôi sống trong đĩa petri giống nhƣ các loại tế bào khác BM CNSH TV – Khoa CNSH
  31. Từ các mô trƣởng thành
  32. Nguồn cung cấp tế bào gốc trưởng thành Từ mô dây rốn & nhau thai
  33. Khả Năng Phân Hoá của ASC
  34. Ví dụ bệnh bạch cầu
  35. ƢU ĐiỂM CỦA ASC • Có thể nuôi cấy ngoài cơ thể làm nguồn tế bào cung cấp cho cấy ghép. • Sự đào thải cơ quan hoặc mô đƣợc hạn chế nếu bệnh nhân đƣợc tiếp nhận chính tế bào của mình • Có khả điều khiển để kích thích sự sinh trƣởng của các loại tế bào chuyên hóa BM CNSH TV – Khoa CNSH
  36. NHƢỢC ĐIỂM CỦA ASC Thời gian duy trì trong nuôi cấy ngắn Khó phân lập và tách chiết Chỉ phân hoá thành một số loại tế bào chuyên hoá Không phổ biến, hầu nhƣ rất hiếm ở ngƣời cao tuổi Sự phát triển và tăng trƣởng cần đƣợc định hƣớng khi cấy vào cơ thể nhận. Khả năng bị đào thải nhƣ một mô lạ là khá cao Sự nhiễm bởi viruses, bacteria, fungi, and Mycoplasma. BM CNSH TV – Khoa CNSH
  37. • Còn đang đƣợc nghiên cứu: “vì sao có tế bào gốc không biệt hoá trong khi các tế bào lân cận đã biệt hoá”? • Có bao nhiêu loại? Có ở tổ chức nào? • Có khả năng biệt hoá đa năng không? • Chƣa biết các tế bào gốc nuôi cấy in vitro (ngoài phôi) có thể hiện đầy đủ các chức năng nhƣ tế bào tự nhiên hay không • Các tế bào gốc cần đƣợc cho phân hóa thành tế bào thích hợp trƣớc khi dùng để trị bệnh. • Gần đây đã phát hiện một số bất thƣờng về số lƣợng và cấu trúc của nhiễm sắc thể trong ba dòng ESC của ngƣời.
  38. 1968, cấy ghép thành công tế bào tuỷ cho bệnh nhân bị suy giảm hệ thống miễn dịch (SCID-Severe combined immunodeficiency) Từ 1970’s, cấy ghép tuỷ đƣợc ứng dụng để chữa bệnh immunodeficiencies và leukemias (bạch cầu)
  39. • 1954 – John Enders nhận giải thƣởng Nobel về y tế về công trình nuôi cấy virus bại liệt trong tế bào thận của ngƣời • In 1998, James Thomson (University of Wisconsin-Madison) phân lập đám tế bào lớp trong của phôi non và phát triển dòng tế bào gốc phôi ngƣời đầu tiên. • 1998, John Gearhart (Johns Hopkins University) phát triển tế bào mầm thai từ các tế bào trong các mô sinh dục của thai (Tế bào mầm nguyên thuỷ-primordial germ cells). • Các dòng tế bào đa tiềm năng(Pluripotent stem cell “lines”) đƣợc phát triển từ hai nguồn trên
  40. • 2001 – phôi ngƣời lần đầu tiên đƣợc nhân dòng (chỉ nhân đến giai đoạn 6 tế bào) bởi Advanced Cell Technology (USA) • 2004* – First human cloned blastocyst created and a cell line established (Korea) *Hwang, W.S., et al. 2004. Evidence of a Pluripotent Human Embryonic Stem Cell Line Derived from a Cloned Blastocyst. Science 303: 1669-1674.
  41. KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC 1 Trong nghiên cứu cơ bản 2 Thử nghiệm về an toàn dƣợc phẩm 3 Tế bào trị liệu BM CNSH TV – Khoa CNSH
  42. Trong nghiên cứu cơ bản • Tìm hiểu các tác nhân tham gia vào quá trình xác định hƣớng biệt hóa của tế bào, Trong quá trình này sự đóng mở các gen có vai trò quyết định • Nắm đƣợc cơ chế điều khiển các gen biệt hóa sẽ góp phần quan trọng trong việc phòng và chữa các bệnh do rối loạn chức năng của các gen này ( ƣng thƣ, sự phát sinh các dị tật ) • Là cơ sở cho việc điều khiển một tế bào qua thao tác gen phát triển thành một cơ thể BM CNSH TV – Khoa CNSH
  43. Thử nghiệm về an toàn dƣợc phẩm • Các TB đa tiềm năng là đối tƣợng quan trọng để thử nghiệm về an toàn dƣợc phẩm in vitro và in vivo Nghiên cứu Tìm hiểu đƣợc cơ chế, hiệu quả và những tác động Dƣợc phẩm không mong muốn của dƣợc phẩm thử Nuôi cấy nghiệm đối với cơ thể biệt hóa Mô, sống cơ quan BM CNSH TV – Khoa CNSH
  44. Tế bào trị liệu Bệnh gây nên do rối loạn chức năng tế bào, sự 1 thoái hóa các tế 2 bào mô cơ thể Kích thích các tế Thay thế các cơ bào đa tiềm năng quan lấy từ cơ thể phát triển thành tế khác bào chuyên biệt, Nguồn cung hạn cấy các tế bào này chế vào cơ thể Có triển vọng lớn nhưng cần phải nắm rõ các sự kiện diễn ra trong quá trình biệt hóa, để đinh hướng sự biệt hóa.Vượt qua hàng rào miễn dịch của cơ thể.
  45. TẾ BÀO TRỊ LiỆU • Tế bào trị liệu –Sử dụng tế bào gốc tạo máu: –Sử dụng tế bào gốc phôi thai: • Điều trị đái tháo đường • Tái tạo hệ thống thần kinh bằng tế bào gốc • Điều trị bệnh lý tim mạch • Điều trị thực nghiệm bằng gen BM CNSH TV – Khoa CNSH
  46. SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC MÁU • Điều trị bệnh của cơ quan tạo máu và các cơ quan khác –Ung thư máu: chiếu xạ hoặc hoá chất phá hỏng tế bào tạo máu rồi thay thế tế bào gốc tạo máu. –Tế bào gốc tạo máu có tác dụng điều trị nhiều bệnh ung thư khác: ung thư phổi, tuyến tiền liệt, ung thư vú có khả năng chống khối u, tế bào bệnh lý. BM CNSH TV – Khoa CNSH
  47. SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC THAI • Sử dụng tế bào gốc bào thai: điều trị các bệnh của các tổ chức khác nhau: tế bào gốc (tế bào mầm bào thai) tế bào chuyên biệt: bệnh parkinson, đái đƣờng, bệnh tim mạch, bệnh sƣng khớp. – Bệnh đái tháo đƣờng: tế bào gốc có thể sinh ra tế bào beta sản xuất insulin. – Parkinson: tế bào gốc biệt hoá thành tế bào sản xuất dopamin, các tế bào này có thể thiết lập lại hệ thần kinh trung ƣơng. – Tim mạch: Thay thế tế bào cơ tim tổn thƣơng: tế bào gốc sẽ phát triển thành tế bào nội mạc mạch máu và tế bào cơ trơn tạo thành mạch máu. đây là hai loại tế bào quan trọng cấu trúc lên cơ tim. BM CNSH TV – Khoa CNSH
  48. Triển vọng ứng dụng của công nghệ tế bào gốc
  49. Thần kinh-Neural Võng mạc-Retinal Xƣơng-Bone Sụn-Cartilage Biểu mô -Epithelial
  50. Ví dụ bệnh tiểu đường
  51. 3.3 CÔNG NGHỆ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT (Kỹ thuật cloning) 3.3.1 KHÁI NIỆM Sử dụng nhân của tế bào sinh dƣỡng (tế bào soma) và tế bào trứng đã loại bỏ nhân để tạo phôi vô tính trong ống nghiệm. Sau đó cấy phôi này vào tử cung của con cái để nuôi phôi vô tính thành cơ thể hoàn chỉnh. Nhân bản vô tính động vật thành công đã chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào động vật. 3.3.2 CƠ SỞ KHOA HỌC • SỰ BIỆT HÓA • SỰ PHẢN BIỆT HÓA • TÍNH TOÀN NĂNG CỦA TẾ BÀO BM CNSH TV – Khoa CNSH 53
  52. SỰ BIỆT HÓA Ở động có vú, sau khi trứng đƣợc thụ tinh sẽ phân chia liên tục và biệt hóa theo một hƣớng xác định để đầu tiên tạo nên phôi và sau đó tạo nên tất cả các loại tế bào của động vật trƣởng thành. Trong thời gian từ trứng thụ tinh - hợp tử - trở thành một cơ thể trƣởng thành, có 2 quá trình diễn ra song hành: Sinh trƣởng Phát triển là quá trình tăng không thuận nghịch số là quá trình biến đổi về chất trong tế lượng và kích thước tế bào: từ 1 tế bào bào dẫn tới sự thay đổi về hình thái, ban đầu chúng sẽ phân chia nguyên chức năng của tế bào. Qúa trình này nhiễm liên tiếp: 1 tế bào 2 tế bào thực chất là sự biến đổi các tế bào 4 tế bào 8 tế bào 16 tế bào phôi sinh ban đầu giống nhau thành .vv 200 tỷ tế bào. Cơ thể con các tế bào chuyên hóa của các mô người có tới 200 tỷ tế bào nhưng gần cơ quan khác nhau. Thí dụ như tế như tất cả đều có số lượng và chất bào thận, tế bào gan, tế bào máu lượng gen giống nhau. Qúa trình này còn đƣợc gọi là biệt hóa hay phân hóa. BM CNSH TV – Khoa CNSH 54
