Bài giảng môn Công nghệ sinh học ứng dụng

261 trang vanle 3310

Download

Bạn đang xem 20 trang mẫu của tài liệu "Bài giảng môn Công nghệ sinh học ứng dụng", để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên

Tài liệu đính kèm:

bai_giang_mon_cong_nghe_sinh_hoc_ung_dung.pdf

Nội dung text: Bài giảng môn Công nghệ sinh học ứng dụng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ DỰ ÁN HỢP TÁC VIỆT NAM – HÀ LAN BÀI GIẢNG CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG Người biên soạn: TS. Trần Thị Lệ Huế, 08/2009
BÀI I CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP I. Khái niệm 1. Ý nghĩa của tạo dòng DNA Trước đây khoảng hơn một trăm năm Gregor Mendel đã đưa ra những định luật cho phép giải thích sự di truyền những đặc điểm sinh học. Cơ sở của những định luật này là mỗi một đặc điểm di truyền của sinh vật được điều khiển bởi 1 yếu tố, được gọi là gene, tồn tại ở đâu đó trong tế bào. Sự khám phá lại những định luật này của Mendel vào năm 1900 là sự khai sinh của di truyền học, ngành khoa học này có mục đich là hiểu bản chất của gene và giải thích những tác động của nó. Công nghệ DNA tái tổ hợp là một tập hợp các kỹ thuật phân tử để định vị, phân lập, biến đổi và nghiên cứu các đoạn DNA. Thuật ngữ tái tổ hợp được dùng thường xuyên do mục tiêu của nó là phối hợp DNA từ hai nguồn xa nhau. Ví dụ: các gene từ hai nguồn vi khuẩn khác nhau có thể được liên kết lại, hoặc một gene người có thể được đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn. Công nghệ DNA tái tổ hợp (thường được gọi là công nghệ di truyền) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA. 2. Tạo dòng DNA là gì? Về nguyên tắc một thí nghiệm tạo dòng DNA gồm những bước cơ bản sau đây: 1. Tinh sạch DNA 2. Cắt phân tử DNA 3. Xác định độ lớn của các đoạn DNA 4. Đưa các đoạn DNA vào vectơ tạo DNA tái tổ hợp 5. Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ 6. Xác định những tế bào chủ chứa phân tử tái tổ hợp DNA 3. Tại sao sự tạo dòng DNA quan trọng như vậy ? Ý nghĩa của tạo dòng đối với nghiên cứu và công nghệ sinh học Từ hình 1.1 ta nhận thấy việc tạo dòng gene là một quá trình tương đối đơn giản. Tại sao phương pháp này trong sinh học lại có ý nghĩa lớn như vậy ? Câu trả lời là: Trước hết việc tạo dòng gene là tách một gene ra khỏi tất cả những gene khác ở dạng tinh khiết, mà những gene này thường tồn tại với nhau trong một tế bào. Sẽ hiểu chính xác hơn khi quan sát thí nghiệm tạo dòng ở hình 1.2. Đoạn DNA được tạo dòng có thể thuộc một hỗn hợp gồm nhiều đoạn khác nhau, mà mỗi đoạn mang một gene hoặc một phần của gene. Hỗn hợp này có thể là toàn bộ hệ gene của một sinh vật (ví dụ hệ gene của người). Sau đó mỗi một đoạn được đưa vào một phân tử vector phù hợp và tạo nên một tập hợp các phân tử DNA tái tổ hợp, trong đó một phân tử mang gene cần tìm. Thông thường mỗi tế bào chủ chỉ tiếp nhận một phân tử DNA tái tổ hợp duy nhất. Như vậy, khi một gene nào đó được tách ra từ nhiều gene khác thì người ta có thể nghiên cứu đặc điểm của nó chính xác hơn. Quyết định sự thành công của thí nghiệm tạo dòng là liệu người ta có phân biệt được dòng quan tâm từ nhiều dòng khác nhau không? Ví dụ khi quan sát hệ 5
gene của vi khuẩn E.coli có khoảng 2000 gene, có thể tìm ra một gene trong điều kiện có nhiều dòng không (Hình 1.3)? Kỹ thuật gene đã mở ra một loạt cơ hội mà trước đây không thể có được. Vấn đề cơ bản là các gene có kích thước quá nhỏ và có hàng ngàn gene ở trong mỗi tế bào. Thậm chí khi quan sát trên kính hiển vi mạnh nhất, thì DNA xuất hiện như là một sợi dây bé xíu, không thể thấy các nucleotide và không có một dấu hiệu nào để nhận biết chỗ bắt đầu và kết thúc của một gene. 1. Thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp Phân tử DNA tái tổ hợp Vector Đoạn DNA ngoại lai 2. Đưa vào tế bào chủ Vi khuẩn Vi khuẩn chứa phân tử 3. Nhân phân tử DNA DNA tái tổ hợp tái tổ hợp 4. Nhân tế bào chủ 5. Xuất hiện một dòng qua nhiều lần phân chia tế bào Các dòng vi khuẩn phát triển trên môi trường agar Hình 1.1. Các bước cơ bản của tạo dòng DNA 6
Các đoạn DNA Các phân tử DNA tái tổ hợp Vector Mỗi phân tử chứa một đoạn DNA khác nhau Đưa vào vi khuẩn Nuôi trên môi trường agar Mỗi một dòng chứa một phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau với nhiều bản sao Hình 1.2. Bằng việc tạo dòng người ta tạo ra dạng đồng nhất chứa các đoạn DNA khác nhau 7
Để minh họa vấn đề này chúng ta hãy xem xét một ví dụ đặc trưng về di truyền phân tử như sau: Giả thiết chúng ta muốn phân lập một gene của người và đưa nó vào vi khuẩn để sản xuất một lượng lớn các protein người. Vấn đề đầu tiên là phải tìm được gene mong muốn. Geneome đơn bội của người chứa khoảng 3,3 tỷ cặp base. Giả sử gene mà chúng ta muốn phân lập dài 3.000 bp. Như vậy gene đích của chúng ta chỉ chiếm một phần triệu của geneome, vì thế để tìm kiếm gene trong một hệ gene đồ sộ là khó khăn hơn nhiều so với việc tìm kiếm một cây kim trong một đống cỏ khô. Và nếu chúng ta có thể định vị gene, thì tách nó ra khỏi geneome như thế nào? Không có forcep đủ nhỏ để gắp một đoạn DNA, và cũng không có một cái kéo cơ học nào đủ nhỏ để cắt ra khỏi hệ gene một đoạn gene riêng biệt. Một đoạn rất nhỏ từ geneome của E. coli Gene muốn tạo dòng Những đoạn DNA với những gene khác nhau, trong đó có trpA mà người ta muốn tạo dòng Làm thế nào mà người ta tìm ra được 1 gene hoặc xác định nó? Hình 1.3. Vấn đề khó khăn khi chọn lọc 8
Công nghệ DNA tái tổ hợp đã biến đổi sâu sắc phương thức nghiên cứu gene. Trước đây thông tin về cấu trúc và tổ chức của gene thu được bằng cách kiểm tra biểu hiện kiểu hình, ngày nay những kỹ thuật mới đã tạo ra khả năng tự đọc các trình tự nucleotide. Trước đây các nhà di truyền phải chờ đợi sự xuất hiện các đột biên ngẫu nhiên hoặc cảm ứng để phân tích hiệu quả của sự sai khác di truyền, ngày nay họ có thể tạo ra đột biến ở các điểm nhất định một cách chính xác và xem chúng thay đổi kiểu hình như thế nào. Công nghệ DNA tái tổ hợp đã cung cấp thông tin mới về cấu trúc và chức năng của gene và đã thay đổi nhiều khái niệm cơ bản của di truyền học. Ví dụ: trong khi mã di truyền được xem là rất phổ biến, thì bây giờ chúng ta còn biết rằng các mã không phổ biến cũng tồn tại trong DNA ty thể. Trước đây chúng ta cho rằng tổ chức gene eukaryote giống với prokaryote, nhưng bây giờ đã chứng minh được nhiều gene eukaryote bị gián đoạn bởi các intron. Ngày nay, chúng ta đã biết đầy đủ hơn về các quá trình tái bản, phiên mã, dịch mã, biến đổi RNA (RNA processing) và điều hòa gene thông qua việc sử dụng các kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Các kỹ thuật này cũng được dùng trong nhiều trong nhiều lĩnh vực khác, như hóa sinh học, vi sinh vật học, sinh học phát triển, sinh học thần kinh, tiến hóa và sinh thái học. Công nghệ DNA tái tổ hợp cũng được ứng dụng để tạo ra nhiều sản phẩm thương mại: thuốc, hormone, enzyme và các giống cây trồng, vật nuôi. Một nền công nghiệp hoàn toàn mới, công nghệ sinh học, đã phát triển chung quanh việc sử dụng các kỹ thuật này để tạo ra các sản phẩm mới. Trong y học, kỹ thuật DNA tái tổ hợp được dùng để thăm dò bản chất của ung thư, chẩn đoán các bệnh di truyền và nhiễm trùng, sản xuất thuốc và điều trị các rối loạn di truyền. Nếu chúng ta thành công trong việc định vị và phân lập gene mong muốn, thì bước tiếp theo là đưa nó vào tế bào vi khuẩn. Các đoạn DNA mạch thẳng sẽ bị thoái biến nhanh bởi vi khuẩn và để tồn tại và tái bản được gene phải được chèn vào trong một dạng ổn định. Khi biến nạp DNA tái tổ hợp thành công vào vi khuẩn còn phải đảm bảo rằng gene được phiên mã và dịch mã. Sự biểu hiện của gene là một quá trình phức tạp đòi hỏi một số trình tự DNA khác nằm ở ngoài gene. Tất cả những trình tự này phải hiện diện trong các hướng, ở các vị trí thích hợp của chúng để sản xuất protein. Phản ứng chuỗi polymerase 9
Hình 1.4. Bằng phản ứng chuỗi polymerase người ta có hàng triệu bản sao từ một gene Cuối cùng, các phương pháp được sử dụng để chuyển gene có hiệu quả rất thấp, trong hàng triệu tế bào chỉ có một số tế bào được biến nạp thành công và biểu hiện gene. Vì vậy, chúng ta có phương pháp để phát hiện được tế bào mang DNA tái tổ hợp mong muốn. Trong toàn bộ nghiên cứu sinh học chỉ có rất ít lĩnh vực không bị tác động bởi tạo dòng DNA, PCR và kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Đã từ lâu con người đã sử dụng vi sinh vật như vi khuẩn để sản xuất các hợp chất có ích, ví dụ thuốc kháng sinh penicillin, được tạo thành từ loài nấm có tên là Penicillium và streptomycin, một sản phẩm của vi khuẩn Streptomyces griseus. Tạo dòng DNA đã đưa lại cho sinh học một cuộc cách mạng, vì chúng mở ra một khả năng sản xuất protein của động vật có vú trong tế bào vi khuẩn. Các gene tạo dòng có một đặc điểm quan trọng là có thể biểu hiện trong một loài sinh vật không có quan hệ họ hàng gì với loài của nó. Như vậy, người ta có thể tạo dòng gene động vật trong vi khuẩn (Hình 1.5). Điều này có ý nghĩa rất lớn, người ta có thể tách các gene điều khiển tổng hợp chất kích thích và hocmon từ một cơ thể tồn tại trong tự nhiên. Sự tách chiết một chất từ sinh vật nguyên thuỷ thường đắt và khó khăn, nhưng khi đưa gene tương ứng vào vi khuẩn hoặc sinh vật khác thì sẽ thu được sản phẩm dễ dàng và với khối lượng lớn. Với phương pháp này người ta đã thành công trong nhiều trường hợp, cho đến nay có ý nghĩa nhất là sản xuất insulin bằng công nghệ gene. Tế bào động vật Gene mã hóa cho một protein động vật Vector cùng Nhiễm sắc thể với gene động 10 mRNA Vi khuẩn biến đổi gene
Hình 1.5. Phương pháp để sản xuất một protein động vật trong vi khuẩn Những nghiên cứu về y học và nông nghiệp nhờ tạo dòng DNA đã có những bước tiến quan trọng. Nhờ tạo dòng DNA mà người ta đã phát triển những chất tiêm phòng để bảo vệ cơ thể chống lại bệnh tật. Nhiều bệnh di truyền ngày nay có thể chẩn đoán ở giai đoạn bào thai và những nghiên cứu xác định được bệnh ở giai đoạn sớm nhất, như ung thư vú và những bệnh hiểm nghèo, có hy vọng chữa trị được. II. Các enzyme tác động lên DNA Khả năng thay đổi DNA trong ống nghiệm là dựa trên những nghiên cứu về sự tổng hợp và biến đổi DNA trong tế bào sống. Người ta đã phát hiện những enzyme có trong tế bào có thể cắt và nối DNA và đã phân lập được những enzyme này. Với chúng ngày nay người ta có thể tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp. Đặc điểm của những enzyme này và việc sử dụng chúng vào thí nghiệm tạo dòng sẽ đề cập chi tiết sau đây. a. Một exonuclease Chỗ cắt Liên kết hydro Nucleotide Liên kết phosphodiester Chỗ cắt b. Một endonuclease Chỗ cắt 11
Hình 1.6. Các phản ứng do hai loại nuclease xúc tác a. Exonuclease tách các nucleotide từ các đầu cuối phân tử DNA b. Endonuclease cắt liên kết phosphodiester từ bên trong Khi đã có DNA tinh khiết, bước tiếp theo của thí nghiệm tạo dòng là thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp. Vector tạo dòng cũng như DNA phải được cắt ở những vị trí xác định và bằng cách xác định để nối lại với nhau. Cắt và nối là hai ví dụ về phương pháp thay đổi DNA. Trong những năm qua một loạt các phương pháp được phát triển để biến đổi các phân tử DNA không những chỉ cắt, nối mà có thể làm ngắn, nối dài, gắn vào hoặc tách những nhóm hoá học xác định nào đó. Tất cả những biến đổi này có thể thực hiện được trong ống nghiệm, và tạo nên nền tảng không chỉ đối với tạo dòng mà còn đối với những nghiên cứu cơ bản về hoá sinh DNA, cấu trúc của gene và điều khiển sự biểu hiện gene. Trong tế bào những enzyme này tham gia vào các quá trình sống, như tái sinh, sao chép, phân giải (ví dụ DNA của virus), sửa chữa DNA đột biến và kết hợp các phân tử DNA khác nhau. Nhiều loại enzyme này được tách từ dịch tế bào và chúng có thể thực hiện chức năng trong điều kiện nhân tạo. Các phản ứng enzyme thường rất đơn giản, nhưng đòi hỏi enzyme phải ở dạng tinh khiết. Enzyme được chia làm 5 nhóm lớn dựa trên phản ứng mà enzyme xúc tác. 1. Nuclease là những enzyme cắt, làm ngắn, phân giải các phân tử nucleic acid 2. Ligase nối các phân tử nucleic acid 3. Polymerase sản sinh các bản sao của phân tử nucleic acid 4. Các enzyme biến đổi bằng cách tách hoặc gắn những nhóm hoá học 5. Topoisomerase: làm xuất hiện hoặc mất cấu trúc xoắn của DNA dạng vòng. Trước khi đi vào các nhóm enzyme cụ thể cần phải nêu lên hai điểm: Thứ nhất phần lớn các enzyme được xếp vào một nhóm, tuy nhiên một số enzyme có thể thuộc vào hai hay nhiều nhóm. Vi dụ các polymerase, chúng vừa có thể tạo nên phân tử DNA mới và vừa có hoạt tính của nuclease là phân giải DNA. Thứ hai là cần chú ý rằng, bên cạnh những enzyme làm thay đổi DNA, người ta cũng biết nhiều enzyme tương tự tác dụng lên RNA. Ví dụ enzyme ribonuclease, sử dụng để phân giải RNA trong dịch tế bào khi muốn thu nhận DNA tinh sạch. Ở đây trước hết đề cập đến enzyme tác động lên DNA. 1. Nuclease Cũng theo tiêu chuẩn này người ta phân biệt các endonuclease. Endonuclease S1 (từ nấm Aspergillus oryzae) chỉ tác động lên từng sợi đơn (Hình 1.8a), trong khi đó deoxyribonuclease I (DNase I, từ dạ cỏ bò), cắt cả sợi đơn và sợi kép (Hình 1.8b). DNase I tác động lên DNA ở các liên kết phosphodiester bên trong. Khi xử lý với enzyme càng lâu thì xuất hiện một hỗn hợp các mononucleotide và các oligonucleotide rất ngắn. 12
