›
›

Công nghệ Hóa học - Chương 7: Chất thơm

pdf 137 trang vanle 2790
Download
Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Công nghệ Hóa học - Chương 7: Chất thơm", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

  • pdfcong_nghe_hoa_hoc_chuong_7_chat_thom.pdf

Nội dung text: Công nghệ Hóa học - Chương 7: Chất thơm

  1. Chương 7 CHẤT THƠM 7.1. GIÓI THIỆU Chất thcrm của một sàn phẩm thực phẩm là một tổ hợp gồm rất nhiều chất hoấ học khác nhau (như hợp chất amine, những hợp chất dị vòng chứa nitơ hoặc lưu huỳnh, những rượu, aldehyt, xeton, những hợp chất cacbiiahydro, tecpen ) chúng có với lượng vô cùng nhỏ (vài mg/kg sản phẩm) hoặc ở trạng thái vết mà con người có thể cảm nhận được qua khứu giác. Những tiến bộ mới của phương pháp phân tích lý - hoá, những cô' gắng của nhiều nhà khoa học để thiết lập những quan hệ giữa sự có mặt hoặc không có của một vài hợp chất bay hơi với chất lượng của sản phẩm đang trên đà phát triển. Những chất thơm phải là những chất bay hơi và có nồng độ nhất định để cảm nhận được bằng cảm giác. Ngưỡng cảm nhận của các chất rất khác nhau, có những chất với nồng độ vô cùng nhỏ nhưng cường độ mùi thơm lại lớn hcfii so với những chất có nồng độ cao hơn, và chất đó là chất chính đặc trưng cho mùi của sản phẩm đó. Cùng một hợp chất thơm, nhưng nằm trong môi trường khác nhau sẽ cảm nhận khác nhau. Chẳng hạn trong môi trường có lipit thì cường độ miii thcrm sẽ thay đổi so với môi trường không có lipit. Để phân tích những chất thơm trước hết phải tiến hành chiết chúng ra khỏi các sản phẩm thực phẩm. 187
  2. 7.2. NHỮMG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CHẤT THƠM Nghiên cứu những hợp chất bay hơi cùa chấl thơm rất phức tạp bới vì trong một sản phẩm thực phấm có rất nhiều chất bay hơi. Những chất này có nhữiig tính chất lý học và hoá học rất khác nhau (áp suất hơi, tính có cực ) và nồng độ của chúng trong sản phẩm cũng rất khác nhau. Hiện nay để phân tích chất thơm bàng phương pháp sắc kí khí, nhất thiết phái tách nhimg hợp chất bay hơi ra khỏi phần không bay hơi. CóIiliiề ii phương pháp tách chiết khác nhau, và hiện nay khó có thể nói là phương pháp nào tốt nhất vì mỗi phương pháp tách chiết thích hợp cho một vài hợp chất có trong thành phần chất thơm, có nghĩa là hiệu suất tách chiết từng cấu từ chất bay hơi tiiỳ thuộc vào phương pháp tách chiết (bảng 7.2). Báng 7.2. Hiệu suất thu hổi (%) của một số chất theo phương pháp tách chiết Nhóm hoá hoc Không gian đầu Chưng cất Trích li lỏng- lỏng Tecpen 74,5 2,1 23,4 Sexquitecpen 5,3 1,8 6,1 Rượu béo mạch thẳng 1,4 17,9 14,2 Rượu tecpen 7,8 57,2 36,7 Lonon và dẫn suất 2,2 8,0 13,9 Các xeton khác 3,9 2,2 2,6 Vì vậy tùy thuộc vào thành phần và lính chất của các hợp chất thơm có trong sản phẩm mà dùng những phương pháp tách chiết khác nhau. 7.2.1. PHƯƠNG PHÁP KHÒNG GIAN ĐẦU (PHƯƠNG PHÁP HEAD- SPACE) Phương pháp này dùng một khí trơ (nitơ, acgon, CO2) với tốc độ nhất định đi qua dung dịch phân tích, khí trơ sẽ kéo theo hơi của nhữiig chất bay hơi có trong dung dịch. Hơi này sẽ được đưa trực tiếp vàoCỘI của máy sắc kí khí nhờ hệ thống van tự động để phân tích hoặc thu hồi chất thơm bằng các cột hấp thụ. Nồng độ của chất bay hơi trong pha hơi phụ thuộc vào bản chất của chất bay hơi và bản chất của môi trường chứa chất bay hơi. V í dụ trong dung dịch chứa chất thơm, nếu cho thêm đường saccaroza, glucoza hoặc fructoza, sẽ làm tăng áp 188
  3. suất hơi của những chất bay hơi. Ngược lại nếu có thêm axit citric ihì áp suất hơi sẽ giảm xuống. Nồng dộ của các chất trong pha hơi còn phụ thuộc vào hệ số hoạt độ cỉia các chất hoặc hệ số phân chia cứa chất bay hơi. 1 ’rường hợp khi phân tích chất thơm cùa một sản phám, nồng độ chất thơm quá nhò cần phải cò đạc bằng cách: - Ngưng lụ hơi của các chất thơm bàng cách làm lạnh, theo phương plìáp này thì nước cũng bị ngưng tụ; - Hấp phụhơi thu được bằng cột cóchứa các chất hấp phụ, những chất hấp thụ thường dùng là than hoạt tính, chromosorbe 102, Porapak Q (polyme cua ethyl- vinylbenzen-divinylbenzen), Tenax G.c (polyme của 2.6 diphenyl-p-phenylen oxyl). Sau đó phải tiến hành quá trình nhả hấp phụ, lức là giải phóng chất thơm ra khỏi cột hấp phụ bằng cách đun nóng cột hấp phụ và cho khí trơ đi qua CỘI hấp phụ theo chiểu ngược lại với tốc độ nhất định; khí Irơ sẽ kéo theo hơi của chít thơm và hơi của nhữiig chất này được ngưng tụ trong một ống làm lạnh bằng khí nitơ lỏng ( -196"C). Phương pháp Head- space có ưu diểm là phân tích nhanh, thiết bị đơn giản không đắt tiển. Nhimg phương pháp này khõng thích hợp với những chất bay hơi có nồng độ rất nhỏ. Hình 7.2.1. Lấy chất thơm ra ^ ^ khỏi cột hấp thụ; 1. cột hấp phụ chất thơm; 2. ống teílon; 3. binh chứa N2 lỏng (-196”C); 4. chất thơm ngưng tụ: 5. điện trở đun nóng : 6. phòng đun nóng. 189
  4. 7.2.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT NHỮNG CHẤT BAY HƠI TRONG DUNG DỊCH BẰNG CHƯNG CẤT Nguyên tấc của phương pháp này rất đơn giản; tách những chất bay hơi cc trong sản phẩm ra khỏi phần không bay hơi bàng chimg cất theo hơi nước. Đế’ trárứ cho chất thơm khỏi bị biến đổi tính chất ở nhiệt độ cao, người ta thường tiến hànl chưng câì ở nhiệt độ thấp tức là chimg cất ở áp suất chân không. Chimg cất theo hơ nước có thể chưng cất ở áp suất thường như chưiig cất tinh dầu trong các cây, qu; có chứa tinh dầu hoặc chimg cất ở áp suất chân không như chưng cất chất thơn trong sản phẩm thực phẩm. Chimg cất ở nhiệt độ cao thường làm cho những hợp chất thơm bị thay đổ tính chất như chúng bị biến tính hoá học, bị oxy hoá để biến thành những hợp chá khác. Chẳng hạn người ta thấy lượng mitxen trong tinh dầu chanh thu hồi bằnị phương pháp chưiig cất ít hơn so với lượng tinh dầu chanh thu được từ bằnị phương pháp ép lạnh, vì dưới táccÌỊing của nhiệt mitxel có thể chuyển thành linalol nerol và geraniol. Có nhiều loại thiết bị chưng cất tinh dầu, sau đây là nguyên lý của mộtS( thiết bị thường dùng. Thiết bị chưng cất dạng quay (Rotavơpor) kiểu Biiclti (Hình 7.2.2a) Dung dịch để cất (nếu mẫu phân tích là sản phẩm rắn, nghiền nhỏ và chí thêm nước vào), được đặt trong bình cầu 4, bình cầu này quay được nhờ mô to Bình cầu 4 được đặt trong nồi cách thuỷ giữ ở nhiệt độ 45-50"C. Để giữ cho thiết b làm việc ở nhiệt độ thấp, áp suất ở trong thiết bị được điều chinh vào khoảnj VOmmHg. Hơi cùa những chất thơm cùng hơi nước ở bình 4 bốc lên và được ngưn] tụ trên thành ống sinh hàn 7 và được thu vào bình 6 cầu; bình này được đặt tron] chậu nước đá (để tránh sự bay hơi của các chất dễ bay hơi). Một ống thu hồi 5 đượ đặt trong bình chứa nitơ lỏng (-196"C) được lắp vào giữa rotavapor và bơm châi không nhằm thu hồi những chất dễ bay hơi nhất. 190
  5. Hình 7.2.2a. Thiết bị chưng cất dạng quay: 1. bình chứa N2 lỏng: 2. bơm chân không: 3. mô tơ; 4. 5, 6. bình cầu; 7. ống sinh hàn. Sau khi kết thúc thí nghiệm, có thể phân tích riêng hai phần chất thcrm thu được ở hai bình6 và 5 hoặc trộn lẫn cả hai phần đem cô đặc và tiến hành phân tích bằng sắc ký khí. Lượng những chất bay hơi thu được trong bình6 thu được thường bằng khoảng 80% so với lượng châì ban đầu. Hiệu suất của những chất bay hơi thu được phụ Ihuộc vào thời gian chưng cất, lượiìg dung dịch ban đầu, nhiệt độ chưng cất. Thiết bị chưng cất chán không (Hình 7.2.2h) 191
  6. Hình 7.2.2b. Mô hình thiết bị chưng cất chân không: 1, bình đựng mẫu; 4. ống thu hồi chất bay hơl đặt trong N2 lỏng; 2, bình chứa nước chưng; 5 . ống thu hồi dạng xoắn đặt trong lỏng 3, ống làm lạnh ở 0°C; Mẫu phân tích được đặt trong bình cầu 1. Bình này được đun nóng trong bình cách thuỷ ở nhiệt độ từ 40-50"C. Để tạo cho sự bốc hơi được đều, trong bình 1 đặt một thanh từ vào nồi cách thủy được đun bằng máy điện lừ, thanh từ sẽ quay làm cho dung dịch được khuấy trộn, hơi chất thcfm cùng với hơi nước bay hơi qua ống sinh hàn 3, được ngimg tụ và rơi xuống bình cầu 2. Những chất dễ bay hơi hơn lại tiếp lục qua ống sinh hàn thẳng đimg 3 và được ngimg tụ trong cốc ống thu hồi 4, 5 đặt trong các bình chứa nitơ lỏng (-196"C). Sau khi kếi thúc thí nghiệm đem trộn nước ngimg tụ tại bình 2 và 4 rồi đem cô đặc và đem phân tích chất thơm bằng sác ký khí. 7.2.3 PHƯƠNG PHÁP TRÍCH LY Phương pháp trích ly là phirơng pháp cổ điển được dùng trong nghiên cứii chất thcrm. Nguyên tắc của phương pháp này là dựa vào sự hoà tan của các hợp chất có trong sản phẩm vào các dung môi hữu cơ. 192
  7. Phương pháp này thường được dùng đối với những sản phẩm đã được loại bỏ lipit hoặc những sản phẩm không béo. Nó rất thích hợp trong việc nghiên cứii chất thơm của các loại rượu. Tuy nhiên việc sử dụng dung môi để trích ly cũng có thể gày ra sự không chính xác do trong quá trình trích ly có thế tạo ra những chất mới, hoặc có thể làm cho mẫu phân tích bị nhiễm tạp chất, vì vậy dung môi đê trích ly đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao. Trong phương pháp trích ly việc chọn dung môi để chiết chất thơm rất quan trọng. Nhiều nghiên cứu về trích ly những hỗn hợp chất thơm cho thấy hiệu suất thu hồi đối với tìmg chất trong hỗn hợp thay đổi rất nhiều luỳ thuộc vào loại dung môi để trích ly. Dung môi trích ly chất thơm thường phải đảm bảo những yêu cẩu sau: - Dung môi phải có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ sôi của những chất bay hơi cần nghiên cứu, nhầm dễ dàng loại bỏ dung môi khi chưng cất và tránh sự tổn thất của những hợp chất dễ bay hơi. - Dung môi không hoà tan nước và rượii etylic. - Tính có cực (hằng sô' điện môi) của dung môi phải phù hợp với những chất thơm nghiên cứu, nhầm đạt hiệu suất trích ly cao, mỗi dung môi nhất định có tính đặc hiệu đối với một số loại hợp chất hiìii cơ tạo thành chất thơm. - Dung môi phải có khả năng dễ làm sạch. - Dung môi phải có ít mùi nhằm dễ dàng cho việc đánh giá mùi của chất thơm sau khi trích ly (bảng 7.2.3) Bảng 7.2.3. Những dung môi thường dùng trong trích ly chất thơm Tên dung môi Nhiêt đòsôi °c Tỷ trọng (d) Dicloromethan 40 1,325 Ete dietylic 34 0,714 Hexan 69 0,659 Pentan 36 0,626 Trichloroíluoro methan 24 1,49 (Freon II) 193
  8. Hoặc dùng hỗn hợp hai dung môi để trích ly dichloromethane/penlan (1:2); dichloromethane/penian (3:7); hoặc dichloromethane/hexan. Thiết *bị dùng để trích ly các chất thơm có trong các dung dịch ihirờng dùng là thiết bị kiểu Soxhlet. Có hai loại, loại dùng cho dung môi hCm cơ nặng hơn nước và loại dùng cho dung m ôi hữii cơ nhẹ hơn nirớc. Tlìiết bị trích ly dìiỉìg cho dung môi ỉỉhẹ lìơn nước Bình mẫu 4 được đun nhẹ ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ sôi của dung môi một ít (40"C đối với ete diethyl). Hơi dung môi bay hơi và được ngưng tụ ở ống sinh hàn 1 rồi rơi vào một cái phễu dẫn xuống tận đáy của tháp trích ly 3, tại đây có chứa chất lỏng cần trích ly. Dung môi nhẹ hơn nước sẽ nổi lên qua lớp dung dịch phân tích, hoà tan nhữiig chất thcrm có trong dung dịch phân tích và rơi xuống bình cầu 4 qua ống thông 6 , và cứ tuần hoàn như vậy cuối cùng la thu được chất chiết trong bình cầu 4. Hình 7.2.3a, Thiết bị trích ly lỏng: 1. ống sinh hàn; 2. nước vào; 3. tháp trích ly; 4. bình mẫu; 5. bể nhiệt; 6. Ống thông. Tlìiết bị trích ly dùng cho dung môi tiặng lỉơti nước Dung môi nặng hcm nước được đựng trong bình 4 và được đun nóng trong nồi cách thuỷ 5 (45"C đối với diclorometan). Hơi bay lên ngưng tụ trên thành ống sinh hàn 1 (ống sinh hàn được làm lạnh bằng nước đá 0‘’C) rồi rơi xuống tháp trích 194
  9. ly 3 qua ống thuỷ tinh 2. Trong tháp có chứa dung dịch mẫu phãn lích, Dung môi đi qua lớp dung dịch chứa chấl thơm, nó hoà tan chất thơm rồi lắng xuống đáy tháp và lại chảy sang bình 4, và cứ tuần hoàn như vậy, cuối cùng thu được dung môi và chất thơm tại bình 4. Hinh 7.2.3b. Thiết bị trích ly Ẳ dùng cho dung môi nặng -2 hơn nước: 1. ống sinh hàn; 2. ống: 5 4 0 3. tháp trích ly; o s 4. nổi cách thuỷ; 5. bể điều nhiệt. 7.2.4.PHƯƠNG PHÁP LIKENS - NICKERSON Phương pháp LIKENS - NICKERSON là phưcmg pháp kết hợp đồng thời vừa chưng cất vừa trích ly. Thiết bị chiết Likens - Nickerson (hình 7.2.4). Dung dịch phân tích được đặt trong bình cầu 1. M ột lượng nhỏ dung môi được đặt trong bình cầu cả 2. hai bình này đều được đun nóng trên nổi cách thuỷ đến nhiệt độ sôi. Hơi dung môi ở bình 2 và hơi nước kéo theo chất thơm ở bình 1 sẽ gặp nhau ở buồng 3 và được ngưng tụ trên ống sinh hàn rồi chảy xuống ống xiphông 5, ở đây do sự khác nhau về tỷ trọng, dung môi sẽ hoà tan các chất thcnn và nước sẽ tách ra, dung môi chứa chất thcím sẽ quay trở về bình2 , còn nước quay về bình1 . 195