  53. SỰ PHẢN BIỆT HÓA là sự trở về trạng thái phôi sinh của các tế bào đã biệt hoá rồi từ đấy lại tái biệt hóa theo định hƣớng khác Thực vật Động vật khi nuôi cấy mô tế bào trong môi Khác với thực vật, các tế bào đã biệt hóa của động trường nhân tạo, từ các tế bào đã phân vật rất khó phản biệt hóa để trở về dạng tế bào hóa như ở mô lá, mô thân lại có thể phôi sinh ban đầu và phân hóa tiếp theo định phản phân hóa trở về dạng tế bào ban hướng khác. Chính vì thế công trình nhân bản đầu rồi từ đấy lại phân hóa tiếp tục theo thành công một con cừu từ nhân của tế bào tuyến định hướng khác. Thí dụ, từ mô lá có vú (tế bào thân thể đã biệt hóa) đã chức minh thể tái sinh thành rễ, chồi. được tế bào động vật còn có khả năng phản phân hoá. BM CNSH TV – Khoa CNSH 55
  54. TÍNH TOÀN NĂNG Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO tế bào hợp tử Trƣớc 1997 tế bào phôi ở giai đoạn sớm Năm 1997, J.Wilmus và cộng sự Viện Roslin đã tạo ra chú cừu Dolly. Thành công này khẳng định học thuyết về tính 1997 (cừu Dolly) toàn năng của tế bào không chỉ thể hiện ở thực vật mà còn ở cả động vật. Hiện nay việc ứng dụng tính toàn năng của tế bào động vật thông Ngày nay qua sử dụng tế bào gốc trong y sinh học trị liệu – hƣớng mới trong CNSH ĐV
  55. HIỆN TƢỢNG NHÂN BẢN VÔ TÍNH TRONG TỰ NHIÊN Nảy chồi:Thủy tức Phân mảnh:hải quì, giun đốt Tái sinh: Sao biển, Trinh sản: ong, thằn lằn kỳ giông Mẫu sinh: cá Phụ sinh: cá Trinh sản giả: (trứng chỉ chứa vật chất di truyền từ mẹ) BM CNSH TV – Khoa CNSH 57
  56. 3.3.3.PHÂN LOẠI Nhân bản sinh sản Nhân bản trị liệu Tạo những cá thể động vật Dùng để nghiên cứu hoặc trị hoàn chỉnh liệu BM CNSH TV – Khoa CNSH 58
  57. 3.3.4.THÀNH TỰU CỪU DOLLY Do nhóm nghiên cứu J. Wilmut, A.E Schnicke, J.Mc Whir, A.J Kind và K.H.S Campbell công bố trên tạp chí Nature (27/2/1997). • Ian Wilmus, Keith Campbell và các cộng sự tạo ra cừu Dolly • (5 tháng 7 năm 1996 - 14 tháng 2 năm 2003) • - Từ 277 quả trứng có 29 phôi đƣợc tạo thành, chỉ có 3 con cừu đƣợc sinh ra và có duy nhất Dolly sống sót BM CNSH TV – Khoa CNSH 59
  58. QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN BẢN CỪU DOLLY • Lấy nhân của tế bào thƣợng bì tuyến vú của con cừu Dorset cho dung hợp vào tế bào trứng đã loại bỏ nhân (1n) của một cừu khác (cừu Black face –mặt đen) hình thành nên tế bào trứng chứa nhân tế bào soma (2n). • Nuôi cấy tế bào trứng này cho phát triển thành phôi. • Sau đó cấy vào tử cung của một cừu khác (mặt đen) để “chửa” hộ. • Sau 5 tháng cừu cái này đã sinh ra cừu con và đƣợc đặt tên là Dolly có các đặc điểm giống hệt nhƣ cừu cho nhân (Dorset –mặt trắng) ChuÈn bÞ  Dung hîp Ph©n bµo Nu«i ph«i  CÊy ph«i Sinh con nh©n b¶n BM CNSH TV – Khoa CNSH
  59. 3.3.5. CÁC BƢỚC CƠ BẢN TRONG KỸ THUẬT TẠO DÕNG VÔ TÍNH BẰNG CHUYỂN NHÂN 2n * Bƣớc 1: Chuẩn bị trứng và khử nhân (tế bào nhận nhân) * Bƣớc 2: Chuẩn bị tế bào cho nhân •Bƣớc 3: Chuyển tế bào cho nhân vào tế bào trứng đã khử nhân •Bƣớc 4: Dung hợp 2 tế bào * Bƣớc 5: Hoạt hóa trứng đã cấy nhân * Bƣớc 6: Nuôi phôi và cấy phôi vào tử cung con nhận BM CNSH TV – Khoa CNSH
  60. CÁC BƢỚC CƠ BẢN TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG VÔ TÍNH BẰNG CHUYỂN NHÂN 2n BM CNSH TV – Khoa CNSH
  61. 3.3.6.MỘT SỐ THÀNH CÔNG VỀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT July 1998 Cloned cloned calves Cloned mouse mule BM CNSH TV – Khoa CNSH
  62. MỘT SỐ THÀNH CÔNG VỀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT December 2001 Five cloned female piglets, named December 2001 Noel, Angel, Star, Joy and Mary The world's first cloned kitten, named Cece BM CNSH TV – Khoa CNSH
  63. MỘT SỐ THÀNH CÔNG VỀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT - Tháng 11.2008, các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc tạo chuột sống từ mẫu chuột chết cách đó 16 năm. Mẫu chuột để đông lạnh sau 16 năm Hậu duệ của chuột chết BM CNSH TV – Khoa CNSH
  64. Lîn Millie, Christa, Alexis, Carel vµ Dotcom ®•îc sinh vµo ngµy H•¬u Dewey ®•îc nh©n b¶n 05/05/2000 qua nh©n b¶n sö vµo th¸ng 05/2003 t¹i Mü dông c¸c tÕ bµo tr•ëng thµnh. ¶nh. MÌo Tabouli vµ Baba Ganoush ®•îc Chó ngùa nh©n b¶n nh©n b¶n b»ng c¸ch chuyÓn nhiÔm s¾c MÌo "Carbon Copy" (03/2002) Prometea thÓ (05/2004)
  65. “CC” Carbon Copy • 2001 – Cat cloned 2002 – Rabbits cloned 2003 – Mule cloned 2004 – Bull serial-cloned
  66. NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT Ở VIỆT NAM  Từ 2006 đến nay, Viện công nghệ sinh học bước đầu thành công trong tạo phôi vô tính một số loài vật nuôi và động vật hoang dã, quý hiếm (chuột, trâu, bò nhà, bò tót, gấu, khỉ và sao la). BM CNSH TV – Khoa CNSH
  67. 3.3.7.HẠN CHẾ CỦA NHÂN BẢN VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT Con vật Cừu Dolly Chó Snuppy - Tỷ lệ sống thấp - Con vật mang thai có thể gặp Hiệu suất 277 trứng 1095 phôi nguy hiểm 29 phôi 3 123 con chó cái mang - Tuổi thọ ngắn con cừu và duy thai hộ nhất Dolly sống 3 con có chửa (1 chó - Xác suất thất bại cao sót. con chết ngay sau Gần đây ngƣời ta đã phát hiện có sinh, 1con chết sau 22 sự thoái hoá telomer (các trình tự ngày , còn sống sót 1 cuối của nhiễm sắc thể có tác dụng con tên Snuppy) nhƣ “mũ bảo vệ” cho chuỗi ADN) - theo hƣớng ngắn dần khi cơ thể già hoá. Khi toàn bộ telomer bị tiêu Sinh lý Lão hóa sớm, Viêm phổi, huỷ, nhiễm sắc thể sẽ bị hỏng, cơ mắc bệnh viêm thể dễ dàng nhiễm bệnh và chết. phổi Ngƣời ta đã xác định đƣợc độ dài telomer của cừu Dolly ngắn hơn Tuổi thọ 7 năm 20% so với con cừu sinh ra cùng ngày (ĐC :11-12 năm) BM CNSH TV – Khoa CNSH
  68. ỨNG DỤNG CỦA TẠO DÕNG VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT Nhân dòng các nguồn gen quí hiếm Mô hình nghiên cứu về gen của ngƣời Mô hình nghiên cứu quá trình biệt hóa của tế bào Bioreactor: sản xuất sản phẩm trị liệu Dị ghép: Liệu pháp tế bào Hỗ trợ sinh sản BM CNSH TV – Khoa CNSH
  69. 3.4 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO ĐỘNG VẬT 3.4.1 KHÁI NIỆM Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đƣa một hay nhiều gen lạ đã đƣợc thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trƣng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen đƣợc xem là thành công khi gen chuyển vào đƣợc tổ hợp vào genom của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp đƣợc duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 73
  70. 3.4.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO ĐỘNG VẬT Phƣơng pháp chuyển gen trực tiếp : – Chuyển gen nhờ phốt phát canxi – Chuyển gen nhờ xung điện – Chuyển gen nhờ vi tiêm – Chuyển gen nhờ liposom – Chuyển gen nhờ tinh trùng Phƣơng pháp chuyển gen gián tiếp: nhờ virus 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 74