a. Bal 31 b. Exonuclease III Hình 1.7. Các loại exonuclease khác nhau xúc tác cho các phản ứng a. Bal31 tách các nucleotide từ hai đầu của DNA sợi kép b. Exonuclease III tách nucleotide chỉ đầu cuối 3’ Ngược lại, có một nhóm đặc enzyme biệt hơn, được gọi là enzyme hạn chế (restriction endonuclease), cắt DNA sợi kép chỉ ở một số vị trí xác định (Hình 1.8c). Những enzyme này sẽ được mô tả chi tiết ở phần sau. 13
2. Ligase Trong tế bào DNA-ligase sửa chữa những chỗ đứt trên sợi đơn của phân tử DNA sợi kép, những chỗ đứt này có thể xuất hiện khi tái sinh DNA. Ngoài ra DNA- ligase của hầu hết các sinh vật có thể nối hai đoạn DNA sợi kép lại với nhau. 3. Polymerase a. Nuclease S1 Lỗ hổng trên sợi đơn b. DNase I c. Endonuclease Không có sự cắt tiếp theo 14
Hình 1.8. Các phản ứng được xúc tác bởi nhiều loại endonuclease khác nhau a. Nuclease I chỉ cắt các sợi đơn và các lổ hổng trên sợi đơn của DNA sợi kép b. DNAase I cắt DNA cả sợi đơn và kép c. Một endonuclease cắt sợi kép chỉ ở một số vị trí nhất định DNA-polymerase là những enzyme tổng hợp sợi DNA mới nhờ có sợi DNA hoặc RNA khuôn mẫu (template) (Hình 1.10a). Phần lớn các polymerase chỉ hoạt động khi trong khuôn có một đoạn sợi kép, đoạn này được gọi là primer (mồi) bắt đầu cho phản ứng tổng hợp. Có ba loại DNA-polymerase được sử dụng trong công nghệ gene: DNA-polymerase I, được tách ra từ E. coli. Enzyme này gắn vào một đoạn đơn ngắn là điểm đứt trên 1 sợi DNA trong DNA sợi đôi (nick) của phân tử DNA sợi kép và tổng hợp nên một sợi hoàn toàn mới. DNA-polymerase I cũng là một ví dụ cho enzym có hai chức năng: tổng hợp và phân giải DNA. a. Sữa chữa chỗ đứt trên sợi đơn Chỗ đứt trên sợi đơn DNA-ligase b. Gắn kết hai phân tử DNA-ligase 15
Hình 1.9. Hai loại phản ứng được xúc tác bởi DNA-ligase a. Sửa chữa liên kết phosphodiester bị thiếu trên một sợi đơn b. Gắn hai sợi kép lại với nhau Hoạt tính polymerase và nuclease của DNA polymerase I được điều khiển bởi những vùng khác nhau của phân tử enzyme. Hoạt tính nuclease nằm ở 323 gốc amino acid đầu tiên của chuỗi polypeptide. Nếu cắt đi phần này thì enzyme bị thay đổi, hoạt tính polymerase vẫn còn, nhưng hoạt tính phân giải DNA bị mất. Enzyme bị biến đổi này được gọi là đoạn Klenow. Đoạn Klenow có thể tổng hợp sợi bổ sung từ DNA khuôn, tuy nhiên sự tổng hợp không tiếp tục khi chỗ đứt trên sợi đơn được lấp đầy (Hình 1.10c). Ứng dụng quan trọng nhất là đoạn Klenow là xác định trình tự DNA. Một loại DNA-polymerase thứ ba là reverse transcriptase, enzyme tham gia vào sự tái sinh của nhiều virus. Đặc tính duy nhất của nó là sử dụng RNA làm khuôn (Hình 1.10d). Khả năng tổng hợp nên sợi DNA bổ sung từ RNA khuôn của enzyme có ý nghĩa trung tâm trong kỹ thuật tạo dòng cDNA. a. Phản ứng cơ bản Sợi khuôn Đoạn mồi Sợi mới được tổng hợp b. DNA-polymerase I Lỗ hổng trên sợi đơn (nick) Những nucleotide này được thay thế bằng những nucleotide mới c. Đoạn Klenow Những nucleotide này không Chỉ có lỗ hổng được lấp đầy được thay thế 16 d. Reverse transcriptase
Hình 1.10. Các phản ứng được xúc tác bởi DNA-polymerase a. Phản ứng cơ bản: Một sợi DNA mới được tổng hợp theo hướng 5’ 3’ b. DNA-polymerase I trước hết lấp những lỗ hổng trên sợi đơn và sau đó tổng hợp sợi mới trên cơ sở phân giải sợi cũ c. Đoạn Klenow chỉ lấp những lỗ hổng d. Enzyme Reverse Transcriptase sử dụng RNA làm khuôn 4. Các enzyme biến đổi DNA Có nhiều enzyme làm thay đổi DNA bằng cách gắn vào hoặc tách ra các nhóm hoá học. Quan trọng nhất là những enzyme sau đây: 1. Phosphatase kiềm (từ E. coli hoặc ruột bê) tách nhóm phosphate của đầu 5’ của phân tử DNA (Hình 1.11a). 2. Polynucleotide kinase (từ E. coli nhiễm phage T4) có tác dụng ngược với phosphatase kiềm: gắn nhóm phosphate vào đầu 5’ tự do (Hình 1.11b). Enzyme terminal deoxynucleotide transferase gắn một hoặc nhiều deoxynucleotide vào đầu cuối 3’ của phân tử DNA. a. Phosphatase kiềm b. Polynucleotide transfrease 17 c. Terminal deoxynucleotide transferase
Hình 1.11. Các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme biến đổi DNA a. Phosphatase kiềm tách nhóm phosphate ở đầu 5’ b. Polynucleotide kinase gắn nhóm phosphate ở đầu 5’ c. Terminal deoxynucleotide transferase gắn các nucleotide vào đầu 3’ của sợi đơn (1) hoặc sợi kép (2). 5. Topoisomerase Topoisomerase là enzyme có khả năng thay đổi hình dạng của DNA vòng, đồng hoá trị (DNA plasmid), bằng cách làm mất hoặc xuất hiện xoắn ở mức cao hơn. Đối với nghiên cứu sự tái sinh DNA thì những enzyme này quan trọng, nhưng với công nghệ gene cho đến nay chưa có ứng dụng thực sự nào. III. Enzym hạn chế: Restriction endonuclease Khi tạo dòng điều cần thiết là cắt các phân tử DNA chính xác và luôn luôn cùng cách. Vector phải được cắt ở một vị trí duy nhất để mở vòng và chèn đoạn DNA ngoại lai vào. Phân tử DNA bị cắt nhiều lần, thành hai hoặc nhiều đoạn riêng lẻ thì không thể dùng làm vector tạo dòng. Vậy vector phải được thiết kế như thế nào và cần những endonuclease nào để thực hiện sự thay đổi này? a. Phân tử vector Mở vector ở vị trí cắt 18
Hình 1.12. Tại sao ở thí nghiệm tạo dòng người ta phải cắt thật chính xác Thường người ta phải cắt DNA khi tạo dòng (Hình 1.12 b), vì phần lớn những vector tạo dòng tiếp nhận đoạn DNA có độ lớn xác định. Ví dụ các vector trên cơ sở M13 chỉ tạo dòng có hiệu quả khi đoạn DNA nhỏ hơn 3 kb. Với các enzyme hạn chế tinh khiết người ta mới có thể cắt chính xác các phân tử DNA. Nhờ sự phát hiện những enzyme này mà Arber, Smith và Nathans nhận được giải thưởng Nobel vào năm 1978, là một trong những điều kiện quan trọng nhất đối với sự phát triển của công nghệ gene. 1. Phát hiện và kiểu tác động của enzyme hạn chế Quan sát đầu tiên dẫn đến sự phát hiện ra enzyme hạn chế đã bắt đầu từ những năm đầu những năm năm mươi. Người ta thấy một số loài vi khuẩn miễn dịch đối với một số phage, hiện tượng này được gọi là hạn chế ký chủ. Cơ chế của quá trình này không phức tạp lắm, tuy nhiên mãi 20 năm sau người ta mới hiểu một cách đầy đủ. Nguyên nhân của hạn chế là enzyme do vi khuẩn sản sinh ra, phân giải DNA của phage trước khi chúng tự tái sinh và tổng hợp nên hạt phage mới (Hình 1.13a). a. Giới hạn của DNA phage Phage đẩy DNA 19 vào tế bào vi
Hình 1.13 Chức năng của endonuclease trong tế bào DNA của phage (a) bị phân giải nhưng DNA của vi khuẩn (b) thì không Tuy nhiên, DNA của vi khuẩn không bị phân giải vì các base nitrogene ở trình tự nhận biết đã bị methyl hóa nên enzyme không còn nhận ra được vị trí cắt (Hình 1.13b). Những enzyme phân giải này được gọi là enzym hạn chế (restriction endonuclease). Chúng có mặt ở tất cả các loài vi khuẩn. Hiện nay, đã có hơn 1200 enzyme thuộc loại này được xác định. Người ta biết có ba loại enzyme hạn chế khác nhau. Loại I và III có ý nghĩa rất giới hạn đối với công nghệ sinh học. Ngược lại loại II là những enzyme cắt rất quan trọng đối với tạo dòng DNA. 2. Enzyme hạn chế loại II cắt DNA ở những trình tự hoàn toàn xác định Enzyme hạn chế loại II đặc biệt đã trở thành một công cụ rất hữu ích đối với các nhà sinh học phân tử. Những enzyme này gắn vào DNA ở bất kỳ vị trí nào và di chuyển dọc theo sợi DNA cho đến khi gặp trình tự nhận biết. Khi enzyme gắn vào trình tự nhận biết cấu trúc của enzyme thay đổi tạo điều kiện cho phản ứng cắt. Các vị trí nhận biết này có kích thước khác nhau tuỳ thuộc loại enzyme: Nhiều enzyme 20
hạn chế có trình tự nhận biết 6 nucleotide, một số khác có 4, 5, 8 nucleotide, hoặc cũng có thể là 20. Ví dụ Sau3A (từ Staphylococcus aureus dòng 3A) có trình tự nhận biết là GATC và AluI (từ Arthrobacter luteus) là trình tự AGCT. Ngoài ra còn có những enzyme nhận biết các trình tự thoái hoá, nghĩa là chúng có thể cắt DNA ở nhiều trình tự tương tự nhau. Ví dụ HinfI (từ Haemophulus influenzae dòng Rf) nhận biết trình tự GANTC và có khả năng cắt ở các trình tự sau: GAATC, GATTC, GACTC và GAGTC. Mặc dù trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế là khác nhau, nhưng khi cắt so le chúng đều tạo ra trình tự palindrome giống nhau khi đọc theo hướng 5' đến 3' trên mỗi sợi đơn. Một ví dụ về trình tự palindrome được tạo bởi enzyme EcoRI là AATT. Hình 1.14 Enzym EcoRI Các trình tự nhận biết của một số enzyme hạn chế thường được sử dụng trình bày ở bảng 1.1 EcoRI nhận biết trình tự 6 nucleotide là GAATTC đọc từ đầu 5' đến 3'. Trình tự bổ sung (trên sợi DNA bổ sung) khi đọc từ 5' đến 3' cũng là GAATTC. Trên hình 1.14 biểu diễn enzyme EcoRI gắn và cắt đối xứng ở cùng điểm bên trong trình tự (giữa G và A khi đọc từ 5' đến 3') trên cả hai sợi, ở đây ta có thể nhận ra trình tự palindrome. 21
Bảng 1.1 Một số enzymne hạn chế thường được sử dụng Enzyme Nguồn vi sinh vật Trình tự nhận biết Loại đầu EcoRI Escherichia coli 5’-G AATTC-3’ Dính 3”-CTTAA G-5’ BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5’-G GATCC-3’ Dính 3’-CCTAG G5’ BglII Bacillus globigii 5’-A GATCT-3’ Dính 3’-TCTAG A-5’ PvuI Proteus vulgaris CGATCG Dính PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Đầu bằng HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT Dính Rd Hinfl GANTC Dính Haemophilus influenzae Rf Sau3A GATC Dính Staphylococcus aureus AluI AGCT Đầu bằng Arthrobacter luteus TaqI TCGA Dính Thermus aquaticus HaeIII GGCC Đầu bằng Haemophilus aegyptius Notl GCGGCCGC Dính Nocardia otitidis- caviarum 22
3. Đầu bằng và đầu dính Đối với thí nghiệm tạo dòng điều quan trọng là đoạn cắt được tạo ra từ enzyme hạn chế như thế nào. Nhiều enzyme cắt đơn giản hai sợi DNA ở giữa trình tự nhận biết (Hình 1.15a), vì vậy xuất hiện đầu bằng (blunt ends), ví dụ enzyme PvuII và AluI. a. Tạo ra các đầu bằng AluI “N”=A, G, C hoặc T Các đầu bằng b. Tạo ra các đầu dính EcoRI Các đầu dính c. Các endonuclease khác nhau tạo ra các đầu dính giống nhau BamHI BglII Sau3A Hình 1.15. Các đầu cuối xuất hiện do DNA được cắt bằng những endonuclease khác nhau a. Đầu bằng được tạo ra bởi AluI 23
b. Đầu dính được tạo ra bởi EcoRI c. Các đầu dính giống nhau được tạo ra bởi BamHI, BglII và Sau3A Điểm quan trọng là khi cắt tạo nên những “đầu dính”, vì chúng dễ dàng gắn lại với nhau theo nguyên tắc bổ sung. Những enzyme này cắt hai sợi DNA không ở cùng một vị trí mà thường dịch chuyển 2 hoặc 4 nucleotide, vì vậy những đoạn DNA xuất hiện có đầu cuối là sợi đơn nhô ra (Hình 1.15b). Những enzyme hạn chế với các trình tự nhận biết khác nhau có thể tạo ra những đầu dính giống nhau. Ví dụ, BamHI (trình tự nhận biết là GGATCC) và BglII (trình tự nhận biết AGATCT). Khi cắt bằng hai enzyme này đều xuất hiện đầu dính có trình tự GATC (Hình 1.15c). Đầu dính như vậy cũng được tạo ra bởi Sau3AI, enzyme có trình tự nhận biết 4 nucleotide GATC. Các đoạn DNA xuất hiện khi cắt bằng những enzyme này có thể gắn lại được với nhau, vì các đầu dính này bổ sung cho nhau. 4. Số vị trí nhận biết của enzyme hạn chế trong phân tử DNA Chúng ta có thể ước lượng được tần suất cắt DNA khi biết được kích thước của vị trí cắt. Có 4 loại nucleotide cấu tạo nên DNA nên khả năng cắt xảy ra ở bất kỳ một loại nucleotide nào là 1/4. Trong trường hợp kích thước của vị trí cắt có 4 nucleotide thì xác suất cắt xảy ra ở bất kỳ vị trí nào đó là 1/4 x 1/4 x 1/4 x 1/4 = 1/256, có nghĩa là cứ trung bình 256 bp có một lần cắt. Bằng cách tính tương tự có thể dự đoán được số đoạn DNA tạo ra nếu biết kích thước của trình tự nhận biết. Điều này có ý nghĩa đối với lập bản đồ gene và kỹ thuật di truyền. Tuy nhiên, trong thực tế không hoàn toàn chính xác như vậy. Ví dụ DNA của phage  có chiều dài 49 kb, theo tính toán có chứa khoảng 12 chỗ cắt cho một enzyme có trình tự nhận biết là 6 nucleotide, nhưng thực tế số lượng vị trí cắt ít hơn (ví dụ có 6 vị trí cắt đối với BglII, 5 với BamHI và chỉ 2 với SalI). a. Các vị trí cắt của một số enzyme trên  DNA BglII: có 6 vị trí cắt BamHI: có 5 vị trí cắt SalI: có 2 vị trí cắt b. Độ lớn của các đoạn DNA BglII 24 BamHI