  10. Thời gian chiết tuỳ thuộc vào mẫu phân tích, khoảng từ 30 phút đến vài giờ. Thường phương pháp phân tích này hay thực hiện ở áp suất khí quyển, nhưng để tránh hiện tượng các chất bị oxy hoá trong quá trình chiết, người ta thực hiện ở áp suất thấp. Hiệu suất tách chiết của phương pháp này tuỳ thuộc vào loại dung môi, vào nhiệt độ và thời gian chưng cất, vào độ pH của dung dịch chứa các chất thơm. Phương pháp chưng cất và trích ly đồng thời có ưu điểm nhanh, hiệu suất cao (>95%), chiết được những chất bay hơi có trong dung dịch ờ nồng độ loãng và tốn ít dung môi. Dung dịch chiết được nhiều khi không cần cô đặc. Hình 7.2.4. Thiết bị chiết Likens- Nickerson (loại dung môi nhẹ hơn nước): 1. bình cầu đựng dung dịch phân tích; 2. bình đựng dung môi; 3. buồng hỗn hợp hơi dung môi và hơi nước kéo chất thơm; 4. ống sinh hàn; 5. ống xi phông. 7.2.5. CÔ ĐĂC Sau khi chiết các chất thcrm bằng phương pháp chưng cất hoặc trích ly bằng các đung môi hữu cơ, dung dịch thu được cần được cô đặc trước khi đưa vào phân tích bằng máy sắc ký khí. Thường đối với phương pháp chưng cất theo hơi nước, dung dịch nirớc có chứa chất thcfm thường có nồng độ loãng, để cô đặc trước hết là tiến hành chiết lấy 196
  11. những chất thơm trong dung dịch nước bằng dung môi hữu cơ, sau đó cấl cho bay hơi dung môi bằng cột Vigreux. Dung dịch sau khi trích ly được đựng trong bình cầu 2. Sau đó lắp thiết bị như hình vẽ 7.2.5. Bình 2 được đun nóng đến nhiệt độ sôi, hơi dung môi sẽ qua cột Vigreux rồi qua ống sinh hàn và được ngưng tụ rồi rơi xuống bình thu hồi dung môi 4. Đun như vậy cho đến khi ở bình cầu 1 còn lại thể tích khoảng 2ml. Hình 7.2.5. Hệ thống cô đặc dung mòi sau khi trích ly: 1. cột Vigreux; 2. bình cầu; 3. dung dịch để cô đặc; 4. binh thu hổi dung môi; 5. đường nước vào. 7.2.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN ĐOẠN VÀ NHẬN BIẾT Dung dịch chiết được là hỗn hợp các cấu tử chất thcrn. Để tách được các cấu tử chất thơm, người ta dùng phương pháp chưng cất phân đoạn, các phương pháp sắc ký. Hiện nay để phân tách từng cấu tử chất thcfiĩi, phương pháp hay dùng nhất là phương pháp sắc ký khí (hình 7.2.6a). 197
  12. Cóiiạ Ixnii IU .H I Hình 7.2.6a. Nguyên lý phương pháp sắc ký khí Hỗn hợp chất thơm sau khi chiết được bằng các phương pháp trên được cô đặc và được đưa vào máy sắc ký khí để tách tìmg cấu tử chất thơm. T iiỳ từng loại hợp chất bay hơi mà người ta sử dụng các máy sắc ký có cột và detectơ khác nhau, thông dụng nhất là loại detectơ ngọn lửa ion hoá. Căn cír vào phổ sắc ký người ta định lượng được các hợp chất bay hơi có trong dung dịch mẫu phân tích. Thành phần của hỗn hợp chất thơm được thể hiện dưới dạng tín hiệu cùa detectơ hay còn gọi peak trên sắc ký đồ. Để xác định tên gọi của từng peak, cần dựa vào thời gian luxi của chất chuẩn đã được phân tích trên cùng chương trình phân tích. Định lượng thành phần trong hỗn hợp, có thể dựa vào tỷ lệ phần trăm diện tích peak hoặc bằng phương pháp xây dimg đường chuẩn, kết hợp với detectơ khối phổ (hình 7.2.6b). 198
  13. Hinh 7.2.6b Nguyên iý hoạt động của detectơ khối phổ 7.3. PHẦN THỰC HÀNH Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu là chỉ số đặc trưng về chất lượng của nguyên liệu đó. Để xác định hàm lượng tinh dầu có thể dùng phưcfng pháp chưng cất với các loại thiết bị khác nhau. Bài I. Chimg cất tỉnh dầu theo phương pháp Clevende a. Dụng cụ, lioá chất - Thiết bị Clevende - Bếp điện - Nước cất b. Cách tiến liànlì Mẫu nguyên liệu (hoa hồi đã được nghiền nhỏ hoặc lá hương nhu đã được thái nhỏ) được cân khoảng 25-50g (tuỳ thuộc vào lượng tinh dầu trong nguyên liệu nhiều hay ít) cho vào bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3a. Đặt bình cầu lên bếp điện. Qua ống sinh hàn 3 rót vào bình cầu 150-200ml nước cất rồi đun. Nước trong bình sôi. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu sẽ theo ống dẫn hơi lên ống sinh hàn và ngưng tụ lại chảy xuống ống thu tinh dầu, ở đây do tinh dầu không hoà tan trong 199
  14. nirớc và tùy theo khối lượng riêng của nó lớn hơn hoặc nhỏ hơn khối lượng riêng của nước mà chìm xuống dưới (hình 7.3a A) hoặc nổi lên trên (hình 7.3a B), hoặc, còn nước chưng theo ống xiphóng b hồi lini vào bình cầu 1. Thời gian chưng cất kéo dài cho tới khi thấy lượng trong ống ihu c không đổi thì ngừng cất (khoảng 2-3 giờ tuỳ thuộc vào loại nguyên liệu). Sau khi chimg cất kết thúc, để nguội, đọc lirợiig tinh dầu trong ống thu. a. Tính kết quả: Hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, tính theo % khối lượng nguyên liệu được xác định bằng công thức sau: a. 7.100 E% = m trong đó: a: thể lích tinh dầu có trong ống thu; ỵ : khối lượng riêng của rinh dầu; m: khối lượng pơuyên liệu nghiên cứu. Nếu tính hàm lượng tinh dầu theo khối lượng chất khô tuyệt đối thì: 200
  15. a.y.ioo Et% = m (lOO- w) 100 trong đó: W- hàm ẩm của nguyên liệu; Các ký hiệu khác như trẽn. Bài 2. Chưng cất tính dăii theo phương pháp Ghinbe Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng tinh dầu trong nguyên liệu hoặc trong nước chưng, loại nhẹ hơn nước. a. Dụng cụ, hoá clìấí Bình cầu 500ml; Bếp điện; Ống sinh hàn; Nước cất. Ống Ghinbe; b. Cách ĩiển lìàỉìlì Cân 30-40g nguyên liệu đã nghiền nhỏ hoặc 250-300ml nước chưng cho vào bình cầu 1. Lắp thiết bị như hình vẽ 7.3b: Hinh 7.3b. Thiết bị Ghinbe: 1. bình cầu; 2. ống Ghinbe; ống Ghinbe 3. ống sinh hàn; 4. bếp điện. 201
  16. Nếu xác định hàm lượng tinh dầu của nguyên liệu, qua ống sinh hàn rót vào bình cầu 250-300ml nước cất. Đun sôi bình cầu trên bếp điện. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu bay lên ống sinh hàn 3 ngưng tụ lại chảy vào ống Ghinbe. Tinh dầu nằm ở trên còn nước chưng theo ống xiphông chảy về binh cầu. Thời gian chimg cất kéo dài khoảng 2-3 giờ. Khi thấy nước tinh dầu trong ống Ghinbe không thay đổi thì ngừng cất, để nguội. Lấy ống Ghinbe ra đọc lượng tinh dầu. d. Tíitli kết quả Cách tính kết quả như bài 1. Bài 3. Phân tích thành phần tỉnh dầu bằng phương pháp sắc ký khí 1. Nguyên tắc Khi bơm mẫu vào buồng bơm mẫu, dưới tác dụng cùa nhiệt độ làm bay hơi các cấu tử của dung môi và của các cấu tử cần phân lích. Dòng khí mang sẽ dẫn các cấu tử bay hơi vào cột tách sắc ký, tại đày diễn ra sự tương tác giữa các chất hấp phụ được phủ bên trong cột và các cấu tử nên các cấu tử bị giữ lại trên cột. Tuỳ theo tính chất của các cấu tử mà tương tác với chất hấp phụ khác nhau nên thời gian lim của các cấu tử cũng khác nhau. Dòng khi mang vẫn được đưa liên tục vào cột tách và nó sẽ mang những cấu tử đã tách ra khỏi cột tách qua ngọn lửa hyđro do đó làm thay đổi độ dẫn điện của ngọn lửa. Dctector sẽ ghi lại sự thay đổi này và đưa ra sắc ký đồ của cấu tử cần phân tích 2. Dụng cụ, rliiết bị a. Dụng cụ Càn phân tích 10-4g; ống thuỷ tinh. Xylanh 1 |,il; b. Thiết bị Thiết bị ký sắc ký khí GC 2010, Shimadzu, Nhật Bản; Điều kiện chạy máy ; Khí mang: nitơ; Vận tốc dòng: 1,25 m l/ p h ú t; 202
  17. Detector: detector ion hoá ngọn lửa (FID); Cột tách: DB Wax, 60 m X 0,25 mm X 0,25 um; Chế độ chia dòng: 1 :50; Chương trình nhiệt độ: "c70 (2 phút), 2"c/phút, 230 "c (20 phút); Nhiệt độ injector và detector: 250 ”C; Thể tích mầu: 0,2 |.il. 3. Hóa chất, thuốc thử a. Hoá chất, thuốc thử Qíc loại dung môi và chất chuẩn thuộc nhóm monoterpen, sesquiterpen độ tinh khiết 99,9%; Khí nitơ 99,999%. 1. Kết quả lín hiọu săc ký Hình 7.3.3. sẳcký đổ tinh dầu Citrus kumquat (DB Wax, 60m X 0,25 mm X 0,25 um) 203
  18. Bảng 7.3.3. Một số thành phần tinh dẩu mẫu Citrus kumquat Hàm lượng STT Thành phần Thời gian lưu (% diên tích peak) 1 p - Pinen 7,2 0,250 2 Sabinen 8,6 0,107 3 3 - Caren 8,8 0,192 4 Mycren 9,2 1,627 5 a -Phellandren 9,7 0,055 6 Limonen 11,5 94,817 7 p - Phellandren 11,9 0,101 8 z - |3 - Ocimen 13,0 0,013 9 Terpinolen 14,0 0,004 10 Octanal 14,5 0,172 11 Tetradecan 14,8 0,059 12 Z- Limonen oxyt 16,8 0,004 13 Menthon 17,6 0,010 14 Citronellal 20,0 0,035 15 Decanal 20,8 0,123 16 /7-Cubeben 23,3 0,012 17 Octanol 25,3 0,011 18 Terpinen - 4 - ol 27,4 0,029 204
  19. Chương 8 VITAMIN 8.1. GIÓI THIỆU Các vitamin được chia làm hai nhóm - Nhóm hoà tan trong chất béo gồm các vitamin A, D - Nhóm hoà tan trong nước gồm vitamin nhóm B (B l, B2 ) và vitamin c. Nói chung các loại thịt, cá, trứrig, sữa có đủ các vitamin hoà tan trong chất béo và vitamin hoà tan trong nước. Riêng gạo và trứng có chứa nhiều vitamin A, D cũng như B l, B2 Ngũ cốc chủ yếu chứa vitamin nhóm B nhưng hoàn toàn không có vitamin c. Trong ngũ cốc chỉ có ngô vàng chứa khoảng 0,4mg caroten trong lOOg. Các loại hạt họ đậu là nguồn cung cấp vitamin nhóm B rất tốt và một lượng nhỏ caroten, còn vitamin nhóm B và vitamin c ở hàm lượng rất thấp. Các loại rau quả có đầy đủ caroten, vitamin nhóm B với lượng rất ít nhưng lại chứa khá nhiều vitamin c. Ngày nay một số vitamin còn được gọi theo bản chất hoá học của chúng, ví dụ; Vitamin c là axit ascorbic, BI là thiamin, B2 là riboílavin Trong chương này, chúng tôi chỉ trình bày một sô' phưcmg pháp xác định caroten, vitamin A, vitamin c và vitamin B l, B2. 205
  20. 8.2. CAROTEN VÀ VITAMIN A Vitam in A chỉ được tổng hợp trong cơ thể người từ caroten của thực vật do thức ăn đưa vào cơ thể. Dưới tác dụng của men carotenaza, caroten tạo nên vitamin A. Trong thực vật tồn tại cả ba loại đồng phân của caroten: a, p và y-caroten, trong đó quan trọng nhất là P-caroten. Do tác dụng của vitamin A và caroten đối với cơ thể rất giống nhau nên khi phân tích cần xác định caroten riêng hoặc xác định lổng lượng caroten và vitamin A. Thông thường đối với thực phẩm nguồn gốc thực vật người ta quy hoàn loàn ra caroten, đới với thực phẩm nguồn gốc động vật thì quy hoàn toàn ra vitamin A trên cơ sờ 3 caroten bằng 1 vitamin A. Bài 1. Xác định caroten bằng phương pháp sắc ký cột a. Nguyên tắc Tách caroten ra khỏi lương thực, thực phẩm bằng phương pháp sắc ký cột rồi đem so màu. b. Dụng cụ, lioá chất - Cân phân tích - Bình định mức V = 50ml, lOOml - Cối sứ - Máy so màu - Cột sắc ký: dài 30cm, o = Icm - Cát tinh chế: đổ cát qua rây có đường kính lỗ 4 - 5mm. Rửa cát qua rây bằng nước máy, rồi dùng HCl (tỷ lệ 1/1) cho vào cát, khuấy kỹ, ngâm 1 đêm. Rửa cát cho tới hết axit. Rửa lại bằng nước cất, sấy khô. - Benzin: nhiệt độ sôi 70 - 80"C. - Chấp hấp phụ; Nhôm oxyt2 O,) (A I loại dùng cho sắc ký, sấy ở 100"C trong 1 giờ, bảo quản trong bình làm khô có chất chống ẩm silicagen. - Natrisuníat khan (Na 2S0 4 ). 206
  21. - Dung dịch azobenzen tiêu chuẩn: Cân chính xác 0,145g azobenzen cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm rượu etylic 96% đến vạch mức, lắc kỹ. Khi thí nghiệm, đem dung dịch này pha loãng gấp 10 lần bằng rượu etylic 96%. Dung dịch này để ở chỗ tối, màu sẽ không biến đổi. c. Cách tiến hành Cân 5 gam mẫu lương thực, thực phẩm khô cho vào cối sứ, nghiền kỹ với 5 gam cát sạch trong 30 phút. Đê làm khô kỹ, ta cho thêm vào cối sứ 10 gam Na 2S0 4 khan nghiền tiếp hỗn hợp trong 30 phút nữa. Phần dưới của cột sắc ký được nhồi bông thấm nước. Sau đó cột được nhồi nhôm oxyt khoảng 2/3 cột. Dùng đũa thuỷ tinh nén nhôm oxyt cho chặt. Trên cùng lại đặt1 lớp bông dày 1 cm. Bột khô từ cối được chuyển vào phần trên của cột sắc ký. Cho benzin vào cột đến khi thấy lớp bột không thấm benzin nữa. Sau đó dùng bơm hút nhẹ để lớp bột được rửa chầm chậm bằng benzin đến khi không còn thấy những giọt màu vàng chảy ra khỏi cột sắc ký vào bình hứng. Cần chú ý cho benzin phủ ngập lớp bột vì caroten để bị oxy hoá bởi không khí. Chuyển toàn bộ caroten từ bình hứng vào bình định mức dung tích 50ml hoặc lOOml (tuỳ thể tích nước hứng được) và thêm benzin đến vạch mức, lắc nhẹ. Dung dịch caroten này được đem so màu cùng với dung dịch azobenzen tiêu chuẩn (đã pha loãng 10 lần). Trong Im l dung dịch có mầu giống dung dịch azobenzen tiêu chuẩn chứa 0,00235 mg caroten. c. Tính kết CỊiiả Hàm lượng caroten (tính theo mg trong lOOg sản phẩm) được tính bằng công thức: 0,00235.lOO.V.D,, x = in trong đó: V - dung tích bình định mức chứa dung dịch caroten trong benzin, ml; G - lượng mẫu cân, g; 207
  22. D,,. - mật độ quang hoặc chiều cao thước (trên máy Dubốt) của dung dịch azobenzen tiêu chuẩn, mm; D „ - mật độ quang, hoặc chiều cao thước (trên máy Diibốt) của dung dịch caroten, mm. Hình 8.2. Cột sắc ký xác định caroten Bài 2. Xác định vitamỉn A bằng phương pháp so màu a. Nguyên tắc Vitam in A là một alcohol cao cấp chưa no có công thức hoá học như hình sau và thường kết hợp với axil béo (palinitic và stearic) tạo thành este phức tạp. Vì vậy khi muốn xác định vitamin A phải xà phòng hoá các sản phẩm, rồi xác định vitamin A trong phần không xà phòng hoá. Vitamin A được tách ra khỏi dung dịch không xà phòng hoá bằng cloroform khan và nó cho phản ứng với antimon (III) clorua tạo sản phẩm màu xanh và đem so màu với dung dịch tiêu chuẩn. HsC^ ^CHa / ^ \ H2C ọ (CH=CH-CCH3=CH)2-CH20H H2Ò^ c — CH3 c H2 V it a m in A 208