  71. Chuyển gen nhờ phốt phát canxi Nguyên lý: các DNA ngoại lai đƣợc trộn với CaCl2 sau đó đƣợc chuyển vào một dung dịch chứa ion phosphat. Một phức hợp đồng ngƣng kết (coprecipitate) giữa canxi phosphat và DNA sẽ đƣợc hình thành, phức hợp này sẽ đƣợc các tế bào động vật có vú tiếp nhận khi nuôi cấy, kết quả là có sự thể hiện gen ngoại lai trong tế bào. Kỹ thuật này có thể sử dụng để đƣa bất kì DNA vào tế bào động vật có vú với mục đích các test thể hiện chuyển nạp hay biến nạp lâu dài. Các DNA chuyển nạp mang một gen chỉ thị chọn lọc (nhƣ gen aminoglycoside phosphatransferase) để giúp cho việc thanh lọc các tế bào không tiếp nhận DNA. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 75
  72. Chuyển gen nhờ xung điện Nguyên lý:  Khi có một nồng độ tế bào cao và tạo ra một điện thế cao trong một thời gian rất ngắn, lúc đó trên màng tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có thể tƣơng tác với genome của tế bào. Máy electroporation thƣờng đƣợc lắp đặt một công suất ổn định (và cả thời gian gây xung ổn định) với các điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm. Đối với hầu hết tế bào, sự thiết lập nhƣ vậy đảm bảo 20-50% số tế bào còn sống sau khi thực nghiệm chuyển DNA. Quá trình chuyển gen nhờ electroporation đƣợc thực hiện ở nhiệt độ phòng còn các tế bào đƣợc gi? liên tục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ các tế bào. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 76
  73. Chuyển gen nhờ vi tiêm Nguyên lý:  Tiêm trực tiếp ADN ngoại lai vào tiền nhân (pronucleus) của hợp tử nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm rất mảnh. Việc chuyển gen vào tế bào động vật tốt nhất là chuyển vào một trong những pronucleus của trứng đã thụ tinh trƣớc khi chúng kết hợp với nhau để tạo ra hợp tử lƣỡng bội. • Nếu tiến hành chuyển gen ở các giai đoạn muộn có thể tạo ra phôi khảm: chỉ có một số tế bào có gen chuyển vào. • Bằng cách chuyển gen vào giai đoạn tiền nhân, gen chuyển vào sẽ đƣợc truyền cho các thế hệ phôi tiếp theo và có thể di truyền cho con cháu. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 78
  74. Thiết bị chuyển gen bằng vi tiêm
  75. Phƣơng pháp này cho kết quả rất cao nhƣng số lƣợng tế bào đƣợc xử lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào. Phƣơng pháp này thƣờng dùng để đƣa DNA vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm
  76. Gene injected into the male pronuclei
  77. Chuyển gen nhờ liposom Nguyên lý: • Phƣơng pháp dựa trên sự tƣơng tác ion của DNA và thể liposome tạo ra một thể phức hợp, phức hợp này có thể phóng thích các DNA chức năng vào tế bào nuôi cấy Liposom cấu tạo từ các lớp màng lipid tạo dạng túi, bên trong chứa nƣớc, kích thƣớc khoảng 10 nm đến 1000 nm. Liposom thƣờng có một lớp lipid mang điện tích dƣơng (lipofectamin) và các phân tử lipid trung tính - nên nó có điện tích dƣơng (+). Liposom có thể kết hợp với các phân tử, hoặc các chất mang điện tích âm (-) tạo thành phức hợp ổn định. • Thiết kế tạo vectơ liposom thực chất là tạo các phức hợp liposom - DNA. Phân tử DNA có điện tích âm (-) có thể kết hợp với liposom tạo nên các phức hợp ổn định, đƣợc sử dụng làm vectơ chuyển gen. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 83
  78. Sơ đồ cấu trúc và hoạt động của vectơ liposom Thiết kế tạo vectơ liposom thực chất là tạo các phức hợp liposom - DNA. Phân tử DNA có điện tích âm (-) có thể kết hợp với liposom tạo nên các phức hợp ổn định, đƣợc sử dụng làm vectơ chuyển gen. BM CNSH TV – Khoa CNSH 84
  79. Cơ chế hoạt động của vectơ liposom • Vectơ liposom có khả năng tiếp xúc với màng tế bào của các tế bào đích và chui qua màng tế bào, khi đó lớp các phân tử lipid bị phân huỷ làm cho các gen mục tiêu đƣợc đƣa vào trong tế bào. • Gen mục tiêu có thể đƣợc đƣa vào trong nhân, tồn tại trong nhân nhƣ những đơn vị gen độc lập. Trong nhân các gen mục tiêu có thể có quá trình tái tổ hợp làm cho gen này đƣợc gắn vào bộ gen của tế bào chủ. BM CNSH TV – Khoa CNSH 85
  80. CHUYỂN GEN NHỜ VIRUS • Nguyên lý: Khi xâm nhiễm vào tế bào, virus có khả năng chuyển bộ gen của nó vào tế bào chủ. Một số nhóm virus có thể gắn bộ gen hoặc một số gen của chúng vào bộ gen tế bào chủ, tạo thành một thể thống nhất. Các gen virus gắn với bộ gen của tế bào chủ có thể tồn tại lâu dài cùng với quá trình phân chia của tế bào chủ, tạo nên các provirus. BM CNSH TV – Khoa CNSH 86
  81. SƠ ĐỒ CHUYỂN GEN NHỜ VIRUS
  82. 5.1.4. chuyÓn gen nhê virus  Khi trong c¬ thÓ hay tõ ngoµi m«i tr•êng cã mét t¸c nh©n nµo ®ã kh«ng b×nh th•êng (th•êng lµ tia tö ngo¹i, c¸c chÊt ®éc, tia phãng x¹ hay nhiÖt ®é cao ) t¸c ®éng vµo provirus, lµm cho bé gen virus t¸ch khái bé gen tÕ bµo, thùc hiÖn qu¸ tr×nh t¸i b¶n gen virus vµ c¸c thµnh phÇn cña virus trong tÕ bµo chñ.  Qu¸ tr×nh l¾p ghÐp c¸c thµnh phÇn cña virus t¹o nªn c¸c virion, c¸c virion ho¹t ®éng t¹o nªn v« sè virus míi ph¸ vì tÕ bµo chñ, tiÕp tôc x©m nhiÔm c¸c tÕ bµo kh¸c
  83. 5.1.4. chuyÓn gen nhê virus Trªn c¬ së hiÓu biÕt ®Æc ®iÓm vµ c¬ chÕ x©m nhiÔm cña virus vµo tÕ bµo chñ, con ng•êi ®· t×m ra c¸c biÖn ph¸p lo¹i bá c¸c gen cã h¹i cña virus, hoÆc g©y bÊt ho¹t c¸c gen cã h¹i cña virus, nh•ng vÉn gi÷ l¹i c¸c gen virus gióp cho sù x©m nhiÔm vµ g¾n gen vµo bé gen cña tÕ bµo, t¹o nªn c¸c vect¬ chuyÓn gen. Vect¬ chuyÓn gen h×nh thµnh tõ nh÷ng virus biÕn ®æi gen nh• trªn ®•îc gäi lµ vect¬ chuyÓn gen cã b¶n chÊt virus. Trong c¸c vect¬ nµy, gen ngo¹i lai cÇn chuyÓn n¹p ®•îc thay thÕ vµo vÞ trÝ mét sè gen cña virus, nh•ng vÉn ®¶m b¶o ®Ó virus cã kh¶ n¨ng x©m nhiÔm vµ chuyÓn gen vµo tÕ bµo, hoÆc g¾n gen ngo¹i lai víi bé gen cña tÕ bµo ®Ých nh»m thùc hiÖn chøc n¨ng chuyÓn gen. Chóng gåm mét sè lo¹i chñ yÕu: +vect¬ adenovirus + vect¬ adeno-associated virus (AAV) +vect¬ retrovirus + vect¬ herpes simplex virus (HSV) +vect¬ baculovirus +
  84. chuyÓn gen nhê Vect¬ retrovirus • Bé gen retrovirus gåm hai sîi ARN gièng nhau, kÝch th•íc kho¶ng 7 kb - 11 kb. Mçi sîi RNA chøa 3 nhãm gen chñ yÕu: gag, pol, env. • Gen gag m· ho¸ protein lâi trong thµnh phÇn cÊu tróc h¹t virion, gen pol m· ho¸ enzyme phiªn m· ng•îc vµ c¸c enzyme cÇn thiÕt cho ho¹t ®éng cña virus, gen env m· ho¸ protein trong cÊu tróc c¸c líp vá cña virus. • Hai ®Çu mçi sîi RNA cã mét tr×nh tù lÆp dµi tËn cïng - LTR (long terminal repeats) cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen cña virus vµ gióp cho qu¸ tr×nh g¾n bé gen cña virus víi bé gen cña tÕ bµo chñ, gäi lµ tr×nh tù g¾n xen - att (attachment site). • T¹i 5’ - LTR cã tr×nh tù gióp qu¸ tr×nh ®ãng gãi bé gen cña virus gäi lµ tr×nh tù  (psi) .
  85. S¬ ®å cÊu tróc cña Retrovirus env
  86. chuyÓn gen nhê Vect¬ retrovirus 2.Nguyªn lý thiÕt kÕ vect¬ retrovirus ThiÕt kÕ vect¬ retrovirus lµ mét qu¸ tr×nh phøc t¹p, gåm nhiÒu giai ®o¹n kh¸c nhau:  Lo¹i bá c¸c gen chñ yÕu cña virus gag, pol, env vµ thay thÕ b»ng gen cÇn chuyÓn n¹p (gen môc tiªu) t¹o thµnh vect¬ bé gen  Xö lý c¾t riªng c¸c gen gag, pol vµ env cña retrovirus nh•ng vÉn ®¶m b¶o chøc n¨ng c¸c gen.  §•a vect¬ bé gen cïng víi c¸c gen gag, pol vµ env ®· xö lý cña virus vµo mét tÕ bµo ®Æc hiÖu lµ tÕ bµo ®ãng gãi.  Trong tÕ bµo ®ãng gãi, c¸c gen virus ho¹t ®éng tæng hîp c¸c thµnh phÇn vá cña virus, c¸c thµnh phÇn vá nµy kÕt hîp víi vect¬ mang gen môc tiªu h×nh thµnh nªn vect¬ retrovirus.