Hình 1.16. Cắt DNA phage  bằng các enzyme hạn chế khác nhau a. Vị trí nhận biết của BglII, BamHI và SalI b. Các đoạn thu được khi cắt bằng các endonuclease. Các con số biểu diễn độ lớn của các đoạn DNA bằng cặp base (bp) Ngoài ra, các vị trí cắt phân bố không đồng đều trên phân tử DNA, vì nếu phân bố đồng đều thì các đoạn tạo ra có độ lớn phải bằng nhau. Hình 1.16b cho thấy độ lớn các đoạn thu được khi cắt phage  bằng BglII, BamHI và SalI. Trong nhiều trường hợp các đoạn thu được có độ lớn phân tán rất rộng. Điều này nói lên rằng các nucleotide sắp xếp hoàn toàn ngẫu nhiên trên DNA. Từ hình 1.16 với phương pháp toán học người ta có thể hình dung có bao nhiêu vị trí cắt có thể chờ đợi ở một phân tử DNA, nhưng bức tranh thực tế chỉ có được khi phân tích thực nghiệm. 5. Quá trình cắt bằng enzyme hạn chế trong phòng thí nghiệm Ví dụ cắt -DNA (nồng độ 125 g/ml) bằng BglII. Trước hết cho DNA vào eppendorf, lượng bao nhiêu là tùy thuộc vào mục đích của từng loại thí nghiệm, ví dụ 2 g DNA tube (có trong 16 l, Hình 1.17). Thành phần được cho vào tiếp theo là dung dịch đệm. Đệm được cung cấp trên thị trường có nồng độ cao hơn 10 lần so với nồng độ phản ứng, vì vậy phải được pha loãng 10 lần. Ví dụ thể tích cuối cùng của hỗn hợp phản ứng là 20 l, thì chỉ cần 2 l dung dịch đệm BglII. Enzyme là thành phần cuối cùng được cho vào hỗn hợp phản ứng. Enzyme ở dạng tinh khiết với nồng độ đã biết do nhà sản xuất cung cấp. Nồng độ enzyme phải được tính chính xác để đảm bảo hoạt tính enzyme là cao nhất. Một đơn vị enzyme là lượng enzyme cần để cắt 1 g DNA trong thời gian 1 giờ, ví dụ có 2g DNA thì cần 2 đơn vị BglII. BglII trên thị trường có nồng độ 4 đơn vị/l nên chỉ cần 0,5 l cho thí nghiệm này. Để có thể tích cuối cùng là 20l cần thêm 1,5 l nước cất (Hình 1.17c). Phần lớn các enzyme hạn chế hoạt động tốt ở pH 7,4, nhưng các loại enzyme khác nhau cần nồng độ ion khác nhau (được tạo ra bởi NaCl) và nồng độ Mg2+ (tất cả các enzyme hạn chế loại II cần Mg2+). Ngoài ra, cần cho thêm chất khử dithiothreitol để tăng sự bền vững và giảm sự bất hoạt của enzyme. Điều quan trọng là phải tạo điều kiện phản ứng chính xác cho mỗi loại enzyme. Nồng độ NaCl và 25
Mg2+ không chính xác không những làm giảm hoạt tính của enzyme mà còn thay đổi tính đặc hiệu của chúng là cắt DNA ở những vị trí không đặc hiệu. Thành phần dung dịch đệm thích hợp cho BglII được trình bày ở bảng 1.2. Bảng 1.2 Thành phần đệm của enzyme BglII có nồng độ cao gấp 10 lần Thành phần Nồng độ (mM) Tris-HCl, pH 7,4 500 MgCl2 100 NaCl Dithiothreitol 500 10 Yếu tố cuối cùng cần chú ý là nhiệt độ ủ. Hầu hết enzyme hạn chế có hoạt tính cao nhất ở nhiệt độ 37 0C, nhưng một số khác có nhiệt độ tối thích cao hơn. Ví dụ TaqI thu được từ vi khuẩn Thermus aquaticus thích nghi ở nhiệt độ cao như suối nước nóng. Khi cắt bằng enzyme này người ta ủ ở nhiệt độ 650C mới đạt được hoạt tính cực đại. Sau thời gian ủ 1 giờ phản ứng xảy ra hoàn toàn (Hình 1.17d). Nếu muốn sử dụng các đoạn DNA này cho thí nghiệm tạo dòng thì phải khử hoạt enzyme bằng cách nào đó. Có nhiều phương pháp làm bất hoạt enzyme. Trong nhiều trường hợp chỉ cần ủ trong thời gian ngắn ở nhiệt độ 700C hoặc chiết bằng phenol hoặc cho vào hỗn hợp phản ứng EDTA, chất này kết hợp với Mg2+ làm cho enzyme mất hoạt tính (Hình 1.17c). (a) (b) (c) Cho vào 1,5 l H2O Cho vào 2 l đệm BglII và 0,5 l BglII 2 g -DNA (16 l) o Ủ: 1 giờ ở 37 C (d) (e) DNA của phage 26  được cắt ra Cho thêm phenol hoặc EDTA hoặc gia nhiệt 70oC trong 15 phút
Hình 1.17 Tiến trình cắt bằng enzyme giới hạn trong phòng thí nghiệm 6. Phân tích kết quả của phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế Phản ứng cắt làm xuất hiện một số đoạn DNA, độ lớn của từng đoạn phụ thuộc vào vị trí các điểm cắt trong phân tử DNA gốc (Hình 1.16). Khi tạo dòng người ta cần một phương pháp để xác định số lượng và độ lớn của các đoạn DNA. Nói chung, phân tử DNA được cắt hay không, có thể dễ dàng nhận biết bằng cách xác định độ nhớt của dung dịch. Các phân tử DNA lớn làm cho dung dịch đặc quánh hơn phân tử DNA nhỏ. Tuy nhiên để xác định chính xác số lượng và độ lớn của sản phẩm là khó khăn và mất nhiều thời gian. Vào đầu những năm 70 vấn đề này đã được giải quyết nhờ phương pháp điện di. 6.1. Sự tách các phân tử bằng điện di a. Điện di thường DNA Đệm Điện di DNA di chuyển về cực dương nhưng quá trình tách theo độ lớn 27 b. Điện di trên gel
Hình 1.18. Điện di thường (a) không tách được các đoạn DNA có độ lớn khác nhau, điện di trên gel (b) thì tách được Cũng như protein và nhiều phân tử khác, DNA mang điện và tích điện âm. Vì vậy, chúng di chuyển về cực dương khi ở trong điện trường (Hình 1.18a). Tốc độ di chuyển của chúng phụ thuộc vào hai đặc điểm: hình dạng và điện tích của phân tử. Phần lớn các phân tử DNA có cùng hình dạng và điện tích thì tỷ lệ với độ lớn. Bằng điện di đơn giản người ta không thể tách các đoạn DNA có độ lớn khác nhau. Khi cho hỗn hợp các đoạn DNA điện di trong gel được tạo nên từ agarose hoặc polyacrylamide, các phân tử DNA phải di chuyển qua hệ thống lỗ rây để đi đến cực dương. Phân tử DNA càng nhỏ, thì di chuyển càng nhanh. Nhờ vậy các phân tử DNA được tách ra trong điện di theo độ lớn của nó (Hình 1.18b). 28
Trong thực tế nồng độ agarose được xác định phụ thuộc vào độ lớn của các phân tử DNA. Ví dụ, gel có độ dày 0,5 cm từ 0,5% agarose, thì lỗ có kích thước tương đối lớn dùng để tách các phân tử DNA có độ lớn từ 1-30 kb, và phân biệt được rõ ràng khi phân tử có độ lớn 10-12 kb. Gel mỏng nhất (0,3 mm) được tạo nên từ 40% polyacrylamide dùng để tách các phân tử DNA ngắn hơn 300 bp. Những gel này cho phép phân biệt được các phân tử có độ dài khác nhau một nucleotide. 6.2. Sự hiển thị của phân tử DNA trong gel Phương pháp đơn giản nhất để hiển thị kết quả điện di là nhuộm gel với ethidium bromide (EtBr, Hình 1.19). Sau khi nhuộm EtBr và quan sát gel dưới ánh sáng tử ngoại có thể nhận biết vị trí các vạch tương ứng với độ lớn của các đoạn DNA với điều kiện là DNA phải đạt được một lượng nhất định. Tuy nhiên, nhuộm gel bằng EtBt có nhược điểm là độ nhạy có giới hạn. Khi một vạch có lượng DNA ít hơn 25 ng thì không nhận ra được. Vì vậy, cần phải có phương pháp phát hiện nhạy hơn. Phóng xạ tự ghi giải quyết được vấn đề này. Trước khi điện di DNA được đánh dấu phóng xạ, rồi hiển thị chúng bằng cách đặt một bản phim lên gel. DNA phóng xạ “chiếu sáng” phim, nhờ vậy có thể nhận ra được các vạch (Hình 1.20). Để đánh dấu DNA người ta đưa vào phân tử DNA các nucleotide chứa đồng vị phosphore phóng xạ 32P (Hình 1.21a). Có nhiều phương pháp đánh dấu nhưng thông dụng nhất là phương pháp nick-translation và gắn nucleotide vào đầu cuối. Nick-translation được thực hiện bởi DNA-polymerase. Trong mọi trường hợp, ngay cả khi người ta tinh sạch rất cẩn thận mẫu DNA bao giờ cũng chứa một số phân tử với những chỗ gãy trên một sợi (nicks). DNA-polymerase I có khả năng gắn các nucleotide vào một sợi và xúc tác cho phản ứng được gọi là thay thế sợi (Hình 1.10b). Các giếng để cho mẫu vào Gel agarose Khung gel bằng chất tổng hợp cho tia cực tím đi qua 29 Ngâm gel trong dung dịch
Hình 1.19. Các vạch DNA được hiển thị trong gel agarose sau khi nhuộm EtBr và quan sát dưới tia cực tím. 30
Tấm kính Gel agarose được làm khô Bản phim được đặt ltrực tiếp lên gel Chiếu sáng (12 đến 100 giờ) để tráng phim Các vạch DNA đã nhuộm đen Phóng xạ tự ghi phim 31
Hình 1.20. Hiển thị các vạch DNA bằng đánh dấu phóng xạ tự ghi Với nick-translation người ta có thể đánh dấu được bất kỳ phân tử DNA nào, nhưng trong một số trường hợp dẫn đến sự phân cắt protein. Một phương pháp khác là lấp đầy đầu cuối. Tuy nhiên với cách này chỉ đánh dấu được những phân tử có đầu dính. Enzyme được sử dụng là đoạn Klenow, lấp đầy các đầu dính bằng cách tổng hợp một sợi bổ sung (Hình 1.21). Nếu đưa vào phản ứng này các nucleotide đã dánh dấu phóng xạ thì thực hiện được sự đánh dấu DNA. Với nick-translation và lấp đầy đầu cuối người ta có thể phát hiện bằng phóng xạ tự ghi các vạch chứa một lượng DNA rất nhỏ (2 ng). a. [ -32P] dATP 32P phóng xạ a. Đánh dấu bằng nick-translation DNA-polymerase I 32 + P + dATP Những chỗ đứt trên sợi đơn Những đoạn đánh dấu c. Đánh dấu bằn việc lấp đầy những đầu cuối Đoạn Klenow + 32P + dATP Nhứng đầu dính (EcoRI) Những đầu được đánh 32
Hình 1.21. Đánh dấu phóng xạ DNA a. Cấu trúc của dATP b. Đánh dấu DNA bằng nick-translation c. Đánh dấu DNA bằng lấp đầy các đầu cuối 6.3. Đánh giá độ lớn của các đoạn DNA Trong điện di các phân tử DNA được tách ra dựa trên độ lớn của nó: phân tử nhỏ nhất di chuyển nhanh nhất và phân tử lớn nhất di chuyển chậm nhất đến điện cực dương. Nếu có nhiều đoạn DNA có độ lớn khác nhau (ví dụ sau phản ứng cắt bằng enzyme hạn chế thành công), thì xuất hiện trong gel rất nhiều vạch. Vậy làm thế nào để biết được độ lớn của các vạch? Mối quan hệ toán học giữa vận tốc di chuyển và khối lượng phân tử được biểu diễn theo công thức sau: D = a - b (log M) Ở đây D là khoảng cách di chuyển của DNA, M là khối lượng phân tử, a và b là hằng số phụ thuộc vào điều kiện điện di. Người ta cho DNA size marker (chuẩn kích thước của DNA), hỗn hợp các đoạn DNA có độ lớn đã biết, cùng chạy trong gel. Marker thường sử dụng là DNA của phage  được cắt bằng HindIII , gồm 8 đoạn: đoạn nhỏ nhất có độ dài 125 bp và đoạn lớn nhất là hơn 23 kb. So sánh vị trí của các đoạn DNA trong mẫu nghiên cứu với các vạch. a. Ước lượng độ lớn bằng mắt thường HiindI Độ lớn II chưa  biết khoảng 5000 bp khoảng 3200 bp khoảng 2000 bp b. Ước lượng chính xác bằng đồ thị 33
Hình 1.22. Xác định độ lớn của các đoạn DNA trên gel agarose a. Ước lượng bằng mắt thường b. Xác định độ lớn DNA chính xác hơn bằng đường chuẩn dựa trên khoảng cách di chuyển của chúng trên gel. 6.4. Lập bản đồ giới hạn phân tử DNA Như đã đề cập là làm thế nào để xác định được số lượng và độ lớn của các đoạn DNA được cắt bằng enzyme hạn chế? Bước tiếp theo trong phân tích là thiết kế bản đồ, trong đó chỉ ra vị trí cắt tương đối của các enzyme. Bản đồ giới hạn giúp cho việc lựa chọn enzyme phù hợp cho phản ứng cắt mong muốn. Để thiết kế bản đồ phải tiến hành cắt phân tử DNA bằng một loạt các enzyme. Bằng điện di người ta biết được số lượng và độ lớn của các đoạn được tạo ra khi sử dụng các enzyme cắt riêng lẻ (Hình 1.23). Thêm vào những phát hiện này người ta cần một loạt các cắt đôi, nghĩa là đồng thời sử dụng hai loại enzyme. Nếu hai loại enzyme này có cùng yêu cầu về pH và nồng độ Mg2+ thì có thể để chúng cùng cắt trong một phản ứng. Ngược lại, thì cho hai phản ứng xảy ra kế tiếp nhau để có điều kiện phù hợp với từng loại enzyme. Qua việc so sánh kết quả của phản ứng cắt đơn và đôi người ta có thể xác định được nhiều hay tất cả vị trí các điểm cắt (Hình 1.23). Trong những trường hợp còn chưa rõ ràng thì để phản ứng cắt xảy ra từng phần, nghĩa là chọn điều kiện phản ứng để chỉ một phần các vị trí được cắt. Sự cắt từng phần đạt được bằng cách ủ thời gian ngắn, hoặc ủ ở nhiệt độ thấp (ví dụ 40C), điều này làm giảm hoạt tính của enzyme. Kết quả của phản ứng cắt từng phần là các vạch phức tạp ở gel điện di. Bên cạnh những đoạn bình thường nhận được khi cắt hoàn toàn, còn xuất hiện thêm những đoạn khác. Biết được độ lớn của nó, người ta có thể biết được những vị trí nào ở cạnh nhau trong phân tử không được cắt (Hình 1.23). 34
Phản ứng cắt đơn và đôi Enzyme Số lượng đoạn Độ lớn (kb) Xbal 2 24,0 24,5 Xhol 2 15,0 33,5 Kpnl 3 1,5 17,0 30,0 Xbal + Xhol 3 9,0 15,0 24,5 Xbal + Kpnl 4 1,5 6,0 17,0 24,0 Nhận xét: 1. Vì DNA ở dạng thẳng, có một vị trí cắt cho enzyme Xbal và Xhol, 2 vị trí cắt cho Kpnl 2. Vị trí nhận biết của Xbal và Xhol được sắp xếp như sau: Các đoạn của Xbal 24 24,5 Các đoạn của Xbal và Xhol 9 15,5 24,5 Các đoạn của Xhol 15,0 33,5 Xhol Xbal Khả năng duy nhất là 15,0 9,0 24,5 Cắt từng phần Enzyme Độ lớn các đoạn (kb) KpnI, những điều kiện giới hạn 1,5 17,0 18,5 30,0 31,5 48,5 Nhận xét: Đoạn có độ lớn 48,5 kb là DNA của phage không bị cắt Các đoạn 1,5, 17,0 và 30,0 kb là sản phẩm được cắt hoàn toàn Các đoạn 18,5 và 31,5 kb là sản phẩm bị cắt từng phần Các KpnI Vị trí cắt của Kpnl phải như sau: XhoI XbaI KpnI Vị trí cắt của 3 enzyme như sau: 15,0 9,0 6,0 1,5 17,0 35