  23. iì. Dụiiị’ cụ, lioá chất - Cân phân tích; - Bình nón dung tích 250ml; - Phều chiết; - Ông làm lạnh; - Nồi cách thiiỷ, cốc thuỷ tinh dung tích 250ml, bình định mức dung tích 25ml, 500ml; - Ong nghiệm dung tích lOml, 22 cái, giá để ống nghiệm; - Dung dịch màu tiêu chuẩn được chuẩn bị như sau: cân 75g đồng sunfat (CUSO4 .5 H2 O) và 3,5g coban nitrat Co(NO ,)2 cho vào bình định mức dung tích 500ml, thêm nước đến vạch mức, lắc kỹ cho tan hết. Từ dung dịch này tạo dãy màu tiêu chuẩn theo bảng 8.2.4. Bảng 8.2.4. Dãy dung dịch màu tiêu chuẩn SỐ ống s ố m l Sô đơn Số ống Số ml Số đơn nghiệm DD gốc Nước vi màu Nghiệm DD gốc Nưóc vi màu 1 20 0.0 9.2 12 20 31,6 4.0 2 20 0.4 9.0 13 20 41.2 3.5 3 20 1.6 8.5 14 20 55.4 3.0 4 20 3.0 8.0 15 20 742 2.5 5 20 4.5 7,5 16 20 104,2 2.0 6 20 6.3 7,0 17 20 131,0 1,75 7 20 8.7 6.5 18 20 175,0 1.5 8 20 11.6 6.0 19 20 190,0 1,25 9 20 14,6 5.5 20 20 240,0 1.0 10 20 19,0 5.0 21 20 330,0 0,75 11 20 24,4 4,5 22 Nước cất - - - Giấy quì, natri suníat khan: đã sấy ở 100"C trong 1 giờ - Cloroform (CHCl,): Rửa 5 lần bằng nước cất tỷ lệ 2 nước : 1 cloroíorm trong phễu chiết rồi làm khô bằng natri simfat khan sau đó chưng cất để thu dịch tinh chế. 209
  24. Dung dịch antimon (III) clorua (SbClO bão hoà: SbCl, được rửa bằng cách khuấy trong cloroíorm đến khi nuớc rửa không màu, SbCli đã rửa được để trong bình làm khô (có chứa axit suníuric đặc) qua 2 ngày, sau đó hoà tan SbCl, trong cloroform đến bão hoà. - Ete etylic tinh khiết - Kali hyđroxit dung dịch 20% trong rượu etylic b. Cách tiến hành Cân 10 đến 20 g mẫu cho vào bình nóng dung tích 250ml thêm 20ml dung dịch kali hyđroxit 20% trong rưcru etylic. Đậy bình bằng nút bấc có gắn ống làm lạnh và đun hồi lưu trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ 85 - 90"C trong 2 giờ để xà phòng hoá. Dung dịch đã xà phòng hoá được pha loãng bằng 20ml nước cất rồi chuyển vào phễu chiết. Thêm vào phễu chiết 50ml ete etylic và lắc kỹ (để tránh tạo huyền phù, cần chiết dịch lúc nguội và lắc mạnh) chiết phần không xà phòng hoá ra (lớp trên) vào một phễu chiết thứ hai. Lại thêm 25ml ete etylic vào phần xà phòng hoá, tiếp tục lắc và chiết lấy lớp trên vào phễu chiết thứ hai. Rửa dịch chiết bằng nước cất trong 3 - 4 lần mỗi lần2 0 ml nước cất cho đến khi nước rửa có phản ứng trung tính (thử bằng giấy quỳ). Làm khô nước chiết đã rửa bằng6 gam natrisunfat khan trong 30 phút. Chuyển cả dung dịch vào cốc, sau đó đun đuổi ete trên nồi cách thuỷ. Hoà tan cặn không xà phòng hoá thu được bằng cloroform (sau khi đã đuổi hết ete) và chuyển vào bình định mức dung tích 25ml, thêm cloroíonn cho đến vạch, lắc nhẹ. Cho vào 1 ống nghiệm (khô, sạch, cùng màu, cùng kích thước như ống nghiệm chứa dung dịch tiêu chuẩn) đúng 0 ,2 ml dung dịch trong bình định mức trên, thêm vào 1 - 3 giọt anhydric axetic, 2ml dung dịch SbCl, bão hoà lắc nhanh và để không quá 10 giây đem đo màu với ống tiêu chuẩn trong 2 0 giây. c. Tính kết quả Hàm lượng vitamin A tính theo đơn vị màu của ống tiêu chuẩn có màu trùng với màu của ổng nghiệm chứa dung dịch mẫu. Nếu màu của ống mẫu nằm giữa màu của 2 ống tiêu chuẩn thì lấy trị số trung bình. Cuối cùng hàm lượng vitamin A (mg trong lOOg sản phẩm) tính bằng công thức: 210
  25. n .v X = G.4 n - số đơn vị màu tìm được khi so màu; V - dung tích bình định mức chứa dung dịch không xà phòng hoá trong cloroíorm, ml; G - lượng mẫu cân, g; 4 - hệ số thực nghiệm để tính ra mg%. 8.3. NHÓM VITAMIN c, BI VÀ B2 Bài 3. Xác định vitamin c a. Nguyên tắc Vitam in c (axit ascorbic) có phổ biến trong cơ thể động và thực vật. Nó tham gia vào nhiều quá trình oxy hoá khử xảy ra trong cơ thể người. Trong phân tử ascorbic chứa nhóm dienol (-COH=COH-) có tính khử mạnh. Vitamin c dễ bị oxy hoá thành axit dehydroascorbic, phản ứng có tính thuận nghịch. 0 = c 0 = 9 ■2H 1 c — OH ò = 0 Ó o c — OH c HỌ HC HO— ỘHI. HO— CH L CH2OH CH2OH Axit ascorbic Axit dehydro ascorbic Axit dehydroascorbic cũng như axit ascorbic là chất hoạt động sinh học mạnh và chống xuất huyết. Dựa trên tính khử-mạnh của axit ascorbic người ta đã đề ra hàng loạt phương pháp hoá học để định lượng nó. Tuy nhiên, cho kết quả chính xác nhất và hay dùng nhất là phương pháp cho axit ascorbic khử muối natri của 2 ,6 diclophenolindophenol. Màu xanh đen của chất chỉ thị này (dạng oxy hoá) khi gặp axit ascorbic sẽ chuyển thành không màu (dạng khử). 211
  26. Xác định vitamin c dựa trên nguyên tắc: vitamin c được chiết ra khỏi lương thực, thực phẩm bàng axit axetic hoặc axit clohydric. Các chất khử khác và chất màu khác phải được tách ra khỏi nước chiết bằng chì axetat. Sau đó chuán độ nước chiết trong môi trường axit (pH = 3-4) bằng 2,6 diclophenolindophenol, rồi tính ra lượng vitamin c. b. Dụng cụ lioủ chất - Cân phân tích; - Bình định mức dimg tích lOOml, lOOOml; - Cốc dung tích lOOml; - Bình nón dung tích 200ml; - Pipet các loại; - Microburet; - Giấy lọc; - Phễu thuỷ tinh, cối chày thuỷ tinh hoặc sứ,thuỷ bột tinh hoặc cát sạch; - HCl 1% hay CH,COOH 5%, axit metaphotphoric 2% hay axit oxalic 1%; - Dung dịch oxalat amoni bão hoà, dung dịch hồ tinh bột 1%; - K I tinh thể, H2SO4 2%, axit ascobic tinh thể (tinh khiết); - Dung dịch muối natri 2,6 diclophenolindophenol 0,001 N. Cho 0,15g 2,6 diclophenolindophenol vào bình định mức dung tích 500ml, thêm 350 ml nước cất và tiếp đó dung dịch đệm photphat có pH = 6,9-^7,0 cho tới vạch mức. V ì trong dung dịch nước thuốc thử này bị phá huỷ rất nhanh nên phải pha trong dung dịch đệm. Dung dịch đệm có pH = 6,9-^7,0 được pha như sau: trộn 2 thể tích KH2PO4 (9,078 gam trong 1 lít) và 3 thể tích Na 2HP0 4 (11,867 gam NÍI2HPO4 .2 H 2O trong 1 lít nước) với nhau trước khi đem dùng. Thuốc thử 2,6 diclophenolindophenol được bảo quản trong bình có màu ở nơi tối. 212
  27. c. Cách tiến hành - Chuẩn bị mẫu thử: Tất cả các sản phẩm dạng lỏng hoặc bột đểu phải trộn đều nhưng không lắc để tránh lên bọt khí. Lượng cân sản phẩm lấv tiiỳ thuộc vào hàm lượng vitaminc của nó. Khi hàm lirợng ít thì lấy mầu nhiều hoặc ngược lại. Theo kinh nghiệm thì nên lấy lượng cân các sản phấm như sau 8.3a. Báng 8.3a. sảnphẩm và lượng mẫu tương ứng Mầu Lưọng cản Thực vật tươi (rau, quả) 10 - 50 g Nước ngọt (cam, chanh 1 - 50 g Đổ hộp 5 - 10 g Quả khô 10 g Chuẩn độ đối với xán plìẩiìi lỏng Lấy một lượng cân chất lỏng nhất định cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào bình 20ml dung dịch axit clohydric 1% hoặc axit axetic 5% thêm nước cất đến vạch mức lắc kỹ. Nếu thấy có cặn cần lọc lấy dịch trong. Hút lOml dịch trong và đem đi chuẩn độ bằng dung dịch 2 ,6 diclophenolindophenol. Clniẩii độ đối với sản pliẩiiì dạng kììác Cân vào cối sứ lượng mầu như đã nêu ở trên, thêm H1% C l hoặc axit axetic 5% cho ngập mẫu. Nghiền cẩn thận mẩu, tiếp đó chuyển hoàn toàn hỗn hợp vào bình định mức dung tích lOOml. 'riiêm vào bình định mức dung dịch axit metapholphoric 2% (25ml) để loại bỏ prolein và giúp cho quá trình lọc được dể dàng, rồi thêm H C l 1% đến vạch mức. Có thể dùng axit oxalic 1% dế tráng cối và thèm đến vạch mức, hoặc dùng axetat chì 5% (5ml) để kết tủa protein, loại trừ chất khử và sắc tố. Khi thí nghiệm với các phẩm vật có nguồn gốc dộng vật thì dùng axit tricloaxetic 20% sao cho nồng độ cùa nó đạt 5% trong dimg dịch (25 ml). Trường hợp không có axit metaphotphoric hoặc oxalic, có thể chi dùng riêng một mình H C l 1% hay axit axetic 5%. Sau khi để yên 10 phút, lắc cẩn thận và lọc. 213
  28. Dùng pipel hút vào bình nón hoặc cốc nhỏ 5ml dịch lọc có chứa vitamin c, ihẻm 5ml dung dịch oxalat amoni bào hoà, lOml nước cất và định phân bằng dung dịch 2,6 diclophenolindophenol 0,001N từ microburei cho tới xuất hiện mầu hồng bền (không mất mầu trong 1 phút). Trường hợp dùng axit oxalic thì không cần cho thêm oxalat amoni nữa. Chú ý Khi xác định vitamin c irong một phẩm vật nào đó phải tiến hành phân tích ít nhất là 2 mẫu thí nghiệm, đối với mỗi mẫu - 2 lần xác định. Kết quả định phân không được sai lệch nhau quá 0,03ml 2,6 diclophenolindophenol 0,001 N. Phải dùng microburet để định phân. Thời gian định phân không kéo dài quá 2 phút và lượng 2,6 diclophenolindophenol dùng trong định phân nên ở trong khoảng l - 2 ml (không quá 2 ml). c. Tính kết quả Hàm lượng vitamin c (mg %) tính theo công thức: ^ _ (a-b)f.V.100 X — 5.m trong đó; a: sô' ml 2, 6 diclophenolindophenol dùng định phân dịch chiết vitamin C; b: sô' ml 2 , 6 diclophenolindophenol dùng định phân mẫu kiểm chứng (hỗn hợp các thuốc thử đem dùng); f: số mg axit ascorbic ứng với 1 ml dung dịch 2 ,6 diclophenolindophenol; v: tổng thể tích pha loãng; m: lượng mẫu cân, g: 5: 5ml dịch lọc hút đem chuẩn độ. Để xác định hệ số f ta tiến hành như sau: Hoà tan 1 - l,5mg (lấy ước lượng không cần cân) axit ascobic tinh khiết trong 50ml H2SO4 2%. Lấy cnính xác 5ml dung dịch đó và chuẩn độ bằng dung dịch 2,6 diclophenolindophenol cho đến màu hồng bền (không mất màu sau 1 phút). 214
  29. I.ấy vào một bình khác 5ml dung dịch axit ascorbic tinh khiết trên, thêm l vài hạt tinh thể K I (3 - 5mg) và 5 giọt 'dung dịch hồ tinh bột 1% rồi định phân bằng dung dịch KIO, chính xác 0,00 IN cho đến khi xuất hiện màu xanh. Hệ số f được tính theo công thức: ^ 0,08 8 .a b trong đó: 0,088 - số mg axit ascobic ứng với Iml dung dịch KIO, 0,001N; a - sô' ml KIO , 0,00IN dùng định phàn 5ml dung dịch axit ascobic; b - sô' ml 2,6 diclophenolindophenol dùng định phân 5ml dung dịch axit ascorbic tinh khiết trên. Bài 4. Xác định vitamỉn Bị bằng phương pháp đo màu huỳnh quang Vitam in B i (thiamin) có công thức cấu tạo như sau: .N HịCI CH3 H2 c—c — CH2OH H2 H2 H3C— c ■ c— c • Cl CH HC' Vitamin B| ở dạng este pirophotphoric là một tiền men cacboxylaza tham gia vào sự trao đổi gluxit. Thiamin là chất kết tinh không màu. Trong môi trường trung hoà và kiểm, nó rất nhạy với nhiệt ciộ cao (dễ bị phân huỷ hoặc tự phân huỷ). Vitamin B| bền trong môi trường axit, ở pH = 3 nó không bị phân huỷ khi đun nóng tới 120"C. Thiamin dễ tan trong nirớc, trong rượu etylic loãng, trong rượu metylic, trong axit axetic và không tan trong cloroíorm, rượu butylic, isobiitylic, isoaniylic ete petrol, ete suníuric. Thiamin rất nhạy với chất oxy hoá và chất khử. M ột điểm đặc biệt là khi bị oxy hoá nó biến thành thiocrom. Chất này dưới ánh sáng tử ngoại có màu huỳnh quang xanh. Đây là cơ sở của phương pháp xác định vitamin B| vì phản ứng oxi hoá thiamin thành thiocrom xảy ra theo đúng tỷ lệ đương lượng; một phân tử thiamin tạo thành một phân tử thiocrom. 215
  30. Để phán ímg trên có thể xảy ra. trước hết phải giải phóng thiamin ra khỏi mẫu bằng chế phẩm men. b. Dung cụ, lioá chất - Cân phân tích; - Nồi cách thiiỷ; - Ông nghiệm; - Phều thiiỷ tinh; - Cối thuỷ tinh; - Phếu chiết, bình định mức, máy huỳnh quang. - Rượu biitylic, isobutylic hoặc isoamylic. Các rirợii này phải không phát huỳnh quang. Có thể khử chất phát huỳnh quang bằng than hoạt tính (15 gam than cho Iml rượu): rượu trộn với than lắc 30 phút trên máy lắc, làm khan bằng CaCl2 và cất ở nhiệt độ thích hợp. - Chế phẩm men của khuẩn ti penicilliiim, khiiẩn li penicillium được sấy khô ở nhiệt độ dirới 40"C rồi chiết lấy men bằng cách nghiền khuấn ti với một ít dung dịch natri axetat. - Dung dịch vitamin B| tiêu chuẩn - Dung dịch cơ sở (a) được pha như sau: hoà tan 10 gam tiiih thế thiamin vào lOml axit clohydric ciiing dịch nồng độ O.OOIN, chuyển toàn bộ dung dịch vào bình định mức dung tích lOOml. Thêm nước cất đến vạch mức, lác kỹ, Iml dung dịch này chứa 100|.ig thiamin. Dung dịch này được đựng trong chai màu, đế' chỗ mát trong 1 tháng không bị hỏng. Lấy Iml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, Iml dung dịch này chứa 1 fig thiamin. Dãy tiêu chuẩn (b) được chuẩn bị như sau: từ dung dịch trên, lấy vào một dãy ống nghiệm lần lượi 0,5; 1; 1,5; 2ml (chứa 0,5; 1; 1,5; 2 y thiamin) rồi thêm vào 3, 5; 5; 2,5; 2,0ml nước cất và Iml K,Fe(CN)fi dung dịch 1% (vừa điểu chế). Cuối cùng cho vào mỗi ống 3ml natri hydroxit dung dịch 15%, lắc nhanh. Mỗi ống lại được cho vào lOml rượu butylic, lấc kỹ. Để yên 2 phút, dung dịch sẽ tách thành 2 lớp, tách bỏ lớp dưới. Cho vào đó Ig natri suníat khan. Dung dịch rượu khan chứa thiocrom được cho vào dãy ống nghiệm khác. Ta đirợc một dãy màu tiêu chuẩn bền trong 2 - 3 ngày. 216