  87. Retrovirus vector
  88. chuyÓn gen nhê Vect¬ retrovirus 3. Sö dông vect¬ Retrovirus  Vect¬ Retrovirus ®•îc ®•a ®Õn c¸c tÕ bµo ®Ých b»ng nhiÒu kü thuËt kh¸c nhau. Khi tiÕp cËn tÕ bµo ®Ých ë nh÷ng thô thÓ, vect¬ retrovirus x©m nhËp vµo trong tÕ bµo.  Trong tÕ bµo chÊt cña tÕ bµo ®Ých vá vect¬ bÞ ph©n gi¶i vµ phÇn lâi RNA ®•îc gi¶i phãng. Enzym phiªn m· ng•îc cña virus chuyÓn RNA sîi ®¬n thµnh cDNA sîi kÐp. cDNA kÐp qua lç mµng nh©n vµo trong nh©n tÕ bµo ®Ých vµ g¾n vµo bé gen tÕ bµo ®Ých ë nh÷ng ®iÓm t•¬ng ®ång nhê enzym cµi xen. Gen chuyÓn n¹p ®•îc phiªn m·, dÞch m· t¹o protein ®Æc hiÖu cña gen nµy trong tÕ bµo ®Ých  Vect¬ retrovirus ®•îc sö dông hiÖu qu¶ trong liÖu ph¸p gen: ch÷a bÖnh ung th•, suy gi¶m miÔn dÞch do thiÕu hôt enzym ADA, tiÓu ®­êng
  89. CÁC HƢỚNG NGHIÊN CỨU VÀ KHẲ NĂNG ỨNG DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN • Phục vụ Nông nghiệp: Tạo giống, Chất lƣợng thực phẩm, Kháng bệnh • Phục vụ Công nghiệp: Tạo sản phẩm mới (Dê sản xuất tơ nhện) Kiểm tra độ an toàn hóa học • Phục vụ y tế: Cấy ghép phủ tạng Bổ sung dinh dƣỡng Trị liệu gen ở ngƣời • Phục vụ nghiên cứu: Mô hình nghiên cứu mới (chuột chuyển gen) Thúc đẩy tiến hóa (sinh vật với nhiều đặc điểm mong muốn) BM CNSH TV – Khoa CNSH 95
  90. MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ CHUYỂN GEN ĐỘNG VẬT • Năm 1988 Ward và cộng sự đã chuyển 2 gen mã hoá cho 2 enzym của vi khuẩn vào cừu để biến đổi Serine thành Cystein nhằm tăng sản lƣợng len do Serine kìm hãm quá trình tổng hợp len. • Viện nghiên cứu nông nghiệp quốc gia Pháp (INRA) đã tạo ra giống bò tiết sữa chua (yaourt) do chuyển gen lên men sữa chua từ vi khuẩn vào bộ máy di truyền của bò sữa. Con bò này tên là BuBu do Danny Lactaire tạo thành công. • Chuyển gen kháng virut nhƣ interferon, gen kháng influenza vào lợn, gà và cừu. • Chuyển gen kháng đông lạnh vốn mã hoá cho một phân tử protein giữ cho máu khỏi bị đông lạnh. Protein này (AFPs) đƣợc De Vries phát hiện từ 1969 ở cá sống ở vùng đông lạnh (- 20 C). Ngƣời ta đang nghiên cứu thiết kế gen này để chuyển vào cá, một số động vật và kể cả cây trồng. BM CNSH TV – Khoa CNSH 96
  91. Gia súc chuyển gen Bò sữa mang các thêm các bản copy của hai loại gen sinh casein có khả năng sản xuất tăng 13% protein sữa
  92. EnviroPig TM Lơn biểu hiện phytase trong tuyến nước bọt Phytic acid trong thức ăn của lợn được phân giải, giải phóng P P được hấp thu bởi lơn Thường thì phức hợp phytic acid/P đi qua lơn và thải ra ngoài ở dạng phân Phân lơn là chất gây ô nhiễm môi trường , thúc đẩy sự phát triẻn rêu ở ao hồ gây chết cá Phytatic Figure 1. Phytase produced in the salivary glands and secreted in the saliva increases the digestion of phosphorus contained in feed grains. Phytase
  93. Cá chuyển gen Tilapia Salmon/trout Catfish Tốc độ sinh trưởng tăng lần do chuyển gen sinh hocmon sinh trưởng
  94. Cá chuyển gen antifreeze protein Antifreeze promoter from pout As water temperature drops the GH gene is turned on The fish continue to grow when normally they would not
  95. Animal Bioreactor “Pharming” 1997, Tracy the sheep, the first transgenic animal to produce a recombinant protein drug in her milk alpha-1-antitrypsin (AAT) treatment for emphysema & cystic fibrosis Created by PPL Therapeutics & The Roslin Institute
  96. • Bằng cách chuyển gen vào động vật lấy sữa có thể thu đƣợc sữa có mang các protein là sản phẩm của gen chuyển nạp: • Gen tạo Lysostaphin: kháng khuẩn gây bệnh viêm vú ở trâu bò. • Gen sản xuất Factor IX (ngƣời): yếu tố đông máu • Chuyển gen 1-PI của ngƣời với promotor  lactoglobulin vào cừu và cho kết quả rất khả quan, hàm lƣợng 1- PI đạt đƣợc 35g/lít sữa, chiếm 50% tổng lƣợng sữa. • Chuyển gen cho dê Alpine để sản xuất sữa chứa protein đặc hiệu điều trị ung thƣ có tên là BR96. • Chuyển gen tạo albumin của máu ngƣời vào cừu để sản xuất albumin- thành phần chính cấu tạo nên máu từ sữa cừu. Việc sản xuất đại trà albumin ngƣời trong sữa cừu sẽ đƣợc phát triển mạnh khi phƣơng pháp nhân bản động vật đã đƣợc hoàn thiện. ở Mỹ đang kết hợp kỹ thuật nhân bản động vật với kỹ thuật gen để tạo ra các bò sản xuất albumin cao trong sữa (80 kg albumin/bò/năm).
  97. SƠ ĐỒ CHUYỂN GEN ĐỂ SẢN XUẤT FACTOR VIII TRONG SỮA LỢN
  98. • Trƣờng đại học Cambridge đã tạo ra lợn chuyển gen kháng thể của ngƣời, có tim đƣợc bao bọc bởi protein ngƣời nên có thể ghép cho ngƣời mà không gây phản ứng đào thải. • Ca ghép tim lợn cho ngƣời đầu tiên thực hiện cho thấy sau 1 năm ghép quả tim lợn trong cơ thể ngƣời vẫn làm việc bình thƣờng. • Hiện tại các nhà khoa học Mỹ đã có 500 con lợn có thể cung cấp phủ tạng ghép.
  99. • Một thành công rất đáng chú ý là chuyển gen vào muỗi để chống lại bệnh sốt rét với 2 hƣớng: – Tạo muỗi có khả năng đề kháng với ký sinh trùng sốt rét, ký sinh trùng không thể sống lâu trong cơ thể muỗi, chúng sẽ bị diệt trƣớc khi truyền bệnh cho ngƣời. – Tạo muỗi mẫn cảm với ký sinh trùng sốt rét, muỗi sẽ bị diệt bởi chính ký sinh trùng này trƣớc khi truyền bệnh cho ngƣời.
  100. Webster and Peter Transgenic male goat carrying silk gene
  101. Transgene -> Gene coding for a growth hormone
  102. ANDi, the first transgenic primate born in January, 2000 224 unfertilized rhesus eggs were infected with a GFP virus ~Half of the fertilized eggs grew and divided 40 were implanted into twenty surrogate mothers five males were born, two were stillborn ANDi was the only live monkey carrying the GFP gene
  103. Alba, the EGFP (enhanced GFP) bunny Created in 2000 as a transgenic artwork
  104. Transgenic Pigs Pass on the Transgene
  105. GloFish, originally developed in Singapore as a way to monitor water pollution The normally black-and-silver zebrafish was turned green or red by inserting various versions of the GFP gene Glofish are on sale throughout the US except in California Glofish retail for about $5 per fish. Normal zebrafish cost around one tenth of the price
  106. p27 knockout mouse p27 knockout mouse is bigger than the control This is not due to obesity, but the skeletal structure is increased in size (everything about the mouse is larger)
  107. normal knockout GDF8 (Myostatin) knockout mouse Over twice the muscle mass of a wildtype mouse
  108. Naturally Occurring GDF8 Mutants
  109. FGF5 knockout mouse has long, angora-like hair
  110. 3.5 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VACXIN VÀ KHÁNG THỂ ĐƠN DÕNG 3.5.1 KHÁI NIỆM VACXIN Vacxin là chế phẩm có tính kháng nguyên dùng để tạo miễn dịch đặc hiệu chủ động, nhằm tăng sức đề kháng của cơ thể đối với một (số) tác nhân gây bệnh cụ thể. Thuật ngữ vacxin xuất phát từ vaccinia, loại virus gây bệnh đậu bò nhưng khi đem chủng cho người lại giúp ngừa được bệnh đậu mùa (tiếng Latinh vacca nghĩa là "con bò cái"). Việc dùng vacxin để phòng bệnh gọi chung là chủng ngừa hay tiêm phòng hoặc tiêm chủng, mặc dù vacxin không những đƣợc cấy (chủng), tiêm mà còn có thể đƣợc đƣa vào cơ thể qua đƣờng miệng. Các nghiên cứu mới còn mở ra hƣớng dùng vacxin để điều trị một số bệnh (vacxin liệu pháp, một hƣớng trong các miễn dịch liệu pháp). BM CNSH TV – Khoa CNSH 116