Hình 1.23. Lập bản đồ giới hạn. Ví dụ chỉ ra cách xác định vị trí cắt của Xbal, Xhol và các KpnI trên DNA của phage  IV. Gắn các phân tử DNA (ligation) Bước cuối cùng trong việc thiết kế một phân tử DNA tái tổ hợp là nối các đoạn DNA lại với nhau (Hình 1.24). Enzyme xúc tác cho phản ứng này là DNA- ligase. Gene tạo dòng Vector DNA-ligase Gene Phân tử DNA tái tổ hợp Hình 1.24. Nối kết (ligation): Bước cuối cùng khi thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp 1. Tác dụng của DNA-ligase Trong các tế bào sống đều có mặt DNA-ligase, nhưng enzyme được sử dụng trong công nghệ gene có nguồn gốc từ vi khuẩn E. coli nhiễm phage T4. 36
Trong tế bào ligase có nhiều chức năng quan trọng: DNA-ligase sửa chữa các chỗ đứt ở trên sợi đơn của DNA sợi kép (Hình 1.9a). Ở các vị trí đứt này là do thiếu liên kết phosphodiester giữa hai nucleotide ở cạnh nhau (ngược lại với những chỗ đứt mà ở đó một hay nhiều nucleotide bị mất). DNA-ligase còn nối các phân tử DNA khác nhau hoặc hai đầu của một phân tử. Phản ứng hoá học ở sự sửa chữa các chỗ đứt cũng giống phản ứng nối, chỉ khác là ở phản ứng nối hai liên kết phosphotdiester giữa hai sợi được tạo nên (Hình 1.25a). 2. Các đầu dính tăng hiệu quả phản ứng gắn Ở hình 1.25a hai đoạn DNA đầu bằng được nối lại với nhau. Tuy nhiên phản ứng này đạt hiệu quả rất thấp. Để phản ứng nối các đầu bằng có hiệu quả thì nồng độ DNA phải cao. Việc nối kết dễ dàng hơn khi thực hiện với các đầu dính. Các đầu dính phù hợp có thể liên kết với nhau bằng liên kết hydrogene giữa các cặp base bổ sung, sau đó liên kết bền vững được tạo nên dưới tác dụng của ligase. Khi các liên kết phosphodiester không được tạo nên thì những đầu cuối lại tách ra trở lại. Tuy nhiên, nhờ sự bắt cặp của các base mà hiệu quả của phản ứng nối được tăng lên, vì nhờ các liên kết hydrogene mà các đầu này duy trì tiếp xúc với nhau ở thời gian dài hơn. a. Gắn các đầu bằng b. Gắn các đầu dính Chỗ đứt trên sợi đơn Trạng thái trung gian của cặp đôi base 37 DNA-ligase gắn các chỗ đứt trên sợi đơn lại với nhau
Hình 1.25. Các phản ứng khác nhau được xúc tác bởi DNA-ligase a. Gắn các đầu bằng b. Gắn các đầu dính 3. Tạo đầu dính từ phân tử DNA đầu bằng Như vậy muốn nối các phân tử DNA lại với nhau trong thí nghiệm tạo dòng là phải tạo ra các đầu dính. Để có được các đầu dính bổ sung cho nhau người ta sử dụng cùng một enzyme để mở vectơ và cắt đoạn DNA tạo dòng. Tuy nhiên, điều này không phải luôn luôn xảy ra. Thường là vector có các đầu dính, trong khi đó đoạn DNA tạo dòng có đầu bằng. Có ba phương pháp để tạo nên DNA đầu dính từ các đoạn đầu bằng. a. Gắn đoạn nối (linker) vào đầu bằng Để thực hiện phương pháp đầu tiên là tạo nên đoạn nối, đoạn DNA nhỏ có trình tự đã biết, được tổng hợp nhân tạo. Một phần nối điển hình được nêu trong hình 1.26a. Đoạn nối này có đầu bằng và trong đó chứa một vị trí cắt cho BamHI. Nhờ DNA-ligase mà người ta có thể gắn đoạn nối này với phân tử DNA lớn hơn có đầu bằng. Mặc dù ở đây là nối các đoạn DNA có đầu bằng nhưng phản ứng xảy ra rất hiệu quả, vì có thể tạo ra một lượng lớn các oligonucleotide tổng hợp, nghĩa là phản ứng nối được thực hiện ở nồng độ DNA cao. a. Một linker điển hình b. Sử dụng linker Phân tử DNA đầu bằng Linker DNA-ligase Linker gắn vào BamHI Đầu đính (BamHI) Linker được cắt ra 38
Hình 1.26. Linker và sử dụng linker a. Cấu trúc của một linker điển hình b. Gắn một linker vào phân tử có đầu bằng Ở đầu cuối mỗi phân tử DNA có thể gắn nhiều linker, làm xuất hiện cấu trúc chuỗi (Hình 1.26b). Bằng việc xử lý với enzyme hạn chế (ví dụ BamHI) chuỗi này được cắt ở những vị trí nhận biết tạo nên các đoạn chứa đầu dính BamHI. Như vậy đoạn DNA tạo dòng được biến đổi cho phù hợp với vector cũng được mở vòng bằng BamHI. b. Đầu gắn (adapter) Sẽ xảy ra điều gì khi sử dụng linker với đoạn DNA tạo dòng chứa một hay nhiều vị trí nhận biết của BamHI? Ở phản ứng cắt cần thiết với linker thì phân tử DNA cũng bị cắt thành nhiều đoạn (Hình 1.27). Những đoạn này có các đầu dính mong muốn, nhưng không có lợi, vì gene đã bị cắt nhỏ. BamHI Các vị trí cắt của BamHI bên trong phân tử Hình 1.27. Một vấn đề xảy ra khi sử dụng linker: So sánh tình trạng ở đây với kết quả mong muốn khi cắt bằng BamHI ở hình 1.26b. 39
Phương pháp thứ hai là gắn với một adapter. Adapter cũng như linker là olygonucleotide tổng hợp, ngắn, có một đầu bằng và một đầu dính (Hình 1.28a). Để đạt được mục đích là đoạn DNA tạo dòng có được đầu dính thì đầu bằng của adapter phải được nối với một đầu của phân tử DNA. Phương pháp này đơn giản hơn so với gắn linker, nhưng cũng gặp khó khăn, vì các đầu dính của các adapter gắn lại với nhau, do các cặp base bổ sung, tạo nên dimer (Hình 1.28b). Lời giải cho vấn đề nằm ở cấu trúc hoá học ở đầu cuối của adaptor. Thông thường hai đầu của một sợi polynucleotide có cấu tạo hoá học khác nhau (Hình 1.29a). Đầu cuối được gọi là 5 mang một gốc phosphate (5 -P), một đầu khác được gọi là 3 mang một nhóm hydroxyl (3 -OH). Trong DNA hai sợi nằm đối song (Hình 1.29b), như vậy ở mỗi đầu của phân tử có một đầu cuối 5 và 3 . Phản ứng nối thường xảy ra giữa 5 -P và 3 -OH (Hình 1.29c). 40
a. Một adapter điển hình Đầu dính (BamHI) b. Adapter có thể nối lại với nhau c. Phân tử DNA mới luôn luôn có 2 đầu bằng Phân tử đầu bằng Adaptor DNA-ligase Adapter nối lại với nhau Hình 1.28. Adapter và những khó khăn khi sử dụng a. Một adapter điển hình b. Adapter có thể nối lại với nhau tương tự linker c. Phân tử có đầu bằng sau khi gắn thêm adapter vẫn có đầu bằng, vì vậy cần phải cắt bằng một enzyme hạn chế 41
Người ta tổng hợp adapter có đầu bằng ở dạng tự nhiên của nó, nhưng đầu dính ở 5 lại thiếu gốc phosphater, nghĩaa. lCàấu ở trúc 5' của mang sợi polynucle nhóm OHotide: (5 -OH, Hình sự khác nhau giữa đầu 5’-phosphate 1.30a). Ligase không thể tạo được liên và kết đ ầu phosphodieste 3’-OH giữa nhóm 3 -OH và nhóm 5 -OH. Vì vậy, các adapter không gắn lại với nha Một nucleotide Base Base Base b. Trong DNA xoắn kép hai sợi polynucleotide nằm đối song c. Sự gắn kết xảy ra giữa 5’-phosphate và 3’-OH Hình 1.29 Sự khác nhau giữa đầu 5’ và 3’ 42
Adaptor có thể nối kết với các đoạn DNA tạo dòng nhờ ligase. Sau đó nhóm OH ở C5' (5 -OH) của đầu dính được chuyển sang dạng phosphate (5'-P) nhờ enzyme polynucleotide kinase sang dạng tự nhiên 5 -P. Như vậy đoạn DNA tạo dòng có lại đầu dính bình thường để có thể nối kết với vector a. Cấu trúc của một “đầu gắn” (adapter) Đầu 5’-OH được biến đổi b. Gắn bằng adapter Adapter Phân tử có đầu bằng DNA-ligase Polynucleotide kinase Đầu 5’-phosphate Hình 1.30 Sử dụng adapter a. Cấu trúc của adapter có đầu 5’ đã biến đổi 43
b. Đoạn DNA tạo dòng đầu bằng đã biến thành đầu dính sau khi gắn thêm adapter a. Tổng hợp đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) Terminal transferase + dCTP b. Gắn với đuôi homopolymer Vector có đuôi poly(dC) DNA được gắn thêm đuôi poly(dG) Phân tử DNA tái tổ hợp c. Các bước sửa chữa Lỗ hổng trên sợi đơn Chỗ đứt trên sợi đơn Klenow-polymerase điền lỗ hổng Ligase gắn chỗ đứt trên sợi đơn Hình 1.31. Gắn đuôi homopolymer 44
a. Tổng hợp đuôi homopolymer b. Tạo phân tử DNA tái tổ hợp từ một vector và đoạn DNA có gắn đuôi c. Sửa chữa một phân tử DNA tái tổ hợp c. Tạo đầu dính bằng việc gắn đuôi homopolymer Một phương pháp hoàn toàn khác để tạo đầu dính ở phân tử DNA đầu bằng là gắn đuôi homopolymer (tailing). Homopolymer là một chuỗi polymer, được tạo nên từ nhiều đơn phân giống nhau, ví dụ chỉ gồm các nucleotide là deoxyguanosin, được gọi là poly deoxyguanosine hoặc poly (dG). Khi gắn đuôi có sự tham gia của enzyme deoxynucleotide tranferase, các nucleoitde cùng loại lần lượt gắn vào đầu 3 -OH của DNA sợi kép (Hình 1.31a). Người ta thường gắn vào vector đuôi poly (dG) và đoạn DNA tạo dòng đuôi poly (dC). Trộn lẫn các phân tử này thì sự cặp đôi giữa các đuôi sẽ xảy ra theo nguyên tắc bổ sung. Trong thực tế đuôi poly (dG) và poly (dC) có độ dài không chính xác bằng nhau, như vậy khi các đuôi này nối lại với nhau sẽ có những lỗ hổng trên sợi đơn (Hình 1.31c). Vì vậy, sự nối kết xảy ra hai bước: Trước hết đoạn Klenow lấp đầy các lỗ hổng và sau đó DNA-ligase tạo liên kết phosphodiester. Các đuôi homopolymer có chiều dài hơn 20 nucleotide gắn lại với nhau rất bền vững. V. Vector tạo dòng Vấn đề trung tâm của thí nghiệm tạo dòng là vector tạo dòng. Một phân tử DNA được coi là vectơ tạo dòng khi có khả năng tồn tại và tái sinh trong tế bào chủ. Tạo dòng DNA vẫn còn là một vấn đề mới mẽ, nhưng kỹ thuật này đã phát triển rất nhanh. Ngày nay, có nhiều loại vector tạo dòng khác nhau. Hầu hết chúng bắt nguồn từ các plasmid tồn tại trong tự nhiên hoặc virus, nhưng được biến đổi theo những cách khác nhau. Tuỳ theo mục đích tạo dòng mà lựa chọn vector cho phù hợp. Sau đây sẽ mô tả các nhóm vector tạo dòng quan trọng nhất của E.coli. 1. Vector plasmid Plasmid là phân tử DNA dạng vòng, tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn (Hình 1.32). Hầu hết plasmid chứa một hoặc hai gene mã hóa cho các đặc tính có lợi cho vi khuẩn. Ví dụ khả năng sống sót của vi khuẩn ở nồng độ gây chết của chất kháng sinh chloramphenicol hoặc ampicillin là nhờ plasmid mang các gene kháng kháng sinh. Các gene này được sử dụng làm gene chọn lọc (marker). 45
Plasmid Plasmid Chromosome vi khuẩn Hình 1.32. Plasmid là vật chất di truyền tồn tại độc lập trong tế bào vi khuẩn Trong mỗi plasmid có ít nhất một trình tự DNA được gọi là điểm bắt đầu sao chép (origin of replication, ori). Vì vậy, plasmid có khả năng tự tái sinh độc lập với DNA nhiễm sắc thể ở trong tế bào (Hình 1.34a). 46
Gene kháng ampicillin Gene kháng kanamycin Gene kháng tetracycline Một số tế bào E. coli, trong đó một số chứa RP4 Tế bào chứa plasmid Tế bào không chứa plasmid Dung dịch nuôi cấy không Dung dịch nuôi cấy chứa có kháng sinh tetracilin (50 g/ml) Tất cả các tế bào đều phát Chỉ có tế bào chứa RP4 triển phát triển Hình 1.33. Kháng kháng sinh là đặc điểm chọn lọc của plasmid 47
RP4 mang các gene kháng ampicillin, tetracycline và kanamycin. Trong dung dịch nuôi cấy chứa một hoặc nhiều kháng sinh ở nồng độ gây độc, chỉ những tế bào E.coli nào chứa RP4 (hoặc plasmid tương tự) thì mới sống sót. Các plasmid nhỏ thường sử dụng những enzyme sao chép của tế bào để tái sinh. Ngược lại những plasmid lớn hơn, trong một số trường hợp chứa các gene mã hoá cho các enzyme đặc hiệu cho sự sao chép của plasmid. Một số plasmid cũng có thể sao chép cùng với nhiễm sắc thể của vi khuẩn sau khi hoà nhập (Hình 1.34b). Những plasmid này được gọi là episome, có thể tồn tại bền vững qua nhiều lần phân chia tế bào, nhưng đến một lúc nào đó chúng như là yếu tố độc lập. Sự hoà nhập cũng là đặc điểm quan trọng của nhiễm sắc thể phage. a. Plasmid không hòa nhập Plasmid Tế bào phân chia Chromosome vi khuẩn b. Episome Chromosome kết hợp với plasmid Chromosome vi khuẩn Plasmid Tế bào phân chia 48
Hình 1.34. Sự tái bản của plasmid không hòa nhập (a) và của episome (b) Độ lớn và số lượng bản sao là hai đặc điểm quan trọng của plasmid tạo dòng. Các plasmid tồn tại trong tự nhiên có độ lớn từ 1 đến 250 kb (Bảng 1.3), Các vector tạo dòng nên có độ lớn nhỏ hơn 10 kb. Tuy nhiên các plasmid lớn hơn với những điều kiện nhất định cũng phù hợp cho mục đích tạo dòng. Bảng 1.3 Độ lớn của một số plasmid quan trọng Plasmid Độ lớn Dài (kb) Trọng lượng phân tử Nguồn vi sinh vật (106 d*) pBR345 0,7 0,46 E. coli p BR322 4,362 2,9 E. coli CoIEI 6,4 4,2 E. coli RP4 54 36 Pseudomonas F 95 63 E. coli TOL 117 78 Pseudomonas putida pTiAch5 213 142 A. tume faciens d*: tương ứng 1,66018 x 10-27 kg Số lượng bản sao là số lượng của mỗi loại plasmid tồn tại trong một tế bào vi khuẩn. Yếu tố nào ảnh hưởng đến số lượng bản sao, vẫn chưa được giải thích chính xác. Số lượng này biến động từ 1 (ở những plasmid lớn) đến 50 hoặc nhiều hơn. Nói chung, một vector tạo dòng nên có nhiều bản sao trong một tế bào, như vậy người ta có thể tách được phân tử DNA tái tổ hợp với một khối lượng lớn. 1.1. Vector tạo dòng pB322 Vector tạo dòng đơn giản nhất và được sử dụng nhiều nhất bắt nguồn từ plasmid của vi khuẩn, đặc biệt là E. coli. Đặc tính của các vector này là dễ làm sạch, biến nạp đạt hiệu quả cao, có các gene chọn lọc phù hợp và có thể tiếp nhận các đoạn DNA tạo dòng lớn (đến 8 kb). Một trong những vector tạo dòng đầu tiên được phát triển và hiện nay vẫn được sử dụng rộng rãi là pBR322. a. Cách gọi tên các vector tạo dòng plasmid Tên “pBR322” có nghĩa là: - p là plasmid - BR: Tên viết tắt của người thiết kế ra plasmid: vector này được 2 nhà khoa học là Bolivar và Rodriguez phát triển - 322: số để phân biệt plasmid này với plasmid khác (ví dụ pBR325, pBR327, pBR28 ) b. Ưu điểm của pBR322 Bản đồ vật lý và di truyền của pBR322 (Hình 1.35) đã nói lên tại sao plasmid này được sử dụng nhiều. 49