  31. r. Cách liến liàiili Cân 5 - lOg mẫu, nghiền kỹ trong cối sứ với 10 - 15ml H 2 SO4 0,1N. Chuyên cả vào bình định mức, thêm H 2SO4 đến 75ml. ỉ)ặi bình vào nồi cách tliiiý sôi trong 45 pliút, lác đều. Đế nguội bình và cho chế pliárn men vào (cứ 2 gam inảii cân 0,03 gam khuẩn ti khô) bằng cách: cân khuán ti penicillÌLim, tán nhỏ trong cối thiiỷ tinh với 2 - 3ml natriaxetat dung dịch 30% rồi chuyến \’ào bình định mức thêm nalri axetat đến pll = 5. Đặt bình vào máy điều nhiệl ở 4Ơ"C trong 12 giờ. Sau đó lấy bình ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc. Hút lấy lOml nước lọc cho vào phều chiết, thêm \'ào 20ml rượu butylic, lắc mạnh 1 - 2 phút. Chiếl, tách lớp rượu ra. 'rhêm vào Iml K,Fe(CN)fi dung dịch 1% và 3ml natri hydroxit diing dịch 15%, lắc nhanh hỗn hợp và thêm vào lOml rượu butylic, lại iắc. Tách bỏ lớp nước, còn lớp rượu choqua giấy lọc chứa NÍI2SO4 khan. Sau đó chuyển dung dịch vào ống nghiệm có cùng kích thước, cùng dung tích và màu thuỷ tinh giống Iihir dãy ống tiêu chuẩn. Đo cường độ huỳnh quang của mẫu thử - so với dãy tiêu chuẩn trên máy huỳnh quang. Đo cường độ huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại của đèn thạch anh ihuỷ ngân 71 K-4, dùng kính lọc màu đen. d. Tíiili kết quả Hàm lượng vitamin B| (mg%) tính bằng công thức a.V.IOO X- V, .0.1000 trong đó: a- lượng thiarnin có irong ống tiêu cliuẩn có màu huỳnh quang trùng với ống chứa mẫu thử, |.ig; V - dung tích bình định mức, ml; V| - thể tích dung dịch thử lấy để oxi hoá, ml; Ci - lượng mẫu cân, g. 217
  32. 1 0 0 0 - giá trị chuyển đổi từ ng sang mg. V’/' dụ tíiili toán Giả sử càn 10 gam gạo, sau khi nghiền và định mức trong bình địiih mức dung tích lOml đem oxi hoá. Cuối cùng đo cường độ huỳnh quang màu của ống chứa mẫu thử trùng với màu của ống chứa 1,5 |.ig dãy thiamin chuẩn. Vậy hàm lượng thiamin (mg%) trong gạo là: 1,5.100.10 X = — = 0,15mg% 10. 10.1000 G hi chú 1. Đây là phương pháp xác định lượng nhỏ vitamin B| nên các thao tác cần phải làm tỉ mỉ, thận trọng, nhất là quá trình chiết. 2. K,Fe(CN)fi trong môi trường NaOH là chất oxi hoá thiamin thành thiocrom. Bài 5. Xác định vitamin B2 bằng phương pháp huỳnh quang a. Nguyên tắc Vitamin B 2 (RiboAavin) chứa nhiều trong men bia, gạo, bột mì, khoai tây và trong các sản phẩm lương thực, Ihực phẩm khác. Công thức hoá học của ribofIavin như sau H2C (CHOHla-CH^OH H 1 H3 C. ^ 9 = 0 1 ĩ I ^NH I, H II 0 Riboílavin là chất kết tinh màu vàng, vị đắng. RiboAavin liên kết với axit photphoric trong thành phần của men gọi là men ílavin thuộc vào nhóm dehydraza hiếu khí. Do vậy vitamin B 2 tham gia vào quá trình oxi hoá khử. Khi bị khử dạng màu vàng của vitamin B 2 chuyển thành dạng không màu. Riboflavin có màu huỳnh quang vàng xanh trong dung dịch nước trung tính. Khi bị axit hoá hoặc kiềm hoá, 218
  33. màu huỳnh quang của riboAavin giảm dần rồi mất hẳn. RiboAavin bị phân huỷ trong môi trường kiềm, bền trong axit. Đặc tính phát huỳnh quang của riboflavin là cơ sở của phưcfng pháp định lượng vitamin B 2 . Dựa vào việc đo cường độ huỳnh quang của dung dịch vitamin B 2 ta có thể xác định được hàm lượng của chúng chứa trong thực phẩm. Nhược điểm của phương pháp này là trong nước chiết các sản phẩm thực phẩm ngoài vitamin B 2 còn chứa một sổ các chất khác cũng phát huỳnh quang. Nhimg nhược điểm này có thể khắc phục được bàng cách đo huỳnh quang các chất trong mẫu thử sau khi đã khử riboAavin bằng natri dithiosunfat. b. Dụng cụ, Ììoá clìất - Pipet, buret; - Cốc thiiỷ tinh; - Cân phân tích; - Bình nón; - Cối thuỷ tinh; - Nồi cách thuỷ; - Bình định mức lOOml, - Máy huỳnh quang HcpM ; - KM 1 1 O 4 đung dịch 4%. - Phễu thuỷ tinh; - Natri axetat dung dịch 2,5M: hoà tan 340g natri axetat trong lOOOml nước cất. - Dung dịch thiếc clorua: lOg SnCl^ hoà tan trong 25ml axit clohydric đậm đặc (đ = 1,19). Dung dịch này được đựng trong bình màu nâu. Từ dung dịch này điều chế dung dịch mới bằng cách pha 0,2ml với nước cất thành lOOml. - Dung dịch natriciithiosiinfat: 0,25g Na 2 S2 0 4 .2 H 2 0 hoà tan trong lOml Na 2 C 0 , dung dịch 2 %. - Dung dịch K 2 HPO 4 4M: 69,6 gam K 2 HPO 4 hoà tan tỏng lOOml nước cất - Dung dịch đệm photphat (pH = 7 - 8 ) - Chế phẩm men tripsin hoặc pancreatin tinh khiết - Dung dịch riboflavin tiêu chuấn; cân 10 gam riboflavin tinh thể cho vào bình định mức dung tích 250ml thêm axit clohydric dưng dịch 0,0IN đến vạch 219
  34. mức, lắc kỹ cho tan hết riboílavin (Iml dung dịch này chứa 4ơy riboAavin). Dung dịch này giữ ở chỗ mát, tối trong 1 tháng không bị hỏng. Sau đó lấy Iml dung dịch này cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào đó 37,5 axit tricloaxetic dung dịch 20% và 25ml dung dịch K2HPO4 4M, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. c. Cáclì tiến hàn lì Cân 5 - lOg sản phẩm lưcnig thực, thực phẩm (gạo, quả ) nghiền kỹ trong cối thiiỷ tinh với 20ml dung dịch đệm photphat (pH = 7 + 8 ). Chuyển toàn bộ vào bình định mức dung tích 250ml, rồi thêm lOOml dung dịch đệm nữa. Hỗn hợp được để đúng 40 phút trong nồi cách thiiỷ đang sôi. Sau đó lá'y ra làm nguội dến 30"C rồi đo pH bằng giấy thử pH. Nếu pH < 7 thì phải đưa về pH = 7,8 ^ 8 bằng dung dịch đệm photphat. Cho vào hỗn hợp này Ig chế phấm men tinh khiết tripsin và để vào tủ ấm ở t" = 37"C trong 10 giờ. Men sẽ thuỷ phàn protein và phá vỡ mối liên kết bền của riboAavin với protein. Lấy bình định mức ra, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ, lọc qua giấy lọc khô. Dùng pipet hút lấy lOml nước lọc vào bình nón, thêm vào 5ml axit tricloaxetic dung dịch 20% và để hỗn hợp 10 phút trong nồi cách thuỷ đang sôi để giải phóng hoàn toàn riboflavin ra khỏi hỗn hợp ở dạng lự do. Sau khi làm nguội, thêm vao dung dịch một lượng H 2HPO 4 4M để đưapH về6 . Tiếp đó nhỏ vào bình nón từng giọt KMnƠ4 dung dịch 4% đến có màu hồng nhạt. Để yên 10 phút, nhỏ vào bình nón vài giọt H2 O 2 dung dịch 3% đến mất màu hồng hoàn toàn. Cuối cùng thêm vào 0,2ml dung dịch thiếc clorua và 0,1 ml dung dịch natri dithiosuphat, lắc mạnh 20 phút. Lọc lấy dung dịch qua giấy lọc khô cho vào 1 cốc khỏ sạch. Đem nước lọc đo cường độ huỳnh quang trên máy huỳnh quang HOM. Dung dịch mẫu thử và dung dịch riboflavin tiêu chuẩn được cho vào ciivet 0 , Ig Na 2 C0 , và 0 ,lg Na 2 S2 0 4 .2 H2 0 và lại đo cường độ huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang chính xác của riboflavin đo bằng hiệu số. 220
  35. d. Tíỉììì kết quả: ỉ làm lượng viiamin B 2 (mg%) tính bằng công thức: _ (a-b).0,4.V.100 C.V,.G.1000 trong đó: a: trị sô' máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch thử; b: trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch đã khử riboílavin; c: trị số máy khi đo cường độ huỳnh quang của dung dịch tiêu chuấn chứa 0,4 |jg riboAavin trong Iml; 0,4: lượng riboílavin của Iml dung dịch tiêu chuẩn, |ig; V: dung dịch bình định mức, ml; v,: thể tích dung dịch mẫu thử hút từ bình định mức để thí nghiệm, ml; G: lượng cân mẫu, g; 1 0 0 0 : giá trị để chuyển từ Ị,ig sang mg. 221
  36. Chương 9 ALCALOIT VÀ PHENOL 9.1. CÁC CHẤT ALCALOIT 9.1.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA Hợp chất alcaloit là một nhóm hợp chất hữu cơ, phân tử có chứa nhân dị vòng và có tính kiềm, một sô' các chất trong nhóm này là những chất lưỡng tính. Nitơ trong phần tử alcaloit tạo nên dặc tính cơ bản của loại hợp chất này. Alcaloit có chứa trong nhiều loại cây. Chính các alcaloit này tạo ra tính chất dược liệu hoặc tạo ra tính chất kích thích gây “nghiện” cho người sử dụng khi dùng các sản phẩm chế biến từ các loại thực vật có chứa nhóm hợp chất này. Nói chung các alcaloit có tác dụng kích thích hệ thần kinh trung ương, hoạt động của tim, hoạt động của các cơ bắp và tàng cường sự hô hấp Trong các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật dùng để chế biến thực phẩm có chứa các alcaloit khác nhau có thể kể đến: chè, cà phê, cacao, thuốc lá, côca, thuốc phiện Việc xác định hàm lirợng alcaloit không những có ý nghĩa xác định chất lượng sản phẩm mà còn phát hiện việc làm giả và trộn lẫn hàng giả vào các sản phẩm nguyên gốc. 222
  37. 9.1.2. NGUYÊN TẮC v à c á c p h ư ơ n g p h á p t á c h CHIẾT ALCALOIT TỪ THỰC VẬT Các alcaloit do có tính kiềm nên trong thực vật chúng thường tổn tại ở dạng muối với axit hĩai cơ. Do vậy có thể tách chúng ta ở dạng muối alcaloit hay ở dạng bazơ alcaloit, 9.1.2.1. Chiết rút các alcaloit ỏ dạng muối Chiết nguyên liệu thực vật có chứa alcaloit bằng nước hoặc rượu đã được axit hoá bằng axit tactric (muối của alcaloit với axit tactric tan khá Irong rượu và nước). Bước này tiến hành trong các dụng cụ chiết rút thông thường trên nồi đun cách thuỷ. Tiếp theo loại tạp chất và thu nhập alcaloit. Trong dung dịch chiết ở bước một, ngoài alcaloit ở dạng muối, còn chứa một lượng khá lớn tạp chất kèm theo như protein, chất nhựa, tanin Do đó phải loại bỏ tạp chất để có alcaloit tinh khiết hcm. Cách tiến hành như sau: Kiểm hoá dung dịch đã chiết ra được sẽ làm cho các muối alcaloit chuyển thành bazơ alcaloit và dùng dung môi hữu cơ thích hợp để trích ly sẽ loại bỏ được một số tạp chất nằm lại trong nước. Tuy nhiên trong dịch chiết bằng dung môi hữu cơ này, ngoài bazơ alcaloit vẫn còn tạp chất. Để tiếp tục loại tạp chất, người ta loại axit hoá dung dịch bằng cách cho thêm dung dịch axit tactric 1 - 5%. Lúc này toàn bộ bazơ alcaloit lại chuyển thành muối alcaloit và tan vào lớp nước axit, tạp chất nằm lại trong lớp dung môi hữu cơ. Tách lấy lớp nước axit, một lần nữa lại kiềm hoá dung dịch rồi trích ly lấy bazơ alcaloit bằng dung môi hữu cơ. Đó là do các muối alcaloit dỗ tan trong nước còn bazơ alcaloit dễ tan trong dung môi hữu cơ. Sau bước này, các bazơ alcaloit đã tương đối tinh khiết, làm bay hơi dung môi hữii cơ, phần còn lại ở dạng bột hoặc tinh thể, đó chính là các bazơ alcaloit tổng số. Muốn tách riêng từng cấu tử alcaloit phải xử lý qua các cột hấp phụ và dùng các dung môi cơ thích hợp không tan lẫn nhau để tách tìmg loại alcaloit hoặc bằng các phưcmg pháp hoá học khác. 223
  38. 9.1.2.2. Chiết rút các alcaloit ở dạng bazơ a. Xi’(ỉý nguyên liệii Các chất alcaloit trong thực vật chủ yếu tồn tại ở dạng muối. Muốn tách chúng ở dạng bazơ phải xử lý nguyên liệu thực vật bằng kiềm. Trong thực tế, thường dung các loại kiềm như: N H 4O H , NaHCƠỊ, Nếu dùng kiềm mạnh có thể phân huỷ một sô' alcaloit. Tuy nhiên có một số alcaloit là những bazơ khá mạnh, ở trường hợp này dùng kiềm yếu để tách chúng ra khỏi dạng muối là chưa đủ, có khi phải dùng tới MgO hoặc NaOH. Vì vậy việc chọn dùng loại kiềm nào, ở đây giữ vai trò quan trọng. b. Cách tiến hành Sau khi xử lý nguyên liệu thực vật bằng kiềm, dùng dung môi hữu cơ để chiết rút lấy bazơ alcaloit, có kèm theo các tạp chất khác. Làm sạch bazơ alcaloit và loại bỏ tạp chất bằng cách cho thêm vào đó một lượng dung dịch axit để chuyển bazơ alcaloit thành muối alcaloit tan trong nước - axit, tạp chất sẽ nằm lại trong lớp dung môi hữu cơ. Tách lấy lớp nước - axit, sau đó lại kiềm hoá để chuyển muối alcaloit thành bazơ alcaloit và dùng dung môi hữu cơ để chiết rút lấy bazơ alcaloit, còn tạp chất sẽ nằm lại trong lớp nước - axit. Lặp đi lặp lại các bước trên nhiều lần cho đến khi thu được môi hữu cơ có chứa bazơ alcaloit tương đối tinh khiết thì làm bay hơi dung môi hữu cơ sẽ thu được bazơ alcaloit tổng số. Muốn tách riêng từng cấu tử alcaloit ra khỏi hỗn hợp có thể dùng phương pháp chưng cất phân đoạn hoặc các phương pháp khác. 9.1.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ALCALOIT Trước khi phân tích định lượng phải chuẩn bị dịch chiết chứa alcaloit từ nguyên liệu thực vật hoặc từ các hỗn hợp phức tạp, sau đó làm sạch, loại bớt tạp chất, cuối cùng mới chọn phương pháp thích hợp để phân tích. 224
  39. 9.13.1. Phương pháp trọng lượng Phương pháp này dùng để xác định hàm lượng cùa bazơ hay muốn alcaloit sau khi loại bỏ dung môi. Cáclì tiến liàiili: lọc dung dịch đã trích ly các alcaloit bằng clorofooc hoặc ete vào bình đã biết uước trọi^ teọmgvTtòro sấy kbô ipỊíiần còn lại đến trọng lirợng không đổi, để nguội và cân. 9.1.3.2. Phương pháp thể tích Trong phương pháp này, phương pháp trung hoà được dùng phổ bịến hơn cả. Cần chú ý các trường hợp sau đây: ! a. Chuẩn độ các bazơ a lca lo it I Siiu khi trích ly các bazơ alcaloit bằng dung môi hữu cơ, làm ba^ hơi dung môi, sau đó cho thêm vào một lượng dư dung dịch axit đã biết dung tíệh và nồng độ. Các bazơalcaloit sẽ bị hoà tan và chuyển thành muốn alcaloit tương ệiig. ỉ Luợag axit dư đươc chuẩn đô bằng dung dịch kiềm với chất chỉỊthị mầu là phenolphtalein (cách chuẩn độ này được gọi là chuẩn độ ngược hay chlịẩn độ gián tiếp). Ị I Người ta còn có thể tiến hành chuẩn độ trực tiếp phần alcaloit còsị lại sau khi đã làm Imy hơi dung môi bằng dung dịch axit với chất chỉ thị màu làimetyl - da cam. h. Chuẩn độ các m uối a lca lo it Cíc dung dịch nước rượu của các muối alcaloit được tạo thành từpác alcaloit có tính bazơ yếu có đặc tính là không phản ứng với phenolphlalein vì có hằng số phân ly rất nhỏ. Hơn nữa, khi có mặt rượu hằng sô' phân ly này còn thấp hcm. Do đó có thể chuẩn độ chúng bằng kiềm với chỉ thị màu phenolphlein. Màu củà dung dịch sẽ xuất hiện khi tất cả các bazơ được giải phóng ra khỏi muối alcaloit, còn axit được tạo ra từ muối sẽ kết hợp với kiềm đã dùng để chuẩn độ, giọt kiềnị dư sẽ hiện màu với thtiốc thử. ___ 1 Nếu bazơ alcaloit trong dung dịch nước - rượu có phản ứng với phenolphtalein (ví dụ atropin) thì việc chuẩn độ các muối bằng kiềm phải tiến hành với sự có mặt của clorofooc vì cloroíooc sẽ hòa tan các bazơ alcaloit được tách ra 225