  111. Một số loại vacxin thường sử dụng • Vacxin nhƣợc độc là chế phẩm sinh học từ vi khuẩn hoặc virut đã đƣợc làm yếu đi đến mức không nguy hiểm cho cơ thể nhƣng vẫn gây miễn dịch tốt, hoặc là từ những chủng vi sinh vật vốn có tính gây bệnh thấp đối với động vật đƣợc tuyển chọn từ tự nhiên • Vacxin vô hoạt là chế phẩm sinh học từ vi khuẩn, virut mầm bệnh đã bị giết chết bằng các tác nhân vật lý nhƣ tia cực tím, các chất hóa học nhƣ axit phenic, formol, crystal violet, (Vacxin ung khí thán cũng nhƣ các vacxin tụ huyết trùng trâu bò, tụ huyết trùng lợn, thƣờng dùng trƣớc đây là những vacxin vô hoạt bằng formol pha chất bổ trợ là keo phèn). • Giải độc tố (toxoid): độc tố của vi khuẩn đã đƣợc giải độc bằng một số hóa chất nhất định (thƣờng là formol hoặc phenol). Giải độc tố uốn ván, chẳng hạn, là chế phẩm sinh học hữu hiệu và an toàn đối với ngƣời và động vật. Giải độc tố mất độc tính nhƣng còn tính sinh miễn dịch. Khác với vacxin gây miễn dịch các bệnh do vi khuẩn, giải độc tố chỉ gây miễn dịch với độc tố của vi khuẩn. • BM CNSH TV – Khoa CNSH 117
  112. Ƣu nhƣợc điểm của một số loại vacxin • Các loại vacxin vô hoạt và giải độc tố thƣờng an toàn và ít gây phản ứng phụ. Tuy nhiên, cần phải dùng với liều tiêm khá lớn do trong vacxin phải có chất bổ trợ để duy trì kháng nguyên kéo dài trong cơ thể nên việc sử dụng gặp nhiều phiền toái và chất bổ trợ cũng có thể gây kích thích dẫn đến những phản ứng phụ bất lợi. Sau khi tiêm trung bình từ 2 - 3 tuần lễ thì cơ thể mới có miễn dịch. Độ dài miễn dịch thƣờng ngắn (3 - 6 tháng) vì vậy có loại phải tiêm nhiều lần trong năm. • Các vacxin nhƣợc độc đƣợc chế từ vi khuẩn và virut có độc lực thấp, gây miễn dịch tốt hơn vacxin vô hoạt. Vacxin virut nhƣợc độc thƣờng gây miễn dịch sớm (3 - 4 ngày sau khi tiêm, do hiện tƣợng cản nhiễm hay can thiệp cảm nhiễm), thời gian miễn dịch tƣơng đối dài. Nhƣng những loại vacxin này khi dùng dễ gây phản ứng, đòi hỏi nhiệt độ bảo quản thấp, có thể lây bệnh không điển hình hoặc làm trỗi dậy các bệnh khác sau khi tiêm BM CNSH TV – Khoa CNSH 118
  113. Vacxin tái tổ hợp • Vacxin tái tổ hợp là những vacxin đƣợc chế bằng cách tách gen chịu trách nhiệm mã hóa kháng nguyên thiết yếu nào đó rồi đƣa di nạp vào cơ thể khác dễ nuôi cấy, chế tạo, bảo quản và cũng ít độc hơn (virut vacxin đậu, trực khuẩn đại tràng, tằm hoặc thậm chí thực vật cho rau và quả, ) để sản xuất đồng loạt sinh vật biểu hiện tính trạng mới là sản sinh kháng nguyên do gen của mầm bệnh ngoại lai chi phối. • Vấn đề then chốt: – Không sử dụng trực tiếp các virus làm tác nhân nhƣ kháng nguyên – Tác nhân kháng nguyên ở đây chính là các protein đặc hiệu của virus. – Chuyển nạp các gen tạo protein có tác dụng kháng nguyên vào vi khuẩn – Bắt các vi khuẩn này sản xuất ra các protein đặc hiệu và chúng đƣợc sử dụng nhƣ vacxin – Khả năng phục hồi độc tính của virus nhƣ vacxin thế hệ cũ không xảy ra. 10/18/2011 BM CNSH TV – Khoa CNSH 119
  114. Nguyên lý tạo vacxin tái tổ hợp • Tác nhân kháng nguyên của các virus gây bệnh là protein/glycoprotein của vỏ virut nên có thể sử dụng chúng làm vacxin • Để tổng hợp các phân tử protein/glycoprotein này, cần tách và nhân dòng các gen mã hóa chúng từ genom của virus và gài vào các vectơ thích hợp. • Các vectơ tái tổ hợp mang gen của virus sẽ đƣợc đƣa vào các tế bào (vi khuẩn, nấm men ) để sản xuất ra các protein/glycoprotein kháng nguyên làm vacxin. BM CNSH TV – Khoa CNSH 120
  115. Reverse Transcription RNA DNA
  116. PCR Cloning DNA encoding gene of interest Expression plasmid
  117. Transfection Extraction Plasmid growth in bacteria Purification of plasmid
  118. In vitro antigen production CHO, yeast, or insect cells Vaccine vector In vivo antigen production
  119. Ví dụ điển hình Sản xuất vacxin tái tổ hợp kháng bệnh lở mồm long móng. Virut FMDV (Foot ADN Mouth Disease Virut) gây bệnh gồm một phân tử ARN đƣợc bọc bởi vỏ protein. Vỏ protein chứa 4 tiểu phần VP1, VP2, VP3 và VP4 trong đó VP1 đóng vai trò kích thích tạo kháng thể. Các nhà khoa học của hãng Gentech đã tách đƣợc gen mã hoá VP1, đƣa nó vào E.coli thông qua plasmit pBR322 và buộc nó sản xuất VP1 trong tế bào E.coli. Kháng nguyên là protein VP1 tái tổ hợp rất ổn định và còn gi? đƣợc hiệu quả tác dụng ở 100 0C. GEN VP1 pBR322 E.coli BM CNSH TV – Khoa CNSH 125
  120. MỘT SỐ VACXIN TÁI TỔ HỢP DÙNG TRONG CHĂN NUÔI • Vacxin tái tổ hợp chống bệnh lở mồm long móng • Vacxin tái tổ hợp chống bệnh xanh lƣỡi cừu (bò) • Vacxin tái tổ hợp chống bệnh bạch cầu bò • Vacxin tái tổ hợp chống bệnh Newcastle • Vacxin tái tổ hợp chống bệnh cúm gia cầm • Vacxin tái tổ hợp chống bệnh Marek BM CNSH TV – Khoa CNSH 126
  121. VECTƠ VIRUS TRONG SẢN XuẤT VACXIN TÁI TỔ HỢP • Có thể sử dụng vectơ virus để nhân dòng các kháng nguyên vacxin • Tiêu chuẩn của vectơ virus: – Không gây bệnh cho động vật đƣợc xử lý – Gây đƣợc miễn dịch – Không truyền ngang cho ngƣời – Có khả năng nhận đoạn AND ngoại lai lớn – Nhân nhanh dễ dàng trong tế bào chủ • Trong thực tế không có loại virus nào thỏa mãn các điều kiện trên. Hiện nay dùng làm vectơ 1 số virus: baculovirus, virus đậu, virus pox, virus Herpes BM CNSH TV – Khoa CNSH 127
  122. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG • Kháng thể: là các protein đƣợc cơ thể ngƣời hoặc động vật có xƣơng sống sản sinh ra để chống lại các kháng nguyên Các kháng thể này thƣờng là đa dòng tƣơng ứng Là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitop khác nhau trên một kháng nguyên cho trước Epitope, hay còn gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) là vị trí cấu trúc trên một phân tử kháng nguyên có thể phản ứng với một kiểu cấu trúc hóa học của phân tử kháng thể hoặc phân tử thụ thể. Đa số các epitope có thể coi là các bề mặt ba chiều có thể khớp với các bề mặt kháng nguyên. BM CNSH TV – Khoa CNSH 128
  123. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG • Kháng thể đơn dòng: là tập hợp của các phân tử kháng thể đồng nhất về cấu trúc và tính chất. Chúng đƣợc tạo ra bởi dòng tế bào lai giữa tế bào ung thƣ myeloma và tế bào lympho của hệ miễn dịch của động vật hoặc ngƣời. Kháng thể đơn dòng, liên kết với một epitop đặc hiệu BM CNSH TV – Khoa CNSH 129
  124. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG • Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinh học và y học, chúng vừa là phương tiện chẩn đoán, vừa là công cụ điều trị. Thí dụ, chúng được ứng dụng trong một phương pháp phát hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay. • Trước đây, việc sản xuất kháng thể đơn dòng in vitro rất khó khăn do đời sống ngắn ngủi của các tương bào. Kháng thể chỉ thu được in vivo bằng cách tiêm một kháng nguyên cụ thể vào một động vật rồi chiết lấy kháng thể trong máu. Phương pháp này rất tốn kém nhưng chỉ thu được lượng kháng thể rất ít, không thuần nhất và bị ô nhiễm. • Một tiến bộ to lớn đã đạt được cuối những năm 1970 bởi Cesar Milstein và Georges Köhler với kỹ thuật hybridoma (tế bào lai giữa 1 lympho B có khả năng sản xuất kháng thể với 1 tế bào ung thư có đời sống khá dài). BM CNSH TV – Khoa CNSH 130
  125. Kháng thể đơn dòng • Kháng thể đơn dòng được sử dụng rộng rãi trong sinh học và y học, chúng vừa là phương tiện chẩn đoán, vừa là công cụ điều trị. Thí dụ, chúng được ứng dụng trong một phương pháp phát hiện có thai được sử dụng phổ biến hiện nay. • Trước đây, việc sản xuất kháng thể đơn dòng in vitro rất khó khăn do đời sống ngắn ngủi của các tương bào. Kháng thể chỉ thu được in vivo bằng cách tiêm một kháng nguyên cụ thể vào một động vật rồi chiết lấy kháng thể trong máu. Phương pháp này rất tốn kém nhưng chỉ thu được lượng kháng thể rất ít, không thuần nhất và bị ô nhiễm. • Một tiến bộ to lớn đã đạt được cuối những năm 1970 bởi Cesar Milstein và Georges Köhler với kỹ thuật hybridoma (tế bào lai giữa 1 lympho B có khả năng sản xuất kháng thể với 1 tế bào ung thư có đời sống khá dài).