Hình 1.35. Bản đồ của pBR322 với vị trí của gene kháng ampicillin (ampR) và tetracycline (tetR), điểm khởi đầu sao chép (ori) và một số vị trí cắt quan trọng của các enzyme hạn chế. Ưu điểm đầu tiên của pBR322 là có độ lớn nhỏ (4.363 bp), có nghĩa là không những dễ dàng tinh sạch vector mà cả các phân tử DNA tái tổ hợp. Khi đoạn DNA tạo dòng dài 6 kp thì phân tử pBR322 tái tổ hợp vẫn còn có độ lớn phù hợp. Đặc điểm thứ hai của pBR322 là mang 2 nhóm gene kháng kháng sinh. Người ta có thể sử dụng gene kháng ampicillin hoặc tetracyclline để chọn lọc tế bào chứa plasmid. Trong hai gene này có những vị trí cắt duy nhất của các enzyme hạn chế để tạo dòng. Nếu đưa một đoạn DNA ngoại lai vào vị trí cắt của PstI, PvuI hoặc ScaI thì gene ampR bị bất hoạt và khi sử dụng một trong 8 enzyme khác (ví dụ BamHI hoặc HindIII) thì khả năng kháng tetracyclline bị mất. Vì có nhiều vị trí cắt khác nhau trong vùng gene chọn lọc mà có thể tạo dòng trong pBR322 với nhiều đầu dính khác nhau. Ưu điểm thứ ba của pBR322 là có số lượng bản sao lớn. Trong tế bào E. coli được biến nạp trung bình có 15 bản sao, số lượng này có thể tăng lên 1000 đến 3000 khi nhân plasmid có sử dụng chloramphenicol để kìm hãm tổng hợp protein. Nuôi cấy E. coli cung cấp DNA tái tổ hợp pBR322 với tỷ lệ cao. c. Nguồn gốc của pBR322 Vector tạo dòng pBR322 được thiết kế nhiều lần nên cuối cùng có được nhiều đặc điểm có lợi. Các bước tạo plasmid này được phác họa ở hình 1.36a. Có thể dễ dàng nhận ra rằng, để tạo ra plasmid này đã tiêu phí nhiều thời gian và phải có tay nghề cao. Hình 1.36b cho thấy plasmid pBR322 chứa các đoạn DNA từ 3 plasmid khác nhau tồn tại trong tự nhiên. Gene ampR có nguồn gốc từ plasmid R1 tìm thấy trong E. coli tự nhiên và gene tetR từ plasmid R6-5. Điểm khởi đầu sao chép của pBR322 để nhân bản vector trong tế bào chủ, có nguồn từ plasmid pMB1. 50
a. Các bước tạo pBR322 Ligation hai đoạn b. Nguồn gốc của pBR322 Hình 1.36 Nguồn gốc của pBR322 a. Các bước tạo plasmid b. Nguồn gốc của từng phần trong plasmid 1.2. pUC8: Plasmid có gene chọn lọc LacZ’ Vector này được nêu lên trong mối liên quan với sự xác định thể tái tổ hợp, ở đây đoạn DNA chèn làm gián đoạn gene mã hoá cho -galactosidase. pUC8 cũng có nguồn gốc từ pBR322, điểm khởi đầu sao chép và gene ampR được giữ lại. Các vị trí chèn được tìm thấy ở pUC8 trong một đoạn ngắn của gene lacZ . 51
a. Các vị trí cắt ở pUC8 b. Các vị trí cắt ở pUC10 c. Chuyển một đoạn DNA của pUC8 đến M13mp8 Plasmid tái tổ hợp pUC8 DNA mới Những vị trí cắt Cắt bằng BamHI và EcoRI Cắt bằng BamHI Gắn kết và EcoRI DNA mới Plassmid tái tổ hợp M13mp8 Hình 1.37. Plasmid pUC8 52
a. Các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pUC8 b. Các vị trí cắt trong pUC10 c. Chuyển một đoạn DNA từ pUC8 đến M13mp8 pUC8 có ba ưu điểm quan trọng đã làm cho nó trở thành một trong những vector tạo dòng ưa thích nhất đối với E. coli. Ưu điểm thứ nhất là khi thiết kế plasmid đã tình cờ xuất hiện một đột biến ở điểm sao chép, nên không cần khuếch đại mà số lượng bản sao có thể đạt tới 500-700. Điều này có tác động rõ rệt lên hiệu quả khai thác DNA tạo dòng thu nhận được từ tế bào E. coli sau khi biến nạp pUC8 tái tổ hợp. Ưu điểm thứ hai là có thể xác định các tế bào tái tổ hợp trong một bước duy nhất. Đơn giản là người ta nuôi chúng lên môi trường thạch có chứa X-gal. Ngược lại ở pBR322 việc xác định thể tái tổ hợp phải qua hai bước. Khuẩn lạc tái tổ hợp được xác định khi so sánh vị trí của chúng trên đĩa thạch có chứa kháng sinh này với đĩa nuôi chứa kháng sinh khác. Thí nghiệm tạo dòng với pUC8 tiết kiệm được một nửa thời gian so với pBR322. Ưu điểm thứ ba ở chỗ là sự tập trung các vị trí cắt hạn chế. Bằng cách này người ta có thể tạo dòng đoạn DNA với hai đầu dính khác nhau (ví dụ EcoRI và BamHI). Các vector pUC khác chứa tổ hợp các vị trí cắt hạn chế khác nhau cho phù hợp với sự đa dạng của các đọan DNA tạo dòng. Ngoài ra những vector này chứa tổ hợp các vị trí cắt hạn chế như loạt vector M13mp. Vì vậy, có thể đưa DNA trực tiếp vào vector M13mp sau khi tạo dòng trong vector pUC và sau đó có thể xác định trình tự hoặc đột biến gene in vitro (Hình 1.38c). 1.3. pGEM3Z: Sự phiên mã DNA tạo dòng in vitro Tương tự pUC vectơ pGEM3Z mang gene ampR và LacZ . Trong gene LacZ có một nhóm các vị trí cắt hạn chế và gần như có cùng độ lớn 53
a. pGEM32 T7-promoter b. Tổng hợp DNA in vitro SP6-promoter T7-promoter Đoạn DNA chèn vào T7-DNA polymerase Bản sao RNA Hình 1.38. Plasmid pGEM3Z a. Bản đồ của vector b. Tổng hợp RNA in vitro. Ngoài ra, ở pGEM3Z còn có 2 trình tự DNA ngắn là các vị trí nhận biết và gắn của RNA-polymerase. Hai trình tự promoter này nằm về hai phía của các vị trí cắt, nơi mà các đoạn DNA tạo dòng được chèn vào. Khi đưa vào ống nghiệm pGEM3Z tái tổ hợp và RNA-polymerase thì xảy ra quá trình phiên mã làm xuất hiện các RNA của đoạn DNA tạo dòng (Hình 1.38b). Các RNA này có thể được sử dụng như là những mẫu dò hoặc trong nghiên cứu quá trình hoàn thiện RNA (RNA processing) và tổng hợp protein. Ở đây không đề cập đến trình tự thông thường của hai promoter trong pGEM3Z và của các vector tương tự được nhận biết bởi polymerase của E. coli. Một promoter đặc hiệu cho RNA-polymerase của thực khuẩn thể T7, và promoter còn lại cho RNA-polymerase của phage SP6. Các RNA-polymerase này được tạo ra sau khi E. coli nhiễm một trong hai loại phage này và thực hiện phiên mã các gene 54
phage. Chúng được sử dụng cho phiên mã in vitro, vì rất hoạt động (chu kỳ sinh tan kéo dài chỉ 20 phút) và trong một phút có thể tạo ra 1-2 g RNA, lượng DNA nhiều hơn so với enzyme bình thường ở E. coli. 2. Vector tạo dòng trên cơ sở thực khuẩn thể M13 Một yêu cầu bắt buộc ở vector tạo dòng là khả năng sao chép trong tế bào chủ. Ở vector plasmid thì điều này đơn giản, vì ở chúng một đoạn trình tự DNA ngắn làm nhiệm vụ khởi đầu điểm sao chép và nó cung cấp phần lớn hoặc thậm chí tất cả các enzyme cần thiết cho sự sao chép trong tế bào chủ. Ở thực khuẩn thể M13 thì sự sao chép phức tạp hơn. Phân tử DNA của thực khuẩn thể nhìn chung mang nhiều gene hơn, trong đó có gene mã hóa cho phần vỏ và những enzyme sao chép đặc hiệu cho phage. Hình 1.39. Hệ gene của M13 với các vị Thay đổi hoặc loại trừ một trong những gene này trí của gene I đến X làm ảnh hưởng hoặc phá huỷ khả năng sao chép của chúng. Vì vậy, ở sự thay đổi của DNA phage có giới hạn hơn và các vector tạo dòng phage nhìn chung chỉ khác biệt nhỏ so với phân tử ban đầu. Khó khăn ở việc thiết kế vector tạo dòng phage rõ hơn khi quan sát M13. Hệ gene của M13 bình thường là 6,4 kb, phần lớn nhất trong đó chứa 10 gene nằm sát nhau (Hình 1.39) là không thể thiếu được cho toàn bộ quá trình sao chép phage. Chỉ có một trình tự duy nhất có 507 nucleotide là người ta chèn vào mà không làm cho các gene khác bị ảnh hưởng và trong vùng này điểm khởi đầu sao chép phải nguyên vẹn. Như đã đề cập M13 có một ưu điểm rất hấp dẫn: với chúng người ta có thể thu được DNA tạo dòng ở dạng sợi đơn. Thực tế này là một kích thích để phát triển vector tạo dòng M13 2.1. Phát triển vector tạo dòng M13mp2 Bước đầu tiên ở sự thiết kế vector tạo dòng M13 là đưa gene LacZ’ vào. Như vậy, xuất hiện M13mp1 có khả năng tạo nên vết tan màu xanh trên môi trường thạch có chứa X-gal (Hình 1.40a). M13mp1 chỉ chứa một vị trí sao chép đơn giản trong gene LacZ’, và có một hexanucleotide GGATTC ở gần điểm khởi đầu của gene, bằng việc thay đổi một nucleotide duy nhất sẽ xuất hiện trình tự GAATTC, là trình tự cắt của EcoRI. Sự thay đổi này thực hiện nhờ in vitro-mutagenease và kết quả là tạo ra vector M13mp2 (Hình 1.40b). Gene LacZ’ của M13mp2 thay đổi rất ít, tuy nhiên - galatosidase mà tế bào nhiễm bởi M13mp2 tạo ra là hoàn toàn hoạt động. M13mp2 là vector tạo dòng đơn giản nhất của M13, người ta có thể đưa vào vị trí tạo dòng đoạn DNA có đầu dính của EcoRI và thể tái tổ hợp được nhận ra trên môi trường agar chứa X-gal là những vết tan trong suốt. 55
a. Cấu tạo của M13mp1 Cắt bằng enzyme giới hạn, nối (ligation) b. Cấu tạo của M13mp2 Đột biến in vitro Bắt đầu gene lacZ’ trong M13mp1 Bắt đầu gene lacZ’ trong M13mp2 Hình 1.40 Cấu tạo của M13mp1 (a) và M13mp2 (b) từ geneom M13 M13mp7 - Nhng v trí to dòng i xng 56
a. Polylinker b. Cấu tạo của M13mp7 Vị trí cắt giới hạn EcoRI, ligase Polylinker Hình 1.41. Cấu tạo của M13mp7 a. Polylinker, b. Polylinker được đưa vào vị trí EcoRI của M13mp2 Bước tiếp theo để phát triển vector M13 người ta đưa vào trong gene LacZ’ các vị trí cắt bổ sung. Cho mục đích này người ta đưa vào polylinker là oligonucleotide ngắn, chứa các vị trí cắt và có các đầu dính cho EcoRI (Hình 1.42a). Polylinker được đưa vào vị trí của EcoRI của M13mp2 (Hình 1.42b) tạo nên M13mp7 (Hình 1.42b), một vector phát triển cao hơn với 4 vị trí tạo dòng (EcoRI, BamHI, SalI và PstI). Polylinker được đưa vào như thế nào đó để không làm hỏng gene LacZ’ và mặc dù -galatosidase bị thay đổi nhưng vẫn hoạt động. 57
a. Sự cắt giới hạn của M13mp7 Toàn bộ hoặc một polylinker Polylinker EcoRI, BamHI hoặc SalI Đầu dính b. Nối với DNA mới: Các khả năng sản phẩm: c. Màu của vết tan trên agar có chưa X- 1. Đưa vào một DNA mới gal Gene LacZ’ bị gián đoạn không có -gal 2. Đưa vào một polylinker vết tan trong suốt 3. Không đưa vào (tự đóng vòng) Gene LacZ’ gắn lại -gal vết tan màu xanh Gene lacZ’ gắn lại -gal vết tan màu xanh Hình 1.42. Tạo dòng với M13mp7 58
M13mp7 với vị trí tạo dòng đối xứng có ưu điểm lớn: người ta có cắt ra những đoạn DNA đã được đưa vào vị trí của BamHI, SalI hoặc PstI. (Hình 1.43). Chỉ một số ít vector cho phép thu nhận lại DNA tạo dòng dễ dàng như vậy. Khi xử lý M13mp7 với EcoRI, BamHI hoặc SalI thì polylinker bị cắt ra hoàn toàn hoặc một phần (Hình 1.42a). Ở sự gắn kết khi có những đoạn DNA mới có thể xảy ra 3 trường hợp (Hình 1.42b). 1. Đoạn DNA mới được chèn vào 2. Polylinker được chèn vào 3. Các đầu cuối của vector gắn lại với nhau mà không có đoạn DNA Khi DNA ngoại lai được vào thì -galactosidase không được tổng hợp, nên vết tan tái tổ hợp trên môi trường agar có màu trong suốt (Hình 1.42c). Ngược lại, khi polylinker được tiếp nhận xuất hiện một thể mới của vector M13mp7 và tạo nên vết tan màu xanh. Nhưng điều gì xảy ra khi vector tự đóng lại mà không tiếp nhận DNA ngoại lai hoặc polylinker? Ở đây sự thiết kế polylinker có một vai trò quan trọng. Không phụ thuộc vào những vị trí cắt nào được sử dụng, sự tự đóng vòng dẫn đến gene mã hoá cho -galactosidase hoạt động (Hình 1.42c), tạo nên vết tan màu xanh. Rõ ràng rằng chỉ lựa chọn các phage có vết tan trong suốt. Đoạn cắt bằng Sau3AI Đầu cuối của Sau3AI (GATC) Cắt bằng BamHI (đầu cuối: GATC) Ligation, tạo dòng 1. Những vị trí nhận biết của BamHI không gắn kết lại 2. M13 chứa nhiều vị trí nhận biết của Sau3AI Đoạn cắt bằng Sau3AI Cắt bằng EcoRI 3. Thu nhận lại những đoạn khi cắt bằng EcoRI Đầu cuối dính 59 của EcoRI Vector đươc đóng vòng
Hình 1.43. Thu nhận một đoạn DNA tạo dòng từ M13mp7 tái tổ hợp bằng việc cắt hạn chế ở các vị trí ngoài polylinker 3. Vector tạo dòng là phage Bacteriophage, gọi tắt là phage, là những virus chỉ nhân lên trong vi khuẩn nên được gọi là thực khuẩn thể. Phage được chia làm 2 nhóm: Phage độc (virulence) và phage ôn hòa (temperaance) Phage độc chỉ có cách phát triển duy nhất là làm tan tế bào chủ. Phage ôn hòa có hai cách phát triển: Phá vỡ tế bào hoặc không phá vỡ tế bào. Khi phage độc khi nhiễm vào tế bào chủ sẽ bơm DNA của nó vào bên trong tế bào. Khi DNA trần đã xâm nhập vào trong tế bào, một loạt quá trình phiên mã xảy ra, sản sinh ra nhiều bản sao của hệ gene phage cũng như các protein cấu trúc. Sau đó DNA được đóng gói vào vỏ tạo phân tử phage hoàn chỉnh. Phage hoàn tất chu trình khi enzyme lysozyme được tạo ra tiêu hóa vách tế bào làm cho tế bào vi khuẩn bị vỡ ra. Phage độc luôn phá vỡ tế bào chủ trong quá trình sống tạo nên vệt tan hoàn toàn (vệt tan trong). Chu trình này được gọi là chu trình tan. Phage ôn hòa khi nhiễm vào tế bào chủ chúng sẽ theo chu trình tan, tương tự phage độc, hoặc chu trình tiềm tan. Phage  thuộc nhóm phage ôn hòa, là DNA sợi đôi, ở dạng mạch thẳng, có chiều dài khoảng 49 kb, mã hóa cho 46 gene. Toàn bộ gene đã được giải trình tự, ở hai đầu có các đoạn ngắn (12 bp) sợi đơn bổ trợ cho nhau, được gọi là trình tự cos. Các đoạn này là những “đầu dính” tạo điều kiện cho hệ gene trở thành mạch vòng sau khi nhiễm vào vi khuẩn. Khi phage nhiễm vào tế bào chủ, nếu tế bào chủ nghèo dinh dưỡng phage sẽ đi vào chu trình tiềm tan và ngược lại. Tuy nhiên nếu sử dụng làm vector thì phage phải đi vào chu trình tan mới có thể nhân dòng gene được. 60