  40. khỏi dung dịch muối alcaloit và một giọt kiềm dư sẽ phản i'nig màu với phenolphtalein dấu hiệu kết thúc sự chuẩn độ. 9.ỉ.3.3. Phương pháp kết tủa Dùng các chất kết tủa khác nhau (thuốc thử Maier: Hgl 2 + KI hoặc dung dịch I2 trong KI) để chuẩn độ. Ví dụ: Cho dung dịch I 2 đã biết nồng độ vào dung dịch chứa alcaloil trong môi trường trung tính hoặc axit yếu, I 2 sẽ tạo thành kết tủa với các alcaloit. Chuẩn độ lượng I2 dư bằng dung dịch Na 2 S2 Ơ, với chất chỉ thị màu là hồ tinh bột. Ngoài các phương pháp đã nêu ở trên, người ta còn định lượng alcaloit bằng phương pháp đo độ hấp phụ ánh sáng. Trong trường hợp này thường dùng các phản ứng màu được tạo thành do đặc tính của các nhóm chức khác nhau của các alcaloit. 9.1.4. PHẦN THỰC HÀNH Bài I: Xác định cafein trong chè bằng phương pháp trọng lượng a. Ngitvêii lắc Caíein có trong chè thường tồn tại ở dạng muối với các hợp chất hữu cơ. Khi xử lý nguyên liệu bằng NaOH hoặc NH4 OH, cafein được giải phóng ra dưới dạng tự do (dạng bazơ), đồng thời cũng tác chác hợp chất khác ra dạng tựdo. Sau khi dùng KMn0 4 để phá bỏ tạp chất, loại tanin, dựa vào tính hoà tan của caíein dùng clorofooc để chiết lấy caíein. Dùng cloroíooc có thể làm cho một sô' chất khác, như clorophin cũng bị chiết ra, cho nên phải dùng A 1 K(S0 4 ) 2 để kết tủa và dùng vazơlin để cuộn lấy kết tủa này và khi làm lạnh dung dịch chúng sẽ bám chặt vào thành bình. Phẩn dung dịch còn lại là cafein hoà tan trong clorofooc, sau khi đuổi hêt dung môi sẽ thu được cafein ở dạng tinh thể. b. Hoá chất, dụng cụ - Cát sạch hoặc bột thuỷ tinh - Clorofooc tinh khiết - Muối KA1 (S0 4 ) 2 tinh thể - chì axetat 10% 226
  41. - Vazơlin - 7’han hoạt tính - H 2 SO4 20% - KOH 25% - NH 4 OH 25% - NaOH 10% - K M n04 2% - Bột chưng cất tuần hoàn và bộ thu hồi dung môi - Nồi đun cách thuỷ - Phễu chiết loại 500 ml - Bình tam giác 250 ml đã biết trọng lượng - Ống đong loại lOOml - Phễu lọc, bông hoặc giấy lọc - Các dụng cụ thòng thường khác. c. Tiến hành Cân chính xác 2 hoặc 3 gam chè đã sấy khô, nghiền nhỏ cho vào bình tam giác đã rửa sạch sấy khô. Cho thêm vào đó 4 - 5 gam cát sạch, khô hoặc bột thuỷ tinh, lắc đều để bột chè và cát trộn lẫn nhau, phân phới đều trènđáy bình. Dùng dung dịch N H 4O H 25% nhỏ giọt tẩm ướt bộl chè (khoảng 5 - lOml), sau đó đặt bình đun trên nồi cách thuỷ để tăng cường quá trình giải phóng cafein ra dạng tự do và kết hợp đuổi hết NH 4 OH. Sau khi đuổi hết NH4 OH dư, cho thêm vào bình 90ml clorofooc, tiếp tục đun trên nổi cách thuỷ có lắp ống sinh hàn trong 25 - 30 phút để cloroíooc chiết rút hết caíein trong bột chè. Sau đó dùng bông để lọc lấy dung dịch, giữ bã lại trong bình và dùng cloroíooc tráng rửa nhiều lần, dịch lọc tập trung vào bình tam giác dung tích 500 ml (bình tam giác này đã có sẩn vazơlin) và 4 - 5g KA 1 (S0 4 )2 . Sau đó lắp bình tam giác này vào bộ chưng cất đun cách thuỷ để thu hồi lại clorofooc, sau khi đuổi hết dung môi, cho thêm vào đó 125ml nước cất, tiếp tục đung trên nồi cách thuỷ cho vazơlin tan chảy hoàn toàn cuộn lấy tạp chất. Sau đó làm lạnh dung dịch dưới vòi nước lạnh, khi làm lạnh chú ý nghiêng xoay bình để vazơlin đã cuộn tạp chất bám chắc vào thành bình, lọc dung dịch sang phễu chiết dùng nước cất tráng rửa bình và lọc tập trung vào phễu chiết. 227
  42. Sau khi lọc xong, cho thêm vào phễu chiết 3 - 5 ml KOH 25%, lắc đế kết tỉia các tạp chất còn lại. Tiếp tục dùng KM1 1 O 4 25% nhỏ giọt, khử tanin cho đến khi mất màu vàng. Sau đó cho ihêm 25ml cloroíooc vào phẽu chiết, lắc dều trong 3 phút, lúc này dung dịch có thể chuyển từ màu hồng nhạt sang màu xanh lơ, để yên cho dung dịch phân lớp. Lóp dưới là lớp cloroíooc chứa cafein, gạn lớp này vào bình tam giác dung tích 2 ỈOml đã biết trước trọng lượng. Tiếp tục dùng cloroíooc để chiết 'ửa dung dịch còn lại nhiều lần và gạn lớp clorofooc tập trung vào bình tam giác. Bình tam giác đựng cloroíooc có chứa caíein được lăp vào bộ chứng cất, đun cách thuỷ thu hồi dung môi. Sau khi đuổi hết dung môi (dung dịch còn lạ 1 - 2 ml) thì lấy bình, ra, để yên cho cafein kết tinh, sau đó đưa đi sấy khô ở nhiệt đ< 100"C - 1500"C troịg 2 giời. Cần và tính kết quả. cl. Tí ììì kết quả trong đó: a - t^ n g lượiig cafein thu được (g); A - tịpng lượng chất khô của mău chè (g). Ghi đlìú: Các phương pháp trong lương khác a. D m g dung dịch chì - axetat để kết tủa tạp chất Cân Bhính xác 5g chè đã sấy khô nghiền nhỏ cho vào binh tam giá( 250ml, cho thêm lOOml nước sôi và đun trên nồi cách thuỷ 45 phút. Sau đó lọc, phần bã còn lại cho thêm 80 ml nước cất dun sôi, đun cách thuỷ thêm 30 phút. Cho thêm vào đó 16 Ịnl dung dịch chì axetat kiềm tính 1 0 % để kết^tủa tạp chất, ll: đẻu và dùng nước cất diều chỉnh đến vạch quy định (250ml). Sau khi lọc, lấy 200 Til dung dịch cho vào bình chiết, dùng H2SO4 20% để khử lượng chì axetat dư. Sau 00 lọc và đùng nước cất rửa kết tủa nhiều lần, lọc và tập trung dung dịch lọc sang bàt sứ, cô đặc trên nồ cách thuỷ cho đến dung dịch còn lại khoảng 15 - 20 ml thì chuỵển sang phễu chiết (qua phễu lọc), cũng tráng rửa bẳng nước cat hoặc clorofooc chiết rút nhiều lần như bài một. Sau khi đuổi hết dung môi, cho kết tinh, sấy khô và cân lượng cafein. 228
  43. Tính kết quả. cafein(%) = ~ .IO O V.A trong đó: a ^ trọhg íưỢng caíein thu được (g); V - tổng thể tích dung dịch chè (ml); V thể tích dung dịch đem phân tích (ml); A - trọng lượng chất khô của chè (g). b. Dù/Ig NaOH để giải phóng cafein và khử tạp chất than hoat tínề G íi chính xác 3g chè đã sấy khô, nghiển nhỏ, cho vào bình tam giệc có dung tích 150 ml, lắc nhẹ cho bột chè phân phối đều trên đáy bình. Dùng 5ml dung dịch NaOH 10% nhỏ giọt thấm ướt bột chè. Để yên 15 phút, sau đó cho ^êm 60ml clorofooe, đun trên nồi cách thuỷ có ống sinh hàn trong 30 - 40 phút. Sau khi đun xong, lọc qua bông hoặc giấy lọc thuỷ tinh, dùng clcaòĩooc tráng rửa nhiểịl lần và lọc tập trung sang bình có dung tích 250 - 300 ml, lắc ^ều và cho vào đó 1 - 2 g than hoạt tính (ở dạng bột và khô), tiếp tục lắc để khử tỊ|p chất cho đến khi M i mầu clorophin. Ị Sí,u đó lọc sang bình tam giác đã biết trọng lượng, dùng clorof 0 Ot tráng rửa nhiều lu^ và lọc tập trung vào bình tam giác trên. Lắp bộ chưng cấl có thiu hồi dung môi đun trên nổi cách thuỷ, sau khi đuổi hết dung môi, để yên cho cafeịn kết tinh, sấy khô, cân và tính kết quả như bài 1 . Bằi 2. Định lượng cafein bằng phương pháp thể tích a. Nguyên tắc Kqì dung dịch chứa cafein, nếu có mặt HCl thì dung dịch I 2 tronệ KI có thể làm cho toàn bộ cafein chuyển thành chất kết tủa ở dạng có công thú^ tổng quát CfiH|||N4 Kl4 . Sau dỗ dung natrithiosiiníat (Na 2 S2 0 ,) đã biết nồng độ chTian lượng I2 biết được lượng I 2 đã tham gia phản ứ:ig, từ đó tính ra lượng caíein có mặt trong dung dịch thí nghiệm. 229
  44. b. H oá chất, dụng cụ - Chì axetat kiềm tính d = 1,25 pha bão hoà trong nước; - Dung dịch NaiSiO, 0,1N; - Dung dịch I 2 pha trong KI 0,1N; -HCl tinh khiết d= 1,18; - Dung dịch H 2 SO4 20%; - Hồ tinh bột 0,5% ; - Nồi đun cách thuỷ ; - Bình cầu các loại 250 mỉ, 500ml; - Bình định mức các loại: 250ml, 500 ml (5 chiếc); - Pipet các loại: 10, 25, 50 ml; - Buret và ống đo các loại 25, 10 ml; - Các dụng cụ thông thường khác. c. Tiến hành Cân chính xác 5g chè đã sấy khô, nghiền nhỏ cho vào bình cầu dung tích 250ml, cho thêm vào đó 150 - 200 ml nước cất đun sôi và tiếp tục đun cách thuỷ trong 45 phút cho đến khi bột chè lắng xuống hết đáy bình. Lọc dung dịch qua phếu lọc bông, tráng rửa bã chè nhiều lần bằng nước cất đun sôi và lọc tập trung vào bình định mức 500 ml, cất giữ làm dung dịch thí nghiệm. Lấy chính xác 200 ml dung dịch chè cho vào binh định mức tích 250 ml, cho thêm vào đó 4 - 5 ml dung dịch chì axetat kiềm tính d = 1,25 pha bão hoà trong nước, dùng nước cất điều chỉnh đến vạch quy định, lắc đều , để yên trong 5 phút, lọc. Lấy 200 ml dung dịch lọc cho vào bình định mức 2 (dung tích 250 ml), cho thêm vào đó t^mg giọt H 2 SO4 20% (khoảng 1,2 - 1,5 ml) cho đến khi không còn tạo ra kết tủa trắng mới thôi. Tiếp tục lấy 200 ml dung dịch lọc (lần thứ 2), cho vào bình định mức thứ ba (dung tích 250 ml), cho thêm vào đó 10 ml HCl tinh khiết (d = 1,18), cho thật chính 230
  45. xác 25 ml dung dịch I2 0,1N vào bình định mức, lại cho thêm 20 ml nước cất, lắc đều đề yên 25 phút ở nhiệt độ 15“C, sau đó lấy ra dùng nước điều chinh đến vách quy định, lắc đều và lọc. Lấy lOOml dung dịch lọc lần Ihứ ba, nhanh chóng dùng Na 2 S2 Ơ 3 chuẩn lượng I2 dư khi dung dịch chuyển sang màu vàng nhạt, cho thêm vào đó 2 ml dung dịch hổn tinh bột mới pha 0,5%, tiếp tục chuẩn độ bàng Na2 S2 0 ^ 0,1N đã dùng bằng B. Plìáỉì tícìì kiểm cììửng: Lấy 203ml nước cất thay cho dung dịch chè và tiến hành các bước tương lự như trên, bắl đầu từ lúc cho thêm HCl. Lượng Na2 S2 Ơ 3 0,1N đã dùng ở thí nghiệm phân tích kiểm chứng ký hiệu là A. d. Tính kết quả. (A-B).2,5K.0.0052 cafein(%)= . 1 0 0 '250'250'250 trong đó; A - sô' ml Na 2 S2 0 , 0,1N đã dùng trong phân tích kiểm chứng; B - sô' tnl Na 2 S2 Ơ, 0,1N đã dùng trong phân tích caíein; K - hệ số điều chỉnh nồng độ của Na2 S2 0 ,; Nồng độ chuẩn K= ^^ Nồng độ pha thực tế G - trọng lượng chất khô của mẫu chè; 2 , 5 - hệ số tính lượng dung dịch thí nghiệm so với lượng dung dịch chè đã pha chế 0,0052 - Sô' g caíein ứng với 1 ml Na 2 S2 Ơ, 0,1N đã dùng dể chuẩn lượng I2 tham gia kết tủa caíein. 23
  46. 9.2. HỌP CHẤT PHENOL THỰC VẬT 9.2.1. VAI TRÒ VÀ Ý NGHĨA CỦA HỢP• CHẤT PHENOL THựC • VẬT • Hợp cliấl phenol thực vật là một nhóm hợp chất tự nhiên có phổ biến trong thực vật. Cfeúng quyết định đến hương vị, làm thay đổi màu sắc tự nhiên cịủa nhiều loại sản pHẩm có nguồn gốc thực vật, ngoài ra chúng còn tham gia tạo hương thơm đặc trưng àho một số sản phẩm thực vật. Hợp chất phenol tạo vị đắng chát ở mức độ khác nhau của sản phẩm chè, bia, vang quả óác loại rau quả và cả ở một số rượu đặc sản có sử dụng nguyên liệu thực vật. Đặc biỂt hợp chất phenol thực vật, sau các phản ứng hoá học còn tạo ra màu sắc đặc tnmg cịho thực phẩm: màu đỏ tươi của chè đen, màu xanh vàng của các loại quả ép, màu \'ầaig nâu của thuốc lá, song hợp chất phenol thực vật cũng ỉàm'thay đổi màu sức tự nhiên của sản phẩm thực phẩm do quá trình oxy hoá tạo thành màu hoặc do kết hợpỊvới các kim loại nặng. Trong quá trình chế biến thực phẩm có nguồn gốc thực vật, cấc hợp chất phenol thường tham gia vào quá trình tạo chất thơni với các axit amin và đường khử để tạo thành aldehyt bay hơi có mùi thơm. Do ló việc xác định hàm lượng các hợp chất phenol thực vật trong nguyên liệu, sản pbẩm và theo dõi sự biến đổi hàm lượng của chúng qua các giai đoạn chế biến, bảo cịuản có ý nghĩa quan trọng đối với việc thiết lập các chế độ công nghệ và bảo quản thực phẩm cũng như đối với việc kiểm tra và đánh giá chất lượng sản phẩm. 9.2.Í. CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG CHẤT PHENOL 9.2.Ỉ.Ỉ- Phương pháp vật lý ThirộBg sử dụng hai phương pháp phổ biến dựa trên các nguyên tắc: a) L^ng dung mồi hữu cơ thích hợp để chiết hợp chất phenol trực tiếp tìr nguyên liệu ỔaỊC vậe hcổc chuyển hoàn toẳn các hợp chất phenol từ dung dịch chiết bàng nước sang dung môi hữu cơ sau khi đã loại bỏ hợp chất, cho dung môi bay hơi sẽ thu được hợp chất phenol ở dạng tinh khiết, sấy khô, cân sẽ thu được hàm lượng của chúng. 232
  47. b) Dùng dung dịch các muối kim loại nặng (thường dùng chì - axetat) để kết tủa hợp chấl phenol từ dung dịch chiết bằng nước thực vật, lọc lấy kết tủa, làm sạch tạp chất sấy khô kết tủa, cân, từ đó suy ra trọng lượng hợp chất phenol và tính ra được hàm lượng của chúng. 9.2.2^ Phượng pháp hqá học ___ a) Cfeuẩn độ trực tiếp các hợp chất phenol trong dung địch chiết fa được từ thực vật bằng dung dịch KMnƠ 4 trong môi trường axit với chất chỉ t|iị màu là indigocacỊãB. b) (phuẩn độ gián tiếp lượng iod dư sau khi tác dụng với hợp c|(ất phenol trong dun^ dịch bằng NaiSỊƠ, trong môi trường kiềm với chất chỉ thị mà |à hồ tinh bột. ' 9.212.3. Phương pháp hoá lý ThiỆBg dùng phương pháp sắc ký trên giấy. Phương pháp này chủỊyếu dùng để tách riệng từng cấu tử trong hỗn hợp các chất phenol thực vật và xác Ịđịnh hàm lượng riên^ của từng cấu tử. Ngiịllyên tắc chung là dùng etanol tinh khiết chiết lấy hợp chất pẳienol thực vật, sau đ|s cố định chúng trên giấy sắc ký, dùng hỗn hợp dung môi thíf h hợp để tiến hành ly từng cấu tử của hợp chất phenol, sau khi tách riêng đượctừng cấu tử người xác định hàm lượng của chúng bằng phương pháp so màu. i 9.2.^. PHẦN THỰC HÀNH 1 ; ị ' Trobg phần này giới thiệu các bài thí nghiệm xác định hàm lượnậ các hợp chất phemil, các cấu tử của hỗn hợp các hỢp chất phenol và các sản phÉii oxi hoá có màu ciịa chúng vẫn còn bản chất plieiiol, ớdáv lấy nguyèn liêu ban đáu la cliè tlế làm ví dụ.ị I Bàầ 3 . Định lượng tanin chè bằng phương pháp trọng lượng I Ị ( a. Ĩ^Miiyên tắc i Tanin chè có tính tan trong etylaxetat không tan trong cloroíorm và benzen, còn nhữiig chất khác trong chè như caíein lại không tan trong etylaxtat hoặc chí tan rất ít. Dựa vào các tính chất này, người ta dùng etylaxetat đế’ chiết lấy tanin chè. 233