  126. Tạo kháng thể đơn dòng 1 Tách đƣợcTB có khả năng tạo kháng thể 2 Lai TB với tế bào ung thƣ pp “dung hợp” 3 Tách các TB lai bằng môi trƣờng chọn lọc 4 Thu từng TB lai riêng rẽ pp “pha loãng” 5 Nuôi cấy các TB lai kháng thể đơn dòng
  127. Công nghệ sản xuất 1 Tạo các tế bào sinh kháng thể Tiêm kháng nguyên vào chuôt Kích thích tế bào tụy chuột sinh kháng thể Phản ứng miễn dịch
  128. Công nghệ sản xuất 2 Tạo các tế bào lai Tế bào u tủy Tách tế bào Dung hợp (PEG) tụy chuột Không kháng HAT Sinh kháng thể Tế bào lai Không sinh kháng thể Kháng được HAT Phân chia liên tục Không phân chia liên tục Sinh kháng thể; Kháng HAT; Phân chia liên tục HAT : (Hypoxanthine, Aminopterin, Thymidine) ; PEG: Polyethylene Glycol
  129. Công nghệ sản xuất 3 Chọn lọc các tế bào lai Nuôi cấy trên môi trường có HAT Tế bào ung thư chết vì không kháng HAT Tế bào tụy chuột phát triển bình thường 1- 2 tuần rồi chết Tế bào lai phát triển bình thường
  130. Công nghệ sản xuất 4 Tách dòng tế bào Nuôi cấy riêng từng tế bào lai Chọn lọc tế bào có khả năng sinh kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên 5 Nuôi cấy tế bào lai kháng thể đơn dòng
  131. Quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng
  132. ỨNG DỤNG KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG • Phƣơng pháp sản xuất mang tính công nghiệp, là kháng thể tinh khiết và có tính đặc hiệu cao. • Xác định sự hiện diện chính xác của virut, vi khuẩn gây bệnh. • Có thể phát hiện đƣợc nhiều kháng nguyên chƣa biết trên bề mặt tế bào. • Dùng kháng thể đơn dòng đặc hiệu có thể chống lại kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T qua đó ức chế phản ứng thải loại khi ghép cơ quan • Có thể chẩn đoán đƣợc khối u qua việc xác định hàm lƣợng hocmon và đánh giá hoạt động của tuyến nội tiết hoặc các protein đặc hiệu cho sự hnh thành khối u. Thí dụ nhƣ: hàm lƣợng phetoprotein có nhiều ở bệnh nhân ung thƣ gan và ung thƣ tiền liệt tuyến hoặc protein HCG (human chorionic Gonadotropin) có mặt ở nhiều bệnh nhân ung thƣ khác. • Định hƣớng thuốc: có thể gắn kháng thể đơn dòng với thuốc nhằm định hƣớng cho thuốc chứa bệnh tới trực tiếp nơi cần chữa trị (nơi có protein đặc hiệu với kháng thể đơn dòng). BM CNSH TV – Khoa CNSH 138
  133. • Khởi động năm 1988, nhận tài trợ 3 tỷ $ năm 1990 từ US Department of Energy. • Mục tiêu chính là giải trình tự toàn bộ hệ gen của người trong 15 naêm, keát thuùc vaøo 2005 • Năm 2003: hoàn tất việc giải mã. • Có thông tin đầy đủ cho mỗi NST • Danh sách đầy đủ các gen trên mỗi NST
  134. a) Xây dựng bản đồ hệ gen người có độ phân giải cao b) Xây dựng bản đồ vật lý của tất cả các nhiễm sắc thể của người và một số sinh vật model điẻn hình khác c) Phát triển năng lực thu thập, dự trữ, phân phát và phân tích các dữ liệu thu dược d) Sáng tạo các công nghệ phù hợp để đạt được các mục tiêu trên e) Vạch ra những vấn đề đạo đức, luật pháp và xã hôi có thể nảy sinh từ dự án
  135. • Public • Commerial/private – Human Genome Project • Celera Genomics – Academic Laboratories • Rockville, MD (from around the world) • J Craig Venter – Most contributions from 6 laboratories (US, UK, Japan) Science Vol 291, 16 February 2001 Nature Vol 409, 15 February 2001
  136. • Nhoùm nghieân cöùu chuû yeáu laø ôû NIH (Hoa Kyø) phoái hôïp vôùi caùc nöôùc Anh, Phaùp, Ñöùc, Trung Quoác vaø Nhaät Baûn goïi laø nhoùm Consortium (Lieân hieäp caùc phoøng thí nghieäm) vaø sau naøy F.Collins chuû trì. Taát caû coù 18 cô quan khoa hoïc lôùn treân toaøn theá giôùi tröïc tieáp tham gia döï aùn.
  137. • James Watson, ngöôøi phaùt minh moâ hình chuoãi xoaén keùp DNA Watson- Crick naêm 1953, laø ngöôøi chuû trì ñaàu tieân cuûa chöông trình ôû caùc Vieän söùc khoûe Quoác gia Hoa Kyø NIH (National Institutes of Health) ñeán naêm 1992 töø chöùc. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 14 ĐHNNHN 4
  138. • Nhoùm thöù hai Celera Genomics do Craig Venter chuû trì, ra ñôøi chaäm hôn nhöng ñaït keát quaû nhanh vôùi chi phí thaáp. Naêm 1967, Craig Venter laøm y taù quaân y ôû Vieät Nam, trôû veà Hoa Kyø oâng thaáy caàn soáng gaáp. Naêm 1998, nhôø coâng ty Applied Biosystems vaø soá voán 300 trieäu ñoâ-la (USD) oâng laäp coâng ty tö Celera Genomics (Celera nghóa laø taêng toác).
  139. • – Ngaøy 26/6/2000 : Coâng boá baûn thaûo haønh ñoäng (working draft) cuûa nguyeân boä gen ngöôøi (> 90% vôùi soá base phaân tích gaáp 3 – 4 laàn boä gen). • – Thaùng 2/2001 : Caùc phaân tích cuûa baûn thaûo haønh ñoäng ñöôïc coâng boá. • – Ngaøy 14/4/2003 : Döï aùn boä gen ngöôøi hoaøn thaønh vaø tuyeân boá keát thuùc sôùm 2 naêm ôû Hoäi nghò khoa hoïc cuûa NIH kæ nieäm 50 naêm chuoãi xoaén keùp DNA.
  140. • Vieäc laäp baûn ñoà (mapping) cuoái cuøng caån troïng hôn gaáp 300 laàn so vôùi coâng boá naêm 2000, caùc loã troáng (400 gaps) ñöôïc laáp kín vaø caùc nhaø khoa hoïc Mó chæ tieâu toán 2,7 tæ USD. Ñaây laø söï kieän troïng ñaïi nhö yù kieán cuûa caùc nhaø khoa hoïc : “Ñaây laø ngaøy chuùng ta hoaøn taát laàn xuaát baûn ñaàu tieân “Cuoán saùch cuûa söï soáng (the Book of Life).” hay “Trong nhieàu theá kæ tôùi, ngaøy hoâm nay seõ ñöôïc nhôù ñeán nhö moät coät moác lòch söû”. • Caùc ñoät phaù kó thuaät goùp phaàn hoaøn thaønh döï aùn coù giaù trò to lôùn trong taát caû caùc lónh vöïc sinh hoïc.
  141. • Naêm 2000, Chöông trình boä gen ngöôøi ñaõ ñaït nhöõng keát quaû ngoaïn muïc, Toång thoáng Hoa Kyø Bill Clinton ñaõ tröïc tieáp daøn xeáp ñeå ñaïi dieän nhoùm “Consortium” laø Francis Collins vaø Craig Venter hôïp taùc nhau coâng boá keát quaû.
  142. • Ngaøy 26/6/2000, döôùi söï chuû trì cuûa Toång thoáng Hoa Kyø Bill Clinton vaø Thuû töôùng Anh Tony Blair, Fr. Collins vaø C.Venter laàn ñaàu tieân coâng boá veà giaûi trình töï boä gen ngöôøi gaàn xong (99%). Thaønh töïu naøy laø moät kì coâng vó ñaïi cuûa loaøi ngöôøi. Do nhöõng keát quaû coâng boá ñaàu tieân naøy coøn haøng traêm loã troáng (gaps) vaø nhieàu sai soùt neân noù ñöôïc goïi laø baûn phaùt thaûo (the Draft), nhöng noù seõ giuùp ñònh höôùng khai thaùc neân coøn goïi laø baûn phaùt thaûo haønh ñoäng (the Working Draft).
  143. Thaùng 2/2001 hai nhoùm coâng boá nhöõng keát quaû phaân tích chi tieát hôn caùc soá lieäu : • – Nhoùm Venter xaùc ñònh chaéc chaén 26.588 gen maõ hoùa protein vaø 12.000 gen khaùc. • – Nhoùm Consortium cho raèng soá gen khoaûng 30.000 ñeán 40.000. • – Venter cho raèng coù 300 gen cuûa ngöôøi khoâng tìm thaáy töông töï ôû chuoät. • – Nhoùm Consortium xaùc ñònh ñöôïc 113 gen cuûa vi khuaån gaén vaøo boä gen ngöôøi, khoâng phaûi do thöøa keá trong tieán hoùa.
  144. • Ñieàu ñaùng kinh ngaïc laø soá gen ngöôøi khoaûng 35.000, ít hôn raát nhieàu so vôùi döï kieán tröôùc ñaây laø 50.000 ÑEÁN 140.000 gen, vaø noù chæ khoaûng gaáp 2 laàn nhieàu hôn soá gen cuûa tuyeán truøng Caenorhabditis elegans (19.099 gen).
  145. • Tuy soá löôïng gen caàn chænh lyù laïi, töø phaùt hieän khieâm toán vaø gôïi toø moø naøy, caùc nhaø khoa hoïc cho raèng chìa khoùa di truyeàn cho söï phöùc taïp cuûa con ngöôøi khoâng do soá löôïng gen, maø ôû choã caùc phaàn cuûa gen ñöôïc söû duïng nhö theá naøo ñeå taïo neân caùc saûn phaåm khaùc nhau trong gheùp noái caùc phaàn cuûa gen theo löïa choïn (Alternative Splicing). Söï phöùc taïp ñöôïc gia taêng töø nhieàu nguoàn khaùc laø haøng nghìn bieán ñoåi hoùa hoïc sau dòch maõ (Post-translational chemical modification) taùc ñoäng ñeán caùc protein vaø chöông trình cuûa caùc cô cheá ñieàu hoøa kieåm soaùt caùc quaù trình ñoù.