Hình 1.44 DNA của phage λ ở dạng mạch thẳng và mạch vòng Cấu tạo của phage λ gồm 1 đầu và 1 đuôi. Phần đầu có dạng nhiều mặt, chứa DNA, đuôi cần cho sự gắn phage vào bề mặt của vi khuẩn và đưa DNA vào trong tế bào. Trước đây phage λ tự nhiên không được sử dụng làm vector vì các lý do: - Độ lớn phân tử -DNA chỉ có thể được vượt quá 5%, tương ứng với đoạn DNA được đưa thêm vào là 3 kb. Những phân tử có độ dài tổng số vượt quá 52 kb sẽ không được gói ở trong cấu trúc đầu của . Độ lớn của đoạn DNA muốn tạo dòng trong vector  không thay đổi là có giới hạn (Hình 1.45a). - Hệ gene của  là lớn nên chứa nhiều vị trí nhận biết của các enzyme hạn chế. Bằng sự cắt hạn chế người ta không thể cắt - DNA để đưa đoạn DNA mới vào vì phage sẽ bị cắt ra thành nhiều đoạn (Hình 1.45b). Con đường để phát triển vector tạo dòng  ở sự phát hiện là có thể cắt bỏ một đoạn lớn ở giữa phân tử -DNA mà không làm ảnh hưởng đến khả năng của phage lây nhiễm tế bào E. coli. Người ta cắt ra phần “không quan trọng”, ở hình 1.46 nó nằm giữa vị trí 20 đến 35, toàn bộ hoặc một phần đã giảm độ dài của - DNA đến 15 kb. Điều đó có nghĩa là bây giờ người ta có thể đưa vào đoạn DNA mới cho đến 18 kb. a. Giới hạn độ lớn Geneome của  là 49 kb Thể kết hợp có thể (> 52 kb) DNA lạ > 3 kb Quá lớn không thể gói được Gói b. Nhiều vị trí cắt hạn chế EcoRI EcoRI Ligation Hỗn hợp các phân tử khác nhau 61
Hình 1.45. Hai vấn đề phải được giải quyết trước khi phát triển hệ thống vector tạo dòng λ a. Sự giới hạn độ lớn của hệ gene cần thiết cho đóng gói ở phần đầu b. DNA của phage λ hầu như có tất cả các vị trí nhận biết cho endonuclease Vùng “ không quan trọng” chứa phần lớn nhất của các gene tham gia vào sự kết hợp và cắt ra của tiền phage từ chromosome của E. coli. Hệ gene  được cắt ngắn vì vậy không có khả năng tiềm tan mà chỉ còn chu kỳ ly tan. Đó là đặc điểm có giá trị cho vector tạo dòng, vì bằng cách này vết tan tạo nên mà không c ần lây nhiễm. Hình 1.46. Bản đồ gene của phage λ. Vị trí của các gene quan trọng nhất và chức năng của các nhóm gene Bằng sự chọn lọc tự nhiên có thể phân lập phage  thiếu các vị trí giới hạn xác định. Mặc dù hệ gene  đã được làm ngắn vẫn còn chứa nhiều vị trí cắt của các enzyme hạn chế. Khi muốn loại bỏ một hoặc hai vị trí cắt người ta sử dụng kỷ thuật in vitro-mutagenease. Bằng cách này từ trình tự GAATTC là vị trí cắt của EcoRI, trình tự GGATTC được tạo ra và như vậy không còn được nhận biết bởi enzyme này nữa. Khi mới bắt đầu phát triển vector  thì kỷ thuật này có ý nghĩa, nhưng ngày nay không còn là phương pháp hữu hiệu khi muốn thay đổi nhiều hơn vài vị trí cắt trong một phân tử. Để thu được các chủng  mà không có các vị trí cắt không cần thiết, người ta sử dụng chọn lọc tự nhiên. Cho mục đích này sử dụng một chủng E. coli là ký chủ tạo ra EcoRI. Phần lớn các phân tử DNA của phage  xâm nhiễm vi khuẩn, bị phá huỷ bởi enzyme hạn chế. Tuy nhiên một số phage  vẫn tồn tại và làm xuất hiện vết tan. Những phage này là thể đột biến, vì ở chúng ví trí cắt của EcoRI (hoặc nhiều hơn) tự nhiên mất đi. Nhiều chu kỳ nhiễm dạng này tạo nên những phân tử  thiếu phần lớn hoặc tất cả các vị trí nhận biết của EcoRI (Hình 1.47). 62
5 vị trí của EcoRI -DNA bình thường Lây nhiễm tế bào E. coli, những tế bào này sản sinh EcoRI Vết tan xuất hiện do phage đột biến Chỉ có 3 vị trí cắt cho EcoRI Rất ít vết tan Sự lây nhiễm mới với phage đột biến Không có vị trí EcoRI Có nhiều vết tan hơn Chủng phage đột biến thứ hai Hình 1.47. Phân lập phage λ, ở chúng thiếu vị trí cắt của EcoRI nhờ chọn lọc tự nhiên Tuy nhiên về sau người ta đã phát hiện ở giữa các DNA của phage  có vùng đệm (stuffer) hay còn gọi là phần trung tâm có chiều dài khoảng 1/3 chiều dài của phage, vùng này không quan trọng và nếu cắt nó đi thì vẫn không ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của phage  trong tế bào vi khuẩn, đó là phần quy định khả năng đi vào chu trình tiềm tan của phage . Vì vậy, người ta đã cắt bỏ đoạn stuffer để lắp các đoạn gene ngoại lai vào. 3.1. Vector thay thế và vector xen đoạn 63
Sau khi giải quyết được khó khăn về lượng DNA giới hạn được gói và nhiều vị trí hạn chế, các vector tạo dòng khác nhau dựa trên phage  được phát triển. Các vector này được phân thành hai nhóm chính là vector xen đoạn và vector thay thế. a. Vector xen đoạn Vector xen đoạn: Trong vector xen đoạn người ta loại bỏ một đoạn dài của vùng bỏ được và gắn hai tay của phân tử phage  lại với nhau. Trên vector xen đoạn chỉ có một vị trí cắt duy nhất cho phép cắt và chèn DNA mục tiêu vào. Độ lớn của đoạn DNA ngoại lai phụ thuộc vào độ lớn của vùng loại bỏ (Hình 1.49a). Hai vector xen đoạn đặc biệt ưa thích là: - gt10 (Hình 1.49b và Hình 1.50) có thể tiếp nhận DNA mới cho đến 8 kb ở vị trí cắt duy nhất EcoRI trong gene cI. Vì gene này bị bất hoạt bởi DNA đưa vào nên phân biệt thể tái tổ hợp có vết tan trong suốt với các vết tan đục. - ZAPII (Hình 1.49c) cho phép đưa vào DNA có độ lớn 10kb vào một trong 6 vị trí hạn chế trong một polylinker. DNA làm bất hoạt gene LacZ’ trong vector, thể tái tổ hợp không tạo nên vết tan màu xanh mà là trong suốt. b. Vector thay thế Vector thay thế: Vector thay thế chứa hai trình tự nhận biết của 2 enzyme cắt hạn chế khác nhau. Khi sử dụng đồng thời 2 enzyme cắt hạn chế này, vector sẽ bị cắt làm 3 đoạn. Đoạn giữa có thể thay thế bằng DNA mục tiêu. Đoạn giữa thường chứa các vị trí cắt hạn chế khác nhau vì vậy người ta dùng các enzyme hạn chế để cắt nhỏ nó ra tránh trường hợp các đoạn vector tự gắn lại với nhau. Nhìn chung vector thay thế có thể tiếp nhận những đoạn DNA lớn hơn các vector xen đoạn. Khả năng tiếp nhận đoạn DNA ngoại lai của vector xen đoạn là 5 kb và của vector thay thế là 20-25 kb. a. Thiết kế vector xen đoạn λ -DNA (49 kb) Cắt, gắn Vector xen đoạn (35-40 kb) Vòng được cắt ra b. gt10 c. -Charron 16 40 kb 41 kb Hình 1.48. Vector xen đoạn λ: P là polylinker trong gene LacZ’ của λZAPII, polylinker chứa vị trí cắt duy nhất cho Sacl, Notl, Spel, EcoRI và Xhol. 64
Hình 1.49. Vector xen đoạn λgt10 a. Tạo dòng với vector thay thế  Cắt bằng enzyme hạn chế Đoạn giữa DNA ngoại lai b. WES.B’ Nhỏ nhất Gắn với DNA DNA mới ngoại lai Lớn nhất Vị trí của EcoRI Không tái tổ hợp Tái tổ hợp (35 kb) (37-52 kb) c. EMBL4 EcoRI, BamHI, SalI hoặc kết hợp DNA ngoại lai, cho đến 23 kb 65
Hình 1.50. Vector thay thế λ Hình 1.51. Vector thay thế λEMBL3 3.2.Thí nghiệm tạo dòng với vector xen đoạn hoặc thay thế Những thí nghiệm tạo dòng với vector  thực hiện theo nguyên tắc như với plasmid. Phân tử  được cắt bằng một enzyme hạn chế để đưa DNA tạo dòng vào và sau đó chuyển nhiễm chúng vào E. coli khả biến (Hình 1.51a). Với thí nghiệm loại này vector phải ở dạng vòng, nghĩa là các vị trí cos của nó được gắn lại nhờ những liên hydrogene. Phương pháp chuyển nhiễm phục vụ cho nhiều mục đích, nhưng hiệu quả không cao. Người ta sẽ nhận được nhiều thể tái tổ hợp hơn khi thay đổi một hoặc hai điểm như sau: Điểm thứ nhất là làm sạch hai nhánh của vector. Khi xử lý vector ở dạng thẳng với enzyme hạn chế thì xuất hiện hai đoạn: nhánh phải và nhánh trái. Trong thực tế ở tất cả vector  nhánh trái dài hơn nhánh phải, vì vậy có thể tách chúng ra khi ly tâm theo gradient saccharose. Để tạo nên phân tử tái tổ hợp người ta trộn DNA tạo dòng với mẫu có chứa nhánh phải và nhánh trái. Ở phản ứng gắn xuất hiện nhiều dạng phân tử, trong đó có sự lặp lại nhiều lần trình tự (concatemere) nhánh trái-đoạn DNA tạo dòng- nhánh phải (Hình 1.51b). Đoạn DNA có độ dài phù 66
hợp được đóng gói in vitro. Như vậy có thể sản xuất trong ống nghiệm các phage tái tổ hợp, sau đó lây nhiễm với E. coli. Với phương pháp này và đặc biệt với phương pháp gói in vitro người ta thu được một số lớn các vết tan tái tổ hợp. a. Tạo dòng với -DNA vòng DNA mới Vector xen đoạn  dạng vòng Phân tử tái tổ hợp Chuyển nhiễm E. coli b. Tạo dòng với -DNA thẳng Thể tái tổ hợp  Hỗn hợp gói in vitro Lây nhiễm E. coli Hình 1.51. Các phương pháp khác nhau khi tạo dòng với vector phage λ a. Dạng vòng của λ-DNA được sử dụng như là plasmid 67
b. Với nhánh phải và nhánh trái của geneom λ và đóng gói in vitro người ta thu được một số lượng lớn hơn các vết tan tái tổ hợp. 4. Các vector lai plasmid/phage 4.1. Cosmid Cosmid là vector kết hợp các thuộc tính của phage và plasmid: Chúng có chứa các vị trí cos của phage nên cho phép DNA có thể bọc gói trong phần đầu của phage, đồng thời chúng lại có một điểm tái bản của plasmid cho phép tự nhân lên như các plasmid trong vi khuẩn. Hầu như toàn bộ phần DNA của phage bị cắt bỏ nên cosmid có thể mang những đoạn DNA ngoại lai có kích thước khá lớn, khoảng 40 – 45 kb. Sau khi các đoạn DNA được ghép nối, các cosmid tái tổ hợp sẽ được bọc gói thành các phân tử phage. Các phage này không thể nhân được như phage bởi chúng hầu như không còn DNA của phage nhưng vẫn duy trì khả năng lây nhiễm vào tế bào vi khuẩn và có khả năng tự tái bản trong tế bào vi khuẩn do có mang điểm khởi đầu sao chép của plasmid. Một cosmid về cơ bản là một plasmid có mang một vị trí cos (Hình 1.52a). Ngoài ra, nó phải có gene marker chọn lọc, ví dụ gene kháng ampicillin và một điểm bắt đầu sao chép plasmid, vì cosmid không chứa các -gene và vì vậy không tạo nên những vết tan. Trên môi trường chọn lọc xuất hiện nhiều dòng vi khuẩn, chính xác như ở vector plasmid. a. Một cosmid điển hình b. Tạo dòng với pJB8 Cắt bằng BamHI pJB8 dạng thẳng pJB8 dạng vòng DNA mới Ligation Gói in vitro Cosmid-DNA tái tổ hợp -Partikel Các khuẩn lạc chứa phân tử pJB8 tái tổ hợp, dạng vòng Lây nhiễm E. coli 68 Môi trường chứa ampicilin
Hình 1.52. Một cosmid điển hình và sử dụng nó khi tạo dòng với các đoạn DNA lớn hơn Một thí nghiệm tạo dòng với cosmid xảy ra như sau (Hình 1.52b): Người ta cắt cosmid ở một vị trí giới hạn duy nhất và đưa DNA ngoại lai vào. Đoạn này thường được tạo ra bằng cắt từng phần bằng một enzyme hạn chế, vì nếu phân giải hoàn toàn sẽ xuất hiện những phân tử mà tạo dòng trong cosmid là quá nhỏ. Phản ứng gắn kết được xảy ra làm xuất hiện các concatemere. Khi đoạn DNA tạo dòng có độ dài chính xác, các vị trí cos được cắt khi đóng gói in vitro và cosmid tái tổ hợp được đưa vào hạt phage. Với những hạt này người ta lây nhiễm tế bào E. coli, nhưng không tạo ra vết tan. Đưa những tế bào nhiễm này lên một môi trường chọn lọc và để cho những dòng kháng kháng sinh phát triển. Tất cả những dòng này là thể tái tổ hợp, vì những cosmid thẳng, không tái tổ hợp có kích thước nhỏ nên không được gói trong phage. 4.2. Phagemid Phagemid là vector được cấu tạo nên trên cơ sở plasmid pBR322 gắn thêm đoạn khởi đầu sao chép (ori) của phage f1, một đoạn có chứa các promoter của phage T3, T7 và polylinker. Điển hình của phagemid là nhóm plasmid bluescript. Hình 1.53. pBluescript SK VI. Tạo dòng gene Sau khi gắn một gene, một trình tự DNA cần thiết vào vector tạo dòng, tạo các phân tử DNA tái tổ hợp và đưa vào tế bào nhận (tế bào chủ), thì tiếp theo là tạo dòng gene nhằm thu một lượng lớn các bản sao của gene hoặc trình tự DNA cần thiết. Tạo dòng gene bao gồm quá trình tách và nhân dòng gene. Có nhiều phương pháp tạo dòng gene khác nhau. Tạo dòng in vitro (in vitro genee cloning) là tách chiết các gene cần thiết từ bộ gene vi sinh vật, động vật, thực vật, tạo vector tái tổ hợp và nhân các gene đó trong tế bào chủ. Tạo dòng in silico là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tạo dòng gene in vitro, rồi dựa vào cơ sở dữ liệu từ ngân hàng gene để lựa chọn các dòng gene ưu việt nhất, đưa vào ứng dụng trong thực tiễn sản xuất hoặc nghiên cứu. 69
Tạo dòng gene in vtro bao gồm tạo dòng gene đã biết và tạo dòng gene chưa biết. Tạo dòng gene đã biết là tạo dòng các gene đã biết kích thước hoặc vị trí của gene trong bộ gene. Tạo dòng gene chưa biết là nhân gene từ các sản phẩm của gene, chủ yếu là các loại mRNA. 1. Tạo dòng gene đã biết Phân lập gene: Tách chiết các gene cần tạo dòng từ các mẫu nghiên cứu, nhân gene bằng máy PCR, sản phẩm PCR được điện di trên gel agar hoặc polyacrylamide, rồi dựa vào kích thước của gene và thang chuẩn DNA để tách ra được gene cần tìm. Tạo vector tái tổ hợp: Tùy theo mục đích tạo dòng để chọn vector tạo dòng phù hợp. Vector tạo dòng phải phù hợp với loại tế bào chủ và kích thước đoạn DNA cần tạo dòng (DNA chèn). Vector tạo dòng là plasmid phù hợp với tế bào chủ là tế bào vi khuẩn, có thể gắn đoạn DNA có kích thước 3-10 kb. Vector tạo dòng là phage cho gắn đoạn DNA từ 15 – 30kb, thích hợp với tế bào vi khuẩn, động vật, thực vật. Vector tạo dòng là cosmid có thể gắn các đoạn DNA lớn đến 45 kb. Sau khi chọn được vector tạo dòng phù hợp, trộn vector tạo dòng và các đoạn DNA chèn vào với nhau theo tỷ lệ nhất định, có sự tham gia của T4 DNA ligase. T4 DNA ligase xúc tác phản ứng gắn các đoạn DNA chèn với vector tạo dòng tạo nên vector tái tổ hợp. 70