  48. Sau đó làm sạch dung dịch chiết bàng cách cho thêm vào đó một lượng cloroíorm (cloroíorm không tan trong etylaxetat) để chuyến caíein tan trong cloroíbrm mới cho thêm. Để yên cho phân lớp và tách lấy etylaxtat có chứa tanin chè, sau khi đuổi hết dung môi sẽ thu được tanin chè ở dạng tinh khiết. b. Dụng cụ, ìioá chất - Cối nghiền chè hoặc cối xay cà phê; - Rây số 4 (đường kính lỗ 0,25 mm); - Cân phân tích; - Bình cầu dung tích 500ml; - Bình định mức, dung tích 250 ml và 500 ml; - Phễu lọc và giấy lọc (hoặc bông trắng); - Bình tam giác các loại; - Nồi đung cách thuỷ và ống sinh hàn; - Bình gạt dung tích 1000 ml; - Bình nước đá, tủ lạnh, tủ sấy, máy cất hơi nước trong dụng cụ chưng cất, máy lọc chân không; - Etylaxetat tinh khiết; - Cloroíorm, benzen tinh khiết; - Natri sunfal tinh thể. í'. Tiến lùinlì Chuẩn bị lioá chất và dung dịcìi: - Để đảm bảo độ tinh khiết cao của các hoá chất đem dùng, cẩn phải đem etylaxetat và benzen đi làm khô hết nước bằng natri sunfat tinh thể. Cír 100 gam natri suníat cho vào 1 0 0 0 ml dung dịch trên, để một ngày đêm cho híu hết ẩm, sau đó gạn lọc lấy dung môi. - Pha chế dung dịch chè: Lấy 30 gam chè đã nghiền nhỏ và sấy khô, dùng nước số pha chè trong bình cầu, đun tiếp trên nồi cách thuỷ 45 phút, cứ 10 phút lắc 234
  49. Iihẹ một lần cho đến khi bột chè lắng hết xuống đáy bình (lượng nước cất đun sôi ban đầu để pha chế khoảng 800 ml). Lọc diiỊig dịch chè qua phều lọc, tráiig bã chè nhiều lần bàng nước cất đun sôi, lập trung các dung dịch chè đã lọc pha thành 1 2 0 0 ml dung dịch, sau đó cất giữ dung dịch để tiến hành các bước sau. ĩiế ii hanh: Lấy chính xác 600 ml dung dịch chề đã pha chế ở trên cho vào bình chiết gạn có dung tích 1 0 0 0 ml, cho thêm vào đó 1 0 0 ml beiizen để loại bỏ chất béo và các chất khác có trong chè. Sau khi cho benzen, lớp dung dịch còn lại được đổ ra chén sứ đun cách thuỷ đuổi hết benzen còn sót lại sau đó đổ lại dung dịch vào bình chiết gạn, cho thêm vào đó 100 ml etylaxetat để chiết lấy tanin chè. Lắc nhẹ bình chiết gạn và đều tay trong 5 phút. Để etylaxetat tiếp tục chiết lấy tanin chề còn lại trong lớp nước từ 5 đến 6 lần cho đến khi dung dịch etylaxetat gạn ra có độ trong suốt như ban đầu. Tập trung tất cả các dung dịch etylaxetat có chứa tanin chè vào bình cầu, đun cách thuỷ đuổi dung môi và khi thấy dung dịch chi còn lại 1/5 thể tích ban đầu thì chuyển sang bình đã chứa sẩn cloroíorm, tráng rửa bình cũ nhiều lần bằng etylaxetat. Sau đó lắc đều để cloroĩorm, chí lấy lớp etylaxetat có chứa tanin đưa đi lọc qua máy lọc chân không. Sau đó đun cách thuỷ hết dung môi sẽ thu được tanin chè. Tanin chè thu được ở dạng bột màu vàng nhạt. Sau đó đem chế biến đi sấy khô ở 60"C trong 30 phút, rồi nâng dần nhiệt độ lên 90 - 95‘’C cho đến khi trọng lượng không đổi. Muốn tránh cho tanin chè khổng bị oxi hoá phải sấy khô irong tủ sấy chân không. d. Tíiili kết c/iiả: Hàm lượng tanin chè theo % trọng lươiig chất khô tính như sau: X = ^ . lõ o A.v trong đó: 235
  50. a^trọng lượng lanin chè thu được trong mẫu đem phân tích (g); A - trọng lượng chất khô của mẫu đem phân tích (g); V - thể tích dung dịch chè đem phân lích (ml); V - tổng thể ích dung dịch chè pha chế (ml). B ^ 4: Định lượng tanin chè bàng phương pháp chuẩn độ KMìĩú^ I a. ^Nguyên tốc TsỊiÉi chè là một hỗn hợp phức tạp gồm các hợp chất phenol ỔCKIi giản phân tử thấp \% hợp chấl poliphenol phân tử lớn. Tanin chè rất dễ bị oxi hoá ^ởi KMĨ 1 O 4 trong mcỊi trường H 2 SO4 có mặt chất chí thị màu indigocamin. Sau khi oxỵ hóa hoàn loàn, cácỊ hợp chất phenol tiếp xúc oxy hoá chất chỉ thị màu làm mấtmằị\ xanh của dung áịcÍL \ ' b. B ụng cụ, lioá chất I -(iđĩ nghiền xay chè hoặc cối xay cà phê, rây số 4 (0,25mm); - (ịlitai phân tích, tủ sấy; - l|Ếnh cầu dung tích 500 ml; - m định mức loại 250 ml và 500 ml; ; lọc và giấy lọc (hoặc bông trắng); I - t e tam giác các loại; - ỉ^ồi đun cách thủy và ống sinh hàn; I 1 - sứ tráng men loại 1 0 0 0 ml; ị - I^et đựng KMnƠ 4 0,1N, inđigocamin; ỉ - ĩ^ìpet 1 0 ml; - lỉU g dịch indigocamin 0,1N trong H 2 SO4 (cứ 1000 ml dung dịth chất chỉ thị 0 , 1 236
  51. c. Tiến hành Clitiẩii bị diiììg dịclì chè: Mẫu chè đem phân tích được sấy ở nhiệt độ 50‘’C - 60"C cho đến khô, nghiền hoặc xay nhỏ và rãy qua rây tiêu chuấn. Tỷ lệ pha chế ; 2g chè/250 ml nước cất i hoặệ : 3g chè/500 ml nước cất i Chd 3 gam chè đã nghiền nhỏ và bình cầu dung tích 500ml, cho thê n vào đó 300 ml nir^ cất đun sôi, đun tiếp trên nồi cách thuỷ khoảng 45 phút, tron|> khi đun cứ 1 0 phúỊ lấc bình một lần, đun cho đến khi toàn bộ chè lắng chìm xuống đáy bình. I Diinịl dịch chè đang còn nóng được lọc bằng giấy lọc hoặc bông B ắng sang bình định ^ức 500 ml, dùng nước cất đun sôi tráng rửa bã chè nhiều lần v| lọc sang bình định taức, cuối cùng dùng nước cất điểu chinh mức dung dịch đến ịvạch quy định. Cất áữ dung dịch chè để đưa đi phân tích. ClnỈấii độ kiểm chứng: Cho vào bát sứ to một lượng nước 750 ml và 25 ml dung dịch indiậocacmin 0,1% troní môi trường axit. Dùng dung dịch KMnƠ 4 0,1N chuẩn độ ch() đến khi mất màux Ịm Ii. Ghi kết quả (ký hiệu A ml KMnƠ4 0,1N) Chaẩn độ tanin trong chè Cho vào bát sứ to; 750 ml nước, 25 ml dung dịch indigocamin 0,1 % trong môi trườriị[ axit và lOml dung dịch chè đã chuẩn bị ở trên. Dùng dung dịcn KMn 0 4 0 , 1 N chuấÌB đô chính xác đến mất màu xanh của dung dịch (lúc này dung dịch chuyểns a Ịig màu vàng nhạt), ghi lại kết quả (ký hiệu B ml dung dịch KMn04 0,1N) d. T hh kết quả HàmTỮOTĨ^tãHn cHẽ tuiTi ĩĩiẽõ^lrộng lữợĩĩg chấrKHỗ V.K.M.(B-A) x = .100 V.G 237
  52. trong dó: V - tổng thể tích dung dịch chè đã pha chế (ml); V - thể tích dung dịch chè đem phân tích; K - hệ số tính tanin tương líng với 1 ml KMnƠ 4 ; K = 5,83 m g/lcc KMnO^ 0,1N hay K = 0,00583 g / / ; M = nồng độ thực / nồng độ chuẩn; G - trọng lượiig chất khô của mẫu chè đem pha chế dung dịch (g); (B - A) - hiệu số lượng KMnƠ4 dùng để chuẩn độ dung dịch chè và dung dịch kiểm chứng. Bài 5: Định lượng calechỉn trong hỗn hợp tanin chè Tanin chè là một hỗn hợp chất phenol chiếm khoảng 30% trọng lượng chất khô của chè. Tanin chè gồm các nhóm catechin, antoxantin, antoxianidin, các axit phenol cacboxylic v.v Trong đó nhóm chất catechin chiếm trên 90% tổng lượng các hợp chất phenol của chè. Người ta có thể tách riêng từng chất catechin bằng phương pháp sắc ký trên giấy và định lượng chúng bằng phương pháp xác định mật độ quang học của chúng. a. Nguyên tắc Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm: cân chính xác Ig chè đã sấy khô và nghiền nhỏ cho vào bình cầu có dung tích 100 ml, cho thêm 20 - 25 ml etanol 96% đun tuần hoàn trên nồi cách thuỷ trong 45 phút. Sau đó lọc qua giấy lọc, dung dịch thu được chuyến sang bình định mức có dung tích 25 ml, làm nguội, dùng etanol 96% điểu chỉnh đến vạch quy định. Lắc đều, cất giữ làm dung dịch thí nghiêm. Chuẩn bị giấy và cììấm mẫu: Giấy sấc ký dùng để chấm mẫu thường gồm hai loại: - Loại thứ nhất: cắt theo hình chữ nhật, dùng trong phương pháp treo đứng. Kích thước giấy có thể thay dổi phụ thuộc vào yêu cầu thí nghiệm và kích thước thùng sắc ký. Nói chung thường dùng loại kích thước 8 X 60 hoặc 10 X 60 cm. 238
  53. - Loại thứ hai: Cắt theo hình tròn trong pliirơng pháp đặt nằm ngang. Thường dùng kích thước của giấy có đường kính 20 - 25 cm. Trên mỏi loại tờ giấy sắc ký có thểchấm mẫu tại điểm đối với loại treo và 8 điểm mẫu đối với loại nằm ngang, mỗi điểm chấm 0,025 ml dung dịch thí nghiệm. Để bảo toàn phân ly và tách biệt được các cấu tử trong hỗn hợp tanin chè cần chấm mầu gọn trong phạm vi hẹp với đường kính điểm chấm 0,5 cm, cần phải tiến hành chấm nhiều lần cho một điểm mẫu, vì vậy phải dùng micropipet loại 0,005 ml và khi châìn mầu phải liên tục thổi khô mẫu chấm bằng luống không khí lạnh khô, tốt nhất là luồng khí nitơ. Chú ý: Vị trí chấm mẩu trên giấy sắc ký quy định như sau: - Loại giấy treo đứng: cách biên ngang > 10 cm và cách biên dọc > 2cm - Loại siấy đặt nằm ngang: cách tâm > 5 cm, tại tâm của tờ giấy có rạch một vạch dài 1 - 1,5 cm để cắm bấc hút dung môi khi tiến hành phân tích. h. Tiến hành Bình sắc ký hoặc thùng sắc ký nên tạo độ chân không là 240 mm thuỷ ngân. Cho dung dịch đã bão hoà dung môi vào đáy bình hoặc đáy thùng sắc ký, sau đó đổ dung môi vào hộp chứa hoặc máng chứa. Hỗn hợp dung môi có tỷ lệ như sau: - 80 ml butylic 95%; - 2 0 ml axit axetic 1 0 0 %; - 25 ml nước cất. Sau đó đặt giấy sắc ký dạng tròn đã cắm bấc chạm hộp chứa dung môi hoặc treo giấy sắc ký dạng hình chữ nhật nhúng vào máng dung môi, đậy kín nắp bình hoặc thùng sắc ký, sau khi rút không khí ra và cho ngay khí nitơ vào thì quá trình phân tích được bắt đầu. Thời gian phân tích được kéo dài từ 8 - 12 giờ, trước khi dung môi thấm đến gần mép giấy thì kết thúc và thổi khô giấy sắc khí ngay ở nhiệt độ cùa phòng. 239
  54. X ÍIC địiili các cấu tử cutecliiii Sau khi phân tích xong, tuỳ theo yêu cầu của thí nghiệm mà tiến hành phân tích định tính hay định lượng catechin. Nói chung, mỗi lần thí nghiệm đều tiến hành cả định tính và định lượng catechin. Vì vậy, ngữời ta đem gỉấy sấc klíí đã ttói vào soi duới (lén tluỳnh quang, dùng bút chì khoanh lại hình dáng của các nhóm điểm mà qua phân tích sắc ký đã phân lý địíỌC. Dựa vào hình đã khoanh được bằng bíit chì, cắt riêng từng ihành giấy chứa mẫu để dùng vào việc xác định catechin sau này. 1 Định tính catechin Từng loại catechin sau khi đã được phân tích sắc ký trên giấy sẽ íiọp thành từng nhóm điểm riêng biệt, vị trí của từng nhóm điểm đó phục thuộc vào' giá trị R| của từng loại catechin (Rf là tỷ sô' giữa khoảng cách tính từ điểm chấm ban đầu đến mép cuối của dung môi đã thấm ra). - NhẸtog nhóm điểm này có thể hiện màu với dung dịch muối sắt hệá trị cao, vanilin liQậc hỗn hợp dung dịch HNOrAg-Amoniac cho kết tủa tốt nhất. ở bặi thí nghiệm này, người ra phun hỗn hợp dung dịch HNOrAgịAmoniac lên giấy sắc ký, sau khi các nhóm điểm đã hiện màu đen xám rõ rệt, nguệi ta đem giấy sắc ký đi sấy khô ở nhiêt đô 80"C, cuối cùng dung dịch natri thiosunịfat 1% để rửa bằng cách ngâm trong dung dịch này 2 - 3 phút, sau đó dùng nước cấtỉrửa nhiều lần. Sau Iđú sấy khô sẽ thu được ảnh của các catechin. Những nhóm điểnị màu này khi đã khộ sẽ có màu đen thẫm, có thể chụp ảnh được để làm tài liệu. Đối VỚI dung dịch chè, nói chung, trên mỗi điểm mẫu chấm ban dMu, sau khi phân tích sắc ký, phân ly ra dược và hiện lên 5 nhóm điểm, lần lượt tương LÌmg với: Dí, - Epicatechingalat có Rr = 0,85 ị 2) L - Epigalocatechingalat có R| = 0,73 3) L - Epicatechin + D, L - catechin có Rị = 0,61 4) D, L - galocatechin có R| = 0,51 5) L - Epigalocatechin có R| = 0,43 240
  55. Chương 10 MỘT■ SỐ CHẤT VÔ Cơ GÂY ĐỘC ■ 10.1. GIÓI THIỆU Các chất độc hoá học gây độc với cơ thể con người có thể có trong lương thực, thực phẩm thường phải kể đến các kim loại nặng như: đồng, chì, kẽm, thiếc, các hợp chất chứa asen, các hợp chất chứa flo Thực phẩm có thể bị nhiễm các chất độc nói trên từ nhiều nguồn khác nhau: nguồn nhiễm độc đầu tiên là do trong quá trình sản xuất hoặc bảo quản thực phẩm đã sử dụng không đúng nguyên tắc các dụng cụ chứa đựng, hoặc các thiết bị chế tạo từ sắt được tráng kẽm và đồng. Đặc biệt là đối với những thực phẩm chứa một lượng khá lớn axit hữa cơ như các loại rau quả muối chua, nước quả, bột quả, các đồ hộp quả, nước uống lên men Các đồ sành sứ, tráng men chứa lượng chì monooxyt cao dễ gây nhiễm độc chì cho thực phẩm nếu chúng được dùng để chứa đựng thực phẩm. Các đường ống dẫn thường được phủ một lớp chì để chống gỉ, lượng chì này có thể đi cùng với nước vào thực phẩm Việc sử dụng các bình mạ thiếc trong sản xuất thực phẩm cũng dễ gây nhiễm độc thiếc cho thực phẩm, ở các xí nghiệp bánh kẹo, đồ hộp có những bộ phận sản xuất các sàn phẩm thực phẩm có độ axit cao do vậy bình mạ thiếc rất dể bị phá huỷ là cho thiếc lẫn vào thực phẩm. Trong nông nghiệp, việc sử dụng các thuốc trừ sâu là hợp chất chứa asen và các thuốc diệt côn trùng trong các kho thóc, gạo cũng có thể là nguồn asen đưa vào lirơng thực, thực phẩm 241