  146. • Ñeå xaây döïng baûn phaùt thaûo haønh ñoäng, 16 Trung taâm giaûi kyù töï chuoãi ñaõ phaân tích hôn 22,1 tyû base cuûa trình töï khôûi ñaàu, goàm caùc ñoaïn truøng laép toång coäng 3,9 tyû base vaø cung caáp 7 laàn phuû kín boä gen ngöôøi (coù theå hieåu laø giaûi kyù töï chuoãi gaáp 7 laàn boä gen ngöôøi). Hôn 30% ñaït chaát löôïng cao, laø nhöõng trình töï cho keát quaû cuoái cuøng, vôùi ñoä phuû kín 8 ñeán 10 laàn, ñoä caån troïng 99,99% vaø moät soá choã troáng.
  147. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 15 ĐHNNHN 6
  148. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 15 ĐHNNHN 7
  149. Nguyễn Thị Phương Thảo ,Bộ Môn CNSH Thực Vật, Khoa CNSH, 15 ĐHNNHN 8
  150. Thôøi ñaïi sau boä gen (Post Genomics Era) ñaõ baét ñaàu vôùi caùc daáu hieäu : – Söû duïng caùc coâng cuï vaø coâng ngheä ñeå khai thaùc boä gen ngöôøi. – Sinh hoïc phaùt trieån ôû möùc cao hôn nhö Sinh hoïc caùc heä thoáng (the Systems Biology). – Söï phaùt trieån haøng loaït caùc coâng ngheä then choát (key tehnologies) môùi nhö Tin sinh hoïc (Bioinformatics), Biochip vaø microarrays, Coâng ngheä sinh hoïc nano (Nanobiotechnology),
  151. • – Cellomics : nghieân cöùu chöùc naêng teá baøo vaø taùc ñoäng cuûa thuoác ôû caáp ñoä teá baøo nhôø söï gaén keát vôùi coâng ngheä thoâng tin (IT). Söû duïng caùc thuaät toaùn (algorithm) ñeå phaân tích töï ñoäng hoùa hình thaùi hoïc cuûa caùc teá baøo seõ cung caáp caùc keát quaû ñònh löôïng giuùp cho taàm soaùt dung löôïng cao (high content screening). • Metabolomis : coâng ngheä gen ñieàu khieån trao ñoåi chaát. . • Ionomics : caùc gen chi phoái söï ñieàu hoøa taát caû caùc ion trong teá baøo.
  152. Microarray và Biochip • Töø naêm 1999, söï phaùt trieån cuûa Genomics vaø Proteomics daãn ñeán Coâng ngheä microarray (Microarray technology) vaø ñeán naêm 2002 saûn phaåm ñaàu tieân coù maët treân thò tröôøng. Xuaát phaùt töø nhu caàu thöïc teá chaån ñoaùn, caùc haõng döôïc phaåm cuõng nhö caùc trung taâm nghieân cöùu lôùn ñaõ cho ra ñôøi nhieàu saûn phaåm duøng cho phaùt hieän nhanh (nhö xaùc ñònh SNP) coù theå ôû daïng chip (boï ñieän töû), daïng bi (bead) coù töø tính (hình 4.9) hay caùc microarray (hình 4.10) vaø coù theå ôû nhieàu daïng khaùc hoaëc laø söï keát hôïp cuûa caùc daïng treân. Töïu chung, nhaèm taïo thuaän lôïi nhaát cho chaån ñoaùn nhanh, nhaïy vaø chính xaùc caùc SNP ñang quan taâm.
  153. Hình 4.9. Caùc vieân bi coù gaén maãu doø Hình 4.10. Microarray vôùi caùc daõy lai vôùi RNA/DNA muïc tieâu chaám, phía treân laø chuøm tia saùng cuûa ñaàu doø (detector) khueách ñaïi caùc ñoám saùng ñeå ñoïc keát quaû
  154. 3.7. CÔNG NGHỆ HỖ TRỢ SINH SẢN Gồm: • Kỹthu ật thụtinh nhân tạo • Công nghệ cấy truyền phôi • Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm • Kỹthu ật cắt phôi, nhân phôi từ tế bào đơn, xác định giới tính phôi • Kỹthu ật điều khiển giới tính 168
  155. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Khái niệm: • TTNT là kỹ thuật mà con ngƣời tiến hành đƣa tinh dịch hoặc tinh bảo quản (ngắn ngày hoặc dài ngày) vào đƣờng sinh dục con cái bằng dụng cụ chuyên dụng ở thời điểm thích hợp. • Đây là biện pháp cải tạo giống nhanh, tiên tiến nhằm tạo ra đàn con có sản lƣợng cao, phẩm chất tốt và đang đƣợc ứng dụng rộng rãi. 169
  156. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Lợi ích của thụ tinh nhân tạo - Phát triển vốn gen - nâng cao khả năng truyền giống của con đực - Kiểm soát dịch bệnh (tránh lây lan qua tiếp xúc ) - Thuận tiện trong vận chuyển tinh dịch - Tiết kiệm đực giống, kéo dài thời gian sử dụng đực giống - Khắc phục đƣợc khó khăn do sự chênh lệch về tầm vóc trong giao phối trực tiếp, đực giống bị thƣơng - Có hiệu quả kinh tế - Đáp ứng trong việc gây động dục đồng loạt 170
  157. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Nhƣợc điểm của thụ tinh nhân tạo • Cần phát hiện động dục tốt • Cần xử lý, bảo quản tinh dịch tốt • Cần có cán bộ kỹ thuật đƣợc huấn luyện • Cần vốn ban đầu cao (đối với cơ sở sản xuất tinh đực giống) 171
  158. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Các nội dung chính trong công tác thụ tinh nhân tạo • Tuyển chọn và huấn luyện đực giống • Kỹ thuật khai thác tinh dịch • Kỹ thuật kiểm tra chất lƣợng tinh dịch • Kỹ thuật pha loãng, bảo tồn (ngắn ngày, dài ngày) • Kỹ thuật dẫn tinh (thụ tinh nhân tạo) 172
  159. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Phƣơng pháp khai thác tinh dịch Các yêu cầu cơ bản của việc lấy tinh dịch: + Lấy đƣợc toàn bộ tinh dịch với phẩm chất tốt nhất và thuần khiết nhất + Phƣơng pháp lấy tinh phải an toàn cho ngƣời và vật + Trang bị không quá phức tạp, kỹ thuật phải đơn giản dễ áp dụng trong thực tiễn sản xuất 173
  160. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo Phƣơng pháp khai thác tinh + Phƣơng pháp hải miên + Phƣơng pháp âm đạo + Phƣơng pháp dùng túi đặt sẵn trong âm đạo + Phƣơng pháp cơ giới (massage) + Phƣơng pháp dùng điện + Phƣơng pháp dùng âm đạo giả: là phƣơng pháp đang đƣợc áp dụng rộng rãi hiện nay 174
  161. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KIỂM TRA PHẨM CHẤT TINH DỊCH * Các chỉ tiêu đánh giá thường xuyên • Thể tích tinh dịch (V - ml): Lƣợng tinh dịch bài xuất trong 1 lần khai thác • Hoạt lực (A - %): Tỉ lệ % tinh trùng vận động tiến thẳng trong vi trƣờng quan sát. A càng càng cao tinh dịch càng tốt chỉ dùng A từ 0.6 trở lên • Chỉ tiêu khác: -Độ pH của tinh dịch, màu sắc, mùi, độ vẩn -Nồng độ tinh trùng (C - triệu tinh trùng / ml): Số lượng tinh trùng / 1ml tinh dịch -Mật độ (d) kiểm tra cùng với A người ta ước lượng khoảng cách tương đối giữa các tinh trùng với chiều dài (l) của tinh trùng nếu d l thì mật độ thưa còn nếu d tương đương với l thì mật độ trung bình. *Chỉ tiêu tổng hợp VAC = VxAxC: Tổng số tinh trùng có khả năng thụ thai trong một lần khai thác 175
  162. Yêu câu kỹ thuật đối với tinh dịch theo tiêu chuẩn Việt Nam Chỉ tiêu Đơn vị Lợn ngoại Lợn nội Trâu bò Lượng tinh đã ml ≥ 100 ≥ 50 ≥ 2 lọc Màu sắc trắng sữa trắng sữa trắng, vàng ngà Mùi tanh tanh tanh Mật độ từ TB trở lên từ TB trở lên từ TB trở lên Hoạt lực ≥ 0.7 ≥ 0.6 ≥ 0.7 Nồng độ 106 ml ≥ 80 ≥ 20 ≥ 500 Sức kháng ≥ 3000 ≥500 ≥ 10.000 PH 6.8-8.1 6.8-8.1 6.4-7.8 Tỷ lệ sống % ≥ 70 ≥ 70 ≥ 70 Tỷ lệ kỳ hình % ≤10 ≤ 10 ≤ 10 Độ nhiễm 103/ml ≤5 ≤ 5 ≤ 5 khuẩn
  163. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KIỂM TRA PHẨM CHẤT TINH DỊCH * Các chỉ tiêu đánh giá định kỳ • Sức kháng của tinh trùng (R): Sức chịu đựng của tinh trùng trong dung dịch NaCl 1% • Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình (K - %) • Kiểm tra thể acrosome (Ac - %) • Các chỉ tiêu khác: Sức kháng thẩm thấu của tinh trùng (Ro), Độ nhớt và tỷ trọng Chỉ số tuyệt đối sức sống của tinh trùng ngoài cơ thể (Sa) Tỉ lệ sống (Sg%) và tỉ lệ chết (Ch%) Hệ số giảm hoạt lực của tinh trùng (Ghh) 177
  164. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KIỂM TRA PHẨM CHẤT TINH DỊCH * Một số máy móc thiết bị 178
  165. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH Bảo tồn dạng lỏng Tinh trùng lợn 6-10o C Tinh trùng bò -14 tới -20 o C, Tinh trùng cừu -10o C • Bảo tồn đông lạnh: tinh đông viên, tinh cọng rạ ( trong Ni tơ lỏng với nhiệt độ -79 tới - 193 o C ) 179
  166. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH Yêu cầu của môi trƣờng pha loãng  Có các điều kiện lý, hóa, sinh thỏa mãn điều kiện sống của tinh trùng:  Áp lực thẩm thấu  pH  Có các chất điện giải và không điện giải phù hợp  Đặc điểm vật lý phù hợp: tỷ trọng, độ nhớt  Phải có tính kinh tế và thực tiễn 180