Hình 1.54 Sơ đồ tạo vector tái tổ hợp Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ: Vector tái tổ hợp được chuyển vào tế bào chủ bằng phương pháp biến nạp. Trong tế bào chủ, các vector tái tổ hợp được nhân lên nhiều lần tạo nên số lượng rất lớn các bản sao. Tế bào chủ thường là vi khuẩn, do vi khuẩn sản sinh nhanh, thao tác dễ và ít tốn kém. Tạo dòng có hai mục đích. Mục đích thứ nhất là bằng cách này có thể tạo ra một số lượng lớn các phân tử DNA tái tổ hợp từ một lượng giới hạn vật liệu ban đầu chỉ vài nanogram, nhưng khi tế bào vi khuẩn tiếp nhận plasmid rồi phân chia nhiều lần làm xuất hiện một dòng (trong đó mỗi tế bào chứa nhiều bản copy) thì có thể thu được nhiều icrogram DNA tái tổ hợp. Đó là sự tái sinh hàng nghìn lần từ lượng ban đầu (Hình 1.54). Bằng cách này sự tạo dòng đã tạo ra một lượng lớn DNA cần cho các thí nghiệm sinh học phân tử về cấu trúc và biểu hiện của gene. 71
Chức năng thứ hai là tinh sạch DNA. Khi tạo dòng bên cạnh các phân tử tái tổ hợp mong muốn hỗn hợp phản ứng gắn (ligation) còn chứa các phân tử sau: 1. Các phân tử vector 2. Các đoạn DNA tạo dòng 3. Các phân tử vector đóng vòng trở lại, nhưng không tiếp nhận DNA mới (tự đóng vòng) 4. Phân tử DNA tái tổ hợp nhưng đã kết hợp với đoạn DNA không mong muốn. Chọn và sàng lọc các thể tái tổ hợp: Trong thí nghiệm tạo vector tái tổ hợp, ví dụ plasmid tái tổ hợp, hỗn hợp vector và một lượng lớn các phân tử DNA được cắt cùng một enzyme hạn chế được gắn với nhau bằng enzyme DNA ligase. Kết quả tạo một hỗn hợp có plasmid tái tổ hợp lẫn các plasmid không mang gene được chuyển vào vi khuẩn. Sau đó, tất cả các tế bào vi khuẩn đó được chuyển lên môi trường dinh dưỡng để phát triển thành các dòng, tức là khuẩn lạc vi khuẩn. Do thí nghiệm tiến hành với một hỗn hợp plasmid không đồng nhất như vậy nên các dòng vi khuẩn mọc lên có 3 loại: - Tế bào vi khuẩn không nhận được plasmid - Tế bào vi khuẩn nhận được plasmid không mang gene ngoại lai mong muốn - Tế bào vi khuẩn nhận được đúng plasmid tái tổ hợp Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định dòng mong muốn, nhưng phương pháp được sử dụng nhiều nhất là xác định trực tiếp gene mong muốn. Đây là phương pháp lới dụng các chỉ thị (marker) trên vector tạo dòng để chọn lọc các dòng mang vector tái tổ hợp. Tế bào chứa nhiều bản sao của phân tử DNA tái tổ hợp Phân chia: Tạo ra một dòng Thu được: nhiều g DNA tái tổ hợp Đưa vào nuôi trong 500 ml môi trường lỏng, ủ trong 18 giờ Thu được: nhiều mg DNA tái tổ hợp Hình 1.55. Bằng cách tạo dòng người ta thu được một lượng lớn DNA tái tổ hợp 72
Các phân tử vector và DNA tạo dòng, nếu được tế bào vi khuẩn tiếp nhận chúng chỉ tái bản trong trường hợp ngoại lệ và thường bị phân giải bởi enzyme của tế bào chủ. Ngược lại, các phân tử vector tự đóng vòng hoặc những plasmid kết hợp với đoạn DNA không mong muốn thì tái bản giống phân tử tái tổ hợp mong muốn (Hình 1.56b). Các dòng khác nhau chứa các phân tử DNA khác nhau. Chỉ có một số ít tế bào vi khuẩn chứa cấu trúc mong muốn. Vậy làm thế nào để xác định được chúng?Trong phần này sẽ đề cập các phương pháp đưa plasmid và phage (phân tử tái tổ hợp) vào tế bào vi khuẩn và chọn lọc chúng. a. Sản phẩm của ligation Các đoạn DNA Vector tạo dòng gene gene DNA tái tổ Vector được mở vòng hợp mong muốn DNA tái tổ hợp “sai” b. Tất cả DNA dạng vòng được tạo dòng Tế bào với Tế bào với vector tự đóng DNA tái tổ hợp vòng “sai” Tế bào với phân tử mong muốn Dòng với Dòng với DNA vector tự đóng “sai” vòng Dòng với vector mong muốn 73
Hình 1.56. Tạo dòng là quá trình tinh sạch DNA. Từ một hỗn hợp các phân tử DNA khác nhau người ta thu được nhiều dòng mà mỗi dòng chỉ chứa một phân tử duy nhất với nhiều bản copy 1.1. Biến nạp (transformation): Sự tiếp nhận DNA của tế bào vi khuẩn Phần lớn các loài vi khuẩn có thể tiếp nhận các phân tử DNA từ dung dịch nuôi cấy. Những phân tử DNA này thường bị phân giải trong tế bào. Khi phân tử DNA là một plasmid thì điểm bắt đầu sao chép của nó được nhận biết bởi tế bào ký chủ. Sự tiếp nhận và tồn tại của plasmid trong tế bào được nhận biết nhờ sự biểu hiện của các gene nằm trên plasmid đó. Các tế bào E. coli thường nhạy cảm với tác dụng kìm hãm sinh trưởng của kháng sinh như ampicillin và tetracyclline. Các tế bào vi khuẩn chứa plasmid pBR322, một trong những vector tạo dòng đầu tiên, được phát triển trong những năm 70, có khả năng kháng kháng sinh. Nguyên nhân là có hai nhóm gene nằm trên plasmid đó: Một gene mã hoá -lactamase, biến đổi ampicillin thành một dạng không độc đối và gene của nhóm thứ hai làm cho tetracyclline trở thành vô hại. Các tế bào đã tiếp nhận pBR322, biến đổi từ dạng nhạy cảm với ampicillin và tetracyclline (ampstets) sang dạng kháng (amprtetr). a. Không phải tất cả tế bào vi khuẩn tiếp nhận DNA với hiệu quả như nhau Trong tự nhiên sự biến nạp có thể không phải là con đường quan trọng để đưa thông tin di truyền vào vi khuẩn. Trong phòng thí nghiệm chỉ có một số ít loại (Bacillus và Streptococcus) biến nạp được thực hiện dễ dàng. Phần lớn những loài vi khuẩn, trong đó có E. coli tiếp nhận DNA trong điều kiện bình thường rất giới hạn. Để tăng khả năng biến nạp của những loài này, người ta phải xử lý bằng phương pháp vật lý và hoá học. Những tế bào vi khuẩn được xử lý này gọi là tế bào khả biến. b.Tạo tế bào khả biến Các tiến bộ quan trọng trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA cũng là bước phát triển quan trọng liên quan đến sự biến nạp vào đầu những năm 70. Lúc đó người ta thấy rằng, tế bào E.coli được xử lý bằng dung dịch muối lạnh tiếp nhận DNA nhiều hơn những tế bào không được xử lý. Người ta thường sử dụng dung dịch CaCl2 50 mM, nhưng các muối khác cũng có cùng chức năng đặc biệt rubidiumchlorid. Tại sao việc xử lý này có tác dụng, vẫn chưa được giải thích một cách chi tiết. Có thể CaCl2 làm tăng khả năng kết tủa DNA ở bên ngoài tế bào, hoặc có thể muối là nguyên nhân làm thay đổi thành tế bào làm cho DNA bám tốt hơn. Xử lý bằng CaCl2 chỉ có tác dụng tăng sự bám DNA ở phía bên ngoài tế bào. Sự di chuyển thực chất của DNA vào tế bào khả biến được thực hiện do việc tăng nhiệt độ lên 420C trong thời gian ngắn. Tuy nhiên, người ta vẫn chưa biết chính xác, tại sao thay đổi nhiệt độ đột ngột lại gây ra tác dụng này. 1.2. Chọn lọc các tế bào biến nạp 74
Vi khuẩn Plasmid gắn phía bình thường ngoài tế bào Xử lý bằng CaCl Tế b ào khả 2 biến o 42 C trong 2 phút Plas mid được đưa vào trong tế bào Tế bào biến nạp Hình 1.57. Tiếp nhận và biến nạp DNA của tế bào vi khuẩn khả biến Sự biến nạp của các tế bào khả biến là một quá trình không có hiệu quả, cả khi người ta chuẩn bị các tế bào này cẩn thận. Khi biến nạp 1 ng pUC8 có thể thu được 1000 đến 10 000 tế bào được biến nạp, nhưng điều đó nói lên rằng chỉ 0,1 % phân tử được tế bào tiếp nhận. 10 000 tế bào được biến nạp cũng chỉ một phần rất nhỏ trong dung dịch tế bào khả biến. Vì vậy, phải tìm ra cách để phân biệt tế bào vi khuẩn tiếp nhận plasmid với hàng ngàn tế bào không biến nạp. Nhằm mục đích này người ta sử dụng gene chọn lọc có trong plasmid. Gene chọn lọc đơn giản là gene tạo cho tế bào biến nạp có một đặc tính mới, ví dụ gene kháng ampicillin trong pBR322. Các tế bào E. coli đã tiếp nhận plasmid amprterr có thể tạo khuẩn lạc trên dung dịch thạch chứa ampicillin và tetracycline. Các tế bào không biến nạp không có khả năng này. Bằng cách này người ta phân biệt một cách dễ dàng các tế bào được biến nạp và không biến nạp. Phần lớn các vector tạo dòng plasmid mang ít nhất một gene làm cho ký chủ có khả năng kháng một kháng sinh. Để chọn lọc các tế bào này người ta đưa chúng lên môi trường thạch chứa kháng sinh đã đề cập. Cũng nên biết rằng tính kháng không phải đơn giản xuất hiện ngay khi có mặt của plasmid trong tế bào. Gene 75
kháng phải biểu hiện, nghĩa là enzyme được tổng hợp. Vì vậy, sự biểu hiện của gene biến nạp sớm nhất cũng sau một vài phút. Do vậy không nên nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường chọn lọc ngay sau khi xử lý schock nhiệt mà nên giữ chúng trong dung dịch lỏng có thể tích nhỏ không có kháng sinh trong thời gian ngắn. Bằng cách này sự tái sinh và biểu hiện của gene có thể xảy ra và khi đưa tế bào này tiếp cận với kháng sinh trên môi trường, chúng đã tạo nên đủ enzyme để sống sót (Hình 1.58). Tế bào E. coli không chứa plasmid Không sóng sót Sống sót và tạo khuẩn lạc Agar với 40 g/ml ampicillin, 15 g/ml tetracylline Hình 1.58. Chọn lọc tế bào chứa plasmid pBR322 bằng cách nuôi chúng trên môi trường chứa ampicillin và/ hoặc tetracycline 1.3. Xác định dạng tái tổ hợp Bằng việc nuôi cấy trên môi trường chọn lọc người ta có thể phân biệt được những tế bào được biến nạp và không biến nạp. Tiếp theo phải khẳng định được tế bào biến nạp nào đã tiếp nhận phân tử DNA tái tổ hợp và những tế bào nào chỉ chứa vector tự đóng vòng. Ở các vector tạo dòng khi đoạn DNA ngoại lai chèn vào thì 76
gene chọn lọc bị gián đoạn (tách thành hai phần). Các thể tái tổ hợp được phân biệt, do các tế bào này không còn có đặc tính mới do gene mã hóa đưa lại. Nguyên lý của bất hoạt do bị chèn được làm sáng tỏ ở thí nghiệm tạo dòng với vector pBR322. Protein (enzyme) làm bất hoạt kháng sinh Plasmid Ngay sau khi biến nạp Sau một giờ ủ ở nhiệt độ 37oC Hình 1.59. Biểu hiện kiểu hình. Thể biến nạp sống sót tốt hơn sau khi ủ một giờ ở 370C, so với trước khi nuôi trên môi trường chọn lọc, vì sau đó vi khuẩn mới bắt đầu tổng hợp enzyme. a. Chọn lọc các biến nạp chứa pBR322: bất hoạt do DNA chèn vào gene kháng kháng sinh Plasmid pBR322 có nhiều chỗ cắt duy nhất cho các enzyme hạn chế, ở đó đoạn DNA được chèn vào. Ví dụ BamHI cắt plasmid chỉ ở một vị trí bên trong nhóm gene kháng tetracyclline. Một đoạn DNA ngoại lai được chèn vào vị trí cắt của BamHI (Hình 1.61b) làm cho tế bào không còn tính kháng tetracyclline, vì gene kháng này đã bị gián đoạn. Các tế bào chứa plasmid tái tổ hợp này vẫn còn kháng ampicillin, nhưng mẫn cảm với tetracyclline (amprtets). Việc tìm kiếm các thể tái tổ pBR322 thực hiện như sau: Sau khi biến nạp (gene kháng tetracycline bị bất hoạt do chèn DNA lạ vào) người ta nuôi các tế bào này trên môi trường thạch chứa ampicillin và ủ chúng cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc (Hình 1.62a). Các khuẩn lạc này bao gồm cả tế bào biến nạp (chứa phân tử pBR322 tái tổ hợp) và không biến nạp (chứa plasmid không thay đổi). Để xác 77
định các khuẩn lạc tái tổ hợp người ta chuyển các khuẩn lạc này lên môi trường thạch chứa tetracyclline theo đúng trật tự cũ (Hình 1.61b). Sau khi ủ chỉ một số khuẩn lạc gốc phát triển (Hình 1.62c). Những khuẩn lạc phát triển bình thường không chứa plasmid tái tổ hợp (đoạn DNA ngoại lai không được chèn vào, vì ở chúng nhóm gene kháng tetracylin vẫn còn nguyên (amprtetr). Ngược lại những khuẩn không phát triển trên môi trường này là các tế bào chứa plasmid tái tổ hợp (amprtets). Biết được chính xác vị trí của nó trên đĩa chứa ampicillin, người ta có thể dễ dàng tách chúng ra và tiếp tục sử dụng. a. Vector Sản phẩm gene Gene đích được hoạt hóa b. Vector tái tổ hợp Không có sản phẩm gene Gene đích bị gián đoạn khi đưa DNA vào Hình 1.60. Bất hoạt do chèn DNA ngoại lai vào a. Vector bình thường chứa một gene chọn lọc, đưa lại cho tế bào chủ một đặc tính xác định nào đó. b. DNA ngoại lai được chèn vào gene chọn lọc làm gene gián đoạn, vì vậy tế bào chủ không còn đặc tính đó nữa. 78
a. Vector BamHI Gene kháng ampicillin Gene kháng tetracylline R R amp tet b. pBR322 tái tổ hợp DNA ngoại lai được chèn vào vị trí cắt của BamHI R S amp tet Hình 1.61. Vector tạo dòng pBR322 a. Vector pBR322, b. Phân tử pBR322 tái tổ hợp, đoạn DNA ngoại lai được chèn vào vị trí cắt của BamHI b. Sự bất hoạt do DNA chèn vào không phải luôn luôn là gene kháng kháng sinh Các gene kháng kháng sinh là phương tiện thuận lợi để xác định thể tái tổ hợp, nhưng ở một số vector tạo dòng plasmid người ta còn sử dụng một hệ thống khác, ví dụ pUC8 (Hình 1.37a). Plasmid này mang một gene kháng ampicillin và một gene LacZ mã hoá một phần enzyme -galactosidase. Khi tạo dòng với pUC8 thì gene LacZ bị bất hoạt, vì vậy ở thể biến nạp không tổng hợp được - galactosidase (Hình 1.37b). 79