  56. Những nhà máy sản xuất nhôm, phân lân (supepliotphat), thuốc Irừ sâu thường thải khí hydro tlorua (IỈ 2F). Chất HịP này dề bay hơi làm nhiễm bẩn môi trường nước đất, cây cối bao quanh khu vực nhà máy. Do đó sản phẩm lương thực, thực phẩm của các vùng xung quanh các nhà máy nói trên có thể bị nhiễm độc flo. Nói chung, các luơng thực, thực phẩm nhiễm các chất độc trên thường có vị tanh kim loại. Người ăn phải các sản phấm chứa chất độc sẽ gặp những triệu chứng như: xám lợi, nôn mửa, nhức đầu, rối loạn tiêu hoá nặng. Trúng độc liều cao có thể gây nguy hiểm tới tính mạng. Hàm lượiig tối đa cho phép của một số kim loại nặng hoặc dư lượng thuốc trừ sâu cho phép được nêu trong tiêu chuẩn và an toàn thực phẩm. Sau đây là đặc điểm của một số chất vô cơ gây độc : Đồng (Cu) là một thành phần cần thiết của khẩu phần ăn với liều lượng hàng ngày 0,033mg đến 0,05mg/kg thể trọng. Với liều lượng này không thấy tích luỹ đồng trong cơ thể. Với liều lượng lớn hơn có thể gây những triệu chứng ngộ độc cấp tính nhimg không có dấu hiệu gì đồng gây ung thư cho con người, ở nồng độ nào đó có thể làm ảnh hưởng tới vị và giá trị dinh dưỡng của thức ăn. Hàm lượng đồng tối đa trong thực phẩm qui định tạm thời là 0,05mg/kg thể trọng trong một ngày. Chì (Pb): là một thành phần không cần thiết của khẩu phần ãn. Trung bình hàng ngày trong khẩu phần ăn có lẫn từ 0,003- 0,005mg chì/kg. Ngoài ra có thể có thêm khoảng 0,0013mg chì/kg từ không khí bị nhiễm bẩn. Theo nhiều tác giả luợng chì gây độc tích liiỹ từ l-2mg. Với liều lượng cao hơii chì sẽ gây ngộ độc cấp tính. Với liều lượng thấp hơn, nhưng ăn rải ra nhiều ngày dễ bị ngộ độc hơn. Liều lượng chì tối đa có thể chấp nhận hàng ngày do thực phẩm đưa vào cơ thể quy định tạm thời là 0,005rr.g/kg thể trọng. Thiếc (Sn): là thành phần bình thường của khẩu phần ăn, không có chức năng sinh lý gì, tính độc hại thấp, ở châu Âu và Bắc Mỹ người ta tính ra rằng : một người một ngày có thể ăn từ 2-4 mg thiếc. Với liều lượng này, hầu như không có sự tích luỹ thiếc trong cơ thể và không có dấu hiệu gì chứng tỏ về lâu dài thiếc gây độc hại với cơ thể con người. 242
  57. Kẽm (Zn) là thành phần lự nhiên của thức ãn và cần thiết cho đời sống con người. Một kháu phần cung cấp hằng ngày lừ 0,17-0,25mg kẽin/kg thế trọng. Nói chung cOng chưa có số liệu cụ thể về liều lượng kẽm gây nhiễm độc cho cơ thể người. Asen f As) còn gọi là thạch lín, có tự nhiên trong thực phẩm. Nhưng các hợp châì vô cơ cLÌa asen với liều lượng cao rất độc. Nếu ăn phải loại thực phấm nhiẻm asen hoặc do tiếp xúc với asen thì có thể bị nhiễm độc mãn tính. Do vậy nhiều nước trên thế giới đã qui định giới hạn liều lượng sen tối đa trong thực phẩm. Người ta xác định rằng nếu hằng ngày hấp thụ vào cơ thể từ 0,007-0,6 mg asen/kg thể trọng thì không bị nhiềm độc. Nếu nhiễm asen qua máu sẽ độc hơn rất nhiểu so với qua đường tiêu hoá. Liều asen gây chết người sau 24 giờ là 2mg/kg Ihể trọng. Các kim loại nạng trong lương thực thực phẩm thường đựơc xác định theo phương pháp "Ditizon". Ditizon (diphenyl thiocacbazon) có công thức: H N-N CH, H ^ ' s = c Ditizon tan trong cacbon tetraclorua và cloroíorm tạo thành dung dịch có màu xanh lá cây, ở dạng phân tử trong môi trường axit hoặc trung tính ditizon rất khó tan trong nước. Dung dịch càng có phản ứiig kiềm thì độ tan của dilizon càng tăng do tạo thành anion Dz HDz = Dz+H^ (dung môi) (nước) Ditizon tạo với ion nhiều kim loại những ditizonat có màu ít tan trong nước trong cacbon tetraclorua hay cloroíorm. Các ditizonat có thể tồn tại dưới hai dạng, tiiỳ vào độ axit của môi truờng: - Trong m ôi trường axit hay trung tính chúng tồn tại dưới hai dạng xeto; - Trong môi trường kiềm chúng tồn tại dưới dạng enol. 243
  58. H N N N N CaHs s c M, M. s c M. N N N N C ^H j Dạng xeto Dạng enol Dạng enol thường ít tan trong cacbon tetraclorua hay cloroữorm. Phản ứng cân bằng chính xảy ra khi chiết: M"* + nHDz = MDz + nH" (nước) (dung môi) (dung môi) (nước) Ngoài ra còn phản ứng: + Dz = HDz pK, = 8,7 (nước) (dung môi) Hiện nay phương pháp ditizon được dùng rộng rãi để xác định các độc tố kim loại trong lương thực thực phẩm; Bảng 10.1 ghi các giá trị pH chiết được hoàn toàn các ditizonat của một vài kim loại thường có thể lẫn trong thực phẩm. Bàng 10.1. Nguyên tố kim loại và pH dung dịch chiết pH Nguyên tố Điểu kiện màu của ditỉzonat Dung môi chiết chiết hoàn toàn Đổng (Cu++) Môi trường axit, đỏ, tím. 2-5 CCl, sắt (Fe++) Môi trường kiềm, đỏ, tím. 7-9 CCI, Chì (Pb++) Đỏ 7-10 CCI, Thiếc (Sn++) Đỏ 5-9 CCI4 Kẽm (Zn++) Đỏ 6-9 CCI4 244
  59. Các giá trị pH chiết hoàn toàn ditizonat nói trên chỉ là gần đúng vì pH này phụ thuộc vào các điều kiện chiết như: tỷ số thể tích hai dung môi chiết, lượng thuốc thử dư, các anion có lẫn trong dung dịch và lực ion của dung dịch. 10.2. THỰC HÀNH Bài 1. Chẩn bị dung dịch đê xác định đổng, chỉ, kẽm, thiếc Đồng, chì, kẽm, thiếc có trong thực phẩm với lượng nhỏ nên muốn xác định chúng cần phải vô cơ hoá mẫu thực phẩm. Có hai phương pháp vô cơ hoá mẳu. Phương pháp khô a. Dụng cụ, lioá chất - Capxun dung tích 250ml - Bếp cách cát - Pipet lOOml - Bếp điện - Bình định mức 250ml - Lò nung điều chỉnh nhiệt độ (600-700"C) - Cân kỹ thuật - Magie dioxyt (M g 0 2 ) - Phễu - Canxi axetat CaíCH^COO) 2 - Giấy lọc - Axit nitric đậm đặc (d = 1,4) b. Cách tiếu hành Dùng pipel lấy chính xác lOOml thực phẩm (nếu là sản phẩm lỏng), hoặc cân lấy lOOg thực phẩm (nếu là sản phẩm khô) cho vào capxun. Thêm vào capxun 0,5g MgƠ 2 và 0,5g Ca(CH.,C 0 0 ) 2 để tăng tốc độ vô cơ hoá và chống việc tạo thành các hợp chất bay hơi của kim loại nặng khi vô cơ hoá mẫu. Các chất này nhất thiết không được chứa thiếc, đồng, chì. Đạt capxun lên bếp cách cát, đốt cho thực phẩm cháy thành than. Đặt capxun vào lò nung ở nhiệt độ 600 - 700"C đến khi thực phẩm biến hoàn toàn thành tro xám (mất khoảng 3 giờ). Lấy capxun ra khởi lò nung để nguội. Cho vào capxun 20ml axit nitric đậm đặc (tuyệt đối không chứa đồng và chì) và 50ml nước cất hai lần. Đặt capxun lên bếp điện đun cho tan hết muối bám ở capxun đun sôi thêm 10 phút nữa (tiến hành trong tủ hút). Chuyển toàn bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250ml. Tráng rửa capxun nhiều lần 245
  60. bằng nước cất hai lần, nước tráng cũng chuyển vào bình định mức. 'rhêm nước cất đến vạch mức lắc kỹ. Phương pliáp ướt a. Dụng cụ: Như đã nêu ở phần trên b. Hoá chất : - Axit nitric đậm đặc(d = 1,4) - Axit suníuric đậm đặc (d = 1,84) - Amoni axetat NH^CHiCOO c. Cách tiến lìàiìli: Lấy lượng mẫu như trên cho vào capxun. Thêm vào capxun 3ml axit nitric đậm đặc và 50ml axit sunĩuric đậm đạc. Đặt capxuii lên bếp điện, đun xôi dung dịch trong capxun. Vẫn tiếp tục đun và cứ mỗi phút lại nhỏ thêm 5-20 giọt axit nitric đậm đặc. Quá trình phải làm trong tủ hút bởi khí mầu nâu sẽ thoát ra. Nếu thấy mầu dung dịch trong capxun thẫm lại thì phải tăng tốc độ nhỏ axit nitric đậm đặc. Khi dung dịch trở lên nhạt màu thì giảm tốc độ nhỏ axit nitric cho đến khi dung dịch trở thành không màu thì dừng lại. Tiếp tục đun cho khói trắng bốc đi hết rồi lại tiếp tục đun sôi thêm 10 phút nữa. Nếu sau đó dung dịch vẩn giữ không màu thì việc vô cơ hoá mẫu đã xong. Nếu dung dịch đen trở lại thì lại tiếp tục nhỏ thêm axit nitric cho đến khi dung dịch trở lại không màu. Lấy capxun ra khỏi bếp điện cho vào capxun 0,2g amon axelat, khuấy cho tan hết. Chuyển toàn bộ dung dịch từ capxun vào bình định mức dung tích 250ml thêm nước cất hai lần đến vạch mức, lắc kỹ. Nếu dung dịch trong capxun bị clục ihì phải lọc trước khi chuyển vào bình định mức. Ghi chú: Phưcmg pháp đốt khô nói trên có thể xác định được đồng và chì cũng được thừa nhận đế xác định thiếc. Dùng MgƠ 2 để giải phóng ra oxi hoạt động, giúp oxi hoá nhanh các chất hữu cơ. Ca(CH,C 0 0 ) 2 đóng vai trò phá vỡ MgƠ 2 , làm tăng lượng oxi hoạt động phóng vào chất hữu cơ do đó làm tăng tốc độ đôì. Cũng có thể dùng Mg(CH 3 COO)j và NaCl, Mg(CH,C 0 0 ) 2 và Ca(CH,COO ) 2 ; NH,C1 và 246
  61. NaCl; (NH 4 )2 CO, Tuy vậy hổn hợp MgOs và Ca(CH,COO ) 2 với tỷ lệ 1:1 làm cho tốc dộ đốt chất hữu cơ nhanh nhất. Nếu đốt khô không dùng hỗn hợp MgO; và canxiaxelat, thì muối thiếc dễ bay hơi và một phần Sn nằm dưới dạng không tan là axit P-metastanic. Sự mất thiếc trong đốt khô như vậy có thè’ từ 2,7-77,6%. Bài 2. Xác dịnh chi bằng phương pháp chiết chuẩn độ a. Nguyên lắc Trong môi trường trung tính hoặc kiềm, ion chì (Pb^"^) tạo với ditizon thành chì ditizonat màu đỏ tím trong dung dịch dung môi hữu cơ Pb'" + 2 H2 Dz = Pb(HDz) 2 + 2 i r Vì Pb(HDz) 2 tan rất ít trong dung môi hữii cơ, khi đó khi dùng môi trưòng trung tính thì tốt nhất nên dùng nồng độ của ditizon trong cacbontetra clorua là SOịì.M (microphân tử gam: 12,81mg/lít). Trong clorofom, Pb(HDz ) 2 tan gấp 17 lần trong cacbon tetraclorua. Do đó để xác định chì, người ta thường dùng cloroform để hoà tan ditizon . lon chì cũng tác dụng với ditizon trong môi trường axit yếu. ở pH>7 thì việc thu vào dạng Pb(HDz ) 2 là hoàn toàn. Dung dịch Pb(HDz ) 2 trong clorofom bị phân huỷ ở pH>9,5. Trong dung dịch, sau khi vô cơ hoá thực phẩm, có thể cũng có mật các ion Sn^'"' Cu^^, Zn^*, các ion này có thể liên kết (bị che giấu) bằng kalicyanua (KCN) nhưng không bị che bởi KCN nên tách ra khỏi dung dịch trước khi xác định chì. Phương pháp tách như sau: Lấy 25ml dung dịch từ bình định mức cho vào cốc có dung tích 250ml. Cho vào cốc lOOml brom lỏng (Bĩi) và đun trên bếp diện để đuổi hết hơi4 . SnBr Tiếp tục đun, thêm nước cất vào, rồi lại tiếp tục đun cho đến khi dung dịch không còn màu đỏ của brom. Lúc này dung dịch chi chứa các ion Pb"^, Cu^^, Zn'^Fe^^ b. Dụng cụ, lioá chất - Cân phân tích; - Bình định mức lOOOml; - Cốc dung tích 250ml; 247
  62. - Phiễu chiết dung tích lOOml; - Buret lOml; - Giấy thử pH; - Kalicyaniia tinh Ihể; - Hydroxylamin hydroclorua tinh thể (NH 2 OH.HCI). - Dung dịch chì tiêu chuấn 25 |.iM : Hoà tan 8,28mg Pb(N0,)2 tinh khiết loại I trong nước cất 2 lần thành lOOOinl (trong bình định mức lOOOml). 1 ml dung dịch này chứa 5,175 Y chì. - Dung dịch ditizon tiêu chuẩn : Ditizon trong clorofom dung dịch 50,0ụM. Cân tính xác trên cân phân tích 12,81mg ditizon tinh khiết loại I cho vào cốc. Cho 200ml cloroíom (CHCl,) vào cốc khuấy nhẹ cho tan ditizon. Chuyển dung dịch vào bình định mức dung tích lOOOml. Thêm cloroíom vào vạch mức lắc kỹ. - Amoniac dung dịch 2N; lấy 150ml amoniac dung dịch 25% cho vào bình định mức dung tích lOOOml, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. - Axit nitric dung dịch 2N : Hoà tan 128 ml HNO,đặc (d =1,4) với nước cất thành lOOOml. c. Cách tiếii hành Dung dịch loại ở trên được chuyển vào phễu chiết. Cho vào phễu vào tinh thể NH 2 OH.HCI lắc cho tan hết. Cho vào phễu một lượng (bằng hạt ngô) tinh thể KCN và lắc cho tan hết. Điểu chỉnh pH > 7,5 (theo giấy đo pH) bằng NH 4 OH 2NhoặcHNO, 2N. Nạp ditizon dung dịch 50 vào trong lOml. Nhỏ Iml dung dịch ditizon vào phều thuỷ chứa dung dịch mẫu trên, lắc 30 giây. Nếu có thì trong phần dung môi cloroữom sẽ hiện rõ màu đỏ tím của chất chì ditizonat. Chiết bỏ phần đỏ tím đi (phải chiết thật cẩn thận để phần dung dịch màu không chảy ra). Lại cho thêm Iml dung dịch ditizon vào phễu chiết, lắc 30 giây và lại tách bỏ phần màu đỏ tím. Cứ tiếp tục như trên cho đến khi màu của phần dung môi trong phễu chiết kém đỏ, tức lượng trong dung dịch giảm đi nhiều thì phải giảm lượng dung dịch ditizon nhỏ vào phễu chiết xuống đến 0 ,2 ml, lại lắc và tách như trên đến khi nhỏ ditizon vào phểu chiết, ditizon vẫn giữ màu xanh sau khi lắc 30 giây thì thôi ghi tổng số ml dung dịch đitizon đã dùng để chiết chuẩn độ ion chì. 248
  63. Cần phải xác định độ chuẩn chính thức của dung dịch ditizon trong clorofom 50,0ị-iM như sau : ỉấy chính xáclOml dung dịch chì tiêu chuẩn vào phễu chiết sạch. Nạp dung dịch diiizon 50,0|_im vào burei. Tiến hành chuẩn độ như trên. Chắng hạn hết 15ml dung dịch ditizon. Căn cứ vào độ chuấn của của dung dịch ditizon này, tính kết quả xác định chì. (I. Tính kết quả Trước hết lính xem 1 ml dung dịch ditizon ứng với bao nhiêu chì. Ta biết 1 ml dung dịch Pb(N 0 0 2 25 )LiM chứa 5,175 I-Ig chì. Vậy 1 ml dung dịch ditizon ứng với số Ị.ig chì: 5,175.10 — = 3,45 ịig chì Hàm lượng chì tính bằng Ị.ig có trong 1 lít hoặc 1 kg thực phẩm là: ^ 3,45.a.V.1000 , '^1 '^0 trong dó: 3,45: số chì ứng với 1 ml dung địch ditizon ; a : thể tích dung dịch ditizoii đã dùng để chuẩn độ; V : dung tích bình định mức, ml; V, : thể tích hút ra từ bình định mức để phân tích, ml; v„ : thể tích thực phẩm lỏng lấy dể vô cơ hoá, ml. Kết quả được tính ra |.ig /kg. Nếu hàm lượng chì lớn hơn 1000 yigjl thì kết quà được tính ra mg// ( 1 |ig = 1 0 '^ mg). Ví dụ lính toán Ví dụ lấy 100 ml dung địch thực phẩm đem vô cơ hoá, sau đó đem định mức trong bình dung tích 250ml. Hút 25ml dể loại rồi dung dịch (sau khi loại Sn^^) được cho vào phều chiết đủ và chuẩn độ chì hết lOml ditizon. Hàm lượng chì tính ra mg/1 là 249