  167. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH Chất liệu tạo môi trƣờng • Chất cung cấp năng lƣợng: các loại đƣờng glucose, fructose • Chất đệm: các muối kim loại kiềm yếu (Na3C6H5O7, NaHCO3, hoặc lòng đỏ trứng gà (NaH2PO4/Na2HPO4) • Chất chống choáng lạnh: glyxerin, lòng đỏ trứng (leucitin) • Các chất chống khuẩn: penicillin, streptomycin, tetracycline • Các chất rửa sạch môi trƣờng: do trong tinh dịch có các kim loại nặng đa hóa trị nhƣ Ca2+, Fe2+, Al3+ + - 2+ - -> bổ sung TrilonB (EDTA): Na2H2Y → 2Na + H2Y2 Ca + H2Y2 → CaH2Y 181
  168. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT PHA LOÃNG VÀ BẢO TỒN TINH DỊCH Nồng độ và liều lượng tinh dịch • Với bò: tổng số tinh trùng trong một liều phối phải là 20 x106 có nghĩa là số lượng liều tinh = VxAxC= 20 x106 • Với lợn nội: nồng độ tinh trùng trong 1ml tinh dịch sau khi pha có từ 20 -30 x 106 , liều tinh là 30ml • Lợn ngọai: nồng độ tinh trùng trong 1ml tinh dịch sau khi pha từ 30 - 40 x 106 – Liều phối cho lợn nái nội phải đảm bảo có 1x109 tinh trùng, – Liều phối cho lợn lai phải đạt 1.5 x 109 tinh trùng, – Liều phối cho lợn nái ngoại phải đạt 3.0 x 109 tinh trùng
  169. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT DẪN TINH Kỹ thuật phát hiện động dục – Ví dụ chu kỳ động dục ở bò cái 183
  170. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT DẪN TINH (THỤ TINH NHÂN TẠO) Kỹ thuật phát hiện động dục - Ví dụ chu kỳ động dục ở bò cái Giai đoạn 1 - trước động dục (hay trước chịu đực) - Bò cái ngửi bò khác, bồn chồn, tìm kiếm bò cái khác hoặc bò đực - Cố nhảy lên con khác nhƣng không đứng yên khi bị bò cái khác hoặc bò đực nhảy lên lƣng. - Thích gần ngƣời, gần bò khác hơn thƣờng lệ. - Thỉnh thoảng kêu rống lên. - Âm hộ ƣớt, đỏ và hơi phồng lên. - Bò giảm lƣợng ăn vào và sữa giảm. 184
  171. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT DẪN TINH Kỹ thuật phát hiện động dục - Ví dụ chu kỳ động dục ở bò cái Giai đoạn 2 - động dục (chịu đực) - Giai đoạn này kéo dài khoảng 10-19 giờ. - Đứng yên cho bò khác nhảy lên. - Bồn chồn và kêu rống thƣờng xuyên, thích ngửi cơ quan sinh dục bò khác. - Tai dựng lên, tỏ vẻ dễ gần hơn. - Xƣơng sống lƣng cong lên, phần thắt lƣng lõm xuống, xƣơng hum cong lên. - Âm hộ phồng lên và dịch nhờn tiết ra lúc đầu lỏng sau đặc kéo thành sợi. - Mạn sƣờn lấm bùn và lông ở khấu đuôi xù lên (do bò khác nhảy lên). - Tính thèm ăn giảm, giảm sữa. - Thân nhiệt cao hơn (1oC). 185
  172. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT DẪN TINH Kỹ thuật phát hiện động dục - Ví dụ chu kỳ động dục ở bò cái Giai đoạn 3 - sau động dục (sau chịu đực) - Không cho con khác nhảy lên lƣng. - Ngửi bò khác và bị bò khác ngửi. - Dịch keo đặc từ âm hộ dính lên mông và đuôi. 186
  173. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT DẪN TINH - Kỹ thuật phát hiện động dục Lựa chọn thời điểm dẫn tinh thích hợp: - Bò - 12h sau khi phát hiện dộng dục. - Lợn - 24 và 36h sau khi bắt đầu động dục. - Cừu - 12 đến 18h sau khi bắt đầu động dục 187
  174. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo KỸ THUẬT DẪN TINH - Vị trí dẫn tinh thích hợp 188
  175. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.1. Nguyên lý chung của kỹ thuật cấy chuyển phôi và phân cắt phôi • Dựa vào đặc điểm sinh sản của động vật có vú: Sau thụ tinh phôi còn ở trạng thái tự do, một vài ngày đầu trong phần trên của đƣờng sinh dục con mẹ có thể tách phôi ra ngoài cơ thể và nuôi cấy in vitro sau đó lại có thể chuyển vào cơ thể mẹ chửa tiếp tục rồi sinh sản. • Dựa vào đặc tính toàn năng của tế bào ở giai đoạn phôi thai (4-8 tế bào) có thể lấy phôi và phân cắt phôi để thu đƣợc nhiều phôi hơn nữa (kỹ thuật phân cắt phôi).
  176. 3.2. ĐẶC ĐIỂM PHÁT TRIỂN PHÔI Ở GIAI ĐOẠN SỚM Sơ đồ sự phát triển phôi tuần đầu tiên ở động vật có vú.
  177. Kü thuËtcÊy chuyÓn ph«i 3.3.CÁC BƢỚC CHÍNH TRONG CẤY CHUYỂN PHÔI a. Đối với gia súc cái cho phôi: • Gây rụng trứng hàng loạt bằng cách tiêm các hocmon sinh dục. • Giao phối với con bố đã lựa chọn ở thời điểm động dục cao. • Thu nhận phôi bằng cách rửa dạ con 4-9 ngày sau giao phối. • Đông lạnh phôi và bảo quản chúng trong nitơ lỏng
  178. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.3.CÁC BƢỚC CHÍNH TRONG CẤY CHUYỂN PHÔI b. Đối với gia súc nhận phôi: • Gây động dục đồng loạt một nhóm gia súc cái đã chọn lựa (10 – 15 con). • đƣa phôi vào đàn gia súc nhận bằng cách bơm môi trƣờng dinh dƣỡng chứa phôi vào tử cung nhƣ thụ tinh nhân tạo • Theo dõi chặt chẽ quá trinh mang thai trong một số tháng đầu
  179. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.3.CÁC BƢỚC CHÍNH TRONG CẤY CHUYỂN PHÔI c.Kỹ thuật lấy phôi và cấy phôi • Dùng dụng cụ là ống Foley để thụt rửa để thu phôi • Dung dịch thụt rửa gồm: muối đệm phốt phát Dulbecco (PBS), bổ sung 10 ml huyết thanh bò, 100.000 đơn vị penicilin và 50mg/L streptomicin. Nhiệt độ dung dịch khi sử dụng 37 0C. • Thời gian lấy phôi: 4 - 9 ngày sau thụ tinh. • Cấy phôi vào tử cung theo phƣơng pháp dẫn tinh nhƣ thụ tinh nhân tạo
  180. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI Sơ đồ thụt rửa phôi
  181. Steps in loading a 0.25-cc plastic straw in preparation for transfer (or freezing) an embryo: labelling (A), aspirating embryo in second column of fluid (B), and the loaded straws (C). Note the air bubbles (arrows) to compartmentalize the straw. The top straw is loaded for freezing and the bottom straw is loaded for transfer, with a third column of medium as an added measure of safety
  182. Transfer of frozen embryo In vitro fertilization and embryo transfer
  183. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi a. Nhân nhanh gia súc cái hoặc con thú đặc biệt quí Trong buồng trứng con bê cái có tới 500.000 tế bào trứng. Nếu dùng hocmon kích thích sẽ gây rụng trứng hàng loạt. Có thể thu tối đa tới 75 phôi, thƣờng là 12 - 15 phôi trong một đợt kích thích. Một bò cái có thể chịu đƣợc kích thích 8 lần liên tiếp và nhƣ vậy có thể cho tới hàng trăm phôi. Bằng phƣơng pháp này dễ dàng nhân nhanh bê cái từ một bò sữa cao sản
  184. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi b. Ứng dụng về vận chuyển gia súc - Vận chuyển và thƣơng mại giống gia súc dƣới dạng phôi. Các phôi này đƣợc bảo quản lạnh sâu trong nitơ lỏng (-1960C) hoặc đƣợc bảo quản trong tử cung của thỏ. - So với vận chuyển con vật sống, vận chuyển phôi rất thuận lợi, ít tốn kém, giảm thiểu sự lây lan bệnh, đơn giản hóa việc kiểm dịch khi qua biên giới
  185. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi c. Xác định giới tính phôi trước khi cấy • Xác định qua NST giới tính: thông qua giải phẫu mô và tế bào quan sát NST giới tính của phôi • Xác định qua sự có mặt của kháng nguyên HY chỉ có trong hợp tử đực • Phƣơng pháp phân tích ADN:xác định trinh tự lặp đặc hiệu của NST giới tính qua kỹ thuật PCR (Ví dụ: dùng mồi SE47, SE48 để xác định NST Y ở cừu và hƣơu đỏ Châu Âu. Trình tự của mồi: 5’- CAGCCAAACCTCCCTCTGC - 3’ (SE47) 5’- CCCGCTTGGTCTTGTCTGTTGC - 3’ (SE48) ( I. Pfeiffer and B. Brenig – Department of Molecular Biology, Institute of Veterinary Medicine, Goettingen, Germany )
  186. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI Sơ đồ chuẩn đoán sớm giới tính phôi
  187. KỸ THUẬT CẤY CHUYỂN PHÔI 3.4. Ứng dụng của cấy chuyển phôi d. Nhân nhanh phôi: Chia cắt các tế bào của phôi có từ 4 – 8 tế bào để thu đƣợc nhiều phôi hơn, bằng cách này cho phép thu nhận một số lớn phôi giống hệt nhau về mặt di truyền.