-galactosidase là enzyme phân giải lactose thành glucose và galactose. Bình thường enzyme này được mã hoá bởi gene LacZ có trong nhiễm sắc thể của E.coli. Một số chủng E.coli có gene LacZ thay đổi, gene này thiếu một đoạn lớn, gọi là gene LacZ mã hoá cho một phần ( -peptide) enzyme -galactosidase. Những thể đột biến này có thể tạo nên enzyme khi chúng mang một plasmid, ví dụ như pUC8 chứa phần thiếu LacZ của gene. 80
a. Khuẩn lạc trên môi trường chứa ampicillin b. Chuyển khuẩn lạc từ đĩa agar này lên đĩa agar khác, trên đó khuẩn lạc tiếp tục phát triển theo đúng vị trí ban đầu Khối gỗ bọc nhung Tế bào gắn khối gỗ Tiếp xúc trên bề Tiếp xúc trên mặt bề mặt Khuẩn lạc trên môi trường chứa Môi trường chứa tetracylline R ampicillin Khuẩn lạc tet R R c. Khuẩn lạc amp tet phát triển trên môi trường chứa tetracyclline R S Vị trí của một thể biến nạp amp tet R R amp tet : không có thể biến nạp Hình 1.62. Tìm kiếm thể biến nạp pBR322, ở đây gene kháng tetracycline bị bất hoạt do chèn DNA ngoại lai vào a. Tế bào biến nạp được nuôi trên môi trường thạch chứa ampicillin: Tất cả các tế bào đều tạo khuẩn lạc b. Các khuẩn lạc này được chuyển sang môi trường chứa tetracycline. Những khuẩn lạc phát triển trên môi trường này là những thể không biến nạp (amR tetR) 81
c. Các thể biến nạp (ampR tetS) không phát triển, nhưng người ta có thể biết được vị trí của nó trên đĩa chứa ampicillin Ở một thí nghiệm tạo dòng với pUC8 người ta chọn lọc các tế bào sau khi biến nạp trên môi trường chứa ampicillin và kiểm tra hoạt tính của -galactosidase để xác định thể biến nạp. Tế bào chứa plasmid pUC8 kháng ampicillin và có thể tổng hợp -galactosidase. Thể biến nạp cũng kháng ampicillin nhưng không tạo ra -galactosidase. a. pUC18 Gene kháng ampicillin BamHI gene LacZ’ R + amp -gal b. Phân tử pUC18 tái tổ hợp DNA ngoại lai được chèn vào vị trí cắt của BamHI R amp -gal- Hình 1.63. Vector tạo dòng pUC18: a. Vector pUC18 b. Phân tử pUC18 tái tổ hợp, đoạn DNA ngoại lai được chèn vào vị trí cắt của BamHI 82
Thí nghiệm không kiểm tra lactose có được phân giải thành glucose và galactose hay không mà kiểm tra một phản ứng được xúc tác bởi enzyme. Ở đây sử dụng một chất tương tự lactose là X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-D- galactopyranoside), chất này được phân giải thành một sản phẩm có màu xanh tối nhờ enzyme -galactosidase. Người ta cho X-gal vào agar và một chất cảm ứng enzyme, isopropythiogalactoside (IPTG), các khuẩn lạc không chứa thể tái tổ hợp thì có màu xanh. Ở thể biến nạp gene LacZ bị gián đoạn nên không tạo được - galactosidase và khuẩn lạc có màu trắng. 2. Tạo dòng gene chưa biết Khi chưa biết kích thước hoặc vị trí của gene trong bộ gene thì nhân dòng gene thường sử dụng các sản phẩm của gene, chủ yếu là các loại mRNA. Tạo dòng gene chưa biết từ mRNA là một quá trình phức tạp, có thể thực hiện theo các bước sau: - Tách chiết mRNA - Tạo DNA bổ sung, cDNA (complemantary DNA) - Tạo vector tái tổ hợp - Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào nhận - Chọn lọc 83
a. Ý nghĩa của gene: LacZ’ E. coli Lac Z’ + pUC18 Phân tử -galactose hoàn chỉnh Phân tử enzyme không hoàn chỉnh pUC18 Một phần của -galactosidase được mã hóa bởi gene của vi khuẩn Một phần của -galactosidase được mã hóa bởi gene của plasmid Một phần của -galactosidase hoàn chỉnh b. Tìm tế bào biến nạp pUC8 tái tổ hợp Agar + X-gal + IPTG Khuẩn lạc màu xanh: tế bào không biến nạp pUC8 tái tổ hợp Khuẩn lạc màu xanh: tế bào không biến nạp Khuẩn lạc màu xanh: -galactosidase được tạo nên X-gal  sản phẩm màu xanh Khuẩn lạc màu trắng: -galactosidase không được tạo nên X-gal  Không có sản phẩm màu xanh Hình 1.64. Nguyên tắc bất hoạt gene LacZ’ của pUC8 bằng việc chèn DNA ngoại lai a. Gene của vi khuẩn và plasmid bổ sung cho nhau tạo nên β- galactosidase hoạt động b. Để tìm kiếm thể tái tổ hợp người ta nuôi vi khuẩn trên môi trường thạch chứa X-gal và IPTG Nói chung các bước tiến hành về cơ bản cũng như tạo dòng gene đã biết. Các kỹ thuật chi tiết sẽ trình bày ở chương sau. 84
Tài liệu tham khảo/đọc thê 1. Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ, Hà Thị Minh Thi, Giáo trình Sinh học phân tử, NXB Đại học Huế, 2007. 2. Cherfas, J. Man made Life. Oxford (Blackwell) 1982, Eine Geschichte der fruehen Jahre in der Genetechnik, 3. Felsenfeld, G. DNA. In: Spektrum der Wissenschaft 12 (1985) S. 50 -63, Kurzer Ueberblick ueber die wichtigsten Eigeneschaften der DNA 4. Brown, T. A. (Hrsg.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Oxford (Blackwell) 1994, Ein ausgezeichnetes Nachschlagewerk. 5. Beebee, T.; Burke, J, Genee Structure and Transcription.2, Aufl. Oxford (IRL Press at Oxford University Press) 1992. 6. Dale, J. W. Molecular geneetics of Bacteria, 2. Aufl. Chicheester (Wiley) 1994. 7. Marmur, J. A Procedure for the Isolation of Deoxyribonucleic Acid from Micro-organisms, In: Journal of Molecular Biology 3 (1961) 8. Rogers, S.O.; Bendich, A. J. Extraction of DNA from Milligram Amounts of Fresh, Herbarium and Mummified Plant Tissues, In: Plant Molecular Biology (1985). 9. Birnboim, H. C.; Doly, J. A Rapid Alkaline Extraction Procedure for Screening Recombinant Plasmid DNA, In: Nucleic Acid Research 7 (1979) 10. Smith, H. O.; Wilcox, K. W. A Restriction Enzyme from Haemophilus influenzae, In: Jounal of molecular Biology 51 (1970) 11. Roberts, R. J.; Macelis, D. Restriction Enzymes and Methylase, In: Nucleic Acid research 21 (1993). 12. Rothstein, R. J. et al. Synthetic Adaptors for Cloning DNA, In: methods in Enzymology 68 (1979). 13. Hohn, B.; Murray, K. Packaging Recombinant DNA Molecules into Bacteriophage Particles in Vitro, In: Proceeding of the NationalAcadamy of Sciences, USA 74 (1977). 14. Bolivar, F.et al. Construction and Characterisation of New Cloning Vectors, II. Amulti-Purpose Cloning System. In: Genee 2 (1977). 15. Leder, P. et al. EK2 Derivatives of Bacteriophage Lambda Useful in Cloning of DNA from Higher Organisms, The gtWES System. In: Science 196 (1977) 85
Chương 2 CÁC KỸ THUẬT CHÍNH SỬ DỤNG TRONG PHÂN TÍCH NUCLEIC ACID I. Phương pháp tách chiết DNA Trong công nghệ gene luôn luôn yêu cầu làm sạch ít nhất là 3 loại DNA. Thứ nhất là DNA tổng số của vi khuẩn, thực vật và động vật mà người ta muốn nghiên cứu.Loại DNA thứ hai là plasmid: Theo nguyên tắc như tinh sạch DNA tổng số, tuy nhiên có sự khác nhau là phải tách DNA-plasmid ra khỏi DNA nhiễm sắc thể, mà chúng chỉ chiếm phần nhỏ DNA của tế bào. Cuối cùng là DNA của phage, khi muốn sử dụng chúng làm vector tạo dòng. Nói chung DNA phage không được tách từ tế bào bị nhiễm mà từ các hạt phage. Vì vậy, phải sử dụng các phương pháp đặc biệt hơn để loại phần vỏ của phage. Trường hợp ngoại lệ M13 sợi kép thì được tách như plasmid của tế bào E.coli. 1. Phương pháp tách DNA tổng số Để tách chiết được DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn cần thực hiện 4 bước sau đây (Hình 2.1): 1. Nuôi cấy và thu hoạch vi khuẩn 2. Phá vỡ tế bào để giải phóng phần bên trong. 3. Dịch tế bào được xử lý để loại bỏ các thành phần của tế bào trừ DNA. 4. Cô đặc dung dịch DNA thu được. 1. Vi khuẩn được nuôi và thu hoạch 2. Vi khuẩn được tách ra và phá vỡ tế bào, làm xuất hiện dịch tế bào Ly tâm Vi khuẩn nuôi trong dung dịch Vi khuẩn kết tủa Dịch tế bào DNA sạch 4. Làm tăng nồng độ DNA 3. DNA sạch thu được từ dịch tế bào Hình 2.1 Các bước cơ bản để thu được DNA tổng số từ tế bào vi khuẩn 70
1.1. Nuôi và thu hoạch vi khuẩn Vi khuẩn được nuôi dễ dàng trong môi trường lỏng. Dung dịch nuôi cấy là hỗn hợp các chất cần thiết đảm bảo cho vi khuẩn phát triển và phân chia có hiệu quả. Có hai loại môi trường nuôi cấy thường được sử dụng là M9 và LB (Bảng 2.1). M9 là hỗn hợp các chất vô cơ cần thiết cho sự sống như N, Mg, Ca và đường. Tùy từng loài vi khuẩn mà người ta bổ sung vào M9 các nguyên tố vi lượng và vitamin. Ngược lại LB là môi trường mà người ta không biết chính xác chất nào và với lượng chất bao nhiêu chứa ở trong đó. Ví dụ, trypton và dịch chiết nấm men là hỗn hợp phức tạp chứa các chất chưa biết. Bảng 2.1 Thành phần của hai môi trường nuôi cấy vi khuẩn Thành phần Nồng độ (g/l) 1. Môi trường M9 Na2HPO4 6,0 KH2PO4 3,0 NaCl 0,5 NH4Cl 1,0 MgSO4 0,5 Glucose 2,0 CaCl2 0,015 2. Môi trường LB (Luria-Bertani) Trypton 10 Dịch chiết nấm men 5 NaCl 10 Trypton cung cấp các amino acid cơ bản và các peptide nhỏ. Dịch chiết từ nấm men (dạng bột khô, một phần là những tế bào nấm men được phân giải) cung cấp N, đường, các hợp chất vô cơ và hữu cơ. Môi trường hỗn hợp như LB không cần cho thêm những chất bổ sung. Các loài vi khuẩn khác nhau phát triển tốt trên môi trường này. Khi chỉ muốn tách DNA từ dung dịch vi khuẩn nuôi cấy, thì môi trường LB là phù hợp. Trong môi trường LB, ở nhiệt độ 370C, trên máy lắc với tốc độ 150-250 vòng/phút, tế bào vi khuẩn phân chia trong khoảng 20 phút cho đến khi dung dịch nuôi cấy đạt được mật độ cực đại khoảng 2-3 x 109 tế bào/ml. Để theo dõi sự phát triển của vi khuẩn nuôi cấy, người ta đo mật độ quang (OD) ở 600 nm (Hình 2.2). Ở độ dài bước sóng này 1 đơn vị OD tương ứng với khoảng 0,8 x 109 tế bào vi khuẩn/ml. Để thu vi khuẩn phải ly tâm dung dịch nuôi cấy ở số vòng quay thấp, vi khuẩn sẽ đọng lại ở đáy ống nghiệm (Hình 2.3). Bằng cách này 1 lít dung dịch vi khuẩn nuôi cấy có thể cô đặc lại trong 10 ml hoặc ít hơn. Để phá vỡ tế bào vi khuẩn có thể dùng phương pháp vật lý hoặc phương pháp hoá học, trong đó phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến hơn. Đối với tế bào vi khuẩn người ta thường sử dụng các hóa chất như lysozyme kết hợp với ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) để phá hủy màng tế bào. Lysozyme sẽ phân hủy màng tế bào giải phóng các thành phần bên trong tế bào 71
(dịch tế bào), trong khi đó EDTA tách ion Mg, ion này rất quan trọng trong việc duy trì cấu trúc của vỏ tế bào, ngoài ra nó còn kìm hãm enzyme phân giải DNA. Dưới những điều kiện xác định lysozyme làm yếu màng tế bào và EDTA làm cho tế bào bị vỡ ra, nhưng thường thì người ta cho thêm một hoá chất như sodiumdecysulfate (SDS). 1.2. Xử lý dịch tế bào a. Đo mật độ quang Ánh sáng có bước sóng 600 nm Ánh sáng đi qua Máy đo Dung dịch vi khuẩn trong một curvet có độ dày 1 cm b. Xác định số lượng tế bào nhờ đường chuẩn Mật độ quang ở 600 nm Số lượng tế bào (x 109)/ml Hình 2.2. Xác định số lượng vi khuẩn bằng đo mật độ quang ở máy quang phổ kế 72
a. Cho mẫu vào cuvet thủy tinh và chiếu ánh sáng có bước sóng 600 nm. Đo lượng ánh sáng đi qua dung dịch vi khuẩn và mật độ quang (OD) được tính là OD = -log10 (cường độ ánh sáng đi qua/ cường độ ánh sáng chiếu vào dung dịch) b. Biết được số lượng tế bào tương ứng với mỗi giá trị OD nhờ một đường chuẩn, đường chuẩn này được xây dựng từ các giá trị OD của dung dịch vi khuẩn ở các nồng độ đã biết. Đối với E.coli 1 đơn vị OD = 0,8 x 109 tế bào/ml Chất này làm tăng quá trình hoà tan, vì chúng tách ra những phân tử lipid ra khỏi màng tế bào. Tuy nhiên, trong một số trường hợp vẫn phải sử dụng đến các phương pháp vật lý như sử dụng máy nghiền hay cối và chày sứ. Nhược điểm của phương pháp này là có nguy cơ làm đứt gãy cơ học các phân tử DNA lớn và điều có thể gây trở ngại cho quá trình xử lý tiếp theo. Sau khi tế bào phân giải, người ta phải tách những phần tế bào không hoà tan ra khỏi dịch tế bào, ví dụ các mảnh vỡ màng tế bào không bị phân giải và các bào quan như ty thể, không bào bằng ly tâm (Hình 2.4b), kết quả cuối cùng là thu được phần dịch trong suốt nằm ở phía trên. Dung dịch vi khuẩn Ly tâm 10 phút ở 800 rpm Máy ly tâm Sinh khối vi khuẩn Hình 2.3. Thu sinh khối vi khuẩn bằng ly tâm 73
a. Ly tan tế bào Phá vỡ thành tế bào Phá vỡ màng tế bào Dịch tế bào b. Ly tâm để tách ra phần không hòa tan DNA, RNA và protein Dịch tế bào Ly tâm Chất cặn tế bào Hình 2.4. Thu nhận dịch tế bào a. Ly tan tế bào, b. Ly tâm dịch tế bào để tách ra những phần không tan 1.3. Tách DNA từ dịch tế bào Để thu được DNA tinh sạch người ta cần loại bỏ những thành phần tạp nhiễm mà quan trọng nhất là protein. Bước này được thực hiện bằng cách tách chiết một hoặc vài lần với tác nhân tách chiết, thường là phenol, chloroform, hoặc một hỗn hợp phenol và chloroform cùng thể tích. Phenol là chất làm biến tính protein mạnh nhưng không hòa tan nucleic acid. Chloroform thường đi kèm với phenol có tác dụng bổ sung và loại bỏ hoàn toàn dấu vết của phenol. Vì vậy, người ta hay sử dụng hỗn hợp phenol và chloroform để loại bỏ protein. Như vậy, việc loại bỏ thành phần tạp nhiễm và tách chiết DNA dựa trên sự hòa tan khác nhau của DNA và protein trong 2 pha không hòa tan phenol và chloroform/nước. 74