  64. 3,45.10.250.1000 X = ——-——— = 3,45mg// 25.100.1000 Ghi chú: 1. Nếu trong dung dịch (sau khi vô cơ hoá thực phẩm) để xác định chì có chứa các cation và anion sau đây thì việc ảnh hưởng của chúng đến việc xác định chì như sau: - Ag^ Zn^^ Ni"* không cản trở đến việc xác định chì vì chiliig đều bị che giấu bởi KCN; - PO4 ' nồng độ cao có thể thu ở dạng Pb,(P0 j 2 ; - SO4 có thể tạo với thành PbS0 4 có thể hoà vào dung dịch bằng NH,CH,COO; - SiOs.nHiO ở dạng kẹo, gây khó khăn cho việc chuẩn độ bằng ditizon. Cần lắc mạnh phều chiết khi chuẩn độ. Tốt hơn là nên đuổi 2SÌO đi bằng cách cho HF vào để SÌO 2 bốc hơi dưới dạng axit flosilixic Tuy nhiên trong đa số thực phẩm, lượng các ion trên là rất nhỏ. 2. Phương pháp xác định kim loại nặng bằng ditizon là phương pháp lượng nhỏ, nên các hoá chất dùng là hoá chất tinh khiết loại I; các dụng CỊI phải được rửa sạch, kỹ, dùng nước cất hai lần tráng lại nhiều lần và trong quá trình tiến hành luôn luôn phải dùng nước cất hai lần. 3. Dung dịch ditizon tiêu chuẩn phải pha trong clorofom. Clorofom là loại dung môi dẻ bay hơi nên nếu không có điều kiện bảo quản lạnh, dung dịch ditizon rất dễ tăng nồng độ. Vì vậy tốt nhất mỗi lần sử dụng cần xác định độ chuẩn của nó bàng dung dịch chì tiêu chuẩn. 4. Phương pháp chuẩn độ chì (và kim loại nặng khác) bằng dilizon, nếu không được tiến hành cẩn thận, dễ mắc sai số do việc nhỏ giọt ditizon dễ bị dư ở giọt cuối cùng dùng phương pháp so màu sẽ cho kết quả chính xác hơn. 5. Xác định chì bằng phương pháp so màu xem tài liệu chuyên môn. 250
  65. Bài 3, Xác định đồng bằng phương pháp chiết chuẩn độ a. Nguyẽìì tắc Khi phản ứiig với ditizon, ion đồng thay thế một của diiizon tạo thành phức chất màu đò tím (phương trình I); m và thay thế hai của ditizon tạo thành phức chất màu vàng nâu (phương trình Ila và llb) Cu'" + 2 = Cu(HDz ) 2 + 2H" (I) Cu'" + Cu(HDz) 2 = 2CuDz + 2H" (Ila) + H 2 Dz = CuDz + 2H" (Ilb) Cả hai lớp chất Cu(HDz) 2 và CiiDz đều tan trong môi triròng dung môi hữii cơ nhưng không tan được trong nước. Việc tạo thành Cii(HDz ) 2 xẩy ra thuận lợi trong môi trường axit yếu và có dư ditizon. Trong môi trường trung tính ihấy xuất hiện đồng thời các phản ứng (1 , Ila, Ilb). ở nồng độ cao và pH = 2 việc tạo thành CuDz xảy ra thuận lợi Trong vùng dung môi hữu cơ, Cu(HDz ) 2 dễ phân li tạo thành CuDz: Cu(HDz) 2 = CuDz + H 2 Dz Do vậy, để xác định đồng bàng ditizon người ta thườiig tiến hành phản ứng ở pH = 3 -4 . b. Dựng cụ, lioá chất + Dụng cụ: Sỉr dụng các loại như đã nêu ở mục trên + Hoá chất: - Amorãac dung dịch 2N ; - Axit í-unruric dung dịch 2N: Hoà 55ml H 2 SO4 (d =1,84) vào nước cất, chỉnh đến V = 1000 ml; - Dung dịch ditizon trong clorofom 50 |iM; - Dung dịch đồng tiêu chuẩn: Hoà tan 19,64 mg CUSO4.5H2O tinh khiết loại I trong nước cất đến thành lOOOml (trong bình định mức), 1 ml dung dịch này chứa 5,0 ng đồng. 251
  66. c. Tiến hành Cũng sử dụng dịch đã loại Sii^'' (như khi xác định chì), cho vào phễu chiết. Điều chinh pH của dung dịch đến pH = 3 h-4 bằng dung dịch amoniac 2N hoặc axit suníuric dung dịch 2N với giấy thử pH. Chuẩn độ lượng đồng bằng dung dịch ditizon đã dùng. d. Tính kết quả Tương tự như tính kết quả khi xác định chì bằng phương pháp chiết chuẩn độ Ghi chú: 1. Ag'" cũng tác dụng với ditizon tạo thành AgHDz do đó cản trở việc xác định đồng, Có thể che giấu Ag^ bằng KBr. 2. Zn^'^ cản trở việc xác định đồng bằng ditizon. Nhưng nếu giảm pH xuống còn pH = 1 thì không cản trở. 3. cản trở xác định đồng. Dùng amoniac tạo kết tủa Fe(OH),. Lọc bỏ kết tủa này, nước lọc được cho vào phễu chiết để xác định đổng. 4. CO^'^ và Ni^'^ nồng độ cao, có thể phản ứng với ditizon đồng thời với . Nhưng nếu giảm pH nhỏ hơn 2 thì không cản trở. 5. Các ion S 2 O / , [Fe(CN)fi]'^ cản trở xác định với bất kỳ lượng nào CNS vừa phản ứng với Cu^^, vừa phản líng với ditizon, nên cản trở việc xác định 6. Xác định bằng phương pháp so màu: thu toàn bộ phần dung môi màu đỏ tím khi xác dinh đồng (bằng phương pháp chuẩn độ) vào bình định mức dung tích 25 1 1 1 I, tliêm cloroíom cỉến vạch inức, lắc kỹ. Đo màu dung dịcli Irèn rnáy ệaK-M (tương tự như việc xác định chì). Bài 4. Xác định kẽm bằng phương pháp so màu a. Nguyên tắc Trong lương thực, thực phẩm, lượng kẽm thường rất nhỏ nên có thể xác định được bằng ditizon. Trong môi truờng trung hoà hoặc hoặc có tính kiềm ít (thích hợp nhất là ở nồng độ pH = 8,3 và trong dung dịch có chứa chất đệm xitrat) Z vĩ* phản ứng với ditizon tạo phức chất màu đỏ. 252
  67. + 2 H 2 Dz = Zn(HDz ) 2 + 2H* chú ý là phải loại các ion đồng, chì có trong dung dịch trước khi xác định kẽm h. Dụng cụ, hoá chất + Dụng cụ như đã nêu ở phần trên + Hoá chất: - Dung dịch amoniac 2N - Dung dịch kali-natri tactrat (KNaC 4 H4 0 fi.4 H 2 0 ) 20%: hoà tan 20g kali- natritactrat trong lOOml nước cất. - Dưng dịch ditizon trong cloroíom 50|iM - Dung dịch natrisunfua (Na 2 S) bão hoà - Dung dịch kẽm tiêu chuẩn: cân 43,97mg kẽm suníat (ZnSƠ 4 .7 H2 0 ) tinh khiết loại I cho vào bình định mức dung tích lOOml, thêm vào lOml axit suníuric dung dịch 2N, rồi thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ. Iml dung dịch này chứa 10 |ig kẽm. c. Tiến Ììành Lấy 25ml dung dịch đã vô cơ hoá (bằng phưcmg pháp khô và ướt) cho vào phễu chiết. Trung hoà bằng dung dịch amoniac 2N đến pH=7 (thử với giấy pH), để yên cho phân lớn. Tách,bỏ lớp dưới có phức chất đồng - ditizonat màu đỏ tím. Lại thêm ditizon và tiếp tục lắc cho tới khi không còn màu đỏ tím ở phần ditizon. Trút phần dung dịch ditizon vào một cốc. Cho 3ml kali-natritactrat dung dịch 20% để chống kết tủa các hydroxit kim loại. Trung hoà bàng dung dịch amoniac 2N. Chuyển toàn bộ dung dịch từ cốc vào phễu chiết lắc kỹ. Dung dịch sẽ có lớp màu đỏ của kẽm ditizonat. Cho vào phễu chiết lOml natri sufua dung dịch bão hoà (để loại chì và ditizon dư), lắc kỹ. Để yên phễu cho tách lớp. Tách bỏ lớp dưới. Tiếp tục rửa N hịS cho đến khi lớp dưới không màu thì thôi. 253
  68. Chuyển dung dịch kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25ml, thêm clorofom tới vạch mức rồi lắc kỹ đem dung dịch này đo màu trên máy (ị)3 K- M. Đồng thời cũng lấy lOml dung dịch kẽm tiêu chuẩn vào phễu chiết khác. Tiến hành chuẩn độ trong dung dịch này với ditizon và cũng thu phần dung môi chứa kẽm-ditizonat màu đỏ vào bình định mức dung tích 25ml. Đem đo màu trên máy ệaK-M. r. Tinh kết qitả Ví dụ, trị sô' mật độ quang đọc được đối với 10 ml dung dịch kẽm tiêu chuấn là: 0,752; 0,751; 0,753. Tính trung bình 0,752. Trị sô' mật độ quang đọc được đối với 25ml dung dịch là: 0,502; 0,504; 0,505. Trung bình 0,504. Được biết rằng trong 10 ml dung dịch kẽm tiêu chuẩn có chứa; 10.10 = 100 Ị.ig kẽm. Vậy lượng kẽm có trong 25ml mẫu đem phân tích là: 100.0,504 —— = 66,94|ig 0,752 Từ đó tính ra lượng kẽm có trong llít hoặc Ikg lương thực, thực phẩm. Bài 5. Xác định thiếc bằng phương pháp iod a. Nguyên tắc Sau khi vô cơ hoá lirơng thực thực phẩm ta được dung dịch chứa thiếc ở 2 dạng là và Sn'*^. Dùng hydro khử toàn bộ lượng sang dạng rồi cho iod tác dụng với . Từ lượng iod đã dùng suy ra, tính được lượng thiếc có trong mâu thử. b. Dụng cụ, hoá chất - Pipet 50m l và 2 5 m l; - Bình kíp ; - Bình đốt Kendan dung tích 500ml; - Nút tinh ; - Bình nón dung tích 500 ; - Biiret ; 254
  69. - Cân kỹ thuật ; - Axit clohydric đặc (d =1,19); - Axit siinfiiric đạc (d =1,84); - Nhôm kim loại (hạt haybột); - Axit Iiitric đặc (d =1,14); - Canxi cacbonat CaCO,; - Amon axala' NH4C2O4 tinh thể; - lot dung dịch0.0 IN; - Natri thiosuníat Na 2 S2 0 , dung dịch 0,01 N; - Tinh bột hoà tan, dung dịch 1%: Hoà tan Ig tinh bột trong lOOml nước cất; đun nhẹ cho tan hết. h. Tiến liàiilì Dùng pipet hút 50ml lương thực, thực phẩm (nếu là sản phẩm lỏng) hoặc cân lOOg (nếu ià sản phẩm khô) cho vào bình đốt Kendan. Thêm vào bình 50ml axit suníuric đặc và lOml axit nitric đặc, lắc đều. Dung bếp điện đun cho dung dịch trong bình sôi mạnh để hơi nước và khói trắng bốc lên (tiến hành trong tủ hút). Sau đó cho axit nitric vào thêm tìmg giọt một cho đến hết một lượng khoảng 3-4ml và tiếp tục đun cho tới khi dung địch trong bình có màu vàng nhạt, lúc để nguội không màu mới thôi. Cho vào bình 5g amoni oxalat tinh thể để khử hết các tạp chất chứa nitơ. Đun tiếp trên bếp điện cho tới khi có khói trắng bốc lên. Sau kh' dể nguội chuyển toàn bộ dung dịch từ bình đốt sang bình nón dung tích 500ml Dùng nirớc cất tráng bình đốt nhiều lần, nước tráng cũng cho vào bình nón 30inl axit clohydric đặc. Đậy bình nón bằng nút caosu có hai lỗ. Một lỗ cắm ống thiiỷ tinh để dẫn khí CO2 vào, ống này cắm sát xuống đáy bình nón (xem hình 10.2.5). Lỗ kia cắm một ống thuỷ tinh khác dài lOcm và sâu xuống quá niit 3cm. Cho nhanh 0,5g nhôm (không chứa thiếc) vào bình nón và bắt đầu dẫn khí CO 2 từ bình kíp vào (xem hình 10.2.5), CO2 đuổi oxi của không khí khỏi bình Iión, chống sự oxit hoá Sn^^. Đun sôi dung dịch trong bình nón, nếu thấy có kết tủa Sn thì đun kỹ cho tan hết. Để nguội bình xuống đến nhiệt độ 15-20"c (dùng nước đá), trong lúc này vẫn tiếp tục dẫn khí CO2 vào bình nón. 255
  70. Nhanh chóng tháo bình nón ra 'khỏi bình kíp, mở nút và cho nhanh 25ml dung dịch iod 0,0IN (chứa trong buret) lắc mạnh và đều. Dùng nước cất tráng tất cả chất lỏng dính ở nút, ống thuỷ tiiih và thành trong của bình nón. Cho vào bình nón Iml dung dịch tinh bột tan 1%. Chuẩn độ iod dư bằng natri thiosunfat 0,0 IN cho đến khi dung dịch mất màu xanh. Phải chuấn thật nhanh, tránh oxi không khí vào nhiều ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Hình 10.2.5. Bộ sinh khí CO2 Phải là.n một mẫu trắng: Lấy 25ml dung dịch iod 0,01N vào bình nón sạch, thêm lOOml nước cất và 1 ml dung dịch tinh bột tan 1%. Chuẩn độ iod bằng natri thiosunfat dung dịch 0,01 N đến khi dung dịch mất màu xanh. c. Tính kết quả Hàm luợng thiếc (theo mg//) tính bằng công thức: 0,5935 (a-b). 1000 x = V trong đó: 0,5935 : lượng Sn, tính bằng mg ứng với 1 ml dung dịch iot 0,01 N; a : thể tích NasSiO, 0,0 IN dùng chuẩn mẫu trắng, ml; b : thể tích Na 2 S2 0 , 0,0 IN dùng chuẩn mẫu thử, ml; V : thể tích mẫu lấy để phân tích, ml. 256
  71. G hì chú: í - Khi đốt mẩu HNO^ và H2SO4 lác dụng với nhau tạo axit nylrozynsunfuric, chất này có tác dụng oxi hoá mạnh các chấthỮLi cơ và cả Sn^''. Chất này trong dung dịch nước dễ phàn giải thành HO. 2 ^so + HOH = 2 H 2SO4 + N O + N O 2 ONO'^ NO và NO 2 khi đun mạnh sẽ bốc hơi, khi đun nóng với sự có của các chất hữu cơ, HNO, sẽ phân giải theo phương trình 2H N O , = H 2O + 2N0 + 30 Oxi hoạt động này sẽ oxi hoá các chất hữu cơ thành nước và CO2 , CO2 sẽ bị bay hơi khi đốt mẫu. H2SO4 hút nước và phá huỷ các liên kết phức tạp của protit, lipit, gluxit. Ngoài ra nó cũng bị khử một phần thành SO2 : H2SO4 = H2O + SO2 + o Oxi này giúp vào việc oxi hoá các chất hữu cơ, còn SO 2 sẽ bị bốc hơi khi đun nóng. 2- Khi nhôm gặp axit clohydric sẽ có phàn ứng: AI + 3HC1 = AlCl, + 3H Hydro này sẽ chuyển thành S1 1 CI4 + 2H = SnCl2 + 2HC1 hoặc thành thiếc kim loại: SnCl2 + 2H = Sn + 2HC1 Sn kim loại này tan được trong HCl Sn + 2HC1 = SnClj + 2H 3- Khi CaCO, gặp HCl sẽ tạo ra CO 2 CaCO., + 2HC1 = CaCl 2 + CO2 + H2 O 257
  72. Phản ứng này được thực hiện trong bình kip 4- Sn^'" oxy hoíí bởi I 2 trong môi trường axit clohydric SnCl2 + I2 + 2HC1 = SnCU + 2H1 5- Phản ứng chuẩn độ 2I bàng NaịSiO,: Ỉ2 + 2 Na 2 S,0 , = 2NaI +Na 2 S,Ofi Bài 6. Xác định Asen Phương pháp đo màu bàng giấy tấm thưỷ ngân (II) clorua Các hợp chất chứa asen bị khử bởi hydro tạo thành asen hydrua. Chất này phản ứng với thuỷ ngân (II) clorua (HgCl 2 ) tẩm trên giấy lọc tạo thành hợp chất màu nâu. So sánh độ đậm màu của giấy này với dãy giấy tấm HgClí tiêu chuẩn sẽ tính lượng asen có trong mẫu thử. a. Dụng cụ, lioá chất - Ống đong 25ml; - Bê'p điện ; - Pipet lOOml, 25m l, 5ml; - Bê'p cách cát ; - Bình định mức 250ml; - Lò nung điều chinh nhiệt độ 400-50ơ’C ; - Cân kỹ thuật; - Giấy lọc cắt thành dải chữ nhạt; - Cân phân tích; - Bình nón dung tích 100 ml; - Ống thuỷ tinh: dài 30cm, đường kính 0,7cm; có một lỗ đường kính 0,3ml cách đầu dưới ống 22cm, ống được cắm qua lỗ của nút caosu 3cm. Giấy lọc tẩm HgCli đựơc đặt ở trong ống ở khoảng giữa nút và lỗ. - Axit nitric đậm đặc (d =1,14); - Kẽm hạt không chứa asen; - Axit clohydric đặc (d =1,19); - Asen trioxyt, tinh khiết loại I; - Magie oxyt (M gO) bột; - Thuỷ ngân (II) clorua, tinh khiết loại I, dung dịch 5%; - Axetat chì Pb(CH,C 0 0 ) 2 dung dịch 3%; 258